专利名称：Z-l-丙氨酰-l-谷氨酰胺的酶合成方法
技术领域：
本发明涉及一种Z-L-丙氨酰-L-谷氨酰胺的酶合成方法，属于丙谷二肽合成技术。
背景技术：
谷氨酰胺(Gin)是一种条件必须氨基酸，也是人体血液循环中和机体内游离氨基酸池中 含量最丰富的氨基酸，约占游离氨基酸总量的60%。谷氨酰胺因分子中含氮丰富，可为体内 氨基酸、蛋白质、核酸的合成提供氮源，在机体蛋白代谢和氮的转运中占有十分重要的地位。 同时谷氨酰胺又是目前公认的具有特殊功能的免疫营养素之一，有减轻患者肠道受损程度、 降低高分解代谢、促进蛋白合成、提高免疫力、促进创面愈合等功能，因而谷氨酰胺在营养 支持中的作用受到人们普遍重视。
谷氨酰胺的诸多功能在肠外给养中受到很大限制，这是因为谷氨酰胺在水中溶解度低， 在水溶液中不稳定，加热灭菌时会生成有毒的焦谷氨酸和氨，所以商品复方氨基酸溶液中均 不含谷氨酰胺。目前临床上多采用含谷氨酰胺的二肽来实现谷氨酰胺的肠道给养。含谷氨酰 胺的二肽有两种， 一是丙氨酰-谷氨酰胺(Ala-Gln)，另一种是甘氨酰-谷氨酰胺(Gly-Gln)。 临床证明，Ala-Gln在水中溶解度为游离谷氨酰胺的20倍，不同pH下加热灭菌无有毒的焦 谷氨酸和氨生成。Ala-Gln进入机体后被各器官组织中的二肽酶分解成丙氨酸和谷氨酰胺，半 衰期仅为3.8min，并且仅有1~2%摄入量的Ala-Gln从尿液中排出，说明Ala-Gln被高效利用， 同时避免了二肽积累可能产生的损害，是一种安全有效的提供谷氨酰胺营养素的肠外药物。
目前丙氨酰-谷氨酰胺(简称丙谷二肽，Ala-Gln)主要采用化学方法合成制备，如
1. 专利"丙-谷二肽合成方法"(CN1164611C): N端保护的氨基酸与三苯基磷、六氯乙 垸在有机溶剂中反应生成活泼酯；活泼酯与谷氨酰胺在有机溶剂和无机碱水溶液的混合液中 进行反应，用无机酸酸化，然后脱去N端保护的混合基团。
2. 专利"N (2) -L-丙氨酰-L-谷氨酰胺二肽合成方法"(CN1302008C): N端保护的氨基 酸10mmo1，与三苯基氧磷、三光气在有机溶剂中反应形成活泼酯；活泼酯与谷氨酰胺在无机 碱水溶液中进行反应；用无机酸酸化，脱去N端保护基团。
3. 专利"一种丙氨酰谷氨酰胺二肽化合物的制备方法"(CN1680428A):将L-谷氨酰胺 加入到甲苯与水的混合液中，待冷却后，加氢氧化钠，使L-谷氨酰胺溶解。滴加由a-卤丙酰 卤、甲苯和氢氧化钠组成的溶液，调pH值，经反应后分开有机层。加氯化钠到分开有机层 后的溶液中，调pH值，再加浓盐酸调pH值、放置。经过滤析出晶体，晶体经干燥后与氨水
3进行反应，并控制温度与压力，然后冷却减压浓縮加水，滴加甲醇、放置，经过滤析出获得 L-丙氨酰-L-谷氨酰胺粗制品，再经提纯后得精制品。
4. 专利"一种L-丙氨酰-L-谷氨酰胺的制备方法"(CN1931873A):在縮合剂存在下，在 惰性溶剂中，将D-2-卤代丙酸和谷氨酰胺进行縮合反应，酸化，得到D-2-卤代丙酰谷氨酰胺； 将得到的D-2-卤代丙酰谷氨酰胺用氨水氨解反应得到L-丙氨酰-L-谷氨酰胺。
5. 专利"N(2)-L-丙氨酰-L-谷氨酰胺的制备方法"(CN101062938):包括前体酸钾制备、 混合酸酐制备、谷氨酰胺钠盐制备、N(2)-L-丙氨酰-L-谷氨酰胺的制备和精制几个步骤。
