专利名称：破骨细胞质子泵亚基a3的RNA干扰靶点及其应用的制作方法
技术领域：
本发明属于分子生物学与生物医药技术领域，涉及破骨细胞质子泵亚基 a3序列上用于RNA干扰的干扰耙点，以及针对这些耙点的以各种方式获得的 小干扰RNA分子以及其在制备治疗骨质疏松症的药物中的应用。
背景技术：
骨质疏松症是发病率高、死亡率高、保健费用消耗大的最常见的骨代谢疾 病。据估计，半数以上的妇女和大约三分之一的男性在其生存期内会发生骨质 疏松性骨折。骨折给人们的生活带来极大的痛苦，轻者使人们生活质量下降， 重者将导致瘫痪(如股骨骨折)并由此引发很多并发症甚至导致死亡。这些疾 病的产生与破骨细胞(Osteoclast)的过度活跃有关。破骨细胞与成骨细胞 (Osteoblast)是骨中的两类重要细胞，分别负责骨吸收与骨形成，两者之间的平 衡保证了成年动物及人类骨量的恒定；然而在破骨细胞的活性大于成骨细胞活 性的时候，破骨细胞对骨的吸收大于成骨细胞的骨形成作用，导致骨密度下降 最终出现骨质疏松，对于这些疾病的治疗必须抑制破骨细胞的活性。
破骨细胞V-ATP酶负责破骨细胞的细胞外酸化过程，使骨去矿化并为蛋 白酶降解骨有机成份提供酸性微环境。a3是破骨细胞V-ATP酶具有的特异亚 基，1996年该亚基被发明人首次发现并成功克隆，并于1999年发明人将a3 基因敲除，在小鼠中观察了该基因在破骨细胞骨吸收中的作用。结果表明，所 有的a3突变纯合体(-/-)小鼠生长迟缓，出现了长骨生长异常，骨建造及再 造缺失的骨质硬化，牙齿解体，出生后大约4周龄死亡；&3-/-小鼠缺乏骨髓腔， 骨生长面扩大，转化软骨区域延伸；&3-/-型小鼠的破骨细胞附着在骨上且数目 正常，但是不能形成骨吸收陷窝。体外培养的a3-A小鼠破骨细胞缺乏细胞外 酸化功能，不能使骨去矿化。这些结果表明a3基因是破骨细胞特异质子泵的 基本组成部分。因此，&3-/-小鼠出现的严重骨质硬化是由于破骨细胞失去了细胞外酸化功能。a3仅在破骨细胞中表达，a3 -/-小鼠肾的质子泵不受影响，说 明a3是破骨细胞专一表达的基因。因此，a3可以作为最有希望的药物靶点特 异抑制破骨细胞的活性。本发明设计和体外慢病毒表达a3-shRNA用于抑制破 骨细胞的骨吸收活性，以达到治疗骨质疏松等骨相关疾病的目的。
发明内容
本发明的一个目的在于提供破骨细胞质子泵亚基a3的mRNA干扰靶点， 针对该耙点设计人工序列，并将该序列在表达载体中进行表达获得小干扰 RNA分子，并构建重组慢病毒表达载体。因此本发明的目的也在于提供针对 a3的小干扰RNA分子，包含该小干扰RN A分子的表达载体以及由其转化的 慢病毒表达载体，此外，由表达载体表达产生的、作为小干扰RNA分子前体 的短发夹结构RNA分子也包含在本发明中。
本发明的另一目的在于提供a3的RN A干扰靶点在制备治疗骨质疏松药 物中的应用。
根据本发明的一方面，根据破骨细胞质子泵亚基a3mRNA序列，体外合 成抑制a3基因表达的可表达双链小干扰RNA (SiRNA)片段的DNA序列， 并克隆到短发夹结构RNA (ShRNA)的表达质粒上，表达并筛选对破骨细胞 吸收抑制作用较强的a3-SiRNA ，确定RNA干扰靶点序列，SEQ ID NO. 1~3 为针对a3的RNA干扰耙点序列，优选的RNA干扰耙点具有如SEQ ID NO. 2 所示的核苷酸序列。SEQ ID NO. 4~5为针对干扰靶点序列1的设计的用于表 达SiRNA的DNA序列，SEQ ID NO. 6~7是针对干扰耙点序列2设计的用于 表达SiRNA的DNA序列，SEQ ID NO. 8 9是针对干扰耙点序列3设计的用 于表达SiRNA的DNA序列，每对序列均为互补序列。具体序列见表1和表 2.
