提高多肽的纤维素分解增强活性的方法

专利名称：：提高多肽的纤维素分解增强活性的方法
技术领域：
：本发明涉及用于提高具有纤维素分解增强活性的多肽的活性的方法和组合物。相关技术的说明纤维素是一种由简单糖类葡萄糖通过0-1，4_联结共价键合而成的聚合物。许多微生物可产生水解联结的葡聚糖的酶。这些酶包括内切葡聚糖酶(endoglucanases)、纤维二糖水解酶(cellobiohydrolases)和3_葡糖苷酶(3-glucosidases)。内切葡聚糖酶在随机的部位消化纤维素聚合物，使其暴露于纤维二糖水解酶的攻击之下。纤维二糖水解酶从该纤维素聚合物的末端顺序地释放纤维二糖分子。纤维二糖是一种水溶性的葡萄糖^-1,4-联结二聚物。0-葡糖苷酶将纤维二糖水解成葡萄糖。将含纤维素原料转化为乙醇具有大量原料易得、可理想地避免材料的焚烧和填埋，以及乙醇燃料的清洁性等优势。木材、农业残余物、草本作物，以及城市固体废物已被考虑用来作为生产乙醇的原料。这些材料主要由纤维素、半纤维素和木质素构成。一旦纤维素被转化为葡萄糖，葡萄糖即被酵母容易地转化为乙醇。W02005/074647公开了来自土生梭孢壳(Thielaviaterrestris)的具有纤维素分解增强活性的分离多肽及其多核苷酸。W02005/074656公开了来自橙色嗜热子囊菌(Thermoascusaurantiacus)的具有纤维素分解增强活性的分离的多肽及其多核苷酸。公布的美国专利申请序列号2007/0077630公开了来自里氏木霉的具有纤维素分解增强活性的分离的多肽及其多核苷酸。提高具有纤维素分解增强活性的多肽的活性在本领域中将会是有利的。本发明涉及用于提高具有纤维素分解增强活性的多肽的活性的方法和组合物。
发明内容本发明涉及提高具有纤维素分解增强活性的多肽的活性的方法，其包括向包含具有纤维素分解增强活性的组合物添加可溶性活化性二价金属阳离子，其中可溶性活化性二价金属阳离子在降解或转化含纤维素材料的过程中以约o.OOlmM-约50mM的有效浓度存在，且与没有可溶性活化性二价金属阳离子的具有纤维素分解增强活性的多肽相比，可溶性活化性二价金属阳离子和具有纤维素分解增强活性的多肽的存在使纤维素分解酶组合物对含纤维素材料的降解或转化提高。本发明还涉及降解或转化含纤维素材料的方法，其包括用有效量的纤维素分解酶组合物处理含纤维素材料，所述组合物包含有效量的具有纤维素分解增强活性的多肽和可溶性活化性二价金属阳离子，其中所述可溶性活化性二价金属阳离子以约0.OOlmM-约50mM的有效浓度存在。本发明还涉及产生发酵产物的方法，其包括(a)用有效量的纤维素分解酶组合物糖化含纤维素材料，所述组合物包含有效量的具有纤维素分解增强活性的多肽和可溶性活化性二价金属阳离子，其中所述可溶性活化性二价金属阳离子以约0.OOlmM-约50mM的有效浓度存在；(b)用一种或多种发酵微生物发酵步骤(a)中经糖化的含纤维素材料以产生发酵产物；和(c)从发酵中回收发酵产物。本发明还涉及包含具有纤维素分解增强活性的多肽和可溶性活化性二价金属阳离子的组合物，其中所述可溶性活化性二价金属阳离子在降解或转化含纤维素材料的过程中以约0.OOlmM-约50mM的有效浓度存在，且与没有可溶性活化性二价金属阳离子的具有纤维素分解增强活性的多肽相比，可溶性活化性二价金属阳离子和具有纤维素分解增强活性的多肽的存在使纤维素分解酶组合物对含纤维素材料的降解或转化提高。本发明还涉及包含有效量的具有纤维素分解增强活性的多肽和可溶性活化性二价金属阳离子的纤维素分解酶组合物，其中所述可溶性活化性二价金属阳离子在降解或转化含纤维素材料的过程中以约0.OOlmM-约50mM的有效浓度存在，且与没有可溶性活化性二价金属阳离子的具有纤维素分解增强活性的多肽相比，可溶性活化性二价金属阳离子和具有纤维素分解增强活性的多肽的存在使纤维素分解酶组合物对含纤维素材料的降解或转化提高。附图简述图1显示pMJ04的限制性酶切图。图2显示PCaHj527的限制性酶切图。图3显示pMT2188的限制性酶切图。图4显示PCaHj568的限制性酶切图。图5显示pMJ05的限制性酶切图。图6显示pSMail30的限制性酶切图。图7显示米曲霉葡糖苷酶天然信号序列的DNA序列和氨基酸序列(SEQIDNO57和58)。图8显示特异腐质霉(Humicolainsolens)内切葡聚糖酶V信号序列的DNA序列及氨基酸序列(SEQIDN0:61和62)。图9显示pSMail35的限制性酶切图。图10显示pSMail40的限制性酶切图。图11显示pSaMe-Fl的限制性酶切图。图12A、12B、12C和12D显示米曲霉0-葡糖苷酶变体BG融合蛋白的DNA序列和推定的氨基酸序列(分别为SEQIDNO25和26)。图13显示pSaMe-FX的限制性酶切图。图14A、14B、14C和14D显示米曲霉0-葡糖苷酶融合蛋白的DNA序列和推定的氨基酸序列(分别为SEQIDNO27和28)。图15显示PAlLo47的限制性酶切图。图16显示向包括含有里氏木霉纤维素分解酶、米曲霉葡糖苷酶融合蛋白和具有纤维素分解增强活性的橙色嗜热子囊菌(Therm0asCuSaurantiaCuS)GH61A多肽的发酵液的混合物中加入不同的可溶性二价金属阳离子至终浓度为10mM时，经预处理的玉米秸秆中的纤维素转化为葡萄糖和纤维二糖的情况。图17显示向包括含有里氏木霉纤维素分解酶和米曲霉葡糖苷酶(加入或不加入具有纤维素分解增强活性的橙色嗜热子囊菌GH61A多肽)的发酵液的混合物中加入不同的二价金属阳离子至终浓度为ImM时，经预处理的玉米秸秆中的纤维素转化为葡萄糖和纤维二糖的情况。图18显示向包括含有里氏木霉纤维素分解酶、米曲霉葡糖苷酶融合蛋白和具有纤维素分解增强活性的橙色嗜热子囊菌GH61A多肽的脱盐或未脱盐发酵液的混合物中加入MgCl2和MnS04至终浓度为0.0001-10mM时，经预处理的玉米秸秆中的纤维素转化为葡萄糖和纤维二糖的情况。定义纤维素分解增强活性(cellulolyticenhancingactivity)术语“纤维素分解增强活性”在此定义为增强具有纤维素分解活性的蛋白质对含纤维素材料的水解的生物学活性。为本发明的目的，纤维素分解增强活性是通过测量纤维素分解性蛋白质在下述条件下水解含纤维素材料所致的还原糖增加或纤维二糖与葡萄糖的总量增加来加以确定的l-50mg总蛋白，其包含80-99.5%w/w的纤维素分解蛋白/gPCS中的纤维素，及0.5-20%w/V的具有纤维素分解增强活性的蛋白质，50°C历时1-7天，与用相等的无纤维素分解增强活性总蛋白加载量(l_50mg纤维素分解蛋白/gPCS中的纤维素)所进行的对照水解反应作比较。在一个优选的方面，将存在占纤维素酶蛋白加载3%的米曲霉葡糖苷酶(根据W002/095014在米曲霉中重组表达的)或3%的烟曲霉(Aspergillusfumigatus)0-葡糖苷酶(根据wo02/095014的实施例22在米曲霉中重组表达的)的CELLUCLAST1.5L(NovozymesA/S，BagSV^rd,Denmark)混合物用作纤维素分解活性的标准。所述具有纤维素分解增强活性的多肽具有SEQIDNO:2、4、6、8、10、12或14的成熟多肽的至少20%，优选至少40%，更优选至少50%，更优选至少60%，更优选至少70%，更优选至少80%，进一步更优选至少90%，最优选至少95%，进一步最优选至少100%的纤维素分解增强活性。所述具有纤维素分解增强活性的多肽以下述方式增强由具有纤维素分解活性的蛋白质所催化的含纤维素材料的水解将为达到同样水解程度所需的纤维素分解酶的量减少优选至少0.1倍，更优选至少0.2倍、更优选至少0.3倍、更优选至少0.4倍、更优选至少0.5倍、更优选至少1倍、更优选至少3倍、更优选至少4倍、更优选至少5倍、更优选至少10倍、更优选至少20倍、进一步更优选至少30倍、最优选至少50倍、进一步最优选至少100倍。纤维素分解活性(cellulolyticactivity)术语“纤维素分解活性”在本文中定义为水解含纤维素材料的纤维素酶活性(如内切葡聚糖酶、纤维二糖水解酶、3-葡糖苷酶或其组合)。纤维素分解蛋白可水解或水解羧甲基纤维素(CMC)，从而降低温育混合物的粘度。由此造成的粘度下降可以用振动粘度计(例如Sofraser，France产的MIVI3000)来测定。纤维素酶活性(以纤维素粘度单位(CellulaseViscosityUnit,CEVU)作为量度)测定是通过测量样品降低羧甲基纤维素(CMC)溶液粘度的能力来确定样品中催化活性的量。测定在适合纤维素分解蛋白和底物的温度和PH进行。为本发明的目的，纤维素分解活性是通过测量在下述条件下纤维素分解组合物对含纤维素材料的水解的增加来确定的l_50mg纤维素分解蛋白质/gPCS中的纤维素，历时1-7天，50°C，与不加纤维素分解蛋白的对照水解相比较。内切葡聚糖酶术语“内切葡聚糖酶”在本文中定义为一种内切_1，4-(1，3;1，4)-0-D-葡聚糖4-葡聚糖水解酶(E.C.No.3.2.1.4)，其催化纤维素、纤维素衍生物(诸如羧甲基纤维素和羟甲基纤维素)、地衣淀粉中的1，4-0-D-糖苷联结；混合型0-1，3葡聚糖如谷物(cereal)3-D-葡聚糖或木葡聚糖，和其他含纤维素性组分的植物材料中的3-1，4键的内水解(endohydrolysis)。为本发明的目的，内切葡聚糖酶活性是根据Ghose，1987，PureandAppl.Chem.59:257_268所述的程序利用羧甲基纤维素(CMC)水解来确定的。纤维二糖水解酶术语“纤维二糖水解酶”在本文中定义为一种1，4-0-D-葡聚糖纤维二糖水解酶(E.C.3.2.1.91)，其催化水解纤维素、纤维寡糖、或任何含0-1，4_连接的葡萄糖的聚合物中l，4-0-D-葡糖苷联结，从链的还原端或非还原端释放纤维二糖。为本发明的目的，纤维二糖水解酶活性是依照Lever等，1972,Anal.Biochem.47273-279和vanTilbeurgh等，1982，FEBSLetters149:152_156；vanTilbeurgh禾口Claeyssens，1985，FEBSLettersl87:283_288中记载的程序加以测定的。在本发明中，Lever等人的方法被用来评估玉米秸秆中纤维素的水解，而vanTilbeurgh等人的方法被用于测定对一种荧光性二糖衍生物的纤维二糖水解酶活性。0-葡糖苷酶术语“0-葡糖苷酶”在本文中定义为一种0-D-葡糖苷葡糖水解酶(E.C.3.2.1.21)，其催化水解末端非还原性0-D-葡萄糖残基，释放0-D-葡萄糖。为本发明的目的，3_葡糖苷酶活性是根据Venturi等，2002，J.BasicMicrobiol.4255-66id载的基本程序来测定的，只是使用了如本文所述的不同条件。一个单位的葡糖苷酶活性定义为在lOOmM柠檬酸钠、0.01%TWEEN20中，50°C、pH5条件下每分钟从作为底物的4mM对硝基苯基-0-D-吡喃葡萄糖苷产生1.0微摩尔对硝基苯酚。家族7、12、45或61葡糖苷水解酶术语“家族7糖苷水解酶”或“家族GH7”、“家族12糖苷水解酶”或“家族GH12”、“家族45糖苷水解酶”或“家族GH45”，以及“家族61糖苷水解酶”或“家族GH61”在本文中定义为根据Henrissat，1991，Aclassificationofglycosylhydrolasesbasedonamino-acidsequencesimilarities,Biochem.J.280:309_316以及HenrissatB.,andBairochA.,1996,Updatingthesequence-basedclassificationofglycosylhydrolases,Biochem.J.316695-696分别落入糖苷水解酶家族7、家族12、家族45和家族61的多肽。目前，Henrissat将GH61家族归于未分类之列，表明该家族所属的多肽的机制、催化性亲核体/碱、催化性质子供体以及3D结构等性质均系未知。GH7、GH12或GH45蛋白分别又被称为CEL7、CEL12或CEL45蛋白。含纤维素材料生物质的初生细胞壁中主要的多糖是纤维素，丰度第二高的是半纤维素，第三是果胶。在细胞停止生长后产生的次生细胞璧也含有多糖，并且被与半纤维素共价交联的多聚体木质素所增强。纤维素是脱水纤维二糖的同聚物，因此是一种直链3-(l_4)-D-葡聚糖，而半纤维素包括多种化合物，如木聚糖、木葡聚糖、阿拉伯木聚糖和甘露聚糖，具有复杂的分枝结构和一系列取代基。虽然纤维素一般是无定形的，但植物组织中发现的纤维素主要呈现为由平行葡聚糖链构成的不溶性晶体基质。半纤维素通常通过氢键连接于纤维素以及其他半纤维素上，这有助于细胞壁基质的稳定化。含纤维素材料可以是任何含有纤维素的材料。纤维素通常存在于例如植株的茎、叶、果/种壳(hulls)、果/种皮(husks)和穗轴(cobs)，或者树的叶、枝、和木材等之中。含纤维素材料可以是，但不限于，草质材料(herbaceousmaterial)、农业残余物(agriculturalresidues)、林业残余物(forestryresidues),城市固体废物(municipalsolidwastes)、废会氏(wastepaper),以及会氏菜禾口造会氏厂残余物(pulpandpapermillresidues)0含纤维素材料可以是任何类型的生物质，包括但不限于木材资源、城市固体废物、废纸、作物和作物残余物(见例如Wiselogel等，1995，《HandbookonBioethanol》(CharlesE.Wyman编)，第105-118页，Taylor&Francis,WashingtonD.C.；ffyman,1994,BioresourceTechnology503~16；Lynd,1990,AppliedBiochemistryandBiotechnology24/25695-719；Mosier等，1999,RecentProgressinBioconversionofLignocellulosics,((AdvancesinBiochemicalEngineering/Biotechnology)),T.Scheper总编，第65卷，第23-40页，Springer-Verlag，NewYork)。在本文中应当理解，含纤维素材料优选地为木素纤维素的形式，例如在混合的基质中包含木质素、纤维素和半纤维素的植物细胞壁材料。在一个优选的方面，含纤维素材料是玉米秸秆(cornstover)。在另一个优选的方面，含纤维素材料是玉米纤维。在另一个优选的方面，含纤维素材料是玉米穗轴。在另一个优选的方面，含纤维素材料是柳枝稷(switchgrass)。在另一个优选的方面，含纤维素材料是稻草(ricestraw)0在另一个优选的方面，含纤维素材料是纸和纸浆加工废物。在另一个优选的方面，含纤维素材料是木本或草本植物。在另一个优选的方面，含纤维素材料是甘蔗渣。含纤维素材料可以直接使用，或者可以使用本领域已知的常规技术对其进行预处理。例如，物理预处理技术可包括各种类型的粉碎(milling)、辐射(irradiation)、汽蒸/蒸汽爆破(steaming/steamexplosion)、禾口湿热分角军作用(hydrothermolysis)；化学预处理技术可包括稀酸、碱、有机溶剂、氨、二氧化硫、二氧化碳、和PH受控的湿热分解作用；而生物预处理技术可涉及施加溶木质素性微生物(参见，例如Hsu，T.-A.，1996，Pretreatmentofbiomass,((HandbookonBioethanolProductionandUtilization)),ffyman,C.E.编，Taylor&Francis,Washington,DC,179-212；Ghosh,P.和Singh，A.，1993，Physicochemicalandbiologicaltreatmentsforenzymatic/microbialconversionoflignocellulosicbiomass,Adv.Appl.Microbiol.39295-333；McMillan,J.D.