本发明提供一种酶法合成Z-L-丙氨酰-L-谷氨酰胺的方法，较之上述方法的优点在于反应 过程环境友好、条件温和，反应物系简单、副反应少，产物无消旋问题、易分离，所用酶制 剂廉价易得、生产成本低廉，且制备流程简便。
发明内容
本发明的目的是提供一种Z-L-丙氨酰-L-谷氨酰胺的酶合成方法，该方法具有合成条件温 和、环境友好，副产物少、无消旋，过程简单、成本低廉的优点。
本发明是通过以下技术方案加以实现的， 一种Z-L-丙氨酰-L-谷氨酰胺的酶合成方法，其 特征在于包括以下过程
1. 将谷氨酰胺(Gln)溶于质量浓度为0.1mol/L的氯化钾水溶液中，配制成浓度为 120 800mmol/L的谷氮酰胺溶液，按酶质量与谷氨酰胺质量比为1:10 1:20向该溶液中加入木 瓜蛋白酶、无花果蛋白酶、木瓜凝乳蛋白酶、菠萝蛋白酶或羧肽酶Y中的一种，再添加氢氧 化钠颗粒调节溶液pH为7.0~10.0，于温度35 60'C下电磁搅拌，并保温5-10min，制得谷氨 酰胺与酶的混合液。
2. 将Z-丙氨酸甲酯(Z-Ala-OMe)、 Z-丙氨酸乙酯(Z-Ala-OEt)或Z-丙氨酸节酯 (Z-Ala-OBz)中的一种溶于无水乙醇中，配制成浓度为800~1200mmol/L的溶液。
3. 将步骤2制备的溶液，按Z-丙氨酸甲酯或Z-丙氨酸乙酯或Z-丙氨酸苄酯与谷氨酰胺 的摩尔比为1:2 1:20，逐滴加入步骤1制备的混合液中，在温度30 60。C和系统pH值为 7.0 10.0下电磁搅拌，反应3 8小时，得到含有Z-L-丙氨酰-L-谷氨酰胺的溶液。
4. 将步骤3中反应后所得溶液在沸水浴中加热5 8min,经孔径为0.45~0.8pm的滤膜或 中速定性滤纸过滤，除去沉淀物，滤液于温度-50~ 4(TC下冷冻干燥或在加料流量 5 10mL'min—1，入口温度160 180。C下喷雾干燥，得到Z-L-丙氨酰-L-谷氨酰胺粉末。
本发明具有以下优点
1.采用蛋白酶合成Z-L-丙氨酰-L-谷氨酰胺，酶来源广泛，且对酶的纯度要求不高，故 制备成本低廉；2. 反应历程与体系组成简单，仅有一种副产物生成(Z-Ala-OH)，且反应条件温和，最 佳pH及最佳温度选择范围较广，并始终在水溶液中进行反应，无有毒试剂参与；
3. 采用酶法合成的二肽不会发生再次水解，产物采用反向色谱分析，方法简便、快捷， 短时内即可将体系中所有组分完全分离鉴定。
图1为实施例1中用于制备Z-L-丙氨酰-L-谷氨酰胺的物系在反应结束时的色谱图。 图2为图1色谱图中谱峰1对应物质的质谱图。 图3为图1色谱图中谱峰2对应物质的质谱图。 图4为图1色谱图中谱峰3对应物质的质谱图。 图5为图1色谱图中谱峰4对应物质的质谱图。
具体实施例方式
实施例1:
谷氨酰胺(Gln)1.5mmol溶于3mL0.1mol/L的氯化钾水溶液中，配制成浓度为500mmol/L 的谷氨酰胺溶液，加入0.015g木瓜蛋白酶(即酶与Gln的质量比为1:15)，用氢氧化钠调节 pH=10.0，于35。C下电磁搅拌，保温10min;将Z-丙氨酸甲酯(Z-Ala掘e) 0.15mmo1溶于 0.15mL无水乙醇，配制成浓度100Ommol/L的溶液；按体积比1:20 (即Z-Ala-OMe与Gln的 摩尔比为1:10)将Z-Ala-OMe的无水乙醇溶液0.15ml逐滴加入3mL的Gln与酶的混合液中， 体系温度始终保持35'C，氢氧化钠滴定使pH维持IO.O恒定，电磁搅拌反应6h;随后迅速置 于沸水浴中加热5min，再经孔径为0.45pm的膜过滤，除去沉淀物，滤液于-50'C冷冻干燥， 得到Z-L-丙氨酰-L-谷氨酰胺粉末；同时对滤液中各组分进行HPLC-MS检测鉴定，色谱条件 为C18色谱柱，紫外检测波长2Hnm，流动相为含0.1 %TFA的35%乙腈-水溶液，等度洗 脱，流速lmL/min;质谱条件为电喷雾离子化，正离子检测，鞘气流速35arb，喷雾电压 5kv，毛细管电压2.1kv，毛细管温度300'C，扫描范围m/z 50 500。