专利名称：通过添加铜离子来使植物转化效率提高的方法
技术领域：
本发明是关于通过土壤杆菌属细菌来高效地进行将基因导入到植物材 料中的方法。
背景技术：
根据土壤杆菌法的基因导入，是利用土壤杆菌机能的植物转化方法。土 ;裏细菌土i裏杆菌(Agrobacteriumtumefaciens)具有下列才几能感染植物时，使 作为与土壤杆菌病原性相关的Ti(tumor-inducing)质粒的一部分的T-DNA重 组到植物基因组中。根据土壤杆菌法的植物转化方法是下述方法制备将 Ti质粒的T-DNA结构域置换为希望向植物染色体组中导入的基因的转化用 质粒，使用制备成具有该转化用质粒代替了 Ti质粒的土壤杆菌，通过利用 土壤杆菌的上述机能，将希望向该植物染色体组中导入的基因导入到植物染 色体组中的方法。
由于认为土壤杆菌仅以双子叶植物为宿主，并不寄生在单子叶植物中， 当初，根据土壤杆菌法的植物转化法主要是作为双子叶植物转化法来发展 的。之后，进行了关于根据土壤杆菌法向单子叶植物进行基因导入的各种各 样的尝试，开发了具有强病原性土壤杆菌 一部分病原性基因的超级双元载体 (super binary vector),据报告，在使用该超级双元载体的方法中，在水稻、 玉米等单子叶植物中也稳定，可以效率比较高的进行转化(例如参考特许
第2, 649， 287号公报;特许第3， 329, 819号公报;Hiei,Y.,等，(1994),The Plant Journal, Vol.6,p.271-282;以及Ishida,Y.,等,(1996),Nature Biotechnology, Vol.4,p.745-750)。而且，报道了根据土壤杆菌法也在小麦、大麦以及高梁这 样的单子叶植物中转化的成功例子(例如参考Cheng, M.,等，(1997), Plant Physiol" Vol.115, p.971-980; Tingay，S"等,(1997),Plant J" Vol. 11,p. 1369-1376;以 及Zhao, Z-Y.,等,(2000),Plant Mol.Biol.， Vol.44， p.789-798),达到了在单子叶植物中也可广泛进行根据土壤杆菌法的转化。
根据土壤杆菌法的转化法， 一般的具有效率高，被导入的基因复制数
少，不用将叫做T-DNA的特定结构域片断化就可导入，因为通过短期培养 就可获得转化体所以培养变异少等很多优异的特征。因此，现在它作为在不 论双子叶还是单子叶的很多种类的植物中最有用的转化手段而广泛应用。
根据土壤杆菌法的转化方法，根据植物种类，受试材料、培养的培养基 的组成不同，但共同点是不管是哪种植物，都是使组织材料与土壤杆菌悬 浊液接触，在共存培养后，进行转化细胞的筛选，制备出转化植物。 一般地， 形成材料的植物组织，视需要进行灭菌处理，但除此之外没有特别的处理， 进行土壤杆菌的感染(例如参考Rogers,S，G.，等,(1988), Method for Plant Molecular Biology, p.423-436,CAAcademic Press Inc.;Visser，R.G.F., (1991), Plant Tissue Culture Manual, B5:l-9, Kluwer Academic Publishers; McCormick, S,, (1991), Plant Tissue Culture Manual, B6:l-9, Kluwer Academic Publishers;以 及Lindsey, K.，等(1991)， Plant Tissue Culture Ma画l， B7:l-13， Kluwer Academic Publishers)。
根据土壤杆菌法的转化在很多种类的植物中都有报道，但也存在其转化 效率随植物的种类、基因型以及形成材料的组织而有很大不同(例如参考 Potrykus, L，等，(1998), Agricultural Biotechnology, NY: Mercel Dekker Inc., p.ll9-159)的问题。在培育导入实用基因的品种时，制备出很多的转化植物 是必要的，通过一年而高效率地稳定地获得转化植物的技术开发是重要的。 还有，不依赖植物的种类或基因型的转化法，在高效率地培育实用品种方面 是极为有用的。而且，不依赖于形成材料的植物组织的转化法的开发，也在 高效率地促进转化方面是必要的。
开发象这样地使基因导入效率提高的方法、或者是基因导入困难的植物 种类或基因型也能进行转化的方法是重要的。到现在，为了获得效率良好的 转化植物，培养基组成的研究、标记基因或者启动子的改变、受试材料的研 究、受试材料处理方法的研究等各个侧面的很多技术都有报道。例如，在受 试材料的处理方法方面，报道了通过破坏组织结构来提高感染效率的方法， 还有，不破坏组织结构将植物组织离心处理(例如参考国际公开第02/12520 号小册子；特开2000-342256)、加热处理(例如参考特开2000-342255;特开2000-342253)的方法等。此外，本发明者们发现了将植物组织加压处理对 提高基因导入效率是有用的(结果还未发表)。
此外，特别是在单子叶植物中，还存在玉米在根据土壤杆菌法的转化中 的转化效率与水稻相比较低的问题。到目前，为了提高根据土壤杆菌法的玉 米转化中的转化效率，进行了各种各样的尝试(例如参考Negrotto,D.,等， (2000), Plant Cell Reports, Vol.l9,p.798-803;Zhao,Z-Y"等，(2001), Mol. Breed., Vol.8, p.323-333; Frame,B,R.，等，(2002)， Plant Physiol.，VoU29,p.13-22;以及 Ishida,Y"等，(2003), Plant Biotechnology，Vol.l4,p.57-66)。作为为了提高土壤 杆菌法的玉米转化效率的种种尝试，进行了在N6基本培养基中的转化细胞 筛选(例如参考Zhao,Z-Y.,等,(2001)， Mol.Breed., Vol,8，p.323-333)、在培养基 中添加硝酸银以及羧千西林(例如参考Zhao,Z-Y,等,(2001)， Mol.Breed.， Vol.8，p.323陽333;以及Ishida，Y"等,(2003),Plant Biotechnology，Vol.l4,p.57-66)、 在共存培养基中添加半胱氨酸(例如参考Frame,B.R.,等，(2002)， Plant Physiol.,Vol.l29,p.l3-22)等，但其效果还是较低。对于象玉米这样的，是主要 谷物而转化效率低的植物，不只是在制备实用转化植物的时候、而且在确认 新的基因效果的时候，也希望有转化效率更高的转化方法。
硫酸铜作为微量无机盐存在于植物组织培养的多种培养基中。通常，在
植物组织培养基中含有的硫酸铜的浓度是O.l)iM。近年来，有报道在单子
叶植物的组织培养以及转化试验中，通过在培养基中添加比通常高出50-
500倍或500倍以上的硫酸铜显示出种种效果。Ghaemi们(参考Ghaemi, M.，