SiRNA分子为双链RNA分子， 一单链含有RNA耙点序列和在3'末端的 UU双核苷酸尾(如SEQ ID NO. IO所示)，另一单链为互补链，双核苷酸尾 UU同样位于3'末端。SiRNA进入细胞后直接干扰目标基因的表达。
4表1 a3 RNAi耙点序列序列号靶序列 序列长度位置(bp)
15，-AGAUGAAGGCAGUGUACCU-3，191056-1074
25 ， -GUAUCCUC AUUCACUUCAU-3'191977-1995
35，-ACGGACUGCUCAUGUUUCU-3'191389-1407
表2合成用于表达siRNA的DNA序列序列号序列碱基数 GC含量
5 ，-GATCCCCAGATGAAGGCAGTGTACCT
4TTCAAGAGAAGGTACACTGCCTTCATCT6443.8%
TTTTTGGAAA-3'
3 ，-GGGTCTACTTCCGTCACATGGAAAGT
TCTCTTCCATGTGACGGAAGTAGAAAAA6443.8%
ACCTTTTCGA-5'
5 ，-GATCCCCGTATCCTCATTCACTTCATTT
6CAAGAGAATGAAGTGAATGAGGATACTT6437.5%
TTTGGAAA-3，
3,-GGGCATAGGAGTAAGTGAAGTAAAGT
7TCTCTTACTTCACTTACTCCTATGAAAAA6437.5%
CCTTTTCGA-5'
5 ， -GATCCCC ACGGACTGCTC ATGTTTCTT
8TCAAGAGAAGAAACATGAGCAGTCCGT6443.8%
TTTTTGGAAA-3，
3 ，陽GGGTGCCTGACGAGTACAAAGAAAG
9TTCTCTTCTTTGTACTCGTCAGGCAAAA6443.8%
AACCTTTTCGA-5，本发明的RNA靶点序列SEQ ID NO.2为具有19nt长度，在形成SiRNA 分子后，3'端加上UU双核苷酸尾构成分别具有21bp的双链RNA而发挥功能。 本领域技术人员可以理解的是，增加或减少几个碱基的SiRNA序列在基因沉 默中可以具有同样的功能，例如21~23bp的SiRNA序列已被证明在其他基因 的沉默中具有同样功能(Nature 2001， (411):24, 494-98)。同样可以理解的是， 也可以设计更长的序列，通过在发挥功能时被剪切为短的RNA序列而发挥作 用。
体外合成的抑制a3基因表达的基因序列克隆到表达载体后，表达ShRNA， ShRNA含有干扰靶点序列、干扰靶点序列的反义序列、短发夹结构序列(序 列如SEQ ID NO. 11所示)。形成ShRNA序列的短发夹结构序列优选采用九个 碱基的loop环序列UUCAAGAGA，也可以用TTCG tetraloop ( Leukemia Research 30 (2006) 1013-1017)。短发夹结构RNA，通过表达载体表达产生， 发挥功能时需要细胞内Dicer酶切成siRNA分子干扰基因的表达，图1示出 了通过合成序列克隆到表达载体，产生ShRNA，再加工成具有功能的SiRNA 的过程。
根据本发明的另一方面，提供a3基因的RNA干扰耙点在制备骨质疏松药 物中的应用，慢病毒介导的小干扰RNA分子可抑制破骨细胞的骨吸收活性， 用于治疗骨质疏松等骨相关疾病。
实现本发明目的的技术手段为
第一，在体外合成抑制a3基因表达的双链SiRNA的DNA序列，并克隆 到shRNA表达质粒上；
第二，用细胞外酸化功能和骨片吸收功能的检测方法筛选对破骨细胞骨吸 收抑制作用较强的a3-SiRNA。
第三，通过破骨细胞功能实验阐明a3敲低后破骨细胞骨吸收能力缺陷的 机制。
(一)a3-SiRNA的合成 1. SiRNA设计
采用Dharmacon siDESIGN center (http:〃www.dharmacon.com)设计针对a3 mRNA的特异耙序列，选取特异性的靶序列3条，且靶序列与人的相应 靶序列90%相似。2、 单链SiRNA合成和纯化 由Invitrogen公司合成纯化