检测结果如图1所示； Z-L-丙氨酰-L-谷氨酰胺的产率为33.6%。 实施例2:
谷氨酰胺(Gln)16mmo1溶于20mL O.lmol/L的氯化钾水溶液中，配制成浓度为80Ommol/L 的谷氨酰胺溶液，加入0.12g无花果蛋白酶(即酶与Gln的质量比为1:20)，用氢氧化钠调节 pH=8.0，于60。C下电磁搅拌，保温5min;将Z-丙氨酸乙酯(Z-Ala-OEt) 0.8mmo1溶于lmL 无水乙醇，配制成浓度800mmol/L的溶液；按体积比1:20 (即Z-Ala-OEt与Gln的摩尔比为 1:20)将Z-Ala-OEt的无水乙醇溶液lml逐滴加入20mL的Gln与酶的混合液中，体系温度始 终保持60'C，氢氧化钠滴定使pH维持8.0恒定，电磁搅拌反应8h;随后迅速置于沸水浴中
5加热8min，再经孔径为0.8pm的膜过滤，除去沉淀物，滤液于-4(TC冷冻干燥得到Z-L-丙氨 酰-L-谷氨酰胺粉末；同时对滤液中各组分进行HPLC-MS检测鉴定，色谱条件为C18色谱 柱，紫外检测波长214nm，流动相为含O.l %TFA的35%乙腈-水溶液，等度洗脱，流速lmL/min; 质谱条件为电喷雾离子化，正离子检测，鞘气流速35arb，喷雾电压5kv，毛细管电压2.1kv， 毛细管温度30(TC，扫描范围m/z50 500。 Z-L-丙氨酰-L-谷氨酰胺的产率为27.5% 。 实施例3
谷氨酰胺(Gln) 24mmo1溶于200mL O.lmol/L的氯化钾水溶液中，配制成浓度为 120mmol/L的谷氨酰胺溶液，加入0.35g菠萝蛋白酶(即酶与Gln的质量比为1:10)，用氢氧 化钠调节pf^7.0，于55"C下电磁搅拌，保温10min;将Z-丙氨酸苄酯(Z-Ala-OBz) 12mmo1 溶于10mL无水乙醇，配制成浓度1200mmol/L的溶液；按体积比1:20 (即Z-Ala-OEt与Gln 的摩尔比为l:2)将Z-Ala-OBz的无水乙醇溶液10ml逐滴加入200mL的Gln与酶的混合液中， 体系温度始终保持55'C，氢氧化钠滴定使pH维持7.0恒定，电磁搅拌反应3h;随后迅速置 于沸水浴中加热8min，再经中速定性滤纸过滤，除去沉淀物，滤液在加料流量5ml/min"， 入口温度180。C下喷雾干燥，得到Z-L-丙氨酰-L-谷氨酰胺粉末；同时对滤液中各组分进行 HPLC-MS检测鉴定，色谱条件为C18色谱柱，紫外检测波长214nm，流动相为含0.1XTFA 的35%乙腈-水溶液，等度洗脱，流速lmL/min;质谱条件为电喷雾离子化，正离子检测， 鞘气流速35arb，喷雾电压5kv，毛细管电压2.1kv，毛细管温度30(TC，扫描范围m/z 50 500。 Z-L-丙氨酰-L-谷氨酰胺的产率为23.3%。 实施例4