，1994,Pretreatinglignocellulosicbiomass-.areview,((EnzymaticConversionofBiomassforFuelsProduction》，Himmel,M.E.,Baker,J.0.和Overend,R.P.编，ACSSymposiumSeries566,AmericanChemicalSociety,Washington,DC,第15章；Gong,C.S.,Cao,N.J.,Du,J.和Tsao,G.T.,1999,Ethanolproductionfromrenewableresources,《AdvancesinBiochemicalEngineering/Biotechnology)),Scheper,T.编，Springer-VerlagBerlinHeidelberg,Germany,65:207_241；Olsson,L.和Hahn-Hagerdal,B.,1996,Fermentationoflignocellulosichydrolysatesforethanolproduction,Enz.Microb.Tech.18312-331；以及Vallander,L.和Eriksson,K.-E.L.,1990,Productionofethanolfromlignocellulosicmaterials:Stateoftheart,Adv.Biochem.Eng./Biotechnol.4263-95)。预处理玉米秸秆术语“PCS”或“预处理的玉米秸秆”在本文中定义为通过热和稀酸处理从玉米秸秆获得的含纤维素材料。为本发明的目的，PCS是通过本文中说明的方法制备的。为本发明的目的，PCS是由实施例20所述方法或改变其时间、温度和酸量的变化形式来制备的。分离的多肽本文所用的术语“分离的多肽”是指从一个来源分离的多肽。在一个优选的方面，所述多肽是通过SDS-PAGE测定为至少纯、优选至少5%纯、更优选至少10%纯、更优选至少20%纯、更优选至少40%纯、更优选至少60%纯、进一步更优选至少80%纯、最优选至少90%纯的。基本上纯的多肽术语“基本上纯的多肽”在本文是指这样的多肽制备物，其含有以重量计至多10%，优选至多8%，更优选至多6%，更优选至多5%，更优选至多4%，更优选至多3%，进一步更优选至多2%，最优选至多1%，进一步最优选至多0.5%的与其天然地或重组地相伴随的其他多肽物质。因此，优选的是，基本上纯的多肽以制备物中存在的总多肽物质的重量计是至少92%纯、优选至少94%纯、更优选至少95%纯、更优选至少96%纯、更优选至少96%纯、更优选至少97%纯、更优选至少98%纯、进一步更优选至少99%、最优选至少99.5%纯、进一步最优选100%纯的。本发明的多肽优选是基本上纯的形式，即，多肽制备物实质上不含与其天然地或重组地相伴随的其他多肽物质。这可以通过例如用公知的重组技术或通过经典的纯化方法制备所述多肽来实现。成熟多肽术语“成熟多肽”在本文中定义为经过翻译和任何翻译后修饰(如N末端加工、C末端截短、糖基化、磷酸化等)之后，处于其最终形式的具有生物学活性(例如酶活性)的多肽。成熟多肽编码序列术语“成熟多肽编码序列”在本文中定义为编码成熟的具有生物学活性的多肽的核苷酸序列。同一性两个氨基酸序列之间或者两个核苷酸序列之间的相关性用参数“同一性”来描述。为本发明的目的，两个氨基酸序列之间同一性程度的确定使用如EMBOSS软件^(EMBOSS:TheEuropeanMolecularBiologyOpenSoftwareSuite,Rice^,2000,TrendsinGenetics16:276_277)，优选3.0.0或更新的版本中的Needle程序所执行的Needleman-Wunsch算法(Needleman和Wunsch，1970，J.Mol.Biol.48:443_453)。所用的可选参数为缺口形成罚分(gapopenpenalty)10、缺口延伸罚分(gapextensionpenalty)0.5、和EBL0SUM62(BL0SUM62的EMBOSS版)取代矩阵。将Needle的标记为"longestidentity”(“最长同一性”)(使用-nobrief(无简述)选项获得)的输出结果作为百分比同一性使用，它是这样计算出来的(相同的残基数x100)/(比对长度-比对中的缺口总数)为本发明的目的，两个脱氧核糖核苷酸序列之间的同一性程度的确定使用如EMBOSS(EMBOSS:TheEuropeanMolecularBiologyOpenSoftwareSuite,Rice等，2000，同上)，优选3.0.0或更新的版本中的Needle程序所执行的Needleman-ffunsch算法(Needleman和Wunsch，1970，同上)。所用的可选参数为缺口形成罚分10、缺口延伸罚分0.5、和EDNAFULL(NCBINUC4.4的EMBOSS版)取代矩阵。将Needle的标记为"longestidentity"(“最长同一性”)(使用-nobrief选项获得)的输出结果作为百分比同一性使用，它是这样计算出来的(相同的脱氧核糖核苷酸数x100)/(比对长度-比对中的缺口总数)同源序列术语“同源序列”在本文中定义为用blastp(对蛋白质数据库而言)或tblastn(对核酸数据库而言)算法得出的E值(或称期望值)小于0.001的序列，该算法用BL0SUM62矩阵，字长(wordsize)3、缺口出现罚分(gapexistencecost)ll、缺口延伸罚分(gapextensioncost)1，无低复杂度过滤，并用成熟蛋白序列查询。参见Altschul等，1997，NucleicAcidsRes.25:3389_3402。多肽片段术语“多肽片段”在本文中定义为从成熟多肽的氨基端和/或羧基端缺失一个或多个(数个)氨基酸而得到的多肽；或其同源序列；其中所述片段具有其成熟多肽的活性。子序列术语“子序列”在本文中定义为从成熟多肽编码序列的5’端和/或3’端缺失了一个或多个(数个)核苷酸的核苷酸序列；或者其同源序列；其中所述子序列编码具有其成熟多肽活性的多肽片段。等位变体(allelicvariant)术语“等位变体”是指基因的占据同一染色体座位的两种或更多种可选形式中的任一种。等位变异在天然情况下通过突变产生，并可导致群体中的多态性。基因突变可以是沉默的(被编码的多肽中没有变化)，或者可以编码氨基酸序列被改变的多肽。多肽的等位变体是基因的等位变体所编码的多肽。分离的多核苷酸本文中所用的术语“分离的多核苷酸”是指从一个来源分离而来的多核苷酸。在一个优选的方面，所述多核苷酸通过琼脂糖凝胶电泳测定为至少纯、优选至少5%纯、更优选至少10%纯、更优选至少20%纯、更优选至少40%纯、更优选至少60%纯、进一步更优选至少80%纯、最优选至少90%纯。基本上纯的多核苷酸本文中所用的术语“基本上纯的多核苷酸”是指这样的多核苷酸制备物，其不含有其他无关或不需要的核苷酸，并且处于适合在经基因工程改造的蛋白质的生产系统中使用的形式。因此，基本上纯的多核苷酸含有以重量计至多10%，优选至多8%，更优选至多6%，更优选至多5%，更优选至多4%，更优选至多3%，进一步更优选至多2%，最优选至多1%，进一步最优选至多0.5%的与其天然地或重组地相伴随的其他多核苷酸物质。但是，基本上纯的多核苷酸可以包括天然存在的5’和3’非翻译区，如启动子和终止子。优选的是，基本上纯的多核苷酸以重量计为至少90%纯、优选至少92%纯、更优选至少94%纯、更优选至少95%纯、更优选至少96%纯、更优选至少97%纯、进一步更优选至少98%纯、最优选至少99%纯、进一步最优选至少99.5%纯。本发明的多核苷酸优选是处于基本上纯的形式，即多核苷酸制备物基本上不含与其天然地或重组地相伴随的其他多核苷酸物质。多核苷酸可以是基因组、cDNA、RNA、半合成、合成来源的，或者上述来源的任意组合。cDNA:术语“cDNA”在本文中定义为这样的DNA分子，它能够从获自真核细胞的成熟的、经剪接的mRNA分子通过逆转录制备得到。cDNA缺少在对应的基因组DNA中通常存在的内含子序列。最初的初级RNA转录物是mRNA的前体，它经历一系列步骤被加工之后作为成熟的、经剪接的mRNA出现。这些步骤包括通过一个称为剪接的过程去除内含子序列。因此，从mRNA衍生而来的cDNA缺少任何内含子序列。核酸构建体术语“核酸构建体”在用于本文时是指这样的单链或双链核酸分子其是从天然存在的基因分离的，或者经过修饰而以原本不会存在于自然界中的方式包含核酸的片段，或者是合成的。当核酸构建体包含本发明的编码序列的表达所需的控制序列时，术语“核酸构建体”与术语“表达盒”是同义的。控制序列术语“控制序列”在本文中定义为包括编码本发明多肽的多核苷酸的表达所必需的所有组件。每个控制序列对于编码多肽的核苷酸序列而言，或者对于其它控制序列而言，可以是天然的或者外来的。这样的控制序列包括但不限于前导序列、聚腺苷酸化序列、前肽(prop印tide)序列、启动子、信号肽序列和转录终止子。在最低程度上，控制序列包括启动子以及转录和翻译终止信号。控制序列可以具有接头，用来引入特异性限制性位点以帮助将控制序列与编码多肽的核苷酸序列的编码区连接。可操作地连接术语“可操作地连接”在本文中是指这样一种构型，其中控制序列相对于多核苷酸序列的编码序列被置于合适的位置上，使得该控制序列指导多肽编码序列的表达。编码序列当用于本文时，术语“编码序列”是指这样的核苷酸序列，它直接规定其蛋白质产物的氨基酸序列。编码序列的边界一般是由可读框决定的，后者通常以ATG起始密码子或其他可选的起始密码子如GTG及TTG开始，而以终止密码子如TAA、TAG和TGA结束。编码序列可以是DNA、cDNA、合成的、或重组的核苷酸序列。表达术语“表达”包含多肽产生过程中涉及的任何步骤，包括但不限于转录、转录后修饰、翻译、翻译后修饰、以及分泌。表达载体术语“表达载体”在本文中定义为一种线性或环状DNA分子，其包含编码本发明多肽的多核苷酸，且可操作地连接于为其表达提供条件的其他核苷酸。宿主细胞术语“宿主细胞”在用于本文时包括任何易于被包含多核苷酸的核酸构建体或表达载体所转化、转染、转导等的细胞类型。修饰术语“修饰”在本文中意指对成熟多肽或其同源序列进行的任何化学修饰；以及对编码此类多肽的DNA进行的遗传操作。修饰可以是一个或多个(数个)氨基酸的取代、缺失和/或插入，以及一个或多个(数个)氨基酸侧链的替换。人工变体当在本文中使用时，术语“人工变体”是指由这样的生物体所产生的多肽所述生物体表达成熟多肽编码序列或其同源序列的修饰型核苷酸序列。所述修饰型多核苷酸序列是对所述多核苷酸序列或其同源序列通过修饰加以人工干预而获得的。发明详述本发明涉及提高具有纤维素分解增强活性的多肽的活性的方法，其包括向含有具有纤维素分解增强活性的多肽的组合物加入可溶性活化性二价金属阳离子，其中所述可溶性活化性二价金属阳离子在降解或转化含纤维素材料的过程中以约0.OOlmM-约50mM的有效浓度存在，且与没有可溶性活化性二价金属阳离子的具有纤维素分解增强活性的多肽相比，可溶性活化性二价金属阳离子和具有纤维素分解增强活性的多肽的存在使纤维素分解酶组合物对含纤维素材料的降解或转化提高。本发明还涉及降解或转化含纤维素材料的方法，其包括用有效量的含有有效量的具有纤维素分解增强活性的多肽和可溶性活化性二价金属阳离子的纤维素分解酶组合物处理含纤维素材料，其中所述可溶性活化性二价金属阳离子以约0.OOlmM-约50mM的有效浓度存在。本发明还涉及产生发酵产物的方法，其包括(a)将含纤维素材料用有效量的含有有效量具有纤维素分解增强活性的多肽和可溶性活化性二价金属阳离子的纤维素分解酶组合物糖化，其中所述可溶性活化性二价金属阳离子以约0.OOlmM-约50mM的有效浓度存在；(b)用一种或多种发酵微生物将步骤(a)中经糖化的含纤维素材料发酵；和(c)从发酵中回收发酵产物。本发明还涉及含有具有纤维素分解增强活性的多肽和可溶性活化性二价金属阳离子的组合物，其中所述可溶性活化性二价阳离子在含纤维素材料的降解或转化过程中以约0.OOlmM-约50mM的有效浓度存，且与没有可溶性活化性二价金属阳离子的具有纤维素分解增强活性的多肽相比，可溶性活化性二价金属阳离子和具有纤维素分解增强活性的多肽的存在使纤维素分解酶组合物对含纤维素材料的降解或转化提高。本发明还涉及包含有效量的具有纤维素分解增强活性的多肽和可溶性活化性二价金属阳离子的纤维素分解酶组合物，其中所述可溶性活化性二价金属阳离子在降解或转化含纤维素材料的过程中以约0.OOlmM-约50mM的有效浓度存在，且与没有可溶性活化性二价金属阳离子的具有纤维素分解增强活性的多肽相比，可溶性活化性二价金属阳离子和具有纤维素分解增强活性的多肽的存在使纤维素分解酶组合物对含纤维素材料的降解或转化提高。二价金属阳离子本发明可以使用任何可溶性活化性二价金属阳离子。在一个优选的方面，所述可溶性活化性二价金属阳离子选自由Mn++、Co+\Mg++、Ca++及其组合组成的组。在一个更优选的方面，所述可溶性活化性二价金属阳离子是Mn++。在另一个更优选的方面，所述可溶性活化性二价金属阳离子是Co++。在另一个更优选的方面，所述可溶性活化性二价金属阳离子是Mg++。在另一个更优选的方面，所述可溶性活化性二价金属阳离子是Ca++。在另一个更优选的方面，所述可溶性活化性二价金属阳离子是两种或更多种(数种)选自由Mn++、C0++、Mg++和Ca++组成的组中的阳离子。在最优选的方面，所述可溶性活化性二价金属阳离子是Mn++。在另一个最优选的方面，可溶性活化性二价金属阳离子是Mg++。可溶性活化性二价金属阳离子在降解或转化含纤维素底物的过程中以优选约0.OOlmM-约50mM，更优选约0.OlmM-约25mM，更优选约0.ImM-约25mM，更优选约0.ImM-约10mM,进一步更优选约0.3mM-约5mM，最优选约0.3mM-约2.5mM,进一步最优选约0.3mM-约ImM的有效浓度加入。在一个优选的方面，可溶性活化性二价金属阳离子在降解或转化含纤维素底物的过程中以约0.OOlmM-约50mM的有效浓度加入。在一个更优选的方面，可溶性活化性二价金属阳离子在降解或转化含纤维素底物的过程中以约0.OlmM-约25mM的有效浓度加入。在一个更优选的方面，可溶性活化性二价金属阳离子在降解或转化含纤维素底物的过程中以约0.ImM-约25mM的有效浓度加入。在一个更优选的方面，可溶性活化性二价金属阳离子在降解或转化含纤维素底物的过程中以约0.ImM-约10mM的有效浓度加入。在一个进一步更优选的方面，可溶性活化性二价金属阳离子在降解或转化含纤维素底物的过程中以约0.3mM-约5mM的有效浓度加入。在一个最优选的方面，可溶性活化性二价金属阳离子在降解或转化含纤维素底物的过程中以约0.3mM-约2.5mM的有效浓度加入。在一个进一步最优选的方面，可溶性活化性二价金属阳离子在降解或转化含纤维素底物的过程中以约0.3mM-约ImM的有效浓度加入。可溶性活化性二价金属阳离子优选作为可溶性盐加入，诸如，例如硫酸盐、碳酸盐、氯化物、柠檬酸盐、硝酸盐、亚硝酸盐、氟化物或碘化物。不过，本领域公知纤维素类生物质(cellulosicbiomass)可以含有多种二价金属阳离子。参见，例如F.B.Salisbury禾口C.W.Ross:PlantPhysiology,ffadsworthsPublishingCompany,Belmont,California(1992)。因此纤维素类生物质可以部分地或全部地作为金属阳离子的来源使用。活化性二价金属阳离子可以是可溶的或不溶的。术语“可溶性活化性二价金属阳离子”在本文定义为在溶液中可得的提高具有纤维素分解增强活性的多肽的活性的二价金属阳离子。术语“不溶性活化性二价金属阳离子”在本文定义为在溶液中不可获得的提高具有纤维素分解增强活性的多肽的活性的二价金属阳离子。二价金属阳离子不可获得可以是由于，例如其被螯合(例如被EDTA或EGTA螯合)，或其与纤维素类生物质的组分(例如焦磷酸盐)络合。纤维素类生物质也可提供抑制纤维素分解的可溶性二价金属阳离子(下称“可溶性抑制性二价金属阳离子”)。例如，抑制性二价金属阳离子是Zn++或Fe++。