3、 双链SiRNA的制备和表达ShRNA克隆的构建
两条互补的单链SiRNA经加热后退火处理形成双链SiRNA，并将双链 siRNA克隆到表达ShRNA的质粒上。
(二)用细胞外酸化功能和骨片吸收功能的检测方法筛选对破骨细胞骨吸 收抑制作用较强的a3-SiRNA
体外筛选采用被广泛使用的细胞外酸化功能和骨片吸收功能的检测方法 正常的破骨细胞具有细胞外酸化和骨吸收功能，破骨细胞质子泵将细胞外酸化 后吖啶橙染色呈橘红色，被破骨细胞吸收后的骨片经甲苯胺兰染色后可以观察 到大量深蓝色的骨吸收陷窝。在原代培养的破骨细胞中分别加入各种表达 a3-shRNA的慢病毒，3 — 5天后吖啶橙染色观察细胞的细胞外酸化能力，及甲 苯胺兰染色观察骨片上的陷窝数目及形态；根据骨吸收陷窝数目和形态，选择 骨吸收抑制效果较好的a3-SiRNA用于破骨细胞其它的功能实验。
本发明所针对的药物靶点a3是由申请人首先发现和克隆的，它是破骨细 胞骨吸收功能的必须基因。虽然a3被公认为是治疗骨质疏松的很有前景的药 物靶点，但是至今还没有报道针对a3的破骨细胞抑制剂，所以本发明所选定 SiRNA靶序列的是新的针对a3的药物耙点，且与人的相应靶位置序列90%相
本发明利用的RNAi技术的出现已有近20年，但是利用RNAi技术得到 的实验结果往往发表在影响力很高的期刊上；这也说明了 RNAi在基础研究和 应用上的重要性。随着人们对RNAi原理的了解和其应用范围的扩大，这一技 术已经突破了基础研究的范围，向着应用迈进。疾病治疗领域的初期研究已经 显示，由病毒介导的ShRNA表达抑制致病基因的表达这一技术由于其自身的 优势必将成为药物设计的新的增长点。而慢病毒表达ShRNA本身较腺病毒和 逆转录病毒有很多优势，慢病毒可感染分裂或非分裂细胞及终末分化细胞，而 逆转录病毒只能感染分裂细胞，腺病毒可感染分裂或非分裂细胞。因此，相对 于传统的新药研制来说，慢病毒介导的RNAi技术有很多优点针对性强， 针对治病基因；特异性好；无需知道蛋白的三维结构；无需筛选大量的候选化 合物；它是利用哺乳动物自身的防御系统治疗疾病，至今没有发现副作用；作
7用时间长，它通过整合到细胞基因组中表达发挥作用，且机体有RNAi放大的机制。
本发明开创性的用慢病毒介导RNAi技术抑制疾病基因的表达，可以说具有很强的前瞻性，表达特异a3 ShRNA的慢病毒感染骨髓细胞的技术可有望运用于研制慢病毒型生物制剂以治疗骨质疏松。同时，本发明将为制药业提供全新的思路。
图1为pSUPER-SiRNA质粒的构建；示出了针对耙序列2的SiRNA分子和S h RNA分子形成后的结构图2为PLB-SiRNA载体的构建，将pSUPER-siRNA质粒上的Hl-SiRNA序列克隆到pLB质粒并取代U6启动子；
图3为含有SiRNA的表达载体PLB-SiRNA载体结构图4为逆转录病毒的包装；
图5为Wetem blotting检测Lenti-a3敲低的效率；
图6为检测a3敲低后对破骨细胞的分化和成熟的影响；
图7为检测a3敲低后对破骨细胞细胞外酸化和骨吸收的影响；
图8为检测a3敲低后对丝状肌动蛋白环形成的影响。
具体实施例方式
以下实施例将有助于本领域的普通技术人员进一步理解本发明，但不以任何形式限制本发明。
实施例中所使用各种培养基和试剂如无特别说明均为市售购买。
实施例一原代破骨细胞培养
参照Yang，S. and Li,Y.P. (2007) J.Bone Miner.Res.， 22， 45-54原代培养骨髓单个核细胞并诱导其分化为成熟破骨细胞。6-8周龄C57BL6小鼠，拉颈处死，常规消毒后，取其后肢股骨和胫骨放入冰预冷的含抗生素的RIMP-1640培液中。用剪刀和镊子将骨表面的血管结缔组织分离干净，冰预冷的含抗生素的RIMP-1640培液冲洗。剪刀剪去股骨和胫骨两端，用无菌注射器(lml)将骨髓细胞吹入冰预冷的含10%FBS的a-MEM培液中。注射器针头反复吸冲成单细胞悬液。4°C离心(1100rpmx6min)，用含M-CSF (10ng/ml)禾卩RANKL(10ng/ml) (R&D sysyems)的a-MEM+10%FBS培液重悬细胞。细胞以l-2xl05/孔接种于24孔板，以lxl06/孔接种于6孔板。细胞培养基为a-MEM+ 10% FBS + 10 ng/ml RANKL+10 ng/ml M-CSF。细胞在37。C、 5% C02条件下培养4—6天获的成熟的破骨细胞。
