专利名称：一种提高发酵法生产莽草酸产量的方法
技术领域：
本发明涉及一种获得莽草酸的新方法，特别是由乳糖发酵短杆菌发酵获 得莽草酸的新方法，属于生物化工领域。
技术背景莽草酸(shikimicacid)是芳香族氨基酸和芳香维他命的生物合成通路一 一莽草酸途径的重要中间体。根据对莽草酸的药理研究，莽草酸通过影响花 生四烯酸代谢来抑制血小板聚集，从而可以抑制动、静脉血栓及脑血栓形成； 具有抗炎、镇痛作用。莽草酸还可以作为抗病毒和抗癌药物的中间体，是二 恶霉素，乙二醛酶抑制剂等抗肿瘤药物的合成原料，同时也是合成神经氨酸 酶抑制剂磷酸奥司米伟(oseltamivir phosphate,商品名Tamiflu )的关键起 始原料(于慧杰，周伟澄.磷酸奥司米伟合成路线图解.中国医药工业杂志，2006， 27(1))，随着禽流感疫情在全球蔓延，以及人感染高致病性禽流感病例的增 加，莽草酸更加供不应求。虽然莽草酸途径在植物、微生物和寄生生物中广泛存在，但该途径的中 间代谢物,如莽草酸、奎尼酸等的大量生产却并不容易，目前主要是从八角属 植物果实中提取莽草酸。但由于受到植物资源数量和产地的限制，随着近几 年，禽流感的流行，由于Tamiflu⑧生产需要莽草酸作为关键原料，提取法已 略显不能满足生产的需要。莽草酸及其类似物的化学合成方法，主要有 Diels. Aider反应、逆Diels. Aider反应、碳氢化合物转化法和奎宁酸转化 法。化学方法合成莽草酸，但需耗费大量的化学原料，工艺过程复杂，同时 产生有害物质，污染环境。因此，通过直接发酵生物合成莽草酸，成为优选 的替代方法。但我国目前还没有可以发酵生产莽草酸的菌种。在前人的研究中，莽草酸的发酵物大多通过多步基因工程改造的大肠杆 菌或遗传突变的枯草杆菌获得，在一系列基因操作中包括在生成莽草酸或3-磷酸莽草酸之后阻断莽草酸途径。文献(WO 00/0180; WO 2002029078; CN 200710110469.0)报道基因工程菌发酵生产莽草酸同时敲除aroL和aroK，完 全阻断了芳香族氨基酸和芳香维他命的合成，造成营养缺陷，影响菌体生长。 在付小花研究中(付小花，高益范，郝思捷，等.大肠杆菌aroL基因敲除及其对莽草酸合成的影响.复旦学报(自然科学版)，2007， 46 (3): 366-370.) 敲除aroL基因，同样由于莽草酸途径部分受阻，菌体生长不良，发酵时间偏 长，E."/f LKTop菌株发酵生产莽草酸的能力为原始菌株的1.57。另外，过 多的基因操作，会造成宿主细胞遗传背景复杂，代谢压力过大；同时宿主细 胞易产生回复突变，造成培养工程复杂化，产物产率下降。因此采用酶抑制 剂，在生物量合适时阻断莽草酸途径，促使莽草酸大量积累，同时减少副产 物的产生，是累积莽草酸的优选方法，。目前尚未有人将阻断剂用于生物合成 过程来提高莽草酸产量。 发明内容本发明的目的是提供一种提高发酵法生产莽草酸产量的方法。通过向培 养基中添加适宜的抑制剂，阻断莽草酸途径，从而提高莽草酸的产量，减少 副产物的产生。本发明采用乳糖发酵短杆菌为微生物菌种，经种子培养、发酵培养、检 测培养基中莽草酸累积量，其特征是在发酵体系中添加草甘膦作为EPSPS抑 制剂。具体步骤和方法如下(l)种子培养将乳糖发酵短杆菌接种到pH7.0-pH7.4的种子培养基，在 30°C， 120-180rpm摇床中培养12-16h，得到的乳糖发酵短杆菌培养液； 其中种子培养基的组分和含量为葡萄糖25-35g，硫酸铵15-25g，磷酸二氢 钾1.0-2.0g,硫酸镁0.1-1.0g，尿素0.5-2.0g，玉米浆20-30g，用水定容至1L， 调pH至pH7.0- pH7.4， 1 15。C灭菌30 min，装液量25mL/250Ml。(2)发酵培养将经种子培养得到的乳糖发酵短杆菌培养液接种到？