因此，在存在可溶性二价金属阳离子的混合物的条件下，一些活化而另一些抑制纤维素分解，加入过量的可溶性活化性二价金属阳离子以胜过抑制性二价金属阳离子的抑制性效果。在这种情况下，为了防止抑制性二价金属阳离子反向地影响具有纤维素分解增强活性的多肽，本发明的方法还包括补充可溶性活化性二价金属阳离子的浓度以将可溶性活化性二价金属阳离子的有效浓度在优选约0.00ImM-约50mM，更优选约0.OlmM-约25mM，更优选约0.ImM-约25mM,更优选约0.ImM-约10mM，进一步更优选约0.3mM-约5mM，最优选约0.3mM-约2.5mM,而进一步最优选约0.3mM-约ImM的范围保持一段足以降解或转化含纤维素材料的时间。在一个优选的方面，在降解或转化含纤维素底物的过程中补充可溶性活化性二价金属阳离子以维持其有效浓度为约O.OOlmM-约50mM。在一个更优选的方面，在降解或转化含纤维素底物的过程中补充可溶性活化性二价金属阳离子以维持其有效浓度为约0.OlmM-约25mM。在一个更优选的方面，在降解或转化含纤维素底物的过程中补充可溶性活化性二价金属阳离子以维持其有效浓度为约0.ImM-约25mM。在一个更优选的方面，在降解或转化含纤维素底物的过程中补充可溶性活化性二价金属阳离子以维持其有效浓度为约0.ImM-约10mM。在一个进一步更优选的方面，在降解或转化含纤维素底物的过程中补充可溶性活化性二价金属阳离子以维持其有效浓度为约0.3mM-约5mM。在一个最优选的方面，在降解或转化含纤维素底物的过程中补充可溶性活化性二价金属阳离子以维持其有效浓度为约0.3mM-约2.5mM。在一个进一步最优选的方面，在降解或转化含纤维素底物的过程中补充可溶性活化性二价金属阳离子以维持其有效浓度为约0.3mM-约ImM。纤维素类生物质中二价金属阳离子的浓度可使用本领域公知的任何方法测定，例如原子吸收、电化学电极、金属离子生物传感器或光传感器，或螯合滴定(参见，例如MethodsinEnzymology,v.158(多个章节)，Haugland，R.P.HandbookofFluorescentProbesandResearchChemicals，6thed.；MolecularProbes，Inc.:Eugene，OR,1996.,Thompson等Anal.Chem.，70(22)，4717-4723，1998，InductivelyCoupledPlasmaMassSpectrometry,AkbarMontaser(Editor)May1998)。在本发明的方法中，可溶性活化性二价金属阳离子提高具有纤维素分解增强活性的多肽的活性优选至少0.1倍，更优选至少0.2倍，更优选至少0.3倍，更优选至少0.4倍，更优选至少0.5倍，更优选至少1倍，更优选至少3倍，更优选至少4倍，更优选至少5倍，更优选至少10倍，更优选至少20倍，进一步更优选至少30倍，最优选至少50倍，进一步最优选至少100倍。纤维素分解酶组合物本发明还涉及包含具有纤维素分解增强活性的多肽和可溶性活化性二价金属阳离子的组合物，其中所述可溶性活化性二价金属阳离子在降解或转化含纤维素材料过程中以优选约0.OOlmM-约50mM，更优选约0.OlmM-约25mM，更优选约0.ImM-约25mM，更优选约0.ImM-约10mM，进一步更优选约0.3mM-约5mM，最优选约0.3mM-约2.5mM,而进一步最优选约0.3mM-约ImM的有效浓度存在，且与没有可溶性活化性二价金属阳离子的具有纤维素分解增强活性的多肽相比，可溶性活化性二价金属阳离子和具有纤维素分解增强活性的多肽的存在使纤维素分解酶组合物对含纤维素材料的降解或转化提高。本发明还涉及包含有效量的具有纤维素分解增强活性的多肽和可溶性活化性二价金属阳离子的纤维素分解酶组合物，其中所述可溶性活化性二价金属阳离子在降解或转化含纤维素材料过程中以优选约0.OOlmM-约50mM，更优选约0.OlmM-约25mM，更优选约0.ImM-约25mM，更优选约0.ImM-约10mM，进一步更优选约0.3mM-约5mM，最优选约0.3mM-约2.5mM,而进一步最优选约0.3mM-约ImM的有效浓度存在，且与没有可溶性活化性二价金属阳离子的具有纤维素分解增强活性的多肽相比，可溶性活化性二价金属阳离子和具有纤维素分解增强活性的多肽的存在使纤维素分解酶组合物对含纤维素材料的降解或转化提高。在本发明的方法中，纤维素分解酶组合物可以包含在将含纤维素材料加工成葡萄糖，或将半纤维素加工成木糖、甘露糖、半乳糖和阿拉伯糖、它们的聚合物，或如下所述的它们的衍生产物的加工中涉及的任何蛋白质。在一个方面，所述纤维素分解酶组合物包含内切葡聚糖酶、纤维二糖水解酶、3-葡糖苷酶，或它们的组合。在另一个方面，所述纤维素分解酶组合物还包含一种或多种附加的用于改善含纤维素材料降解的酶活性。优选的附加酶有半纤维素酶、酯酶(例如脂肪酶、磷脂酶、和/或角质酶)、蛋白酶、漆酶、过氧化物酶、或它们的混合物。纤维素分解酶组合物可以是单组分制备物，例如一种内切葡聚糖酶，多组分制备物，例如一种或多种内切葡聚糖酶，一种或多种纤维二糖水解酶；和一种或多种3“葡糖苷酶，或者多组分蛋白制备物与单组分蛋白制备物的组合。纤维素分解蛋白可在酸性、中性或碱性PH范围内具有活性，即，水解含纤维素材料。如上文所述，本发明中使用的纤维素分解蛋白可以是单组分制备物，即基本上不含其它纤维素分解性组分的组分。单个组分可以是重组组分，即通过克隆编码该单个组分的DNA序列，然后用该DNA序列转化细胞，并在宿主中表达而产生的(参见例如TO91/17243和W091/17244)。宿主细胞可以是异源宿主(酶对宿主而言是外来的)或者宿主也可以是野生型宿主(酶对宿主而言是天然的)。单组分纤维素分解蛋白还可以通过从发酵液中纯化此类蛋白来加以制备。本发明使用的酶可以是任何适合在本文所述的方法中使用的形式，例如含或不含细胞的粗发酵液、干粉或颗粒剂、非粉化性颗粒剂(non-dustinggranulate)、液体、稳定化液体、或经保护的酶。颗粒剂例如可如在美国专利4，106，991和4，661，452中所公开的方法制备，并可任选使用本领域已知的方法进行包衣。例如，液体酶制备物可根据既定的方法通过加入稳定剂诸如糖、糖醇或其它多元醇、和/或乳酸或其它有机酸来稳定化。经保护的酶可根据EP238，216中所公开的方法制备。具有纤维素分解酶活性的多肽可以从任何属的微生物获得。术语“从...获得”(或“获自...”)在此处意思是指所述酶可以是从天然产生所述酶作为天然酶的生物体分离而来的。“从.获得”(或“获自...”)在此处还意指所述酶可以是在宿主生物体中重组产生的，其中重组产生的酶对于宿主生物体而言为天然的或外来的，或者具有经修饰的氨基酸序列，例如缺失、插入和/或取代了一个或多个氨基酸，即作为天然氨基酸序列的突变体和/或片段的重组产生的酶或通过本领域已知的核酸改组方法产生的酶。天然酶的意义中涵盖天然变体，外来酶的意义中涵盖通过化学或重组诱变，如通过定点诱变或改组获得的变体。因此，纤维素分解性蛋白的经过化学修饰或蛋白质工程改造的突变体也可以用于本发明。在一个优选的方面，获自给定来源的多肽是胞外分泌的。具有纤维素分解酶活性的多肽可以是细菌多肽。例如，该多肽可以是革兰氏阳性细菌多肽，诸如芽孢杆菌属(Bacillus)、链球菌属(Str印tococcus)、链霉菌属(Streptomyces)、葡萄球菌属(Staphylococcus)、肠球菌属(Enterococcus)、乳杆菌属(Lactobacillus)、乳球菌属(Lactococcus)、梭菌属(Clostridium)、地芽孢杆菌属(Geobacillus)或海洋芽孢杆菌属(Oceanobacillus)的具有纤维素分解酶活性的多肽，或革兰氏阴性细菌多肽，如大肠杆菌、假单胞菌属(Pseudomonas)、沙门氏菌属(Salmonella)、弯曲杆菌属(Campylobacter)、螺杆菌属(Helicobacter)、黄杆菌属(Flavobacterium)、梭杆菌属(Fusobacterium)、泥杆菌属(Ilyobacter)、奈瑟氏球菌属(Neisseria)或尿枝原体属(Ureaplasma)的具有纤维素分解酶活性的多肽。在一个优选的方面，所述多肽是嗜碱芽孢杆菌(Bacillusalkalophilus)、解淀粉芽孢杆菌(Bacillusamyloliquefaciens)、短芽孢杆菌(Bacillusbrevis)、环状芽孢杆菌(Bacilluscirculans)、克劳氏芽孢杆菌(Bacillusclausii)、凝结芽孢杆菌(Bacilluscoagulans)、坚强芽孢杆菌(Bacillusfirmus)、灿烂芽孢杆菌(Bacilluslautus)、缓慢芽孢杆菌(Bacilluslentus)、地衣芽孢杆菌(Bacilluslicheniformis)、巨大芽孢杆菌(Bacillusmegaterium)、短小芽孢杆菌(Bacilluspumilus)、嗜热脂肪芽孢杆菌(Bacillusstearothermophilus)、枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)或苏云金芽孢杆菌(Bacillusthuringiensis)的具有纤维素分解酶活性的多肽。在另一个优选的方面，所述多肽是似马链球菌(Str印tococcusequisimilis)、酿脓链球菌(Streptococcuspyogenes)、乳房链球菌(Streptococcusuberis)或马链球菌兽癌亚种(Str印tococcusequisubsp.Zoo印idemicus)的具有纤维素分解酶活性的多肽。在另一个优选的方面，所述多肽是不产色链霉菌(Str印tomycesachromogenes)、除虫链霉菌(Streptomycesavermitilis)、天蓝色链霉菌(Streptomycescoelicolor)、灰色链霉菌(Streptomycesgriseus)、或浅青紫链霉菌(Streptomyceslividans)的具有纤维素分解酶活性的多肽。具有纤维素分解酶活性的多肽还可以是真菌多肽，更优选酵母多肽，如假丝酵母属(Candida)、克鲁维酵母属(Kluyveromyces)、毕赤酵母属(Pichia)、酵母属(Saccharomyces)、裂殖酵母属(Schizosaccharomyces)或西洋蓍霉属(Yarrowia)的具有纤维素分解酶活性的多肽；或者更优选丝状真菌多肽，如枝顶孢霉属(Acremonium)、蘑菇属(Agaricus)、链格孢属(Alternaria)、曲霉属(Aspergillus)、短梗霉属(Aureobasidium)、葡萄座腔菌属(Botryospaeria)、拟赌菌属(Ceriporiopsis)、毛壳菌属(Chaetomidium)、金孢子菌属(Chrysosporium)、麦角属(Claviceps)、旋孢腔菌属(Cochliobolus)、Coprinopsis>Coptotermes、棒囊壳属(Corynascus)、栗疫病菌属(Cryphonectria)、疼急球菌属(Cryptococcus)、色二孢属(Diplodia)、黑耳属(Exidia)、网孢菌属(Filibasidium)、镰孢属(Fusarium)、赤霉属(Gibberella)、全鞭毛虫属(Holomastigotoides)、腐质霉属(Humicola)、奉巴菌属(Irpex)>M(Lentinula)、小球腔菌属(Leptospaeria)、梨孢菌属(Magnaporthe)、Melanocarpus、多孑L菌属(Meripilus)、毛毒属(Mucor)、毁丝毒属(Myceliophthora)、新考玛月旨毒属(Neocallimastix)、脉抱菌属(Neurospora)、拟青霉属(Paecilomyces)、青霉属(Penicillium)、平革菌属(Phanerochaete)、瘤胃壶菌属(Piromyces)、Poitrasia^{段M盘菌属(Pseudoplectania)、Pseudotrichonympha^根毛霉属(Rhizomucor)、裂褶菌属(Schizophyllum)、柱顶孢属(Scytalidium)、踝节菌属(Talaromyces)、嗜热子囊菌属(Thermoascus)、梭孢壳属(Thielavia)、弯颈霉属(Tolypocladium)、木霉属(Trichoderma)、Trichophaea、轮枝抱属(Verticillium)、小包脚菇属(Volvariella)、或炭角菌属(Xylaria)的具有纤维素分解酶活性的多肽。在一个优选的方面所述多肽是卡尔酵母(Saccharomycescarlsbergensis)、酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)、糖化酵母(Saccharomycesdiastaticus)、道格拉氏酵母(Saccharomycesdouglasii)、克鲁弗酵母(Saccharomyceskluyveri)、诺地酵母(Saccharomycesnorbensis)或卵形酵母(Saccharomycesoviformis)的具有纤维素分角军酶活性的多肽。在另一个优选的方面，所述多肽是解纤维枝顶孢霉(Acremoniumcellulolyticus)、棘抱曲霉(Aspergillusaculeatus)、泡盛曲霉(Aspergillusawamori)、烟曲霉(Aspergillusfumigatus)、臭曲霉(Aspergillusfoetidus)、曰本曲霉(Aspergillusjaponicus)、构巢曲霉(Aspergillusnidulans)、漂曲霉(Aspergillusniger)、米曲霉、嗜角质金抱子菌(Chrysosporiumkeratinophilum)、Chrysosporiumlucknowense、热带金抱子菌(Chrysosporiumtropicum)、Chrysosporiummerdarium、Chrysosporiuminops、Chrysosporiumpannicola、Chrysosporiumqueenslandicum、Chrysosporiumzonatum、杆抱状德抱(Fusariumbactridioides)、禾谷德抱(Fusariumcerealis)、库成德抱(Fusariumcrookwellense)、大刀德抱(Fusariumculmorum)、禾本禾斗德抱(Fusariumgraminearum)、禾赤德抱(Fusariumgraminum)、异抱德抱(Fusariumheterosporum)、合欢木德抱(Fusariumnegundi)、尖德抱(Fusariumoxysporum)、多枝德抱(Fusariumreticulatum)、粉红德抱(Fusariumroseum)、接骨木德抱(Fusariumsambucinum)、肤色德抱(Fusariumsarcochroum)、拟分枝？包德？包(Fusariumsporotrichioides)、硫色德抱(Fusariumsulphureum)、圆镰？包(Fusariumtorulosum)、拟丝孢镰孢(Fusariumtrichothecioides)、镶片镰孢(Fusariumvenenatum)、灰色腐质酶(Humicolagrisea)、特异腐质霉、疏棉状腐质霄(Humicolalanuginosa)、乳白奉巴菌(Irpexlacteus)、米赫毛霄(Mucormiehei)、嗜热毁丝霉(Myceliophthorathermophila)、粗糙脉孢菌(Neurosporacrassa)、绳状青霉(Penicilliumfuniculosum)、产紫青霉(Penicilliumpurpurogenum)、黄抱|if(Phanerochaetechrysosporium)>^Cfe^(Thielaviaachromatica)、Thielaviaalbomyces>ThielaviaBlbopilosB、^^州—冑(Thielaviaaustraleinsis)>Thielaviafimeti、小抱子梭抱壳(Thielaviamicrospora)>Thielaviaovispora、Thielaviaperuviana^Thielaviaspededonium、€f包冑(Thielaviasetosa)、Thielaviasubthermophila、_zht—冑、P^H(Trichodermaharzianum)(Trichodermakoningii)、长枝(Trichodermalongibrachiatum)、里氏7^、參录fe*霉(Trichodermaviride)或Trichophaeasaccata的具有纤维素分解酶活性的多肽。