实施例二抗体准备
合成多肽a3 816CFYSGTGYKLSPFTFTVDSD 834偶联到KLH，免疫雄性新西兰大白兔获得抗a3的多克隆抗体，抗GAPDH的单克隆抗体购自cellsignaling公司。
实施例三筛选有效的SiRNA序列
米用Dharmacon siDESIGN center (http:〃www.dharmacon.com)设计小干扰siRNA，选三条特异的针对Atp6v0a3 mRNA的耙序列
a3siRNAl: 5，-AGATGAAGGCAGTGTACCT画3， (SEQ ID NO. 1);
a3siRNA2: 5，-CTCGGCGTTTCATCTGTGG-3， (SEQ ID NO. 2);
a3siRNA3: 5，-ACGGACTGCTCATGTTTCT-3' (SEQ ID NO. 3)。
阴性对照为特异针对LacZ基因mRNA的靶序列si-LacZ :5，-CTCGGCGTTTCATCTGTGG-3，。化学合成的短发夹结构的耙序列经退火复性后连接到pSUPER载体(OligoEngine)上Bglll/Hindlll位点之间。短发夹结构RNA (shRNA)敲低a3表达的效率检测是通过在人胚肾细胞系293T(HEK293T, ATCC No. CRL-11268 )中共表达质粒pFlag-CMV-4-a3 (Flag-a3 )和质粒pSUPER-siRNA完成的。艮口 用lipofectamine reagent (Invitrogen公司)将克隆有siRNA的shRNA表达质粒与Flag-a3质粒共转染HEK293T细胞，转染后48小时，收集细胞(裂解液50 mM Tris-HCl, pH 6.8, 100 mMdithiothreitol, 2% SDS, 0.001% bromphenol blue, 10% glycerol),进行蛋白印迹实验(western blotting)。实施例四包装逆转录病毒
第一天(9-10am): 293T细胞接种，每10cm培养皿接种2-2.5xl06 293T细胞；第二天(9-10am):转染，准备钙一磷酸沉淀(lml/10cm plate)Transfer vector (PLB， Addgene) - 20(igPackaging plasmid (dR8.2， Addgene) - 15|igEnvelope plasmid (vsvg， Addgene) - 6|ng力口2.5MCaCL2 50ul，力q ddH20到500jli1，混匀；加500jul2xHBS，吹打混匀；
室温孵育20分钟，将沉淀逐滴加到培养的细胞中，混匀；转染后6—8小时，换新鲜培液，6ml/plate;第四天(9-10am):收集病毒收集培养上清3000rpm/5min/RT离心
上清0.45pm过滤，分装，直接感染细胞或冻存于一8(TC实施例五逆转录病毒滴度测定
第1天(9-12am):在24孔板每个孔接种3x104 293T细胞，lml培液培养；第2天(4-6pm):计数一个孔的细胞(应该6 — 8x104)， 4一6倍系列稀释的病毒感染细胞，加4ing/nlpolybrene。第3天(9画12am):加lml培液;第5天观察细胞荧光蛋白表达，并用FACS分析表达荧光蛋白的细胞比例，并计算滴度。
实施例六逆转录病毒感染破骨细胞