谷氨酰胺(Gln) 240mmo1溶于2000mL O.lmol/L的氯化钾水溶液中，配制成浓度为 120mmol/L的谷氨酰胺溶液，加入2.923g木瓜凝乳蛋白酶(即酶与Gln的质量比为1:12)， 用氢氧化钠调节pH^7.5，于40'C下电磁搅拌，保温8min;将Z-丙氨酸甲酯(Z-Ala-OMe) 120mmo1溶于100mL无水乙醇，配制成浓度1200mmol/L的溶液；按体积比1:20(即Z-Ala-OEt 与Gln的摩尔比为1:2)将Z-Ala-OMe的无水乙醇溶液100ml逐滴加入2000mL的Gln与酶 的混合液中，体系温度始终保持4(TC，氢氧化钠滴定使pH维持7.5恒定，电磁搅拌反应7h; 随后迅速置于沸水浴中加热8min，再经中速定性滤纸过滤，除去沉淀物，滤液在加料流量 10mL'min—1，入口温度16(TC下喷雾干燥，得到Z-L-丙氨酰-L-谷氨酰胺粉末；同时对滤液中 各组分进行HPLC-MS检测鉴定，色谱条件为C18色谱柱，紫外检测波长214nm，流动相 为含0.1XTFA的35X乙腈-水溶液，等度洗脱，流速lmL/min;质谱条件为电喷雾离子化， 正离子检测，鞘气流速35arb，喷雾电压5kv，毛细管电压2.1kv，毛细管温度30(TC，扫描范
围m/z 50-500。 Z-L-丙氨酰-L-谷氨酰胺的产率为24.6% 。
权利要求
1. 一种Z-L-丙氨酰-L-谷氨酰胺的酶合成方法，其特征在于包括以下过程(1)将谷氨酰胺溶于质量浓度为0.1mol/L的氯化钾水溶液中，配制成浓度为120～800mmol/L的谷氨酰胺溶液，按酶质量与谷氨酰胺质量比为1∶10～1∶20向该溶液中加入木瓜蛋白酶、无花果蛋白酶、木瓜凝乳蛋白酶、菠萝蛋白酶或羧肽酶Y中的一种，再添加氢氧化钠颗粒调节溶液pH为7.0～10.0，于温度35～60℃下电磁搅拌，并保温5～10min，制得谷氨酰胺与酶的混合液；(2)将Z-丙氨酸甲酯、Z-丙氨酸乙酯或Z-丙氨酸苄酯中的一种溶于无水乙醇中，配制成浓度为800～1200mmol/L的溶液；(3)将步骤(2)制备的溶液，按Z-丙氨酸甲酯或Z-丙氨酸乙酯或Z-丙氨酸苄酯与谷氨酰胺的摩尔比为1∶2～1∶20，逐滴加入步骤1制备的混合液中，在温度30～60℃和系统pH值为7.0～10.0下电磁搅拌，反应3～8小时，得到含有Z-L-丙氨酰-L-谷氨酰胺的溶液；(4)将步骤(3)中反应后所得溶液在沸水浴中加热5～8min，经孔径为0.45～0.8μm的滤膜或中速定性滤纸过滤，除去沉淀物，滤液于温度-50～-40℃下冷冻干燥或在加料流量5～10mL·min-1，入口温度160～180℃下喷雾干燥，得到Z-L-丙氨酰-L-谷氨酰胺的粉末。
全文摘要
本发明公开了一种Z-L-丙氨酰-L-谷氨酰胺的酶合成方法。该合成步骤包括分别配制一定浓度的谷氨酰胺的水溶液和Z-丙氨酸甲酯或Z-丙氨酸乙酯或Z-丙氨酸苄酯的乙醇溶液，将两溶液混合，以木瓜蛋白酶、无花果蛋白酶、木瓜凝乳蛋白酶、菠萝蛋白酶或羧肽酶Y中的一种为催化剂，在酶的最适条件下，恒温、恒pH反应一定时间，所得溶液沸水浴灭酶，过滤除去沉淀物，滤液经干燥后得到Z-L-丙氨酰-L-谷氨酰胺粉末。本发明提供的酶合成方法具有反应过程环境友好、条件温和，反应物系简单、副反应少，产物无消旋问题、易分离，所用酶制剂廉价易得、生产成本低廉，且制备流程简便等诸多优点。
文档编号C12P21/02GK101423857SQ200810153908
公开日2009年5月6日 申请日期2008年12月10日 优先权日2008年12月10日
发明者何志敏, 王梦凡, 苏荣欣, 崴 齐 申请人:天津大学