等，(1994), Plant Cell,Tissue and Organ Culture,Vo1.36, p.355-359)报道，通过
将小麦的花药在含有10mg/l的硫酸铜和2.5~5mg/l的硝酸银的培养基中培
养，提高了胚状体(embryoid)的形成率。Zhang们(参考Zhang,S.,等，(W99),Plant
Cell Reports, VoU8,p.959-966)报道，通过将由完全成熟的大麦种子发芽的形
成的小苗在含有5pM硫酸铜和30g/l麦芽糖的培养基中培养，提高了苗条
分裂组织培养(shoot meristematic cultures:SMCs)的诱导率。认为麦芽糖在减
少褐变组织方面具有效果，硫酸铜在促进苗条分裂组织培养被诱导时的小苗
发育方面具有效果。此外，在通过将未成熟胚在含有硫酸铜的培养基中培养
而得的愈伤组织中，再分化率和每个愈伤组织的再分化植物数增大，这在大
麦(例如参考Dahleen， L.S.， (1995), Plant Cell,Tissue and Organ Culture, Vol. 43,p.267-269;以及Cho， M-J,等，(1998)， Plant Science, Vo1.138， p.229-244)和水 稻(例如参考Sah画at， A.K.和Chand, S., (1999), J. Plant Physiol" Vol. 154, p.517-522)中有报告。而且，用含有硫酸铜的培养基诱导的具有绿色再分化 能力的组织，被认为是适合作为转化材料(例如参考Visser， R.G.F., (1991), Plant Tissue Culture Manual, B5:l-9, Kluwer Academic Publishers; 以及 McCormick, S.， (1991)， Plant Tissue Culture Manual, B6:l-9， Kluwer Academic Publishers)。
Ishida们(参考Ishida,Y.，等,(2003)，Plant Biotechnology，Vol.l4，p.57-66)将接
种了土壤杆菌、进行了共存培养的玉米(品种是H99)未成熟胚，在含有1~ 100nM硫酸铜的培养基中培养，考察从未成熟胚形成的愈伤组织。用含有 1 ~ 10 p M硫酸铜的培养基，愈伤组织形成率提高，但其效果很微弱。
象上述那样通过在培养基中添加高浓度的硫酸铜，在单子叶植物的组织 培养中可见种种效果的情况有所报道。然而，添加含铜离子的金属盐对基因
导入效率以及/或转化效率带来的效果的调查报告，现在还没有。 专利文献l:特许第2，649,287号乂>净艮 专利文献2:特许第3,329,819号公报 专利文献3:国际公开第02/12520号小册子 专利文献4:特开2000-342256 专利文献5:特开2000-342255 专利文献6:特开2000-342253 专利文献7:美国专利第6,235,529号说明书 专利文献8:美国专利第6,541,257号说明书 专利文献9:国际公开第95/06722号小册子
非专利文献l: Hiei，Y.,等，(1994)， The Plant Journal, Vol.6， p.271-282. 非专利文献2: Ishida, Y.,等，(1996), Nature Biotechnology, Vol. 4， p.745-750.
非专利文献3: Cheng, M.,等，(1997), Plant Physiol.， Vol.115, p.971-980. 非专利文献4: Tingay, S"等，(1997), Plant J" Vol.11, p.1369-1376. 非专利文献5: Zhao， Z-Y.，等，(2000)， Plant Mol. Biol" Vol. 44, p.789-798. 非专利文献6: Rogers, S, G"等，(19S8), Method for Plant MolecularBiology, p.423-436, CA:Academic Press Inc.
非专利文献7: Vlsser，R.G.R，(1991),Plant Tissue Culture Manual,B5:l-9, Kluwer Academic Publishers.
非专利丈献8: McCormick,S.,(1991)， Plant Tissue Culture Manual,B6:I誦9， Kluwer Academic Publishers.
非专利文献9: Lindsey，K.，等(1991), Plant Tissue Culture Manual,B7:l-13， Kluwer Academic Publishers.
非专利文献10: Potrykus，I.，等,(1998),Agricultural Biotechnology, NY: Mercel Dekker Inc.,p. 119-159.
非专利文献11: Negrotto，D.，等,(2000),Plant Cell Reports, Vol. 19，p.798-803.
Zhao,Z-Y"等，(2001), Mol.Breed.， Vol.8，p.323-333. Frame,B.R.,等，(2002), Plant Physiol.,Vol.l29，p. 13-22. Ishida,Y.,等,(2003),Plant Biotechnology, VoU4,p.57-66. Ghaemi,M.，等,(1994)，Plant Cell,Tissue and Organ Culture,
非专利文献12: 非专利文献13: 非专利文献14: 非专利文献15: Vol.36,p.355-359.
非专利文献16: Zhang，S"等,(1999),Plant Cell Reports，Vol.l8,p.959-966.
非专利文献17: Dahleen,L.S"(1995), Plant Cell,Tissue and Organ Culture, Vol.43，p,267-269.
非专利文献18: Cho,M-J,等,(1998),Plant Science,Vol.l38,p.229-244.
非专利文献19: Sahrawat,A.K.和Chand,S.,(1999)，J.Plant Physiol., Vol.l54， p.517-522.
非专利文献20: Trick，H.N.和Finer,J丄,(1997)，Transgenic Research, Vol.6, p.329-336.
非专利文献21: Amoah，B.，等，(2001), Journal of Experimental Botany, Vol.52，p.ll35-1142.
非专利文献22: Hoekema,A,等,(1983),Nature，Vo1.303, p.179-180.
非专利文献23: Komari,T.和Kubo T.,(1999)， Methods of Genetic Transformation:Agrobacteriuni tumefaciens. In Vasil, I.K.(ed.)Molecular improvement of cereal crops.,Kluwer Academic Publishers,Dordrecht,p.43-82.