骨髓单个核细胞在M-CSF (10ng/ml)和RANKL (10ng/ml)的存在下诱导48小时，然后在polybrene (4|ig/ml)的存在下用包装好的逆转录病毒感染8小时。换新鲜培液a-MEM+10% FBS+10 ng/ml RANKL +10 ng/ml M-CSF继续培养4一6天。收集破骨细胞蛋白(裂解液50 mM Tris-HCl， pH 6.8, 100mM dithiothreitol, 2% SDS， 0.001% bromphenol blue, 10% glycerol),进行蛋白印迹实验(western blotting)用于检测a3敲低的效率。
被病毒感染的细胞发绿色荧光，病毒感染后2天在荧光显微镜下观察发荧光的细胞，结果显示病毒感染后几乎所有细胞均发绿色荧光(图5)。
10Western-blotting蛋白印迹试验结果显示，与lenti-LacZ感染的破骨细胞的a3表达水平相比，Lenti-a3 (靶序列为a3siRNA2)感染破骨细胞后a3的表达显著降低86% (图5)。说明表达特异针对a3的shRNA的慢病毒感染破骨细胞后能显著抑制a3的蛋白表达水平。
实施例七TRAP染色
固定破骨细胞后用Sigma的TRAP活性染色试剂盒染色，前体破骨细胞盒成熟的破骨细胞(多于三个核)呈现深红色，并在光镜下计数。每组十个视野被计数，数据用均数±标准差表示(n=10)。
TRAP染色的结果显示与lenti-LacZ处理后的细胞相似，Lenti-a3处理后的细胞也能分化成熟为多核破骨细胞，且二者显示相似的多核破骨细胞数目和形成百分比(图6)。说明a3敲低后并不影响骨髓单个核细胞分化成熟为多个核的破骨细胞。
实施例八吖啶橙染色
骨髓单个核细胞被接种在24孔板，在M-CSF (10ng/ml)和RANKL(10ng/ml)的存在下诱导48小时，然后在polybrene (4略/ml)的存在下用包装好的逆转录病毒感染8小时，换新鲜培液a-MEM+10% FBS + 10 ng/mlRANKL +10 ng/ml M-CSF继续培养4天。破骨细胞在含5吗/m 1吖啶橙的a-MEM中37°C孵育15分钟，用a-MEM洗10 minutes,在荧光显微镜下观察细胞(激发光490nm和吸收光525 nm)。
吖啶橙染色结果显示与lenti-LacZ感染的破骨细胞相比，Lenti-a3感染的多核破骨细胞细胞橘红色染色明显减少，细胞外酸化明显受抑制(图7)。说明a3敲低后破骨细胞的细胞外酸化功能明显下降。
实施例九破骨细胞骨吸收功能分析
破骨细胞骨吸收活性的分析通过分析吸收陷窝的形成来完成。骨髓单个核细胞被接种在放置于96孔板孔里的象牙骨片上，在M-CSF (10ng/ml)和RANKL (10ng/ml)的存在下诱导48小时，然后在polybrene (4(ig/ml)的存在下用包装好的逆转录病毒感染8小时，换新鲜培液a-MEM+10% FBS+10ng/ml RANKL +10 ng/ml M-CSF继续培养6天。6天后骨片在1 M NH40H的溶液里超声出去细胞。无细胞的骨片经1% toluidine blue ( 1% sodium borate)染色1分钟。吸收陷窝呈深蓝色，并在光镜下观察，计数随机视野下吸收面积占总视野面积的百分比，每组计数三个视野，数据用均数士标准差表示(n二3)。骨吸收实验结果显示与lenti-LacZ感染的破骨细胞形成骨吸收陷窝(陷窝为深蓝色)面积占随机观察视野面积的百分数相比，Lenti-a3感染的多核破骨细胞在象牙骨片上形成的吸收陷窝面积占随机观察视野面积的百分数明显减少(*P<0.05,n=3)，且Lenti-a3感染的多核破骨细胞在象牙骨片上形成的吸收陷窝更浅(图8)。说明a3敲低后破骨细胞骨吸收功能明显下降。
实施例十细胞丝状肌动蛋白环染色
骨髓单个核细胞被接种在24孔板，在M-CSF (10ng/ml)禾Q RANKL(10ng/ml)的存在下诱导48小时，然后在polybrene (4|ag/ml)的存在下用包装好的逆转录病毒感染8小时，换新鲜培液a-MEM+10% FBS + 10 ng/mlRANKL +10 ng/ml M-CSF继续培养4天。细胞在3.7%多聚甲醛中固定10分钟；0.2% Triton X-100透膜处理10分钟；用1%山羊血清和3% BSA室温下封闭1小时；用2 U/ml rhodamine phalloidin (Molecular Probes)室温下孵育30分钟；1 pg/mlDAPI(Sigma)染核呈蓝色；细胞在荧光显微镜下观察。