在本发明的方法中，任何内切葡聚糖酶、纤维二糖水解酶和/或葡糖苷酶，以及任何其它纤维素分解酶都可以使用。可以用于本发明的细菌内切葡聚糖酶的例子包括但不限于解纤维热酸菌(Acidothermuscellulolyticus)内切葡聚糖酶(W091/05039；W093/15186；美国专利5，275，944；W096/02551；美国专利5，536，655，W000/70031,W005/093050)；褐色喜热裂孢菌(Thermobifidafusca)内切葡聚糖酶III(W005/093050)；和褐色喜热裂孢菌内切葡聚糖酶V(W005/093050)。可以用于本发明的真菌内切葡聚糖酶的例子包括但不限于里氏木霉内切葡聚糖酶I(Penttila等，1986，Gene45:253_263；GenBank登录号M15665)；里氏木霉内切葡聚糖酶II(Saloheimo等，1988，Gene6311-22;GenBank登录号M19373)；里氏木霉内切葡聚糖酶III(0kada等，1988，Appl.Environ.Microbiol.64:555_563；GenBank登录号AB003694)；里氏木霉内切葡聚糖酶IV(Saloheimo等，1997，Eur.J.Biochem.249584-591；GenBank登录号Y11113)；和里氏木霉内切葡聚糖酶V(Saloheimo等，1994，MolecularMicrobiology13:219_228;GenBank登录号Z33381)；棘孢曲霉内切葡聚糖酶(0oi等，1990，NucleicAcidsResearch18:5884)；川地曲霉(Aspergilliskawachii)内切葡聚糖酶(Sakamoto等，1995，CurrentGenetics27:435_439)；金孢子菌属菌种(Chrysosporiumsp.)C1(美国专利6，573,086；GenPept登录号AAQ38150)；Corynascusheterothallicus(美国专利6，855，531；GenP印t登录号AAY00844)；Erwiniacarotovara内切葡聚糖酶(Saarilahti等，1990，Gene90:9_14)；尖镰孢内切葡聚糖酶(GenBank登录号L29381)；灰腐质霉thermoidea变体菌株内切葡聚糖酶(GenBank登录号AB003107)；Melanocarpusalbomyces内切葡聚糖酶(GenBank登录号MAL515703)；粗糙脉孢菌内切葡聚糖酶(GenBank登录号XM_324477)；马瘤胃弧菌(Piromycesequi)(Eberhardt等，2000，Microbiology1461999-2008;GenP印t登录号CAB92325)；米根霉(Rhizopusoryzae)(Moriya等，2003，J.Bacteriologyl851749-1756；GenBank登录号AB047927,AB056667、AB056668)；和土生梭孢壳(W02004/053039；EMBL登录号CQ827970)。公开了使用依照HenrissatB.,1991,Aclassificationofglycosylhydrolasesbasedonamino-acidsequencesimilarities,Biochem.J.280:309_316；以及HenrissatB.禾口BairochA.,1996,Updatingthesequence-basedclassificationofglycosylhydrolasess,Biochem.J.316:695_696的分类法分类的超过13个糖基水解酶家族中的其它内切葡聚糖酶。在一个优选的方面，所述内切葡聚糖酶是里氏木霉内切葡聚糖酶I(CEL7B)。在另一个优选的方面，所述内切葡聚糖酶是里氏木霉内切葡聚糖酶II(CEL5A)。在另一个优选的方面，所述内切葡聚糖酶是里氏木霉内切葡聚糖酶III(CEL12A)。在另一个优选的方面，所述内切葡聚糖酶是里氏木霉内切葡聚糖酶V(CEL45A)。在另一个优选的方面，所述内切葡聚糖酶是嗜热毁丝霉CEL7内切葡聚糖酶。在另一个优选的方面，所述内切葡聚糖酶是ChrysosporiumlucknowenseCEL12内切葡聚糖酶。在另一个优选的方面，所述内切葡聚糖酶是ChrysosporiumlucknowenseCEL45内切葡聚糖酶。在一个更优选的方面，所述里氏木霉内切葡聚糖酶I(CEL7B)是SEQIDN0:74的成熟多肽或其直向同源物或变体。在另一个更优选的方面，所述里氏木霉内切葡聚糖酶IKCEL5A)是SEQIDNO:76的成熟多肽或其直向同源物或变体。在另一个更优选的方面，所述里氏木霉内切葡聚糖酶III(CEL12A)是SEQIDNO:78的成熟多肽或其直向同源物或变体。在另一个更优选的方面，所述里氏木霉内切葡聚糖酶V(CEL45A)是SEQIDNO:80的成熟多肽或其直向同源物或变体。在另一个更优选的方面，所述嗜热毁丝霉CEL7内切葡聚糖酶是SEQIDNO:82的成熟多肽或其直向同源物或变体。在另一个更优选的方面，所述MyceliophthorathermophilaCEL12内切葡聚糖酶是SEQIDNO:84的成熟多肽或其直向同源物或变体。在另一个更优选的方面，所述MyceliophthorathermophilaCEL45内切葡聚糖酶是SEQIDN086的成熟多肽或其直向同源物或变体。在另一个更优选的方面，所述里氏木霉内切葡聚糖酶I(CEL7B)由SEQIDN0:73的成熟多肽编码序列或其直向同源物或变体所编码。在另一个更优选的方面，所述里氏木霉内切葡聚糖酶II(CEL5A)由SEQIDNO:75的成熟多肽编码序列或其直向同源物或变体所编码。在另一个更优选的方面，所述里氏木霉内切葡聚糖酶III(CEL12A)由SEQIDNO77的成熟多肽编码序列或其直向同源物或变体所编码。在另一个更优选的方面，所述里氏木霉内切葡聚糖酶V(CEL45A)由SEQIDNO:79的成熟多肽编码序列或其直向同源物或变体所编码。在另一个更优选的方面，所述嗜热毁丝霉CEL7内切葡聚糖酶由SEQIDNO:81的成熟多肽编码序列或其直向同源物或变体所编码。在另一个更优选的方面，所述金孢子菌CEL12内切葡聚糖酶由SEQIDNO:83的成熟多肽编码序列或其直向同源物或变体所编码。在另一个更优选的方面，所述金孢子菌CEL45内切葡聚糖酶由SEQIDNO:85的成熟多肽编码序列或其直向同源物或变体所编码。所述里氏木霉内切葡聚糖酶I(CEL7B)可根据Penttila等，1986，Gene45:253-263获得。所述里氏木霉内切葡聚糖酶II(CEL5A)可根据Saloheimo等，1988，Gene63:11-22获得。所述里氏木霉内切葡聚糖酶III(CEL12A)可根据Okada等，1988，Appl.Environ.Microbiol.64:555-563获得。所述里氏木霉内切葡聚糖酶V(CEL45A)可根据Saloheimo等，1994，MolecularMicrobiologyl3:219_228获得。所述嗜热毁丝霉CEL7内切葡聚糖酶可根据W095/024471获得。所述ChrysosporiumlucknowenseCEL12内切葡聚糖酶可根据W02001/25468获得。所述ChrysosporiumlucknowenseCEL45内切葡聚糖酶可根据W02000/20555获得。在另一个优选的方面，所述纤维二糖水解酶是里氏木霉纤维二糖水解酶I(CEL7A)。在另一个优选的方面，所述纤维二糖水解酶是里氏木霉纤维二糖水解酶II(CEL6A)。在另一个优选的方面，所述纤维二糖水解酶是具有纤维素结合域的ChrysosporiumlucknowenseCEL7纤维二糖水解酶。在另一个优选的方面，所述纤维二糖水解酶是不具有纤维素结合域的嗜热毁丝霉CEL7纤维二糖水解酶。在另一个优选的方面，所述纤维二糖水解酶是土生梭孢壳纤维二糖水解酶。在另一个更优选的方面，所述里氏木霉纤维二糖水解酶I(CEL7A)是SEQIDNO88的成熟多肽或其直向同源物或变体。在另一个优选的方面，所述里氏木霉纤维二糖水解酶II(CEL6A)是SEQIDNO:90的成熟多肽或其直向同源物或变体。在另一个更优选的方面，所述具有纤维素结合域的ChrysosporiumlucknowenseCEL7纤维二糖水解酶是SEQIDNO92的成熟多肽或其直向同源物或变体。在另一个更优选的方面，所述不具有纤维素结合域的嗜热毁丝霉CEL7纤维二糖水解酶是SEQIDNO:94的成熟多肽或其直向同源物或变体。在另一个更优选的方面，所述土生梭孢壳纤维二糖水解酶是SEQIDN0:96的成熟多肽或其直向同源物或变体。在另一个更优选的方面，所述里氏木霉纤维二糖水解酶I(CEL7A)纤维二糖水解酶由SEQIDNO:87的成熟多肽编码序列或其直向同源物或变体所编码。在另一个更优选的方面，所述里氏木霉纤维二糖水解酶II(CEL6A)纤维二糖水解酶由SEQIDNO:89的成熟多肽编码序列或其直向同源物或变体所编码。在另一个更优选的方面，所述具有纤维素结合域的ChrysosporiumlucknowenseCEL7纤维二糖水解酶由SEQIDNO:91的成熟多肽编码序列或其直向同源物或变体所编码。在另一个更优选的方面，所述不具有纤维素结合域的嗜热毁丝霉CEL7纤维二糖水解酶由SEQIDNO:93的成熟多肽编码序列或其直向同源物或变体所编码。在另一个更优选的方面，所述土生梭孢壳纤维二糖水解酶由SEQIDN0:95的成熟多肽编码序列或其直向同源物或变体所编码。所述里氏木霉纤维二糖水解酶I(CEL7A)可以依照Shoemaker等，1983，Biotechnology(N.Y.)1:691-696获得。所述里氏木霉纤维二糖水解酶II(CEL6A)可以依照Terri等，1987，Gene51:43_52获得。所述具有纤维素结合域的ChrysosporiumlucknowenseCEL7纤维二糖水解酶可以依照W02001/79507获得。所述不具有纤维素结合域的嗜热毁丝霉CEL7纤维二糖水解酶可以依照W02003/000941获得。所述土生梭孢壳纤维二糖水解酶可以依照W02006/074435获得。在另一个优选的方面，所述葡糖苷酶获自米曲霉。在另一个优选的方面，所述葡糖苷酶获自烟曲霉。在另一个优选的方面，所述葡糖苷酶获自巴西青霉(Penicilliumbrasilianum)，例如巴西青霉IBT20888株。在另一个优选的方面，所述葡糖苷酶获自黑曲霉。在另一个优选的方面，所述葡糖苷酶获自棘孢曲霉。在一个更优选的方面，所述米曲霉葡糖苷酶是SEQIDNO:16的成熟多肽或其直向同源物或变体。在另一个更优选的方面，所述烟曲霉葡糖苷酶是SEQIDN0:18的成熟多肽或其直向同源物或变体。在另一个更优选的方面，所述巴西青霉葡糖苷酶是SEQIDN0:20的成熟多肽或其直向同源物或变体。在另一个更优选的方面，所述黑曲霉葡糖苷酶是SEQIDNO:22的成熟多肽或其直向同源物或变体。在另一个更优选的方面，所述棘孢曲霉葡糖苷酶是SEQIDNO:24的成熟多肽或其直向同源物或变体。在另一个更优选的方面，所述米曲霉葡糖苷酶由SEQIDNO:15的成熟多肽编码序列或其直向同源物或变体所编码。在另一个更优选的方面，所述烟曲霉葡糖苷酶由SEQIDN0:17的成熟多肽编码序列或其直向同源物或变体所编码。在另一个更优选的方面，所述巴西青霉葡糖苷酶由SEQIDNO:19的成熟多肽编码序列或其直向同源物或变体所编码。在另一个更优选的方面，所述黑曲霉葡糖苷酶由SEQIDNO:21的成熟多肽编码序列或其直向同源物或变体所编码。在另一个更优选的方面，所述棘孢曲霉葡糖苷酶由SEQIDN0:23的成熟多肽编码序列或其直向同源物或变体所编码。所述具有葡糖苷酶活性的米曲霉多肽可以根据W02002/095014获得。所述具有葡糖苷酶活性的烟曲霉多肽可以根据W02005/047499获得。所述具有0-葡糖苷酶活性的巴西青霉多肽可以根据W02007/019442获得。所述具有0-葡糖苷酶活性的黑曲霉多肽可以根据Dan等，2000，J.Biol.Chem.275:4973-4980获得。所述具有3_葡糖苷酶活性的棘孢曲霉多肽可以根据Kawaguchi等，1996，Gene173:287_288获得。在另一个优选的方面，SEQIDNO16的成熟多肽是由大肠杆菌DSM14240中所含质粒中含有的多核苷酸编码的。在另一个优选的方面，SEQIDN0:18的成熟多肽是由大肠杆菌NRRLB-30695中所含质粒pEJG113中含有的多核苷酸编码的。在另一个优选的方面，SEQIDNO:20的成熟多肽是由大肠杆菌NRRLB-30860中所含质粒pKKAB中含有的多核苷酸编码的。在另一个优选的方面，所述葡糖苷酶是SEQIDN0:26的米曲霉葡糖苷酶变体BG融合蛋白。在另一个优选的方面，所述米曲霉葡糖苷酶变体BG融合蛋白由SEQIDNO:25的多核苷酸编码。在另一个优选的方面，所述葡糖苷酶是SEQIDNO:28的米曲霉葡糖苷酶融合蛋白。在另一个优选的方面，所述米曲霉葡糖苷酶融合蛋白由SEQIDNO27的多核苷酸编码。本发明可用的其它葡糖苷酶实例包括但不限于米曲霉葡糖苷酶(W002/095014；W004/099228)；棘孢曲霉3-葡糖苷酶(Kawaguchi等，1996，Gene173287-288)；Aspergillusavenaceus3-葡糖苷酶(GenBank登录号AY943971)；烟曲霉葡糖苷酶(GenBank登录号XM745234)；川地曲霉葡糖苷酶(GenBank登录号AB003470)；黑曲霉0-葡糖苷酶(GenBankAJ132386)；灰色梨孢菌(Magnaporthegrisea)葡糖苷酶(GenBank登录号AY849670)；黄孢平革菌0-葡糖苷酶(GenBank登录号AB253327)；Talaromycesemersonii0-葡糖苷酶(GenBank登录号AY072918)和里氏木霉葡糖苷酶(GenBank登录号U09580，AB003110,AY281374,AY281375,AY281377,AY281378和AY281379)。0-葡糖苷酶的变体也可使用，如W004/099228中记载的那些。其它葡糖苷酶在根据以下文献分类得到的13个以上的糖基水解酶家方矣中公幵HenrissatB.，1991，Aclassificationofglycosylhydrolasesbasedonamino-acidsequencesimilarities，Biochem.J.280:309_316禾口HenrissatB.，andBairochA.，1996，Updatingthesequence-basedclassificationofglycosylhydrolases,Biochem.J.316:695_6960应当理解的是，就前文所述的物种而言，本发明涵盖了它们的完全和不完全状态，以及其它分类学上的等同物，例如无性型，不管它们已知的种名是什么。本领域技术人员可以很容易地识别出合适的等同物的身份。公众可以在若干保藏机构容易地获取这些物种的菌株，这样的机构诸如美国典型培养物保藏中心(ATCC)、德意志微生物和细胞培养物保藏中心(DSM)、真菌菌种保藏中心(CBS)和北方区域研究中心农业研究机构专利培养物保藏中心(NRRL)。此外，还可以使用上文所述的探针，从包括从自然界(例如土壤、堆肥、水等等)分离的微生物在内的来源鉴定和获取这样的多肽。