发明内容
发明所要解决的课题
本发明所要解决的课题在于，开发与现有的通过土壤杆菌属细菌向植物 中导入基因的方法中的植物基因导入效率相比，更高效率地进行基因导入的 方法。还有，开发与现有的通过土壤杆菌属细菌向植物中导入基因的方法中 的由植物受试组织的转化细胞增殖率相比，更高效率地进行转化细胞增殖的 方法。还有，本发明所要解决的课题在于开发使用前述方法制作出转化植物 的方法。
解决课题的手段
本发明者们为解决上述问题锐意研究努力的结果是，发现通过使用提高 了金属盐浓度的培养基以土壤杆菌属细菌向植物进行基因导入，与使用含有 通常浓度的金属盐的培养基时相比，获得稳定高效率的基因导入，以及由基 因导入的组织的稳定高效率的细胞增殖。而且，发现使用提高了金属盐浓度 的培养基进行基因导入，再加上在使土壤杆菌属细菌感染植物材料之前，进 行加热、离心处理的话，获得稳定更高效率的基因导入。此外，就基因导入 了的植物材料，进一步进行转化体的篩选，发现使用提高了金属盐浓度的培 养基进行基因导入了的植物材料，与使用含有通常浓度的金属盐的培养基时 相比，转化效率飞跃性地提高。
因此，本发明是关于下述方法，其包括
1) 将植物材料进行处理，
2) 使土壤杆菌感染植物材料，
通过土壤杆菌属细菌来进行将基因导入到植物材料中的方法，其特征在
于，在上述1)以及/或2)的工序中，使用提高了含铜离子的金属盐浓度的培 养基。
在本发明方法中，在培养基中高浓度添加的金属盐是含铜离子的金属 盐。在本发明中使用的优选金属盐是硫酸铜或葡糖酸铜，最优选疏酸铜。辟u 酸铜中包括无水盐以及含水盐，不限定于任何一种。
在本发明方法中，所说提高了金属盐浓度的培养基是指与作为本领域普 通技术人员熟知的N6基本培养基、MS(LS)基本培养基、B5基本培养基、NN基本培养基、NT基本培养基、Kao的基本培养基、White的基本培养基 等基本培养基中含有的金属盐的浓度相比，含有高浓度的金属盐的培养基。 所说高浓度是指，比该基本培养基中含有的金属盐浓度还要高。
具体地，各基本培养基的金属盐浓度例如CuS04 5H20浓度是N6基 本培养基中为0mg/1， MS(LS)基本培养基中为0.025 mg/1， B5基本培养基中 为0.025 mg/1， NN基本培养基中为0.025 mg/1， NT基本培养基中为0.025 mg/1, Kao的基本培养基中为0.025 mg/1, White的基本培养基中为0mg/1， 在以这些基本培养基为基础制备的培养基中，含有与该培养基中含有的硫酸 铜浓度相比更高浓度的硫酸铜时，该培养基就是提高了金属盐浓度的培养 基。
本发明中的所谓含铜离子的金属盐是指，在所例举的基本培养基中，一 般不含有具有铜离子的金属盐，或者是含有微量的铜离子的金属盐。
列举优选浓度的例子的话，硫酸铜以及葡糖酸铜是1 ~ 100 nM,优选1 -50 juM，更优选1 ~ IOmM。
在本发明的方法中，使用提高了金属盐浓度的培养基的工序是l)制备植 物材料的工序，以及/或2)使土壤杆菌感染植物材料的工序中的任何工序。 优选至少在2)使土壤杆菌感染植物材料的工序中使用提高了金属盐浓度的 培养基。更优选至少在2)使土壤杆菌感染植物材料的工序中包含，在共存培 养阶段使用提高了金属盐浓度的培养基。
在本发明的方法中，为了进一步提高基因导入效率，在制备植物材料的 工序1)、以及/或在使土壤杆菌感染植物材料的工序2)中，也可以还包括对 植物材料进行选自加压处理、热处理、离心处理、以及超声波处理的至少l 种处理。植物材料的加压处理是将该植物在液体培养基中以1.7 ~ 10atm进行 加压0.1秒~ 4小时，优选以2.4 ~ 8atm进4亍加压1秒~ 30分4t。才直物才才津牛 的热处理可以根据文献(特开2000-342255;以及特开2000-342253)所述的方 法将植物材料进行处理，例如在33 60。C加热5秒~24小时，优选在46°C 加热3分钟来进行。植物材料的离心处理，可以根据Hiei们的方法(国际公 开第02/12520号小册子；以及特开2000-342256)将植物材料进行处理，例如 以100G ~ 25万G离心1秒-4小时，优选以2万G离心10分钟来进4亍。 关于超声波处理，可以根据文献(例如Trick， H.N.和Finer, J丄，(1997),Transgenic Research, Vol.6, p.329-336; 以及Amoah, B.,等，(2001)， Journal of Experimental Botany, Vol.52, p.ll35-1142.)所述的方法来进行处理。
这些加压处理、热处理、离心处理、以及超声波处理可以任意进行l种， 或者也可以多种组合进行。
本发明的方法，在使土壤杆菌感染植物材料的工序2)之后，还可以包括 以下工序
3) 筛选转化细胞，
4) 根据期望，将筛选的转化体进行再分化。
此外，本发明的方法，在使土壤杆菌感染植物材料的工序2)之后，还可 以包括以下工序，而且在以下的至少1个工序中使用提高了含铜离子的金属 盐浓度的培养基
3) 筛选转化细胞，
4) 根据期望，将筛选的转化体进行再分化。'
本发明的基因导入方法，在提高基因导入效率的同时，提高转化效率， 其结果是可以高效地得到转化植物。因此，本发明是关于以使用本发明基因 导入方法为特征的转化植物的制造方法。
进一步，本发明者们就转化植物材料方面发现，通过使用提高了含铜离 子的金属盐浓度的培养基使转化体进行再分化，与使用通常浓度的含铜离子 的金属盐的培养基时相比，促进再分化植物的生长。
因此，本发明是关于下述方法，它是进一步包括
1) 制备植物材料，
2) 使土壤杆菌感染植物材料，
3) 筛选转化细胞，
4) 将筛选的转化体进行再分化，
以土壤杆菌属细菌来进行植物材料转化从而得到转化植物的制备方法， 其特征在于，在上述4)的工序中使用提高了含铜离子的金属盐浓度的培养 基。
此外，本发明是关于促进再分化植物生长的方法，其特征在于，在由脱
分化的植物细胞使植物体再分化的工序中，使用提高了含铜离子的金属盐浓
度的培养基。在这种情况下，脱分化的植物细胞，是不是转化细胞都可以，此外，如果是转牝细胞的情况下，是不是通过土壤杆菌法转化的都可以。
使用土^a杆菌属细菌进行的基因导入以及转化方法
使用土壤杆菌属细菌进行的基因导入， 一般地包括以下工序
a) 制备植物材料的工序；
b) 制备含有具有期望导入基因的载体的土壤杆菌属细菌的工序；
c) 使b)制备的土壤杆菌属细菌感染工程a)制备的植物材料的工序； 进一步，为了得到转化体，在上述工序c)之后也可以实施
d) 筛选转化细胞的工序；以及
e) 根据期望，将筛选的转化体进行再分化的工序。