117.0- pH7.4的发酵 培养基中，接种量5%， 30°C， 120-180rpm摇床中培养48-60h;发酵至16-30 小时加入浓度为l-200(imoL/L之间的草甘膦抑制剂；其中发酵培养基组分和含量为葡萄糖100-160g，硫酸铵30-50g，磷酸 二氢钾0.5-2.0g，硫酸镁0.1-1.0g，玉米浆20-30g，碳酸钙30-50g，用水定容 至1L，调pH至pH7.0画pH7.4， 1 15。C灭菌30 min，装液量为25mL/250Ml。将步骤(2)得到的发酵液5000rmp离心，过0.45pm微孔滤膜，反相高 效液相法检测莽草酸的产量。上述种子培养基和发酵培养基的pH值采用现有技术常用的碱溶液调节， 如氢氧化钠溶液等。本发明利用合适的酶抑制剂提高发酵法合成莽草酸产量的方法，由于草 甘膦抑制了 3-磷酸莽草酸向3-磷酸-5-烯醇式丙酮酸莽草酸的转化，使得莽草 酸途径在生成3-磷酸莽草酸后被阻断，造成莽草酸的累积，提高了莽草酸的 产量，同时减少了莽草酸途径下游的副产物的产生。由于在加入草甘膦之前， 乳糖发酵短杆菌的生长比通过基因工程部分或完全阻断后的乳糖发酵短杆菌 的生长正常，达到相同生物量所需的时间縮短，因此在适当时间加入草甘膦， 既保证了莽草酸途径被阻断，又保证了足够的生物量。莽草酸产量可达未添 加草甘膦时的1.667倍一2.887倍。同时避免了生产中，由于基因工程菌过多 基因操作造成的生产菌种退化问题，使得生产条件更加稳定和可靠。
具体实施方式
对比例(1) 种子培养将乳糖发酵短杆菌接种到种子培养基，种子培养基的组分和含量为葡萄糖30g，硫酸铵20g，磷酸二氢钾1.5g，硫酸镁0.5g，尿素 1.5g，玉米浆25g，用水定容至1L，调pH至pH7.0， 1 15。C灭菌30 min，装 液量为25mL/250Ml。在30"C， 120rpm摇床中培养12h。(2) 发酵培养将经种子培养得到的乳糖发酵短杆菌培养液按照5n/。的接种量接种到pH7.2的 发酵培养基中，其中发酵培养基组分和含量(g/L)为葡萄糖130，硫酸铵40， 磷酸二氢钾1.5g，硫酸镁0.5g，玉米浆25g，碳酸钙40g，用水定容至1L， 调pH至pH7.2， 115T灭菌30min。发酵培养采用250ml三角瓶，装液量为 25ml，于30。C， 140rpm摇床中培养48h。(3) 检测将步骤(2)得到的发酵液5000rmp离心20min，过0.45um微孔滤膜， 反相高效液相色谱法检测莽草酸含量，得到莽草酸含量为0.506g L—、实施例1:(1) 种子培养将乳糖发酵短杆菌接种到种子培养基，种子培养基的组分和含量为葡萄糖28g，硫酸铵20g，磷酸二氢钾1.8g，硫酸镁0.4g，尿素 1.8g，玉米浆20g，用水定容至1L，调pH至pH7.0， 1 15匸灭菌30 min，装 液量为25mL/250Ml。在30°C ， 120rpm摇床中培养16h。(2) 发酵培养将经种子培养得到的乳糖发酵短杆菌培养液按照5%的接种量接种到 pH7.0的发酵培养基中，发酵培养基组分和含量为其中发酵培养基组分和含 量(g/L)为葡萄糖140，硫酸铵45，磷酸二氢钾1.5，硫酸镁1.0，玉米浆 20，碳酸钙30，用水定容至1L，调pH至pH7.0， 115。C灭菌30 min。发酵 培养采用250ml三角瓶，装液量为25ml，于30。C， 120rpm摇床中培养60h。 发酵至30小时时加入浓度为10poL/L之间的草甘膦抑制剂。(3) 检测将步骤(2)得到的发酵液5000rmp离心20min，过0.45um微孔滤膜， 反相高效液相色谱法检测莽草酸含量，得到莽草酸含量为1.043g，L—1，是未 添加草甘膦时的2.061倍。实施例2:(1) 种子培养将乳糖发酵短杆菌接种到种子培养基，种子培养基的组 分和含量为种子培养基的组分和含量(g/L)为葡萄糖30，硫酸铵20，磷酸二氢钾1.5，硫酸镁0.5，尿素1.5，玉米浆25，用水定容至1L，调pH至 pH7.4， 1 15X:灭菌30min，装液量为25mL/250Ml。在3(TC， 140rpm摇床中 培养14h。