用于从天然生境分离微生物的技术是本领域中公知的。然后可以通过类似地筛选此类微生物的基因组文库或cDNA文库来获得所述多核苷酸。一旦用探针检测到了编码多肽的多核苷酸序列，就可以使用本领域普通技术人员公知的技术(参见例如Sambrook等，1989同上)分离或者克隆该多核苷酸。具有纤维素分解酶活性的多肽还包括融合的多肽或者可切割的融合多肽，其中另一多肽融合在所述多肽或其具有纤维素分解酶活性的片段的N-末端或C-末端。融合的多肽是通过将编码另一多肽的核苷酸序列(或其部分)融合到编码具有纤维素分解酶活性的多肽的核苷酸序列(或其部分)而产生的。用于产生融合多肽的技术是本领域已知的，包括将编码各多肽的编码序列连接起来使它们符合阅读框，并使得被融合的多肽的表达处于相同的启动子和终止子的控制之下。融合多肽还可以包含切割位点。融合蛋白一旦被分泌，该位点就被切割，从融合蛋白中释放出具有纤维素分解酶活性的多肽。切割位点的实例包括但不限于Kex2位点，其编码二肽Lys-Arg(Martin等，2003，J.Ind.Microbiol.Biotechnol.3:568_76；Svetina等，2000,J.Biotechnol.76:245_251；Rasmussen-ffilson等，1997,Appl.Environ.Microbiol.63:3488_3493；Ward等，1995，Biotechnology13:498_503；和Contreras等，1991，Biotechnology9:378-381)；Ile_(Glu或Asp)-Gly_Arg位点，其被因子Xa蛋白酶在精氨酸残基之后切割(Eaton等，1986，Biochem.25505-512)；Asp-Asp-Asp-Asp-Lys位点，其被肠激酶在赖氨酸之后切割(Collins-Racie等，1995，Biotechnology13:982-987)；His-Tyr-Glu位点或His-Tyr-Asp位点，其被GenenaseI切割(Carter等，1989，Proteins-Structure,Function,andGenetics6:240_248)；Leu-Val-Pro-Arg-Gly-Ser位点，其被凝血酶在Arg之后切割(Stevens，2003，DrugDiscoveryWorld4:35-48)；Glu-Asn-Leu-Tyr-Phe-Gln-Gly位点，其被TEV蛋白酶在Gin之后切割(Stevens，2003，同上)；以及Leu-Glu-Val-Leu-Phe-Gln-Gly-Pro位点，其被一种基因工程形式的人鼻病毒3C蛋白酶在Gin之后切割(Stevens，2003，同上)。在一个优选的方面，纤维素分解酶组合物包含葡糖苷酶；里氏木霉纤维二糖水解酶I(CEL7A)、里氏木霉纤维二糖水解酶II(CEL6A)和里氏木霉内切葡聚糖酶I(CEL7B)。在另一个优选的方面，纤维素分解酶组合物包含葡糖苷酶；里氏木霉纤维二糖水解酶I(CEL7A)、里氏木霉纤维二糖水解酶II(CEL6A)和里氏木霉内切葡聚糖酶I(CEL7B)，其还包含一种或多种选自下组的酶里氏木霉内切葡聚糖酶11(CEL5A)、里氏木霉内切葡聚糖酶V(CEL45A)和里氏木霉内切葡聚糖酶III(CEL12A)。在另一个优选的方面，纤维素分解酶组合物包含葡糖苷酶；里氏木霉纤维二糖水解酶I(CEL7A)、里氏木霉纤维二糖水解酶II(CEL6A)和里氏木霉内切葡聚糖酶I(CEL7B)，其还包含土生梭孢壳纤维二糖水解酶。在另一个优选的方面，纤维素分解酶组合物包含葡糖苷酶；里氏木霉纤维二糖水解酶I(CEL7A)、里氏木霉纤维二糖水解酶II(CEL6A)和里氏木霉内切葡聚糖酶I(CEL7B)，其还包含(1)一种或多种选自下组的酶里氏木霉内切葡聚糖酶II(CEL5A)、里氏木霉内切葡聚糖酶V(CEL45A)和里氏木霉内切葡聚糖酶III(CEL12A)，和/或还包含⑵土生梭孢壳纤维二糖水解酶。在另一个优选的方面，所述纤维素分解酶组合物包含选自下组的一种或多种(数种)组分有内切葡聚糖酶活性的嗜热毁丝霉CEL7多肽，有内切葡聚糖酶活性的ChrysosporiumlucknowenseCEL12多肽，有内切葡聚糖酶活性的ChrysosporiumlucknowenseCEL45多肽，有纤维二糖水解酶活性并具有纤维素结合域的ChrysosporiumlucknowenseCEL7多肽，和有纤维二糖水解酶活性而没有纤维素结合域的嗜热毁丝霉CEL7多肽。在另一个优选的方面，所述纤维素分解酶组合物包含有内切葡聚糖酶活性的嗜热毁丝霉CEL7多肽，有内切葡聚糖酶活性的ChrysosporiumlucknowenseCEL12多肽，有内切葡聚糖酶活性的ChrysosporiumlucknowenseCEL45多肽，有纤维二糖水解酶活性并具有纤维素结合域的CEL7多肽，和有纤维二糖水解酶活性而没有纤维素结合域的嗜热毁丝霉CEL7多肽。在另一个优选的方面，上述组合物还包含一种或多种(数种)具有葡糖苷酶的多肽。所述纤维素分解酶组合物还可以是商业制备物。适用于本发明的商业纤维素分解酶制备物的实例包括，例如，CELLUCLAST(可获自NovozymesA/S)和N0V0ZYM188(可获自NovozymesA/S)。其它可用的商品化制备物包括CELLUZYME、CEREFL0和ULTRAFL0(NovozymesA/S)，LAMINEX和SPEZYMECP(GenencorInt.),R0HAMENT7069ff(R6hmGmbH)，和FIBREZYMELDI，FIBREZYMELBR‘或VISCOSTAR150L(DyadicInternational,Inc.,Jupiter,FL,USA)。可用于本发明的其它纤维素分解蛋白在下列文献中有记载EP495，257、EP531，315、EP531，372、W089/09259、W094/07998、W095/24471、W096/11262、W096/29397、W096/034108、W097/14804、W098/08940、W098/012307、W098/13465、W098/015619、W098/015633、W098/028411、W099/06574、W099/10481、W099/025846、W099/025847、W099/031255、W02000/009707,W02002/050245、W02002/0076792、W02002/101078、W02003/027306、W02003/052054、W02003/052055、W02003/052056、W02003/052057、W02003/052118,W02004/016760,W02004/043980,W02004/048592,W02005/001065、W02005/028636、W02005/093050、W02005/093073、W02006/074005、W02006/117432、W02007/071818、W02007/071820、W02008/008070,W02008/008793、美国专利4，435，307、美国专利5，457，046、美国专利5，648，263、美国专利5，686，593、美国专利5，691，178、美国专利5，763，254、和美国专利5，776，757。本发明的方法中使用的纤维素分解蛋白可以通过利用本领域已知的程序，用含有合适的碳源及氮源和无机盐的营养培养基发酵上文提到的微生物菌株来加以生产(参见例如Bennett，J.W.禾口LaSure，L.(编辑)，MoreGeneManipulationsinFungi，AcademicPress,CA，1991)。合适的培养基可以从供应商获得，或者可以依照公开的组成(例如美国典型培养物保藏中心的目录中)来制备。适于生长和纤维素分解蛋白产生的温度范围及其它条件是本领域已知的(参见例如Bailey，J.E.和Ollis，D.F.，BiochemicalEngineeringFundamentals,McGraw-HillBookCompany,NY,1986)。发酵可以是任何培养细胞而导致纤维素分解蛋白的表达或分离的方法。因此，发25酵可以理解为包括在实验室或工业发酵罐中实施的摇瓶培养、或小规模或大规模发酵(包括连续、分批、补料分批或固态发酵)，其在合适的培养基中，在容许纤维素分解蛋白表达或分离的条件下进行。依照上述方法所得的纤维素分解蛋白可以从发酵培养基回收并通过如本文描述的常规程序加以纯化。具有纤维素分解增强活性的多肽在第一方面，具有纤维素分解增强活性的分离的多肽包含以下基序(motif)[ILMV]-P-X(4，5)-G-X-Y-[ILMV]-X-R-X-[EQ]-X(4)-[HNQ]禾口[Fff]-[TF]-K-[AIV],其中X是任何氨基酸，X(4，5)是在4或5个邻接位置上的任何氨基酸并且X(4)是在4个连邻接位置上的任何氨基酸。包含上述基序的分离的多肽可进一步包含H-X(1，2)-G-P-X(3)-[Yff]-[AILMV]，[EQ]-X-Y-X(2)-C_X_[EHQN]-[FILV]-X-[ILV]，或H-X(1,2)-G-P-X(3)-[Yff]-[AILMV]禾口[EQ]-X-Y-X(2)-C_X_[EHQN]-[FILV]-X-[ILV]，其中X是任何氨基酸，X(1，2)是在1个位置或2个邻接位置上的任何氨基酸，X(3)是在3个邻接位置上的任何氨基酸并且X(2)是在2个邻接位置上的任何氨基酸。在以上基序中，采用公认的IUPAC单字母氨基酸缩写。在优选的方面，具有纤维素分解增强活性的分离的多肽进一步包含H_X(1，2)-G-P-X(3)-[YW]-[AILMV]。在另一优选的方面，具有纤维素分解增强活性的分离的多肽还包含[EQ]-X-Y-X(2)-C-X-[EHQN]-[FILV]_X_[ILV]。在另一优选的方面，具有纤维素分解增强活性的分离的多肽还包含H-X(1，2)-G-P-X(3)-[YW]-[AILMV]和[EQ]-X-Y-X(2)-C-X-[EHQN]-[FILV]-X-[ILV]。在第二方面，具有纤维素分解增强活性的分离的多肽包含以下基序[ILMV]-P-x(4，5)-G-X-Y-[ILMV]-x-R-x-[EQ]_x(3)-A-[HNQ]，其中x是任何氨基酸，x(4，5)是在4或5个邻接位置上的任何氨基酸以及x(3)是在3个邻接位置上的任何氨基酸。在以上基序中，采用公认的IUPAC单字母氨基酸缩写。在第三个方面，具有纤维素分解增强活性的分离的多肽具有的氨基酸序列与SEQIDN0:2、SEQIDNO:4、SEQIDNO:6、SEQIDNO:8或SEQIDNO:10、SEQIDN0:12或SEQIDNO14的成熟多肽具有优选至少60%，更优选至少65%，更优选至少70%，更优选至少75%，更优选至少80%，更优选至少85%，甚至更优选至少90%，最优选至少95%，并且甚至最优选至少96%、97%、98%或99%的同一性程度，所述多肽具有纤维素分解增强活性(下文中的“同源多肽”)。在优选的方面，所述同源多肽具有的氨基酸序列与SEQIDN0:2、SEQIDNO:4、SEQIDNO:6、SEQIDNO8或SEQIDNO:10、SEQIDNO:12或SEQIDNO14的成熟多肽有十个氨基酸，优选五个氨基酸，更优选四个氨基酸，甚至更优选三个氨基酸，最优选两个氨基酸以及甚至最优选一个氨基酸的不同。具有纤维素分解增强活性的多肽优选包含SEQIDNO2的氨基酸序列或其等位变体；或它们的具有纤维素分解增强活性的片段。在优选的方面，所述多肽包含SEQIDNO2的氨基酸序列。在另一优选的方面，所述多肽包含SEQIDNO:2的成熟多肽。在另一优选的方面，所述多肽包含SEQIDN02的氨基酸20至326，或其等位变体；或它们的具有纤维素分解增强活性的片段。在另一优选的方面，所述多肽包含SEQIDNO:2的氨基酸20至326。在另一优选的方面，所述多肽由SEQIDNO:2的氨基酸序列或其等位变体组成；或者由它们具有纤维素分解增强活性的片段组成。在另一优选的方面，所述多肽由SEQIDNO2的氨基酸序列组成。在另一优选的方面，所述多肽由SEQIDNO:2的成熟多肽组成。在另一优选的方面，所述多肽由SEQIDNO2的氨基酸20至326或其等位变体组成；或者由它们的具有纤维素分解增强活性的片段组成。在另一优选的方面，所述多肽由SEQIDN0:2的氨基酸20至326组成。具有纤维素分解增强活性的多肽优选包含SEQIDNO:4的氨基酸序列或其等位变体；或者它们的具有纤维素分解增强活性的片段。在优选的方面，所述多肽包含SEQIDNO4的氨基酸序列。在另一优选的方面，多肽包含SEQIDNO:4的成熟多肽。在另一优选的方面，所述多肽包含SEQIDN04的氨基酸18至240，或其等位变体；或它们的具有纤维素分解增强活性的片段。在另一优选的方面，所述多肽包含SEQIDNO:4的氨基酸18至240。在另一优选的方面，所述多肽由SEQIDNO:4的氨基酸序列或其等位变体组成；或由它们的具有纤维素分解增强活性的片段组成。在另一优选的方面，所述多肽由SEQIDN0:4的氨基酸序列组成。在另一优选的方面，所述多肽由SEQIDNO:4的成熟多肽组成。在另一优选的方面，所述多肽由SEQIDNO4的氨基酸18至240或其等位变体组成；或由它们的具有纤维素分解增强活性的片段组成。在另一优选的方面，所述多肽由SEQIDN04的氨基酸18至240组成。具有纤维素分解增强活性的多肽优选包含SEQIDNO6的氨基酸序列或其等位变体；或它们的具有纤维素分解增强活性的片段。在优选的方面，所述多肽包含SEQIDNO6的氨基酸序列。在另一优选的方面，所述多肽包含SEQIDNO:6的成熟多肽。在另一优选的方面，所述多肽包含SEQIDN06的氨基酸20至258，或其等位变体；或它们的具有纤维素分解增强活性的片段。在另一优选的方面，所述多肽包含SEQIDNO:6的氨基酸20至258。在另一优选的方面，所述多肽由SEQIDNO:6的氨基酸序列或其等位变体组成；或由它们的具有纤维素分解增强活性的片段组成。在另一优选的方面，所述多肽由SEQIDNO6的氨基酸序列组成。在另一优选的方面，所述多肽由SEQIDNO:6的成熟多肽组成。在另一优选的方面，所述多肽由SEQIDNO6的氨基酸20至258或其等位变体组成；或由它们的具有纤维素分解增强活性的片段组成。在另一优选的方面，所述多肽由SEQIDN06的氨基酸20至258组成。具有纤维素分解增强活性的多肽优选包含SEQIDNO8的氨基酸序列或其等位变体；或它们的具有纤维素分解增强活性的片段。在优选的方面，所述多肽包含SEQIDNO8的氨基酸序列。在另一优选的方面，所述多肽包含SEQIDNO:8的成熟多肽。在另一优选的方面，所述多肽包含SEQIDN08的氨基酸19至226，或其等位变体；或它们的具有纤维素分解增强活性的片段。在另一优选的方面，所述多肽包含SEQIDNO:8的氨基酸19至226。在另一优选的方面，所述多肽由SEQIDNO:8的氨基酸序列或其等位变体组成；或由它们的具有纤维素分解增强活性的片段组成。在另一优选的方面，所述多肽由SEQIDNO8的氨基酸序列组成。在另一优选的方面，所述多肽由SEQIDNO:8的成熟多肽组成。在另一优选的方面，所述多肽由SEQIDNO8的氨基酸19至226或其等位变体组成；或由它们的具有纤维素分解增强活性的片段组成。在另一优选的方面，所述多肽由SEQIDN08的氨基酸19至226组成。具有纤维素分解增强活性的多肽优选包含SEQIDNO10的氨基酸序列或其等位变体；或它们的具有纤维素分解增强活性的片段。在优选的方面，所述多肽包含SEQIDNO10的氨基酸序列。在另一优选的方面，所述多肽包含SEQIDN0:10的成熟多肽。在另一优选的方面，所述多肽包含SEQIDNO:10的氨基酸20至304，或其等位变体；或它们的具有纤维素分解增强活性的片段。在另一优选的方面，所述多肽包含SEQIDN0:10的氨基酸20至304。在另一优选的方面，所述多肽由SEQIDNO10的氨基酸序列或其等位变体组成；或由它们的具有纤维素分解增强活性的片段组成。