具体地，在单子叶植物中，可以采用如文献(特许第2,649,287号公报) 所述的那样，特征在于，如下的方法上述a)工序中用含有植物生长激素(例 如2，4-D2,4-(二氯苯氧基乙酸))或者细胞分裂素等的培养基培养，将植物材料 弄成脱分化的状态或者在脱分化过程中的状态，在上述c)工序中，使土壤杆 菌感染植物材料；或者是采用如文献(特许第3,329,819号公报)所述的那样， 特征在于如下的方法以该植物的未成熟胚作为植物材料，在上述a)工序中 不对未成熟胚进行脱分化处理，在上述c)工序中用含有才直物生长激素(例如 2,4-D)或者细胞分裂素等的培养基培养。
关于工序a)
在本说明书中，供基因导入的"植物，，是单子叶植物以及双子叶植物都 包括。在单子叶植物中包括水稻、玉米、大麦、小麦、石刁柏(7 7,，力' 只)、高梁和其他，但并不限于这些。双子叶植物中包括烟草、大豆、马铃 薯、棉花、向日葵和其他，但并不限于这些。优选植物是单子叶植物，最优 选是玉米。
此外，所说"植物材料"非限定性的包括为以土壤杆菌法进行的转化而 提供的该植物的细胞、叶、根、茎、果实、及其他的任何部位的植物组织， 未成熟胚，愈伤组织或者不定胚样组织(以下在本说明书中称作愈伤组织等， 或者简称为愈伤组织)，或者整个植物体等植物所有的形态。
作为本发明方法中使用的植物形态，优选未成熟胚和愈伤组织，最优选未成熟胚。在本说明书中，所说的植物的细胞、组织、整个植物体采用的是 在本技术领域中一般采用的意义。在本说明书中，所谓的未成熟胚是受粉后 处于成熟过程的未成熟种子的胚。此外，供本发明方法所用的未成熟胚的阶 段(熟期)，没有特别的限制，在受粉后的任何时期采摘的都可以。最优选受 粉后2天以后的未成熟胚。后述的转化之后，以后述的方法，脱分化，优选 使用能够诱导具有再长生成正常个体能力的愈伤组织的未成熟胚胚盘。此 外，未成熟胚优选近亲交配、近亲交配之间的Fl、近亲交配与自然受粉品
种之间的F1、市售F1品种的未成熟胚。在本说明书中，所谓愈伤组织是指 无秩序增殖的未分化状态的细胞块。为了得到愈伤组织，可以将植物组织分 化的细胞置于含有植物生长激素(例如2,4-D)或者细胞分裂素等植物生长调 节物质的培养基(叫做脱分化培养基)中培养得到。该为得到愈伤组织而做的 处理叫做脱分化处理，该过程叫做脱分化过程。
在工序a)中，根据需要，将植物组织、未成熟胚等从植物体、种子等中 取出，制备成转化的适合材料。此外，根据期望，也可以将植物材料在用土 壤杆菌感染之前培养。
本发明中，在工序a)中的植物材料制备过程以及/或工序c)中的使土i裹 杆菌感染过程中，以使用提高了含铜离子的金属盐浓度的培养基为特征。此 外，在工序a)中的植物材料制备过程中也可以进行加压处理。
关于工序b)
4艮久以前就已知土壤细菌的土壤杆菌(Agrobacterium tumefaciens)引起S艮 多双子叶植物的冠瘿病(crown gall disease),在二十世纪70年代，发现Ti质 粒与病原性相关，而且作为Ti质粒的一部分的T-DNA纟皮重组到植物染色体 组。之后明白了该T-DNA上存在与合成诱发肿瘤所必要的荷尔蒙(细胞分裂 素和植物生长激素)相关的基因，尽管是细菌基因却在植物中发现了。在切 割T-DNA与向植物的传递中，在Ti质粒上的病毒结构域(vir结构域)中存在 的基因组是必要的，此外为了将T-DNA切出得到，T-DNA两端上存在的边 界序列(水-夕、、-配列)是必要的。作为其他的土壤杆菌属细菌的毛根土壤杆菌 (Agrobacterium rhizogenes)也具有根据Ri质粒的同样的系统(例如特开 2000-342256的图3和图4)。因为由于土壤杆菌的感染，T-DNA可以重组才直物染色体组中，因此在 T-DNA上插入期望的基因的话，期望能将该基因重组到植物染色体中。然而， 因为Ti质粒是190kb或190kb以上非常大，用标准的基因工程方法在质粒 上的T-DNA上插入基因是困难的。因此，开发了为在T-DNA上插入外源基 因的方法。
首先，制备了从胂瘤性Ti质粒的T-DNA上去除了荷尔蒙合成基因的解 除型菌系(disarmed strains) LBA4404 (参考Hoekema， A.，等，(1983)， Nature, Vol. 303,p.l79-180)、 C58Cl(pGV3850)、 GV3TillSE等。通过使用这些，开 发了2种方法将期望的基因导入到土壤杆菌的Ti质粒T-DNA中，或者将 具有期望基因的T-DNA导入到土壤杆菌中。其中的一种是进行容易的基因 操作就可能插入期望的基因方法，该方法通过三系杂交法(triparental mating),通过同源重组，将在大肠杆菌中能够复制的中间载体导入到土壤杆 菌的解除型Ti质粒的T-DNA结构域中，称作中间载体法。
还有一种是称作双元载体(binary vector)法，该法是基于在将T-DNA重 组到植物中时，需要有病毒(vir)结构域，但没有必要为了机能而存在于同一 质粒上。在该vir结构域中存在有virA、 virB、 virC、 virD、 virE以及virG, (植物生物技术事典(工乂夕7° ， 4 X抹式会社发行(1989)))，所谓vir结构域， 是指包含全部virA、 virB、 virC、 virD、 virE以及virG。因此，双元载体是 将T-DNA重组到可在土壤杆菌和大肠菌双方中复制的小质粒中的东西，将 其导入到具有解除型Ti质粒的土壤杆菌中来使用。
在向土壤杆菌导入双元载体时，可以通过电穿孔法和三系杂交法等公知 的方法进行。在双元载体中，有pBIN19、 pBI121、 pGA482等，以这些为基 础，构建了大量的新型双元载体用于转化。此外，在Ri质粒系统中，也构 建了同样的载体用于转化。
土壤杆菌A281是强病原性(super-virulent)菌系，其宿主范围广，转化效 率比其他菌系高。该特性是由于A281具有的Ti质粒的pTiBo542。 ^使用 pTiBo542到目前开发了 2种新系统。 一种是使用了具有pTiBo542解除型Ti 质粒的菌系EHA101以及EHA105,由于适用于上述双元载体系统，这些作 为转化能力高的系统而在各种植物的转化中被利用。
还有一种是超级双元载体("super-binary"vector)(参考Hiei, Y.,等，(1994)，The Plant Journal, Vol.6， p.271-282; Ishida， Y"等，(1996)， Nature Biotechnology, Vol.4, p.745-750 ; Komari, T.和Kubo T.,(1999), Methods of Genetic Transformation: Agrobacterium tumefaciens. In Vasil， I.K. (ed.) Molecular improvement of cereal crops" Kluwer Academic Publishers, Dordrecht, p,43-82; 以及国际公开第95/06722号小册子)系统(例如特开2000-342256的图4)。由 于该系统是由具有vir结构域(virA、 virB、 virC、 virD、 virE以及virG(以下 也将这些各叫做"vir片断结构域"))的解除型Ti质粒以及具有T-DNA的质 粒组成，因此是双元载体系统的一种。但在使用超级双元载体这点上是不同 的，超级双元载体是在具有T-DNA的端的质粒上，即在双元载体上，重组 了基本上去除了 vir片断结构域中至少一种vir片断结构域的vir结构域片断 (其中优选至少含有virB或virG的片断，更优选含有virB和virG的片断)。 此外，在具有超级双元载体的土壤杆菌中导入重组了期望基因的T-DNA结 构域时，通过三系杂交法的同源重组可作为容易的手法来利用。