(2) 发酵培养将经种子培养得到的乳糖发酵短杆菌培养液按照5%的接种量接种到 pH7.4的发酵培养基中，发酵培养基组分和含量为其中发酵培养基组分和含 量(g/L)为葡萄糖130，硫酸铵40，磷酸二氢钾1.5，硫酸镁0.5,玉米浆 25，碳酸钙40，用水定容至1L，调pH至pH7.4， 115。C灭菌30 min。发酵 培养采用250ml三角瓶，装液量为25ml，于30。C， 140rpm摇床中培养54h。 发酵至24小时时加入浓度为20pmoL/L之间的草甘膦抑制剂。(3) 检测将步骤(2)得到的发酵液5000rmp离心20min，过0.45^m微孔滤膜， 反相高效液相色谱法检测莽草酸含量，得到莽草酸含量为1.456g'L—1，是未 添加草甘膦时的2.877倍。实施例3(1) 种子培养将乳糖发酵短杆菌接种到种子培养基，种子培养基的组 分和含量为种子培养基的组分和含量为葡萄糖32g，硫酸铵15g，磷酸二氢钾2.0g，硫酸镁0.8g，尿素0.7g，玉米浆30g，用水定容至1L，调pH 至pH7.4， 1 15。C灭菌30 min，装液量为25mL/250Ml。在30。C， 160rpm摇 床中培养12h。(2) 发酵培养将经种子培养得到的乳糖发酵短杆菌培养液按照5%的接种量接种到 pH7.4的发酵培养基中，发酵培养基组分和含量为其中发酵培养基组分和含 量为葡萄糖160g，硫酸铵32g，磷酸二氢钾0.8g，硫酸镁0.3g，玉米浆 30 g，碳酸钙50g，用水定容至1L，调pH至pH7.4， 115。C灭菌30 min。发 酵培养采用250ml三角瓶，装液量为25ml，于3(TC， 160rpm摇床中培养48h。 发酵至20小时时加入浓度为100pmoL/L之间的草甘膦抑制剂。(3) 检测将步骤(2)得到的发酵液5000rmp离心20min，过0.45um微孔滤膜， 反相高效液相色谱法检测莽草酸含量，得到莽草酸含量为1.246g，L"，是未 添加草甘膦时的2.462倍。实施例4(1) 种子培养将乳糖发酵短杆菌接种到种子培养基，种子培养基的组 分和含量为种子培养基的组分和含量为葡萄糖25 g，硫酸铵18 g，磷酸二氢钾1.0g，硫酸镁0.1g，尿素0.5g，玉米浆20 g，用水定容至1L，调pH 至pH7.2， 1 15。C灭菌30 min，装液量为25mL/250Ml。在3(TC， 180rpm摇 床中培养12h。(2) 发酵培养将经种子培养得到的乳糖发酵短杆菌培养液按照5%的接种量接种到pH7.2的发酵培养基中，发酵培养基组分和含量为其中发酵培养基组分和含量为葡萄糖100g，硫酸铵30g，磷酸二氢钾0.5g，硫酸镁0.1g，玉米浆 20 g，碳酸钙30g，用水定容至1L，调pH至pH7.2， 115。C灭菌30 min。发 酵培养采用250ml三角瓶，装液量为25ml，于30°C ， 180rpm摇床中培养48h。 发酵至16小时时加入浓度为50pmc)L/L之间的草甘膦抑制剂。 (3)检测将步骤(2)得到的发酵液5000rmp离心20min，过0.45um微孔滤膜， 反相高效液相色谱法检测莽草酸含量，得到莽草酸含量为0.843g，L—1，是未 添加草甘膦时的1.667倍。实施例5(O种子培养将乳糖发酵短杆菌接种到种子培养基，种子培养基的组 分和含量为种子培养基的组分和含量(g/L)为葡萄糖30，硫酸铵25，磷酸二氢钾1.2，硫酸镁0.6，尿素1.2，玉米浆25，用水定容至1L，调pH至 pH7.0， 1 15。C灭菌30min，装液量为25mL/250Ml。在30°C， 140rpm摇床中 培养18h。(2) 发酵培养将经种子培养得到的乳糖发酵短杆菌培养液按照5%的接种量接种到 pH7.0的发酵培养基中，发酵培养基组分和含量为其中发酵培养基组分和含 量为葡萄糖120g，硫酸铵35g，磷酸二氢钾1.2g，硫酸镁0.7g，玉米浆 24 g，碳酸钙40g，用水定容至1L，调pH至pH7.0， 115。C灭菌30 min。