在另一优选的方面，所述多肽由SEQIDNO:10的氨基酸序列组成。在另一优选的方面，所述多肽由SEQIDN0:10的成熟多肽组成。在另一优选的方面，所述多肽由SEQIDNO:10的氨基酸20至304或其等位变体组成；或由它们的具有纤维素分解增强活性的片段组成。在另一优选的方面，所述多肽由SEQIDNO10的氨基酸20至304组成。具有纤维素分解增强活性的多肽优选包含SEQIDNO12的氨基酸序列或其等位变体；或它们的具有纤维素分解增强活性的片段。在优选的方面，所述多肽包含SEQIDNO12的氨基酸序列。在另一优选的方面，所述多肽包含SEQIDN0:12的成熟多肽。在另一优选的方面，所述多肽包含SEQIDNO:12的氨基酸23至250，或其等位变体；或它们的具有纤维素分解增强活性的片段。在另一优选的方面，所述多肽包含SEQIDN0:12的氨基酸23至250。在另一优选的方面，所述多肽由SEQIDNO12的氨基酸序列或其等位变体组成；或由它们的具有纤维素分解增强活性的片段组成。在另一优选的方面，所述多肽由SEQIDNO:12的氨基酸序列组成。在另一优选的方面，所述多肽由SEQIDNO12的成熟多肽组成。在另一优选的方面，所述多肽由SEQIDNO:12的氨基酸23至250或其等位变体组成；或由它们的具有纤维素分解增强活性的片段组成。在另一优选的方面，所述多肽由SEQIDNO12的氨基酸23至250组成。具有纤维素分解增强活性的多肽优选包含SEQIDNO14的氨基酸序列或其等位变体；或它们的具有纤维素分解增强活性的片段。在优选的方面，所述多肽包含SEQIDNO14的氨基酸序列。在另一优选的方面，所述多肽包含SEQIDN0:14的成熟多肽。在另一优选的方面，所述多肽包含SEQIDNO:14的氨基酸20至249，或其等位变体；或它们的具有纤维素分解增强活性的片段。在另一优选的方面，所述多肽包含SEQIDN0:14的氨基酸20至249。在另一优选的方面，所述多肽由SEQIDNO14的氨基酸序列或其等位变体组成；或由它们的具有纤维素分解增强活性的片段组成。在另一优选的方面，所述多肽由SEQIDNO:14的氨基酸序列组成。在另一优选的方面，所述多肽由SEQIDN0:14的成熟多肽组成。在另一优选的方面，所述多肽由SEQIDNO14的氨基酸20至249或其等位变体组成；或由它们的具有纤维素分解增强活性的片段组成。在另一优选的方面，所述多肽由SEQIDNO14的氨基酸20至249组成。SEQIDNO2的成熟多肽的片段优选包含至少277个氨基酸残基、更优选至少287个氨基酸残基、最优选至少297个氨基酸残基。SEQIDNO:4的成熟多肽的片段优选包含至少185个氨基酸残基、更优选至少195个氨基酸残基、最优选至少205个氨基酸残基。SEQIDNO6的成熟多肽的片段优选包含至少200个氨基酸残基、更优选至少212个氨基酸残28基、最优选至少224个氨基酸残基。SEQIDNO:8的成熟多肽的片段优选包含至少175个氨基酸残基、更优选至少185个氨基酸残基、最优选至少195个氨基酸残基。SEQIDNO10的成熟多肽的片段优选包含至少240个氨基酸残基、更优选至少255个氨基酸残基、最优选至少270个氨基酸残基。SEQIDNO:12的成熟多肽的片段优选包含至少175个氨基酸残基、更优选至少190个氨基酸残基、最优选至少205个氨基酸残基。SEQIDN0:14的成熟多肽的片段优选包含至少200个氨基酸残基、更优选至少210个氨基酸残基、最优选至少220个氨基酸残基。SEQIDNO1的成熟多肽编码序列的子序列优选包含至少831个核苷酸、更优选至少861个核苷酸、最优选至少891个核苷酸。SEQIDNO:3的成熟多肽编码序列的子序列优选包含至少555个核苷酸、更优选至少585个核苷酸、最优选至少615个核苷酸。SEQIDNO5的成熟多肽编码序列的子序列优选包含至少600个核苷酸、更优选至少636个核苷酸、最优选至少672个核苷酸。SEQIDNO:7的成熟多肽编码序列的子序列优选包含至少525个核苷酸、更优选至少555个核苷酸、最优选至少585个核苷酸。SEQIDN09的成熟多肽编码序列的子序列优选包含至少720个核苷酸、更优选至少765个核苷酸、最优选至少810个核苷酸。SEQIDNO:11核苷酸67-796的成熟多肽编码序列的子序列优选包含至少525个核苷酸、更优选至少570个核苷酸、最优选至少615个核苷酸。SEQIDNO13的成熟多肽编码序列的子序列优选包含至少600个核苷酸、更优选至少630个核苷酸、最优选至少660个核苷酸。在第四个方面，所述具有纤维素分解增强活性的分离的多肽是由在至少非常低严紧度条件、优选至少低严紧度条件、更优选至少中严紧度条件、更优选至少中_高严紧度条件、进一步更优选至少高严紧度条件、最优选至少非常高严紧度条件下与以下序列杂交的多核苷酸编码的(i)SEQIDN0:1、SEQIDNO:3、SEQIDNO:5、SEQIDNO:7、SEQIDNO:9、SEQIDN0:11或SEQIDNO:13的成熟多肽编码序列，(ii)SEQIDN0:1、SEQIDNO:3、SEQIDNO5或SEQIDNO11的成熟多肽编码序列含有的cDNA序列，或者包含SEQIDNO:7、SEQIDNO9或SEQIDNO13的成熟多肽编码序列的基因组DNA序列，(iii)(i)或(ii)的子序列，或者(iv)(i)、(ii)或(iii)的全长互补链(J.Sambrook，E.F.Fritsch，and1\]\&111土&忉8，1989，同上)。SEQIDN0:1、SEQIDNO:3、SEQIDNO:5、SEQIDNO:7、SEQIDN0:9、SEQIDN0:11或SEQIDNO:13的成熟多肽编码序列的子序列包含至少100个邻接核苷酸或优选至少200个邻接核苷酸。而且，所述子序列可编码具有纤维素分解增强活性的多肽片段。在一个优选的方面，所述成熟多肽编码序列是SEQIDNO:1的核苷酸388-1332、SEQIDNO3的核苷酸98-821、SEQIDN05的核苷酸126-978、SEQIDNO7的核苷酸55-678、SEQIDNO9的核苷酸58-912、SEQIDNO11的核苷酸67-796或SEQIDNO13的核苷酸77-766。同上所述，SEQIDNO:1、SEQIDNO:3、SEQIDNO:5、SEQIDNO:7、SEQIDNO9,SEQIDN0:11或SEQIDNO:13的核苷酸序列，或其子序列；以及SEQIDN0:2、SEQIDN0:4、SEQIDN0:6、SEQIDNO:8或SEQIDNO:10、SEQIDNO:12或SEQIDNO:14的氨基酸序列，或其片段可用于设计核酸探针以从不同属或种的菌株鉴定和克隆编码具有纤维素分解增强活性的多肽的DNA。就本发明而言，杂交表示核苷酸序列在非常低至非常高的严紧条件下与标记的核酸探针杂交，所述核酸探针对应于SEQIDNO:1、SEQIDNO:3、SEQIDNO:5、SEQIDNO7,SEQIDN0:9、SEQIDN0:11或SEQIDNO:13的成熟多肽编码序列、包含在SEQIDNO:USEQIDN0:3、SEQIDNO:5或SEQIDNO:11的成熟多肽编码序列中的cDNA序列、或包含SEQIDNO:7、SEQIDNO:9或SEQIDNO13的成熟多肽编码序列的基因组DNA序列、它的全长互补链或其亚序列，如上文所述。在优选的方面，核酸探针是SEQIDNO:1的成熟多肽编码序列。在另一优选的方面，核酸探针是SEQIDNO:1的核苷酸388至1332。在另一优选的方面，核酸探针是编码SEQIDNO:2的多肽的多核苷酸序列，或其亚序列。在另一优选的方面，核酸探针是SEQIDNO:1。在另一优选的方面，核酸探针是包含在质粒PEJG120中的多核苷酸序列，所述质粒包含在大肠杆菌NRRLB-30699中，其中它的多核苷酸序列编码具有纤维素分解增强活性的多肽。在另一优选的方面，核酸探针是包含在质粒PEJG120中的成熟多肽编码序列，所述质粒包含在大肠杆菌NRRLB-30699中。在另一优选的方面，核酸探针是SEQIDNO:3的成熟多肽编码序列。在另一优选的方面，核酸探针是SEQIDNO:3的核苷酸98至821。在另一优选的方面，核酸探针是编码SEQIDNO:4的多肽的多核苷酸序列，或其亚序列。在另一优选的方面，核酸探针是SEQIDNO:3。在另一优选的方面，核酸探针是包含在质粒pTter61C中的多核苷酸序列，所述质粒包含在大肠杆菌NRRLB-30813中，其中它的多核苷酸序列编码具有纤维素分解增强活性的多肽。在另一优选的方面，核酸探针是包含在质粒pTter61C中的成熟多肽编码序列，所述质粒包含在大肠杆菌NRRLB-30813中。在另一优选的方面，核酸探针是SEQIDNO:5的成熟多肽编码序列。在另一优选的方面，核酸探针是SEQIDNO:5的核苷酸126至978。在另一优选的方面，核酸探针是编码SEQIDNO:6的多肽的多核苷酸序列，或其亚序列。在另一优选的方面，核酸探针是SEQIDNO:5。在另一优选的方面，核酸探针是包含在质粒pTter61D中的多核苷酸序列，所述质粒包含在大肠杆菌NRRLB-30812中，其中它的多核苷酸序列编码具有纤维素分解增强活性的多肽。在另一优选的方面，核酸探针是包含在质粒PTter61D中的成熟多肽编码序列，所述质粒包含在大肠杆菌NRRLB-30812中。在另一优选的方面，核酸探针是SEQIDNO:7的成熟多肽编码序列。在另一优选的方面，核酸探针是SEQIDNO:7的核苷酸55至678。在另一优选的方面，核酸探针是编码SEQIDNO:8的多肽的多核苷酸序列，或其亚序列。在另一优选的方面，核酸探针是SEQIDNO:7。在另一优选的方面，核酸探针是包含在质粒pTter61E中的多核苷酸序列，所述质粒包含在大肠杆菌NRRLB-30814中，其中它的多核苷酸序列编码具有纤维素分解增强活性的多肽。在另一优选的方面，核酸探针是包含在质粒PTter61E中的成熟多肽编码序列，所述质粒包含在大肠杆菌NRRLB-30814中。在另一优选的方面，核酸探针是SEQIDNO:9的成熟多肽编码序列。在另一优选的方面，核酸探针是SEQIDNO:9的核苷酸58至912。在另一优选的方面，核酸探针是编码SEQIDNO:10的多肽的多核苷酸序列，或其亚序列。在另一优选的方面，核酸探针是SEQIDNO:9。在另一优选的方面，核酸探针是包含在质粒pTter61G中的多核苷酸序列，所述质粒包含在大肠杆菌NRRLB-30811中，其中它的多核苷酸序列编码具有纤维素分解增强活性的多肽。在另一优选的方面，核酸探针是包含在质粒pTter61G中的成熟多肽编码序列，所述质粒包含在大肠杆菌NRRLB-30811中。在另一优选的方面，核酸探针是SEQIDNO11的成熟多肽编码序列。在另一优选的方面，核酸探针是SEQIDNO:11的核苷酸67至796。在另一优选的方面，核酸探针是编码SEQIDN0:12的多肽的多核苷酸序列，或其亚序列。在另一优选的方面，核酸探针是SEQIDNO:11。在另一优选的方面，核酸探针是包含在质粒PDZA2-7中的多核苷酸序列，所述质粒包含在大肠杆菌NRRLB-30704中，其中它的多核苷酸序列编码具有纤维素分解增强活性的多肽。在另一优选的方面，核酸探针是包含在质粒PDZA2-7中的成熟多肽编码序列，所述质粒包含在大肠杆菌NRRLB-30704中。在另一优选的方面，核酸探针是SEQIDNO13的成熟多肽编码序列。在另一优选的方面，核酸探针是SEQIDNO:13的核苷酸77至766。在另一优选的方面，核酸探针是编码SEQIDNO:14的多肽的多核苷酸序列，或其亚序列。在另一优选的方面，核酸探针是SEQIDN0:13。在另一优选的方面，核酸探针是包含在质粒pTr333中的多核苷酸序列，所述质粒包含在大肠杆菌NRRLB-30878中，其中它的多核苷酸序列编码具有纤维素分解增强活性的多肽。在另一优选的方面，核酸探针是包含在质粒PTr333中的成熟多肽编码序列，所述质粒包含在大肠杆菌NRRLB-30878中。对于长度至少100个核苷酸的长探针，非常低至非常高的严紧条件如在本文中所定义。对于长度至少100个核苷酸的长探针，载体材料的最终洗涤如在本文中定义。对于长度大约15个核苷酸至大约70个核苷酸的短探针，严紧条件如本文所定义。对于长度大约15个核苷酸至大约70个核苷酸的短探针，载体材料的最终洗涤如在本文中定义。在第五方面，具有纤维素分解增强活性的多肽由包含如下核苷酸序列或由如下核苷酸序列组成的多核苷酸编码，所述核苷酸序列与SEQIDNO=USEQIDNO:3、SEQIDNO:5、SEQIDNO:7、SEQIDNO:9、SEQIDNO11或SEQIDNO13的成熟多肽编码序列具有优选至少60%，更优选至少65%，更优选至少70%，更优选至少75%，甚至更优选至少80%，更优选至少85%，甚至更优选至少90%，最优选至少95%，并且甚至最优选至少96%、97%、98%或99%的同一性程度，其编码具有纤维素分解增强活性的多肽。在一个优选的方面，成熟多肽编码序列是SEQIDNO1的核苷酸388至1332、SEQIDNO3的核苷酸98至821、SEQIDNO5的核苷酸126至978、SEQIDNO7的核苷酸55至678、SEQIDNO9的核苷酸58至912、SEQIDNO11的核苷酸67至796、SEQIDNO13的核苷酸77至766。参见本文中的多核苷酸部分。在第六个方面，具有纤维素分解增强活性的多肽是人工变体，所述人工变体包含取代、缺失和/或插入一个或多个(几个)氨基酸的SEQIDNO:2、SEQIDNO:4、SEQIDNO:6、SEQIDNO8或SEQIDNO:10、SEQIDNO:12或SEQIDNO14的成熟多肽或其同源序列。制备这样的人工变体的方法如上所述。SEQIDNO:2、SEQIDNO:4、SEQIDNO:6、SEQIDNO:8、SEQIDNO:10、SEQIDNO:12或SEQIDNO14的成熟多肽的氨基酸取代、缺失和/或插入的总数是10，优选9，更优选8，更优选7，更优选至多6，更优选5，更优选4，甚至更优选3，最优选2，并且甚至最优选1。具有纤维素分解增强活性的多肽的来源具有纤维素分解增强活性的多肽可从任何属的微生物获得。在一个优选的方面，从给定来源获得的多肽分泌至胞外。具有纤维素分解增强活性的多肽可以是细菌多肽。例如，所述多肽可以是革兰氏阳性细菌多肽，例如具有纤维素分解增强活性的芽孢杆菌属、链球菌属、链霉菌属、葡萄球菌属、肠球菌属、乳杆菌属、乳球菌属、梭菌属、地芽孢杆菌属或海洋芽孢杆菌属多肽；或者可以是革兰氏阴性细菌多肽，例如具有纤维素分解增强活性的大肠杆菌、假单胞菌属、沙门氏菌属、弯曲杆菌属、螺杆菌属、黄杆菌属、梭杆菌属、泥杆菌属、奈瑟氏菌属或脲原体属多肽。在优选的方面，所述多肽是具有纤维素分解增强活性的嗜碱芽孢杆菌、解淀粉芽孢杆菌、短芽孢杆菌、环状芽孢杆菌、克劳氏芽孢杆菌、凝结芽孢杆菌、坚强芽孢杆菌、灿烂芽孢杆菌、迟缓芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、巨大芽孢杆菌、短小芽孢杆菌、嗜热脂肪芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌或苏云金芽孢杆菌多肽。在另一优选的方面，所述多肽是具有纤维素分解增强活性的似马链球菌、酿脓链球菌、乳房链球菌或马链球菌兽瘟亚种多肽。在另一优选的方面，所述多肽是具有纤维素分解增强活性的不产色链霉菌、除虫链霉菌、天蓝色链霉菌、灰色链霉菌或浅青紫链霉菌多肽。具有纤维素分解增强活性的多肽还可以是真菌多肽，并且更优选是酵母多肽例如具有纤维素分解增强活性的念珠菌属、克鲁维酵母属、毕赤酵母属、酵母属、裂殖酵母属或西洋蓍霉属多肽；或更优选是丝状真菌多肽例如具有纤维素分解增强活性的枝顶孢霉属、蘑菇属、链格孢属、曲霉属、短梗霉属、葡萄座腔菌属、拟蜡菌属、毛壳菌属、金孢子菌属、麦角属、旋孢腔菌属、Coprinopsis,Coptotermes、棒囊壳属、栗疫病菌属、隐球菌属、色二孢属、黑耳属、网孢菌属、镰孢属、赤霉属、全鞭毛虫属、腐质霉属、耙菌属、香菇属、小球腔菌属、梨孢菌属、Melanocarpus、多孔菌属、毛霉属、毁丝霉属、新考玛脂霉属、脉孢菌属、拟青霉属、青霉属、平革菌属、瘤胃壶菌属、Poitrasia、假黑盘菌属、Pseudotrichonympha,根毛霉属、裂褶菌属、柱顶孢属、踝节菌属、嗜热子囊菌属、梭孢壳属、弯颈霉属或木霉属、Trichophaea、轮枝孢属、小包脚菇属、或炭角菌属(Xylaria)多肽。