在本发明方法中，作为成为宿主的的土壤杆菌属细菌，没有特別的限制， 可以优选使用土 i裏杆菌(Agrobacterium tumefaciens)(例如上述的土 i裏杆菌 LBA4404(参考Hoekema, A,等，(1983)， Nature, Vol. 303, p.l79-180)以及 EHAIOI。
根据本发明的方法，只要是基于土壤杆菌属细菌中病原性(vir)结构域的 基因组的表达的基因导入系，可以没有特别的限制就得到有意义的效果。因 此，对于上述的中间载体、双元载体、强病原性双元载体、超级双元载体等 中的任何载体系统都可以使用，可以取得本发明的效果。在使用将这些载体 改变的不同载体系统时，也是同样的(例如将土壤杆菌属细菌vir结构域的一 部分或者全部切除，然后重组到质粒中，将vir结构域的一部分或者全部切 除，作为新的质粒的一部分导入到土壤杆菌中等)。此外，根据本发明的方 法，在野生型的土壤杆菌属细菌中，也可以提高野生型T-DNA结构域向植 物的导入效率，事实上提高感染效率。
期望向植物中导入的基因可以基于以下适当的选择标准来选择可以通 过常规方法重组到上述质粒的T-DNA结构域中的限制酶部位中，对在该质 粒上同时或者是以别的途径重组的卡那霉素、巴龙霉素等药物具有耐药性的 基因等。由于体积大，具有多数限制部位的，以通常亚克隆手法将期望的DNA导入到T-DNA结构域内不是都容易。在这样的情况下，可以通过三系 杂交法，利用土壤杆菌属细菌细胞内的同源重组，将目的DNA导入。尽管 没有限定，但被导入的基因的大小优选是大约lOObp-200kbp。
此外，将质粒导入到Agrobactorium tumefaciens等土壤杆菌属细菌中的 操作可以通过现有方法进行，举例的话包括上述的三系杂交法和电穿孔法、 电子注射法、PEG等化学处理的方法。
要导入到植物中的基因，与现有技术一样，基本上是配置在T-DNA的 左右边界序列之间的。然而，因为质粒是环状的，边界序列的数可以是l， 在要将多个的基因配置在不同部位上时，边界序列也可以是3个或3个以上。
此外，在土壤杆菌属细菌中，可以配置在Ti和Ri质粒上，或者也可以配置 在其他质粒上。甚至，也可以配置在多种类的质粒上。
关于工序c)
通过土壤杆菌属细菌进行基因导入的方法，可以通过使植物材料与土壤 杆菌属细菌单独的接触来进行。例如，可以通过制备大约106~ 10"细胞/ml 程度的细胞浓度的土壤杆菌属细菌悬浊液，将植物材料在该悬浊液中浸渍 3-10分钟左右，在固体培养基上进行数日的共存培养来进行。
优选在使土壤杆菌感染植物材料的同时，或者感染之后除去土i裏杆菌之 前，将植物材料与土壤杆菌共存培养。在共存培养中使用公知的培养基。例 如，在实施例中使用的LS-AS培养基、nN6-As培养基、或者其他、N6S3-AS 培养基、2N6-AS培养基(参考Hiei，Y.,等，(1994),The Plant Journal, Vol.6，p.271 -282)等培养基是已知的。
在本发明中，在使土壤杆菌感染植物材料的工序c)之前或者进行中时， 也可以对植物材料进行选自以下的至少一种处理加压处理、热处理、离心 处理、以及超声波处理。已知这些处理在通过土壤杆菌属细菌向植物材料导 入基因的方法中也会提高基因的导入效率。例如，关于离心处理，在文献(例 如国际公开第02/12520号小册子；以及特开2000-342256)中被记载，优选以 100G-25万G、进行离心1秒~4小时。关于热处理，在文献(例如特开 2000-342255)中被记载，优选在33°C ~ 60。C的温度范围内，进行热处理5秒-24小时。进 一 步，关于超声波处理，在文献(例如Trick,H.N.和Finer,J丄，(1997),Transgenic Research, Vol.6， p.329-336 ; 以及Amoah,B., 等,(2001), Journal of Experimental Botany, Vol.52, p.ll35-1142)中4皮记载。
这些加压、加热、离心、以及超声波处理，可以进行任意l种，也可以 多种组合来进行。例如Rogers,S,G"等,(1988),Method for Plant Molecular Biology, p.423-436,CA:Academic Press Inc.记载了关于将热处理和离心处理 组合来进行。
关于工序d)以及e)
进一步根据期望，为了得到转化体，在上述工序c)之后，必需进行
d) 筛选转化细胞的工序；以及
e) 根据期望，将筛选的转化体进行再分化的工序
即， 一般地，为了进行植物的转化，在将外源基因导入到植物细胞后，筛选 外源基因稳定地重组到染色体上的植物细胞是必要的。
在本发明中，在工序d)中的筛选转化细胞的工序，以及/或在工序e)中 的根据期望将筛选的转化体进行再分化的工序中，也可以使用提高了含铜离 子的金属盐浓度的培养基。
筛选被转化细胞的工序是指,通过表型的数据以及/或者物理数据，筛选 具有目的性状的细胞。
表型的数据例如转化效率可以通过进行以下评价来得到与期望导入到 植物中的基因一起，导入标记基因以及/和选择标记基因，评价其表达。作为 标记基因以及/和选择标记基因，可以使用例如GUS( |3 -葡糖醛酸酶)基因， 以及/或耐抗生素基因(例如耐PPT(7才,74乂7，^f少乂)基因，耐卡那霉 素基因)等。作为标记基因使用GUS时，转化的评价可以通过由X-gulc(5-溴-4-氯-3-吲咮基-(3-D-葡糖醛酸)的GUS的切割而伴随的显色来评价。作为 选择标记基因使用耐抗生素基因时，在转化后，可以由在加有抗生素的选择 培养基上生长的情况来评价。
进一步，为了确认外源基因稳定地重组到染色体上，也可以得到 等的DNA印迹物理数据。此外，也可以进行向有性生殖后代的传递的工序、 以及基于向后代基团的遗传性以及分子性分析的选择的工序。
也可以根据期望进行篩选的转化体的再分化，培育再分化个体，然后得到完整的植物体。在由筛选的转化细胞再生长成完整的植物体中，可以根据
公知的方法(例如Hiei,Y.,等,(1994),The Plant Journal, Vol.6, p.271-282;以及 Ishida,Y.，等，(1996), Nature Biotechnology,Vol.4,p.745画750)进行。
本发明方法，与使用含有通常浓度金属盐的培养基的情况相比较，提高 了基因导入效率以及/或转化效率，以及/或促进再分化植物的生长。基因导 入效率可以通过例如评价导入到基因的暂时性表达(一過的発現)范围来进 行评价。在后面的实施例中，将未成熟胚的胚盘中的GUS基因的暂时性表 达评价为l(分散地看到点状的表达)~ 5(整个胚盘均见表达)的5个阶段指数。 或者，在全体的表达量较低的情况下，也可以通过数所有的点数来评价。