发 酵培养采用250ml三角瓶，装液量为25ml，于30°C ， 160rpm摇床中培养48h。 发酵至24小时时加入浓度为150pmoL/L之间的草甘膦抑制剂。(3) 检测将步骤(2)得到的发酵液5000rmp离心20min，过0.45ym微孔滤膜， 反相高效液相色谱法检测莽草酸含量，得到莽草酸含量为1.401g，L—1，是未 添加草甘膦时的2.769倍。实施例6(1)种子培养将乳糖发酵短杆菌接种到种子培养基，种子培养基的组分和含量为种子培养基的组分和含量为葡萄糖35 g，硫酸铵25 g，磷酸 二氢钾2.0g，硫酸镁1.0g，尿素2.0g，玉米浆30 g，用水定容至1L，调pH 至pH7.4， 1 15。C灭菌30 min，装液量为25mL/250Ml。在30。C， 130rpm摇 床中培养14h。(2) 发酵培养将经种子培养得到的乳糖发酵短杆菌培养液按照5%的接种量接种到 pH7.4的发酵培养基中，发酵培养基组分和含量为其中发酵培养基组分和含 量为葡萄糖160g，硫酸铵50g，磷酸二氢钾2.0g，硫酸镁1.0g，玉米浆 30g，碳酸钙50g，用水定容至1L，调pH至pH7.4， 115X:灭菌30 min。发酵 培养采用250ml三角瓶，装液量为25ml，于30。C， 130rpm摇床中培养48h。 发酵至26小时时加入浓度为200pmoL/L之间的草甘膦抑制剂。(3) 检测将步骤(2)得到的发酵液5000rmp离心20min，过0.45Pm微孔滤膜， 反相高效液相色谱法检测莽草酸含量，得到莽草酸含量为1.384g'L"，是未 添加草甘膦时的2.735倍。
权利要求
1. 一种提高发酵法生产莽草酸产量的方法，其特征在于，包括以下步骤1)种子培养将乳糖发酵短杆菌接种到pH7.0-pH7.4的种子培养基，在30℃，120-180rpm摇床中培养12-18h，得到乳糖发酵短杆菌培养液；其中种子培养基的组分和含量为葡萄糖25-35，硫酸铵15-25，磷酸二氢钾1.0-2.0，硫酸镁0.1-1.0，尿素0.5-2.0，玉米浆20-30，其余为水，以上含量单位为g/L，调pH至pH7.0-pH7.4，115℃灭菌30min；2)发酵培养将经种子培养得到的乳糖发酵短杆菌培养液接种到pH7.0-pH7.4的发酵培养基中，接种量5％，30℃，120-180rpm摇床中培养48-60h；发酵至16-30小时加入浓度为1-200μmoL/L之间的草甘膦抑制剂；其中发酵培养基组分和含量为葡萄糖100-160，硫酸铵30-50，磷酸二氢钾0.5-2.0，硫酸镁0.1-1.0，玉米浆20-30，碳酸钙30-50，其余为水，以上含量单位为g/L，调pH至pH7.0-pH7.4，115℃灭菌30min。
全文摘要
一种提高发酵法生产莽草酸产量的方法属生物化工领域。本发明步骤1)种子培养将乳糖发酵短杆菌接种到pH7.0-pH7.4的种子培养基，在30℃，120-180rpm摇床中培养12-18h；种子培养基(g/L)葡萄糖25-35，硫酸铵15-25，磷酸二氢钾1.0-2.0，硫酸镁0.1-1.0，尿素0.5-2.0，玉米浆20-30，其余为水调pH至pH7.0-pH7.4，115℃灭菌30min。2)发酵培养接种到pH7.0-pH7.4的发酵培养基中，接种量5％，30℃，120-180rpm摇床中培养48-60h；发酵至16-30小时加草甘膦抑制剂；发酵培养基(g/L)葡萄糖100-160，硫酸铵30-50，磷酸二氢钾0.5-2.0，硫酸镁0.1-1.0，玉米浆20-30，碳酸钙30-50，其余为水调pH至pH7.0-pH7.4，115℃灭菌30min。莽草酸产量达未添加草甘膦时的1.667-2.887倍，生产稳定可靠。
文档编号C12P7/42GK101245357SQ200810102888
公开日2008年8月20日 申请日期2008年3月28日 优先权日2008年3月28日
发明者艳 程, 袁其朋, 邓美飞 申请人:北京化工大学