在优选的方面，所述多肽是具有纤维素分解增强活性的卡尔酵母、酿酒酵母、糖化酵母、道格拉氏酵母、克鲁弗酵母、诺地酵母或卵形酵母多肽。在另一个优选的方面，所述多肽是具有纤维素分解增强活性的解纤维枝顶孢霉、棘孢曲霉、泡盛曲霉、烟曲霉、臭曲霉、日本曲霉、构巢曲霉黑曲霉、米曲霉、嗜角质金抱子菌、Chrysosporiumlucknowense、热带金抱子菌、Chrysosporiummerdarium、Chrysosporiuminops、Chrysosporiumpannicola>Chrysosporiumqueenslandicum>Chrysosporiumzonatum、杆孢状镰孢、禾谷镰孢、库威镰孢、大刀镰孢、禾本科镰孢、禾赤镰孢、异孢镰孢、合欢木镰孢、尖镰孢、多枝镰孢、粉红镰孢、接骨木镰孢、肤色镰孢、拟分枝孢镰孢、硫色镰孢、圆镰孢、拟丝孢镰孢、镶片镰孢、灰腐质霉(Humicolagrisea)、特异腐质霉、疏棉状腐质霉、乳白耙菌、米赫毛霉、嗜热毁丝霉、粗糙脉孢菌、绳状青霉、产紫青霉、黄孢平革菌、无色梭孢壳、Thielaviaalbomyces、Thielaviaalbopilosa、澳洲梭孢壳、Thielaviafimeti、/J、f包〒—冑、Thielaviaovispora>Thielaviaperuviana^ThieIaviaspededonium、毛梭孢壳、Thielavissubthermophila、土生梭孢霉、哈茨木霉、康宁木霉、长枝木霉、里氏木霉、绿色木霉或Trichophaeasaccata多肽。在更优选的方面，多肽是具有纤维素分解增强活性的土生梭孢霉多肽。在最优选的方面。多肽是具有纤维素分解增强活性的土生梭孢霉NRRL8126多肽，例如，SEQIDNO2、4、6、8或10的成熟多肽或其具有纤维素分解增强活性的片段。在另一更优选的方面，多肽是橙色嗜热子囊菌多肽，例如，SEQIDN0:12的成熟多肽。在另一更优选的方面，多肽是具有纤维素分解增强活性的里氏木酶多肽。在另一最优选的方面，多肽是具有纤维素分解增强活性的里氏木酶RutC30(ATCC56765)多肽，例如，SEQIDNO:14的成熟多肽或其具有纤维素分解增强活性的片段。可理解的是对于前述的种，本发明包含完全和不完全阶段两种，和其它分类学的等同物，例如无性型，无论它们已知的种名。本领域熟练技术人员将轻易地识别适合的等同物的身份。公众可以在若干保藏机构容易地获取这些物种的菌株，这样的机构诸如美国典型培养物保藏中心(ATCC)、德意志微生物和细胞培养物保藏中心(DSM)，真菌菌种保藏中心(CBS)和北方区域研究中心农业研究机构专利培养物保藏中心(NRRL)。此外，还可以使用本文描述的上述探针，从包括从自然界(例如土壤、堆肥、水等等)分离的微生物在内的其它来源鉴定和获取这样的多肽。具有纤维素分解增强活性的多肽还包括融合多肽或者可切割的融合多肽，其中另一多肽融合于具有纤维素分解增强活性的所述多肽或其片段的N-末端或C-末端，并如本文所述，还可以包含切割位点。具有纤维素分解活性的多肽及其多核苷酸的更多细节，请参见以参考方式并入本文的WO2005/074647、WO2005/074656和公布的美国专利申请序列号2007/0077630。编码具有纤维素分解增强活性的多肽的多核苷酸包含编码具有纤维素分解增强活性的多肽的核苷酸序列的多核苷酸可以被分离并用于实践本文所述的本发明的方法。多肽包含如下多核苷酸序列，所述多核苷酸序列与SEQIDN0:USEQIDNO:3、SEQIDNO:5、SEQIDNO:7、SEQIDNO:9、SEQIDNO11或4SEQIDNO13的成熟多肽编码序列具有优选至少60%，更优选至少65%，更优选至少70%，更优选至少75%，甚至更优选至少80%，更优选至少85%，甚至更优选至少90%，最优选至少95%，以及甚至最优选至少96%、97%、98%或99%的同一性程度，其编码具有纤维素分解增强活性的多肽。在优选的方面，所述核苷酸序列包含SEQIDNO:1或由SEQIDNO:1组成。在另一个更优选的方面，所述核苷酸序列包含质粒PEJG120中包含的序列或由该序列组成，所述质粒包含在大肠杆菌NRRLB-30699中。在另一个优选的方面，所述核苷酸序列包含或其组成为SEQIDNO:1的成熟多肽编码序列。在另一个更优选的方面，所述核苷酸序列包含或其组成为质粒PEJG120中包含的成熟多肽编码序列，所述质粒包含在大肠杆菌NRRLB-30699中。本发明还包含如下核苷酸序列，所述核苷酸序列编码具有SEQIDNO2的氨基酸序列或其成熟多肽的多肽，由于遗传密码的简并性，所述核苷酸序列不同于SEQIDNO:1。本发明还涉及SEQIDNO:1的亚序列，所述亚序列编码具有纤维素分解增强活性的SEQIDNO2的片段。在另一优选的方面，所述核苷酸序列包含SEQIDNO:3或由SEQIDNO3组成。在另一个更优选的方面，所述核苷酸序列包含或其组成为质粒pTter61C中包含的序列，所述质粒包含在大肠杆菌NRRLB-30813中。在另一个优选的方面，所述核苷酸序列包含SEQIDNO3的成熟多肽编码序列或由SEQIDNO3的成熟多肽编码序列组成。在另一个更优选的方面，所述核苷酸序列包含质粒pTter61C中包含的成熟多肽编码序列或由质粒pTter61C中包含的成熟多肽编码序列组成，所述质粒包含在大肠杆菌NRRLB-30813中。本发明还包含如下核苷酸序列，所述核苷酸序列编码具有SEQIDNO4的氨基酸序列或其成熟多肽的多肽，由于遗传密码的简并性，所述核苷酸序列不同于SEQIDNO:3。本发明还涉及SEQIDNO3的亚序列，所述亚序列编码具有纤维素分解增强活性的SEQIDNO4的片段。在另一优选的方面，所述核苷酸序列包含SEQIDNO:5或由SEQIDNO5组成。在另一个更优选的方面，所述核苷酸序列包含或其组成为质粒pTter61D中包含的序列，所述质粒包含在大肠杆菌NRRLB-30812中。在另一个优选的方面，所述核苷酸序列包含SEQIDNO5的成熟多肽编码序列或由SEQIDNO5的成熟多肽编码序列组成。在另一个更优选的方面，所述核苷酸序列包含质粒pTter61D中包含的成熟多肽编码序列或由质粒pTter61D中包含的成熟多肽编码序列组成，所述质粒包含在大肠杆菌NRRLB-30812中。本发明还包含如下核苷酸序列，所述核苷酸序列编码具有SEQIDNO6的氨基酸序列或其成熟多肽的多肽，由于遗传密码的简并性，所述核苷酸序列不同于SEQIDNO:5。本发明还涉及SEQIDNO5的亚序列，所述亚序列编码具有纤维素分解增强活性的SEQIDNO6的片段。在另一优选的方面，所述核苷酸序列包含SEQIDNO:7或由SEQIDNO7组成。在另一个更优选的方面，所述核苷酸序列包含或其组成为质粒pTter61E中包含的序列，所述质粒包含在大肠杆菌NRRLB-30814中。在另一个优选的方面，所述核苷酸序列包含SEQIDNO7的成熟多肽编码序列或由SEQIDNO7的成熟多肽编码序列组成。在另一个更优选的方面，所述核苷酸序列包含质粒pTter61E中包含的成熟多肽编码序列或由质粒pTter61E中包含的成熟多肽编码序列组成，所述质粒包含在大肠杆菌NRRLB-30814中。本发明还包含如下核苷酸序列，所述核苷酸序列编码具有SEQIDNO8的氨基酸序列或其成熟多肽的多肽，由于遗传密码的简并性，所述核苷酸序列不同于SEQIDNO:7。本发明还涉及SEQIDNO7的亚序列，所述亚序列编码具有纤维素分解增强活性的SEQIDNO8的片段。在另一优选的方面，所述核苷酸序列包含SEQIDNO:9或由SEQIDNO9组成。在另一个更优选的方面，所述核苷酸序列包含或其组成为质粒pTter61G中包含的序列，所述质粒包含在大肠杆菌NRRLB-30811中。在另一个优选的方面，所述核苷酸序列包含SEQIDNO9的成熟多肽编码序列或由SEQIDNO9的成熟多肽编码序列组成。在另一个更优选的方面，所述核苷酸序列包含质粒pTter61G中包含的成熟多肽编码序列或由质粒pTter61G中包含的成熟多肽编码序列组成，所述质粒包含在大肠杆菌NRRLB-30811中。本发明还包含如下核苷酸序列，所述核苷酸序列编码具有SEQIDNO10的氨基酸序列或其成熟多肽的多肽，由于遗传密码的简并性，所述核苷酸序列不同于SEQIDNO:9。本发明还涉及SEQIDNO9的亚序列，所述亚序列编码具有纤维素分解增强活性的SEQIDNO10的片段。在另一优选的方面，所述核苷酸序列包含SEQIDNO11或由SEQIDNO11组成。在另一个更优选的方面，所述核苷酸序列包含或其组成为质粒PDZA2-7中包含的序列，所述质粒包含在大肠杆菌NRRLB-30704中。在另一个优选的方面，所述核苷酸序列包含SEQIDNO:11的成熟多肽编码序列或由SEQIDNO:11的成熟多肽编码序列组成。在另一个更优选的方面，所述核苷酸序列包含质粒PDZA2-7中包含的成熟多肽编码序列或由质粒PDZA2-7中包含的成熟多肽编码序列组成，所述质粒包含在大肠杆菌NRRLB-30704中。本发明还包含如下核苷酸序列，所述核苷酸序列编码具有SEQIDNO:22的氨基酸序列或其成熟多肽的多肽，由于遗传密码的简并性，所述核苷酸序列不同于SEQIDNO=Il0本发明还涉及SEQIDNO:11的亚序列，所述亚序列编码具有纤维素分解增强活性的SEQIDNO12的片段。在另一优选的方面，所述核苷酸序列包含SEQIDNO13或由SEQIDNO13组成。在另一个更优选的方面，所述核苷酸序列包含或其组成为质粒pTr3337中包含的序列，所述质粒包含在大肠杆菌NRRLB-30878中。在另一个优选的方面，所述核苷酸序列包含SEQIDNO:13的成熟多肽编码序列或由SEQIDNO13的成熟多肽编码序列组成。在另一个更优选的方面，所述核苷酸序列包含质粒pTr3337中包含的成熟多肽编码序列或由质粒pTr3337中包含的成熟多肽编码序列组成，所述质粒包含在大肠杆菌NRRLB-30878中。本发明还包含如下核苷酸序列，所述核苷酸序列编码具有SEQIDNO14的氨基酸序列或其成熟多肽的多肽，由于遗传密码的简并性，所述核苷酸序列不同于SEQIDN0:13或其成熟多肽编码序列。本发明还涉及SEQIDNO:13的亚序列，所述亚序列编码具有纤维素分解增强活性的SEQIDNO14的片段。本发明还涉及在SEQIDNO=USEQIDN0:3、SEQIDN0:5、SEQIDNO:7、SEQIDNO:9、SEQIDNO11或SEQIDNO13的成熟多肽编码序列中包含至少一个突变的突变多核苷酸，其中所述突变核苷酸序列编码SEQIDNO:2、SEQIDNO:4、SEQIDNO:6、SEQIDNO:8或SEQIDNO10,SEQIDN0:12或SEQIDNO:14的成熟多肽。在优选的方面，所述成熟多肽是SEQIDNO2的氨基酸20至326，SEQIDNO4的氨基酸18至240，SEQIDNO6的氨基酸20至258，SEQIDNO8的氨基酸19至226或SEQIDNO10的氨基酸20至304，SEQIDNO:12的氨基酸23至250或SEQIDNO14的氨基酸20至249。在另一优选的方面，所述成熟多肽编码序列是SEQIDNO:1的核苷酸388至1332，SEQIDNO:3的核苷酸98至821，SEQIDNO5的核苷酸126至978，SEQIDNO7的核苷酸55至678，SEQIDNO9的核苷酸58至912，SEQIDNO11的核苷酸67至796，SEQIDNO13的核苷酸77至766。如早前所述，用于分离或克隆编码多肽的多核苷酸的技术是本领域内已知的，包括从基因组DNA分离，从cDNA制备，或其组合。所述多核苷酸也可以是编码具有纤维素分解增强活性的多肽的多核苷酸，所述多核苷酸在至少极低严紧条件下，优选至少低严紧条件下，更优选至少中严紧条件下，更优选至少中-高严紧条件下，甚至更优选至少高严紧条件下，并且最优选至少非常高严紧条件下，与以下杂交(i)SEQIDNOSEQIDNO:3、SEQIDNO:5、SEQIDN0:7、SEQIDNO:9、SEQIDNO11或SEQIDNO13的成熟多肽编码序列，(ii)包含在SEQIDNO:1、SEQIDN0:3、SEQIDNO:5或SEQIDNO11的成熟多肽编码序列中的cDNA序列或包含SEQIDNO:7、SEQIDNO:9或SEQIDNO13的成熟多肽编码序列的基因组DNA序列，或(iii)(i)或(ii)的全长互补链；或其等位变体和亚序列(Sambrook等，1989，同上)，如本文所定义。在优选的方面，成熟多肽编码序列是SEQIDNO:1的核苷酸388至1332，SEQIDNO:3的核苷酸98至821，SEQIDNO5的核苷酸126至978，SEQIDNO7的核苷酸55至678，SEQIDNO9的核苷酸58至912，SEQIDNO11的核苷酸67至796，或SEQIDNO13的核苷酸77至766。核酸构建体可以将编码具有纤维素分解增强活性的多肽或具有纤维素分解酶活性的多肽的分离的多核苷酸用多种方法进行操作，以通过构建核酸构建体提供多肽的表达，所述核酸构建体含有与一种或多种控制序列可操作连接的编码所述多肽的分离的多核苷酸，所述控制序列指导编码序列在合适的宿主细胞中在与这些控制序列相容的条件下表达。取决于表达载体，在插入载体之前对多核苷酸的序列进行操作可能是理想的或者必要的。使用重组DNA方法修饰多核苷酸序列的技术是本领域公知的。控制序列可以是合适的启动子序列，启动子序列是被宿主细胞所识别来表达编码这样的多肽的多核苷酸的核苷酸序列。启动子序列含有介导多肽表达的转录控制序列。启动子序列可以是任何在所选择的宿主细胞中显示转录活性的核苷酸序列，包括突变的、截短的和杂合的启动子，而且可以从对宿主细胞而言为同源或异源的胞外或胞内多肽获得。适于指导核酸构建体的转录，尤其是在细菌宿主细胞中转录的启动子的例子是获自大肠杆菌Iac操纵子、天蓝色链霉菌琼脂糖酶基因(dagA)、枯草芽孢杆菌果聚糖蔗糖酶基因(sacB)、地衣芽孢杆菌α-淀粉酶基因(amyL)、嗜热脂肪芽孢杆菌生麦芽糖淀粉酶基因(amyM)、解淀粉芽孢杆菌α-淀粉酶基因(amyQ)、地衣芽孢杆菌青霉素酶基因(penP)、枯草芽孢杆菌xylA和xylB基因、以及原核β-内酰胺酶基因的启动子(Villa-Kamaroff等，1978,ProceedingsoftheNationalAcademyofSciencesUSA75:3727_3731),禾口tac启动子(DeBoer等，1983,ProceedingsoftheNationalAcademyofSciencesUSA8021-25)οScientificAmerican,1980,242:74_94中"Usefulproteinsfromrecombinantbacteria"和Sambrook等，1989(同上)中描述了其它启动子。适于在丝状真菌宿主细胞中指导核酸构建体的转录的启动子的实例是从下列酶的基因获得的启动子米曲霉TAKA淀粉酶、米赫根毛霉(Rhizomucormiehei)天冬氨酸蛋白酶、黑曲霉中性α-淀粉酶、黑曲霉酸稳定性α-淀粉酶、黑曲霉或泡盛曲霉葡糖淀粉酶(glaA)、米赫根毛霉脂肪酶、米曲霉碱性蛋白酶、米曲霉磷酸丙糖异构酶、构巢曲霉乙酰胺酶、镶片镰孢淀粉葡糖苷酶(W000/56900)、镶片镰孢Daria(WC)00/56900)、镶片镰孢Quinn(ff000/56900)、尖镰孢胰蛋白酶样蛋白酶(W096/00787)、里氏木霉β-葡糖苷酶、里氏木霉纤维二糖水解酶I、里氏木霉纤维二糖水解酶II、里氏木霉内切葡聚糖酶I、里氏木霉内切葡聚糖酶II、里氏木霉内切葡聚糖酶III、里氏木霉内切葡聚糖酶IV、里氏木霉内切葡聚糖酶V、里氏木霉木聚糖酶I、里氏木霉木聚糖酶II、里氏木霉β-木糖苷酶；以及NA2-tpi启动子(来自黑曲霉中性α-淀粉酶基因和米曲霉磷酸丙糖异构酶基因的启动子的杂合体)；以及它们的突变、截短和杂合的启动子。