转化效率可以通过例如将由接种的未成熟胚得到的再分化植物中显示 了 GUS基因表达的作为转化体来计数，以接种的未成熟胚的数除其总数来 算出。或者也可以通过将再分化植物中对于筛选压力显示出抵抗性的作为转 化体来计数，以接种的未成熟胚的数除其总数来算出。
再分化植物的生长促进可以通过例如在使用含有通常浓度金属盐的培 养基的情况与使用提高了金属盐浓度的培养基的情况时，比较其再分化植物 的叶长、叶面积、以^/或重量来评价。
以下通过实施例具体地说明本发明，但本发明不被这些实施例所限制。 本领域普通技术人员基于本说明书的描述可以容易的在本发明上追加修饰、 变更，这些也包含在本发明的技术范围内。
附图的简单说明
图1为显示通过向共存培养基中添加硫酸铜，对玉米(A188)的GUS基 因的暂时性表达方面带来的效果图。纵轴是将显示出GUS基因暂时性表达 的部位的范围进行数值化了的值，在O(没有表达)~ 4(几乎全部的胚盘都表达) 的范围内进行数值化。图的横轴中显示的"Cu x"(此处，x表示数字)，是 表示共存培养基中的硫酸铜浓度是x juM。
图2为显示对共存培养后玉米(H99)的愈伤组织形成方面，共存培养基 中的硫酸铜浓度带来的效果图。在图的横轴中的"Agx"以及"Cux，，(此处， x表示数字)，是分别表示共存培养基中硝酸银以及硫酸铜的浓度是x pM。
图3为显示对共存培养后玉米(A188)的抗:7才只74乂7，4、〉>(PPT)的愈伤组织形成方面，共存培养基中的硫酸铜浓度带来的效果图。纵 轴是将愈伤组织形成进行数值化了的值，在O(没有愈伤组织形成)~ 3(整个胚
盘都愈伤组织化)阶段进行数值化。图的横轴中显示的"Cu x"(此处，x表 示数字)，是表示共存培养基中的硫酸铜浓度是x nM。
图4为显示通过向共存培养基中添加硫酸铜，对水稻(IR64)的GUS基因 的暂时性表达方面带来的效果图。纵轴是将显示出GUS基因暂时性表达的 部位的范围进行数值化了的值，在0(没有表达) 4(几乎整个胚盘都表达)范 围内进行数值化。图的横轴中显示的"Cu5"是表示共存培养基中的硫酸铜 浓度是5 jLJ M。
图5为显示通过向共存培养基中添加葡糖酸铜，对玉米(A188)的GUS 基因的暂时性表达方面带来的效果图。纵轴是将显示出GUS基因暂时性表 达的部位的范围进行数值化了的值，在O(没有表达)~ 4(几乎整个胚盘都有表 达)内进行数值化。
图6为显示通过向共存培养基中添加葡糖酸铜，对玉米(A188)形成愈伤 组织方面带来的效果图。纵轴是将愈伤组织形成进行数值化了的值，在O(没 有愈伤组织形成)~ 3(胚盘全部都愈伤组织化)的阶段进行数值化。
图7为显示通过向共存培养基中添加葡糖酸铜，对水稻"雪光，，品种的 未成熟胚的增殖方面带来的效果图。纵轴是愈伤组织化的未成熟胚的重量， 为每1个未成熟胚的平均值。横轴的实验l、 2、 3是显示各自独立进行的实 验。cont.表示不含硫酸铜或葡糖酸铜的对照、Cu表示硫酸铜、CG表示葡糖 酸铜。Cu以及CG后面的数值表示各自共存培养基中的浓度(M M)。
图8为显示通过向再分化培养基中添加硫酸铜或者葡糖酸铜，对从玉米 (A188)转化愈伤组织再分化生长成转化植物方面带来的效果图。纵轴是再分 化植物的叶长平均值。横轴cont.表示不含硫酸铜或葡糖酸铜的对照、Cu表 示硫酸铜、CG表示葡糖酸铜。硫酸铜以及葡糖酸铜在各自共存培养基中的 浓度中以10pM添加。
图9为显示通过向再分化培养基中添加硫酸铜或者葡糖酸铜，对从水稻 "雪光"品种转化愈伤组织再分化生长成转化植物方面带来的效果图。纵轴 是再分化植物的叶长平均值。横轴cont.表示不含硫酸铜或葡糖酸铜的对照、 Cu表示硫酸铜、CG表示葡糖酸铜。硫酸铜以及葡糖酸铜在各自共存培养基中的浓度中以10juM添加。 实施例
实施例1向共存培养基中添加硫酸铜对玉米的转化带来的效果 才才泮牛禾。方法
无菌方式摘取受粉后第7天-第14天的玉米(品种A188、 H99)的未成 熟胚(大小为1.0 1.5mm)，用LS-inf液体培养基(LS无机盐、0.5mg/L烟酸、 0.5mg/L盐酸吡哆醇、lmg/L盐酸硫胺素、100mg/L肌醇、lg/L酪蛋白水解 物、1.5mg/L2,4-D、 68.5g/L蔗糖、36g/L葡萄糖、pH5.2;参考Ishida，Y.,等， (1996), Nature Biotechnology,Vol.4，p.745-750)洗净1次。在一部分的未成熟 胚中进行为了提高基因导入效率的前处理(46。C、 3分钟的热处理以及 15，000rpm、 IO分钟的离心处理)。在含有lOOpM乙酰丁香酚(7七卜少卩> :3、、乂)的LS-inf液体培养基中，混悬入大约1.0 x 109cfo/mL的Agrobacterium tumefaciens LBA4404(pSB131)(具有在T-DNA结构域中以菜花花叶病毒35S 启动子驱使的PPT(7才只:74乂久，4* 7)耐性基因，以及在菜花花叶病 毒35S启动子上结合有蓖麻过氧化氢酶内含子的GUS基因；参考Ishida，Y., 等,(1996), Nature Biotechnology，Vol.4,p.745-750)作为接种源。向摘取、洗净 的未成熟胚以及热、离心处理的未成熟胚中加入接种源，搅拌30秒后，于 室温静置5分钟。在含有5pM的AgN03的LS-AS培养基(LS无机盐、0.5mg/L 烟酸、0.5mg/L盐酸吡口多醇、lmg/L盐酸石克胺素、100mg/L肌醇、700mg/LL-脯氨酸、1.5mg/L2,4-D、 20g/L蔗糖、10g/L葡萄糖、500mg/LMES、 100(iM 乙酰丁香酚、8g/L琼脂、pH5.8;参考Ishida,Y.,等,(1996), Nature Biotechnology, Vol. 4, p.745-750，固化剂是8g/L琼月旨)中添加了 0 - 10|iM浓度CuS04.5H20 的共存培养基中，使接种了土壤杆菌的未成熟胚胚盘朝上地接种。
于25。C黑暗下培养3天后，将一部分的未成熟胚于含有0.1 %的Triton X-100的0.1M磷酸緩冲液(pH6.8)中浸渍，37。C静止1小时。用磷酸緩冲液 除去土壤杆菌后，添加含有l.OmM 5-溴-4-氯-3-口引咮基-(3-D-葡糖醛酸(X-gluc)
以及20%曱醇的磷酸緩沖液。于37。C处理24小时后，于显孩i镜下观察，考 察呈蓝色的组织的范围。
将在共存培养基上培养3天的未成熟胚于LSD1.5培养基(LS无机盐、L盐酸硫胺素、100mg/L肌醇 700mg/L L-脯氨酸、1.5mg/L2,4-D、 20g/L蔗糖、500mg/LMES、 8g/L琼脂、 pH5.8;参考Ishida,Y.，等,(1996), Nature Biotechnology,Vol.4,p.745-750)上接种，