细胞丝状肌动蛋白环染色结果显示与表达特异LacZ siRNA的成熟破骨细胞形成丝状肌动蛋白环相似，表达特异a3 siRNA的成熟破骨细胞也能形成规则的丝状肌动蛋白环。表明a3敲低不影响成熟破骨细胞骨丝状肌动蛋白环的形成。SEQUENCE LISTING <110>浙江赛尔生物医学研究有限公司 <120>破骨细胞质子泵亚基a3的RNA千扰靶点及其应用
〈130〉 ZJ188-08P103435
<160> 11
<170> Patentln version 3. 1
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<212> 腿
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<213〉 Artificial
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<221> misc_RNA
<222> (1)..(19)
<223>破骨细胞质子泵亚基a3的RNA干扰靶点
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misc一RNA (l).. (21) SiRNA单链
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<220> <221> 〈222〉 <223>
11
49 RNA
Artificial
misc—RNA (l).. (49) ShRNA
<400〉 11
guauccucau ucacuucauu ucaagagaau gaagugaaug aggauacuu 49
权利要求
1、一种破骨细胞质子泵亚基a3的RNA干扰靶点，其特征在于其具有如SEQID NO.2所示的核苷酸序列。
2、 一种小干扰RNA分子，其为双链分子，其中一单链含有权利要求l所示 RNA靶点序列和在3'末端的UU双核苷酸尾，另一单链为互补链。
3、 一种表达载体，其含有权利要求2的小干扰RNA分子。
4、 权利要求3所述的表达载体，其特征在于其具有图3所示结构。
5、 一种重组慢病毒载体，含有权利要求2的小干扰RNA分子。
6、 权利要求5所述的重组慢病毒载体，其特征在于所述慢病毒载体用权利 要求4所述的表达载体转化。
7、 权利要求l所述的破骨细胞质子泵亚基a3的RNA干扰革E点在制备治疗骨 质疏松药物中的应用。
8、 权利要求7所述的应用，其特征在于以权利要求5所述的慢病毒载体作 为破骨细胞吸收抑制剂。
9、 一种短发夹结构RNA分子，其至少含有权利要求1所述的RNA干扰耙点 序列、短发夹结构序列以及RNA干扰靶点序列的反义序列。
10、 权利要求9所述的短发夹结构RNA分子，其特征在于进一步在3'末端 具有UU双核苷酸尾。
全文摘要
本发明属于分子生物学与生物医药技术领域，涉及a3序列上用于RNA干扰的靶点，以及针对该靶点的以各种方式获得的siRNA用于制备治疗骨质疏松的新药物。本发明通过慢病毒感染破骨细胞并表达shRNA及体外基因敲低后破骨细胞功能检测的方法筛选了a3基因上3个RNA干扰的靶点，其中优选的一个靶点为2号靶点。针对2号靶点的siRNA能够明显抑制a3蛋白质的表达，并能稳定抑制破骨细胞的细胞外酸化和骨吸收的能力，但不影响成熟破骨细胞丝状肌动蛋白环的形成。依据这个靶序列可以制备生物药品以治疗骨质疏松。
文档编号C12N15/11GK101638653SQ200810145869
公开日2010年2月3日 申请日期2008年8月7日 优先权日2008年8月1日
发明者李亦平 申请人:浙江赛尔生物医学研究有限公司