于25。C黑暗下培养大约4周后，测定增殖的愈伤组织的直径。另外，将在共 存培养基上培养了7天的未成熟胚在含有5mg/L的:7才X:7 4 乂 7 ， O > (PPT)的LSD1.5培养基上接种，于25。C黑暗下培养1周后，于显微镜下观察， 考察愈伤组织形成的程度。进一步，将这些愈伤组织在含有10mg/L PPT的 同样培养基中，以同样的条件培养6周。将增殖的抗PPT的愈伤组织在LSZ 再分化培养基(从LSD1.5培养基中除去2,4-D,添加5mg/L玉米素)上接种， 于25。C照明下培养2 3周。切取再分化的植物叶片，通过X-gluc考察GUS 基因表达。 结果
将在各种培养基中培养了 3天的未成熟胚(品种A188)通过X-gluc染色， 将显示GUS基因的暂时性表达的部位(呈蓝色的部位)的范围以O(没有表 达)~ 4(几乎全部胚盘都有表达)5个阶段来评价。
在含有1、 5以及10pM的硫酸铜的共存培养基上培养了 3天的未成熟 胚，与在对照培养基上培养的未成熟胚相比，在胚盘的大部分范围内显示出 GUS基因的一过性发现。认为由于在共存培养基中添加硫酸铜而显示GUS 基因的一过性发现的范围的增大是与有没有热、离心的前处理无关(图1)。 由这些可知，通过在共存培养基中添加硫酸铜可提高基因导入效率。
将在各种培养基中培养了 3天的未成熟胚(品种H99)在不含选择压力的 培养基上培养大约4周后，考察形成的愈伤组织的直径。在含有5pM硝酸 银的共存培养基中培养的未成熟胚，显示与在对照培养基中培养的几乎同样 的愈伤组织增殖。与此相对比的，在添加了 10pM硫酸酮以及5|_iM硝酸银 的共存培养基中培养的未成熟胚显示，直径的平均值比在对照共存培养基中 培养的未成熟胚的大2mm或2mm以上，通过添加硫酸铜促进愈伤组织的增 殖(图2)。
在共存培养i周后，将在含有PPT的选择培养基中培养了 1周的未成熟 胚(品种A188)以0(没有愈伤组织形成)-3(胚盘全部都愈伤组织化)4个阶段 来评价增殖的愈伤组织。在添加了硫酸铜的培养基中培养的未成熟胚，与在对照培养基中培养的未成熟胚相比，显示高的愈伤组织形成，可知通过添加 硫酸铜可提高转化愈伤组织形成的效率(图3)。进一步，通过将在含有PPT
的培养基中进行选择得到的愈伤组织，在含有PPT的再分化培养基中培养， 得到抗PPT性植物。切取这些植物的叶片，研究GUS基因的表达。其结果 为，在含有5以及10pM硫酸酮的共存培养基中培养的未成熟胚中，与在不 含硫酸铜的共存培养基中培养的未成熟胚相比较，显示2-3倍高的转化效 率。
_表l在共存培养基中添加硫酸铜对转化效率带来的效果_
CuS04 接种的未成熟胚数再分化植 GUS阳性植物数 转化效率
丄M)_^}_^__(B/A,%)
0 13 2 2 15.4
1 13 2 2 15.4 5 13 6 6 46.2 10 14 6 5 35.7
如上所示，向共存培养基中添加硫酸铜，具有提高通过土壤杆菌法的基 因导入效率、促进愈伤组织形成以及增殖、提高转化效率的效果。
实施例2 向共存培养基中添加硫酸铜对向水稻导入基因带来的效果 材料及方法
将在含有50mg/L潮霉素(乂、 4 / 口 7 ^ 、〉 >)和50mg/L壮观霉素(X 、 夕f 乂 t <少7)的AB培养基(3g/L KH2P04、 lg/L NaH2P04、 lg/L NH4C1、 300 mg/LMgS04.7H20、 150 mg/LKCl、 10 mg/L CaCl2、 2.5 mg/LFeS04.7H20、 5g/L葡萄糖、15g/L琼脂、pH7.0;参考Chilton,M.-D.,等，(1974), Proc.Natl.Acad.Sci. U.S.A.，71: 3672-3676)上培养了 3 ~ ^天的Agrobacterium tumefaciens超级双元载体LBA4404(pSB134)(具有在T-DNA结构域上结合 有玉米泛激素启动子驱使的泛激素(工匕'《千乂)内含子的HPT基因(潮霉素 耐性基因)，以及具有结合了以菜花花叶病毒35S启动子驱使的蓖麻过氧化 氬酶内含子的GUS基因；pSB134的制备是在pKY205(参考WO 03/027290)上，通过将作为表达标记的由pSB32得来的35S-intron GUS-nos片断插入到 HindIII部位中来进行的)以白金接种环挑取，混悬于含有lOOpM乙酰丁香酚 的大约109cfU/ml浓度的AA1液体培养基(AA主要无机盐、LS微量无机盐、 MS维生素、AA氨基酸、0.2g/L酪蛋白水解物、4g/L蔗糖、2g/L葡萄糖， pH5.2) lml中。向放入了无菌摘取的未成熟胚(品种IR64)的埃彭道夫管中加 入土壤杆菌悬浊液lml,用旋涡混合器搅拌30秒后，于室温静置5分钟。 将未成熟胚在nN6-As培养基(N6无机盐、N6维生素、0.5g/L酪蛋白水解物、 0.5g/LL-脯氨酸、lmg/L2,4-D、 0.5 mg/L NAA、 0.1mg/L6BA、 20g/L蔗糖、 10g/L葡萄糖、10pM AgN03、 lOO(iM乙酰丁香酚、8g/L琼脂糖、pH5.2)以 及含有5pM的CuS04.5H20的nN6-As培养基上接种，于黑暗下在25。C培 养1周。 结果
将共存培养后的未成熟胚通过X-gluc染色，将显示GUS基因的一过性 发现的部位(呈蓝色的部位)的范围以O(没有表达)-4(几乎全部胚盘都有表 达)5个阶段来评价。
在含有5pM的硫酸铜的共存培养基中培养了 l周的未成熟胚，与在对 照培养基上培养的未成熟胚相比，在胚盘的大部分范围内显示出GUS基因
的一过性发现(图4)。由这些可知，通过向共存培养基中添加硫酸铜提高基 因导入效率，不仅是在玉米中而且在水稻中也可见。
实施例3 向共存培养基中添加葡糖酸铜对向玉米导入基因带来的影响 材料及方法
无菌方式摘取受粉后第7天-第14天的玉米(品种A188)的未成熟胚 大小1.0 1.5mm,用LS-inf液体培养基洗净1次。进行为了提高基因导入 效率的前处理(46。C、 3分钟的热处理以及15,000rpm、 IO分钟的离心处理)。 在含有100pM乙酰丁香酚的LS-inf液体培养基中，混悬入大约1.0 x 109cfu/mL的Agrobacterium tumefaciens LBA4404(pSB13 l)作为接种源。向热、 离心处理的未成熟胚中加入接种源，搅拌30秒后，于室温静置5分钟。在 含有5pM的AgN03的LS-AS培养差、中添加了 0 ~ 10pM浓度葡糖酸酮的共 存培养基中，使接种了 土壤杆菌的未成熟胚胚盘向上接种。于25。C黑暗下培养3天后，将一部分的未成熟胚于含有0.1 %的Triton X-100的0.1M磷酸緩冲液(pH6.8)中浸渍，于37。C静置1小时。在磷酸緩冲 液中除去土壤杆菌后，添加含有l.OmM 5-溴-4-氯-3-吲咮基-(3-D-葡糖醛酸 (X-gluc)以及20%曱醇的磷酸緩沖液。于37。C处理24小时后，于显微镜下 7见察，考察呈蓝色的组织的范围。
另外，将在共存培养基上培养了 7天的未成熟胚中的愈伤组织形成，以 O(无愈伤组织形成)、l(胚盘的一部分愈伤组织化)、2(胚盘的大约一半愈伤组 织化)、3(胚盘的3/4以上愈伤组织化)的指数进行评价。
结果
将在各种培养基中培养了 3天的未成熟胚(品种A188)通过X-gluc染色， 将显示GUS基因的一过性发现的部位(呈蓝色的部位)的范围以O(没有表 达)-4(在胚盘的几乎全部都有表达)5个阶段来评价。在含有1、 5以及10nM 的葡糖酸酮的共存培养基上培养了 3天的未成熟胚，与在对照培养基上培养 的未成熟胚相比，在胚盘的大部分范围内显示出GUS基因的暂时性表达(图 5)。
考察了在共存培养基上培养了 1周的未成熟胚的愈伤组织形成。在含有 1、 5以及10^M的葡糖酸酮的共存培养基上培养的未成熟胚，与在不含葡糖 酸铜的培养基共同培养的未成熟胚相比，每种都显示高愈伤组织形成。尤其 是在含5以及10)jM的葡糖酸酮的共存培养基中的，与对照相比，显示有意 义的高愈伤组织形成(图6)。
由这些可知，通过在共存培养基中添加葡糖酸S同，与添加硫酸铜时一样， 可提高基因导入效率以及愈伤组织形成率。
实施例4 向接种源液体培养基中添加硫酸铜以及葡糖酸铜对向水稻导 入基因带来的影响 材料及方法
将在含有50mg/L潮霉素和50mg/L壮观霉素的AB培养基上培养了 3 ~ 4天的Agrobacterium tumefaciens超级双元载体LBA4404(pSB134)以白金接 种环挑取，混悬于含有100pM乙酰丁香酚以及0 ~ 50pM的CuS04.5H20或 者葡糖酸铜的大约109cfWml浓度的AA1液体培^1^T^7 T放入了无菌摘取的未成熟胚(品种"雪光")的埃彭道夫管中加入土壤杆菌悬浊液lml,
用旋涡混合器搅拌30秒后，于室温静置5分钟。将未成熟胚在nN6-As培养 基上接种，于黑暗下在25。C培养1周。 结果
测定了共存培养后未成熟胚的重量。尽管进行了 3次试验，但在每个试 验中，当在接种源液体培养基中加入硫酸铜或者葡糖酸铜的情况下，与没有 添加的对照未成熟胚相比，显示出旺盛的增殖(图7)。可知，通过添加^e克酸 铜以及葡糖酸铜对愈伤组织增殖的促进，不只是在共存培养基而且是在接种 源的液体培养基中添加时也同样可见。
实施例5 向再分化培养基中添加硫酸铜、葡糖酸铜对玉米转化植物的 生长带来的影响 材津十和方法
在玉米(品种A188)的未成熟胚(大小1.0- 1.5mm)上4妾种Agrobacterium tumefaciens LBA4404(pSB131),通过在含有PPT的LSD1.5培养基中培养得 到转化愈伤组织。将转化愈伤组织切碎为大约2mm的大小，于含有10pM 的CuS04.5H20或者葡糖酸铜以及PPT的LSZ再分化培养基上接种。在照明 下，于25。C培养3周，测定再分化植物的叶长。
结果
在含有硫酸铜或者葡糖酸铜的再分化培养基中再分化的植物的叶长，与 在对照再分化培养基中再分化的植物相比，显示有意义的加长，硫酸铜或者 葡糖酸铜显示促进再分化植物生长的效果(图8)。
实施例6 向再分化培养基中添加硫酸铜、葡糖酸铜对水稻转化植物的 生长带来的影响 材j^和方法
在水稻(品种"雪光，，)的未成熟胚上接种Agrobacterium tumefaciens LBA4404(pSB134)，通过在含有潮霉素的nN6CC培养基(N6无机盐、N6维 生素、0.5g/ L酪蛋白水解物、0.5g/ L L-脯氨酸、lmg/L 2,4-D、 0.5 mg/L NAA、 0.1mg/L6BA、 20g/L蔗糖、55g/L山梨醇、250mg/L头孢噻肟(七7才夕^夕厶)、250 mg/L羧卡西林、5g/L凝胶剂(少VL，4卜)、pH5.8)中培养得到 转化愈伤组织。将转化愈伤组织切碎为大约2mm的大小，于含有lO(iM的 CuS04.5H20或者葡糖酸铜以及潮霉素的N6R再分化培养基(主要无机盐减 到1/2的N6无机盐、N6维生素、AA氨基酸、lg/L酪蛋白水解物、0.5 mg/L 激动素、20g/L蔗糖、30g/L山梨糖醇、4g/L凝胶剂(y》，4卜)、pH5.8) 上接种。在照明下，于25。C培养3周，测定再分化植物的叶子长度。 结果
在含有硫酸铜或者葡糖酸铜的再分化培养基中再分化的植物的叶长，与 在对照再分化培养基中再分化的植物相比，显示有意义的加长，硫酸铜或者 葡糖酸铜具有促进再分化植物生长的效果，在水稻中也显示出来(图9)。
产业上的利用性
本发明开发了比现有土壤杆菌法更高效率地进行基因导入的廉价简单 的方法。此外，提供对认为用现有土壤杆菌法进行基因导入困难的植物种以 及品种也适用的方法。本发明的方法，与使用含有通常浓度的金属盐的培养 基的情况相比，可提高基因导入效率以及/或转化效率，以及/或可促进再分 化植物的生长。
如图l显示的，通过使用含有高浓度硫酸铜的共存培养基，关于单子叶 植物玉米的基因导入效率，与使用不含硫酸铜的培养基相比较，提高了2-2.5倍。此外，还由于增加了加热、离心处理，与使用不含硫酸铜的培养基 以及未处理的植物材料时相比，基因导入效率提高了 1.5 ~ 3倍。
根据本发明，从提高植物土壤杆菌法的基因导入效率这点，对以下估文出 了贡献可以高效地得到多种转化植物，容易地有效地培育导入有实用基因 的品种。尤其，单子叶植物其中有玉米，由于用现有土壤杆菌法转化效率低， 通过本发明方法提高了转化效率，意义很大。
权利要求
1. 一种以土壤杆菌属细菌来进行植物材料转化从而得到转化植物的制备方法，包含1)制备植物材料，2)使土壤杆菌感染植物材料，3)筛选转化细胞，且4)将筛选的转化体进行再分化，其特征在于，在上述4)的工序中使用含铜离子的金属盐浓度为1-100μM的培养基。
2. 权利要求l所述的方法，其中金属盐是^L酸铜或葡糖酸铜。
3. 权利要求1或2所述的方法，其中金属盐浓度是1 ~ 50pM。
4. 权利要求3所述的方法，其中金属盐浓度是1 ~ 10|iM。
5. 权利要求1或2所述的方法，其中植物是单子叶植物。
6，权利要求1或2所述的方法，其中植物是玉米。
7. 权利要求1或2所述的方法，其中植物是水稻。
8. 权利要求1或2所述的方法，其中植物材料是未成熟胚。
9. 一种促进再分化植物生长的方法，其特征在于，在由脱分化植物细 胞再分化成植物体的工序中，使用含铜离子的金属盐浓度为l-lOOpM的培养 基。
10. —种通过土壤杆菌属细菌来进行将基因导入到植物材料中的方法， 该方法包括(1) 制备植物材料，(2) 使土壤杆菌感染植物材料，(3) 筛选转化细胞，且(4) 将筛选的转化体进行再分化，其特征在于，在上述2)和4)的工序中使用提高了含铜离子的金属盐浓度的培养基。
11. 一种通过土壤杆菌属细菌来进行将基因导入到植物材料中的方法， 该方法包括1) 制备植物材料，2) 使土壤杆菌感染植物材料，3) 筛选转化细胞，且4) 将筛选的转化体进行再分化，其特征在于，在上述2)的工序中使用提高了含铜离子的金属盐浓度的培养基。
全文摘要
本发明提供一种通过添加铜离子来使植物转化效率提高的方法，包含1)将植物材料进行处理，然后2)使土壤杆菌感染植物材料，通过土壤杆菌属细菌来进行将基因导入到植物材料中的方法，其特征在于在上述1)以及/或2)的工序中，使用提高了含铜离子的金属盐浓度的培养基。本发明还提供以采用基因导入法为特征的转化植物的制造方法。
文档编号C12N5/14GK101429522SQ20081018183
公开日2009年5月13日 申请日期2004年8月12日 优先权日2003年8月13日
发明者石田佑二 申请人:日本烟草产业株式会社