在酵母宿主中，有用的启动子是从酿酒酵母烯醇化酶(ΕΝ0-1)、酿酒酵母半乳糖激酶(GALl)、酿酒酵母醇脱氢酶/甘油醛-3-磷酸脱氢酶(ADH1、ADH2/GAP)、酿酒酵母磷酸丙糖异构酶(TPI)、酿酒酵母金属硫蛋白(CUPl)和酿酒酵母3-磷酸甘油酸激酶的基因获得的。对酵母宿主细胞有用的其他启动子在Romanos等，1992，Yeast8:423_488中有记载。控制序列还可以是合适的转录终止子序列。终止子序列是被宿主细胞识别来终止转录的序列。终止子序列可操作地连接于编码多肽的核苷酸序列的3’末端。任何可在所选的宿主细胞中发挥功能的终止子都可以用于本发明。优选的用于丝状真菌宿主细胞的终止子是从米曲霉TAKA淀粉酶、黑曲霉葡糖淀粉酶、构巢曲霉邻氨基苯甲酸合酶、黑曲霉α-葡糖苷酶和尖镰孢胰蛋白酶样蛋白酶的基因获得的。优选的用于酵母宿主细胞的终止子是从酿酒酵母烯醇化酶、酿酒酵母细胞色素C(CYCl)和酿酒酵母甘油醛-3-磷酸脱氢酶的基因获得的。对酵母宿主细胞有用的其他终止子在Romanos等，1992(同上)中有记载。控制序列也可以是合适的前导序列，前导序列是mRNA中的一种不被翻译的区域，它对于宿主细胞进行的翻译而言是重要的。前导序列可操作地连接于编码多肽的核苷酸序列的5’末端。任何可在所选择的宿主细胞中发挥功能的前导序列都可以用于本发明。优选的用于丝状真菌宿主细胞的前导序列是从米曲霉TAKA淀粉酶和构巢曲霉磷酸丙糖异构酶的基因获得的。用于酵母宿主细胞的前导序列是从酿酒酵母烯醇化酶(ΕΝ0-1)、酿酒酵母3-磷酸甘油酸激酶、酿酒酵母α“因子和酿酒酵母醇脱氢酶/甘油醛-3-磷酸脱氢酶(ADH2/GAP)的基因获得的。控制序列还可以是聚腺苷酸化序列，聚腺苷酸化序列是一段与核苷酸序列的3’末端可操作连接的序列，转录后被宿主细胞所识别，作为向被转录的mRNA添加聚腺苷酸残基的信号。任何可在所选择的宿主细胞中发挥功能的聚腺苷酸化序列都可以用于本发明。优选的用于丝状真菌宿主细胞的聚腺苷酸化序列是从米曲霉TAKA淀粉酶、黑曲霉葡糖淀粉酶、构巢曲霉邻氨基苯甲酸合酶、尖镰孢胰蛋白酶样蛋白酶和黑曲霉α-葡糖苷酶的基因获得的。Guo和Sherman，1995，MolecularCellularBiology15:5983_5990记载了在酵母宿主细胞中有用的聚腺苷酸化序列。控制序列还可以是信号肽编码序列，其编码的氨基酸序列连接于多肽的氨基末端，并引导被编码的多肽进入细胞的分泌途径。核苷酸序列的编码序列的5’端可以固有地包含信号肽编码序列，该序列天然地以符合翻译阅读框的方式连接于编码区中编码分泌型多肽的区段。或者，编码序列的5’端可以包含对该编码序列而言为外源的信号肽编码序列。在编码序列天然地不包含信号肽编码序列的场合，可能需要外源信号肽编码序列。或者，可以简单地用外源信号肽编码序列取代天然信号肽编码序列以增强多肽的分泌。然而，引导被表达的多肽进入所选的宿主细胞的分泌途径，即分泌到培养基中的任何信号肽编码序列都可以用于本发明。对细菌宿主细胞有效的信号肽编码序列是从芽孢杆菌NCIB11837产麦芽糖淀粉酶、嗜热脂肪芽孢杆菌α-淀粉酶、地衣芽孢杆菌枯草蛋白酶、地衣芽孢杆菌β-内酰胺酶、嗜热脂肪芽孢杆菌中性蛋白酶(nprT、nprS、nprM)、和枯草芽孢杆菌prsA的基因获得的信号肽编码序列。Simonen和Palva，1993，MicrobiologicalReviews57109-137记载了其它信号肽。对丝状真菌宿主细胞有效的信号肽编码序列是从米曲霉TAKA淀粉酶、黑曲霉中性淀粉酶、黑曲霉葡糖淀粉酶、米赫根毛霉天冬氨酸蛋白酶、特异腐质霉纤维素酶、特异腐质霉内切葡聚糖酶V、和疏棉状腐质霉脂肪酶的基因获得的信号肽编码序列。在一个优选的方面，信号肽包含SEQIDNO:2的氨基酸1_19或者由SEQIDNO:2的氨基酸1-19组成。在另一个优选的方面，信号肽编码区包含SEQIDNO:1的核苷酸330-387或者由SEQIDNO1的核苷酸330-387组成。在另一个优选的方面，信号肽包含SEQIDNO:4的氨基酸1_17或者由SEQIDNO:4的氨基酸1-17组成。在另一个优选的方面，信号肽编码区包含SEQIDNO:3的核苷酸47-97或者由SEQIDNO3的核苷酸47-97组成。在另一个优选的方面，信号肽包含SEQIDNO:6的氨基酸1_19或者由SEQIDNO:6的氨基酸1-19组成。在另一个优选的方面，信号肽编码区包含SEQIDNO:5的核苷酸69-125或者由SEQIDNO5的核苷酸69-125组成。在另一个优选的方面，信号肽包含SEQIDNO:8的氨基酸1_18或者由SEQIDNO:8的氨基酸1-18组成。在另一个优选的方面，信号肽编码区包含SEQIDNO:7的核苷酸1-54或者由SEQIDNO7的核苷酸1_54组成。在另一个优选的方面，信号肽包含SEQIDNO10的氨基酸1_19或者由SEQIDNO:10的氨基酸1-19组成。在另一个优选的方面，信号肽编码区包含SEQIDNO:9的核苷酸1-57或者由SEQIDNO9的核苷酸1-57组成。在另一个优选的方面，信号肽包含SEQIDNO12的氨基酸1_22或者由SEQIDNO:12的氨基酸1-22组成。在另一个优选的方面，信号肽编码区包含SEQIDNO:11的核苷酸1-66或者由SEQIDNO11的核苷酸1_66组成。在另一个优选的方面，信号肽包含SEQIDNO14的氨基酸1_19或者由SEQIDNO:14的氨基酸1-19组成。在另一个优选的方面，信号肽编码区包含SEQIDNO13的核苷酸20-76或者由SEQIDNO13的核苷酸20-76组成。对酵母宿主细胞有用的信号肽是从酿酒酵母α-因子和酿酒酵母转化酶获得的。其它有用的信号肽编码序列在Romanos等，1992，同上文中有记载。控制序列还可以是前肽编码序列，其编码位于多肽的氨基末端的氨基酸序列。所得的多肽被称为酶原(proenzyme)或原多肽(propolyp印tide)(或者在某些情况下称为酶原(zymogen))。前多肽通常是没有活性的，并且通过将前肽从原多肽中催化或自催化切割出来可以转化为成熟的活性多肽。前肽编码序列可以从枯草芽孢杆菌碱性蛋白酶(aprE)、枯草芽孢杆菌中性蛋白酶(nprT)、酿酒酵母α-因子、米赫根毛霉天冬氨酸蛋白酶和嗜热毁丝霉漆酶的基因获得(W095/33836)。在信号肽和前肽序列都存在于多肽氨基末端的场合，前肽序列位于多肽氨基末端的相邻位置，而信号肽序列位于前肽序列的氨基末端的相邻位置。添加这样的调控序列可能也是理想的该序列容许相对于宿主细胞的生长调节多肽的表达。调控系统的例子有导致基因的表达响应于化学或物理刺激(包括调控性化合物的存在)而开启或关闭的那些调控系统。原核系统中的调控系统包括lac、tac、和trp操纵基因系统。在酵母中，可以使用ADH2系统或GALl系统。在丝状真菌中，可以使用TAKAα-淀粉酶启动子、黑曲霉葡糖淀粉酶启动子和米曲霉葡糖淀粉酶启动子作为调控序列。其他调控序列的例子有使基因能够扩增的调控序列。在真核系统中，这些调控序列包括在甲氨蝶呤存在下被扩增的二氢叶酸还原酶基因，和在重金属存在下被扩增的金属硫蛋白基因。在这些场合，编码多肽的核苷酸序列将与调控序列可操作地连接。表达载体可以将本文中描述的各种核酸和控制序列连接起来产生重组表达载体，其包含编码具有纤维素分解增强活性的多肽或具有纤维素分解酶活性的多肽、启动子以及转录和翻译终止信号。所述表达载体可包括一个或多个便利的限制性位点以便于在这些位点上插入或替换编码多肽的多核苷酸序列。或者，可以将多核苷酸序列或包含该序列的核酸构建体插入合适的表达用载体来表达编码这样的多肽的多核苷酸序列。在生成表达载体的过程中，将编码序列置于载体中使得该编码序列与合适的表达用控制序列可操作地连接。重组表达载体可以是任何可便利地进行重组DNA程序并且能够带来多核苷酸序列的表达的载体(例如质粒或病毒)。载体的选择通常将取决于载体与该载体要导入的宿主细胞的相容性。载体可以是线性的或者闭合环状的质粒。所述载体可以是自主复制的载体，即作为染色体外实体存在，其复制不依赖于染色体复制的载体，例如质粒、染色体外元件、微型染色体、或人工染色体。载体可含有任何用于保证自我复制的工具。或者，载体可以是这样的载体，当它被导入宿主细胞时，整合到基因组中并随同它整合到其中的染色体一起复制。另外，可以使用单一的载体或质粒，或两个或更多个共同包含要导入宿主细胞基因组的总DNA的载体或质粒，或者转座子。载体优选含有一个或多个选择标记，这些标记容许容易地选择经过转化、转染、转导等的细胞。选择标记是这样的基因，其产物可提供杀生物剂或病毒抗性、对重金属的抗性，对营养缺陷型的原养性，等等。细菌选择标记的例子有来自枯草芽孢杆菌或者地衣芽孢杆菌的dal基因，或者赋予抗生素抗性如氨苄青霉素、卡那霉素、氯霉素或四环素抗性的标记。用于酵母宿主细胞的合适标记有ADE2、HIS3、LEU2、LYS2、MET3、TRPl和URA3。用于丝状真菌宿主细胞的选择标记包括但不限于amdS(乙酰胺酶)、argB(鸟氨酸氨甲酰基转移酶)、bar(草铵膦乙酰转移酶)、hph(潮霉素磷酸转移酶)、niaD(硝酸还原酶)、pyrG(乳清苷-5，-磷酸脱羧酶)、sC(硫酸腺苷转移酶)，和trpC(邻氨基苯甲酸合酶)，以及它们的等同物。优选用于曲霉细胞的是构巢曲霉或米曲霉的amdS和pyrG基因，以及吸水链霉菌(Str印tomyceshygroscopicus)的bar基因。载体优选包含容许载体整合到宿主细胞的基因组或者容许载体在细胞中不依赖基因组自主复制的元件。为了整合到宿主细胞基因组中，载体可能依赖多核苷酸的编码多肽的序列或者载体的任何其它元件来通过同源或异源重组整合到基因组中。或者，载体可含有附加的核苷酸序列，用来指导通过同源重组在染色体上的精确位置整合到宿主细胞的基因组中。为了增加在精确位置上整合的机率，整合元件优选应含有足够数目的与相应靶序列具有高度同一性的核酸，诸如100-10，000个碱基对，优选400-10，000个碱基对，最优选800-10，000个碱基对，以提高同源重组的概率。整合元件可以是任何与宿主细胞基因组中的靶序列同源的序列。此外，整合元件可以是非编码的或者编码的核苷酸序列。此外，载体可以通过非同源重组整合到宿主细胞基因组中。为了自主复制，载体可进一步包含复制起点，该起点使得载体能够在所讨论的宿主细胞中自主地复制。复制起点可以是在细胞中发挥功能的任何介导自主复制的质粒复制子。术语“复制起点”或“质粒复制子”在本文中定义为使质粒或载体能够在体内复制的核苷酸序列。细菌复制起点的实例有容许在大肠杆菌中复制的质粒pBR322、pUC19、pACYC177和pACYC184的复制起点，以及容许在芽孢杆菌属中复制的质粒pUB110、pE194、pTA1060和ρΑΜβ1的复制起点。用于在酵母宿主细胞中的复制起点的例子有2微米复制起点、ARS1、ARS4、ARS1和CEN3的组合，以及ARS4和CEN6的组合。在丝状真菌细胞中有用的复制起点的例子有AMAl和ANSI(Gems等，1991，Gene98:61-67;Cullen等，1987，NucleicAcidsResearch159163-9175；WO00/24883)。AMAl基因的分离，以及包含该基因的质粒或载体的构建，可以根据WO00/24883中公开的方法来实现。可以向宿主细胞中插入编码这样的多肽的多核苷酸的多于一个拷贝以增加所述多肽的生产。可以通过下述方法获得多核苷酸的拷贝数的增加向宿主细胞基因组中插入至少一个额外拷贝的序列；或者纳入伴随该多核苷酸的可扩增选择标记基因，由此通过在合适的选择剂的存在下培养细胞，可以选择出含有扩增拷贝数的选择标记基因，从而也就含有更多拷贝的所述多核苷酸的细胞。用于连接上述元件来构建重组表达载体的程序是本领域技术人员公知的(参见例如Sambrook等，1989，同上文)。宿主细胞包含编码具有纤维素分解增强活性的多肽或具有纤维素分解酶活性的多肽的多核苷酸的重组宿主细胞可以有利地用于多肽的重组生产。将包含这样的多核苷酸的载体导入宿主细胞使得载体作为染色体整合子或者如前文所述的自复制的染色体外载体被保持。术语“宿主细胞”涵盖亲本细胞的任何因复制过程中的突变而与亲本细胞不同的后代。宿主细胞的选择在很大程度上将取决于编码多肽的基因及其来源。宿主细胞可以是单细胞微生物，例如原核生物，或者非单细胞微生物，例如真核生物。细菌宿主细胞可以是任何革兰氏阳性细菌或革兰氏阴性细菌。革兰氏阳性细菌包括但不限于芽孢杆菌属、链球菌属、链霉菌属、葡萄球菌属、肠球菌属、乳杆菌属、乳球菌属、梭菌属、地芽孢杆菌属和海洋芽孢杆菌属。革兰氏阴性细菌包括但不限于大肠杆菌、假单胞菌属、沙门氏菌属、弯曲杆菌属、螺杆菌属、黄杆菌属、梭杆菌属、泥杆菌属、奈瑟氏球菌属或尿枝原体属。细菌宿主细胞可以是任何芽孢杆菌属细胞。本发明的实践中可以使用的芽孢杆菌属细胞包括但不限于嗜碱芽孢杆菌、解淀粉芽孢杆菌、短芽孢杆菌、环状芽孢杆菌、克劳氏芽孢杆菌、凝结芽孢杆菌、坚强芽孢杆菌、灿烂芽孢杆菌、缓慢芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、巨大芽孢杆菌、短小芽孢杆菌、嗜热脂肪芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌和苏云金芽孢杆菌细胞。在一个优选的方面，所述细菌宿主细胞是解淀粉芽孢杆菌、缓慢芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、嗜热脂肪芽孢杆菌或枯草芽孢杆菌细胞。在一个更优选的方面，所述细菌宿主细胞是解淀粉芽孢杆菌细胞。在另一个更优选的方面，所述细菌宿主细胞是克劳氏芽孢杆菌细胞。在另一个更优选的方面，所述细菌宿主细胞是地衣芽孢杆菌细胞。在另一个更优选的方面，所述细菌宿主细胞是枯草芽孢杆菌细胞。细菌宿主细胞也可以是任何链球菌属细胞。本发明的实践中可以使用的链球菌属细胞包括但不限于似马链球菌、酿脓链球菌、乳房链球菌、和马链球菌兽瘟亚种细胞。在一个优选的方面，所述细菌宿主细胞是似马链球菌细胞。在另一个优选的方面，所述细菌宿主细胞是酿脓链球菌细胞。在另一个优选的方面，所述细菌宿主细胞是乳房链球菌细胞。在另一个优选的方面，所述细菌宿主细胞是马链球菌兽瘟亚种细胞。细菌宿主细胞也可以是任何链霉菌属细胞。本发明的实践中可以使用的链霉菌属细胞包括但不限于不产色链霉菌、除虫链霉菌、天蓝色链霉菌、灰色链霉菌和浅青紫链霉菌细胞。在一个优选的方面，所述细菌宿主细胞是不产色链霉菌细胞。在另一个优选的方面，所述细菌宿主细胞是除虫链霉菌细胞。在另一个优选的方面，所述细菌宿主细胞是天蓝色链霉菌细胞。在另一个优选的方面，所述细菌宿主细胞是灰色链霉菌细胞。在另一个优选的方面，所述细菌宿主细胞是浅青紫链霉菌细胞。向芽孢杆菌属细胞中导入DNA可以通过例如原生质体转化(参见例如Chang和Cohen，1979，MolecularGeneralGenetics168:111_115)、使用感受态细胞(参见例如Young禾口Spizizen，1961，JournalofBacteriology81:823—829，或Dubnau禾口Davidoff-Abelson,1971,JournalofMolecularBiology56:209_221)、通过电穿孔(参见例如Shigekawa和Dower,1988,Biotechniques6:742_751)，或通过接合(参见例如Koehler和Thorne，1987，JournalofBacteriology169:5271_5278)来实现。向大肠杆菌细胞中导入DNA可以通过例如原生质体转化(参见例如Hanahan，1983，J.Mol.Biol.166557-580)或电穿孔(参见例如Dower等，1988，NucleicAcidsRes.16:6127_6145)来实现。向链霉菌属细胞中导入DNA可以通过例如原生质体转化和电穿孔来实现(参见例如Gong等，2004，FoliaMicrobiol.(Praha)49:399_405)、接合(参见例如Mazodier等，1989，J.Bacteriol.171:3583_3585)、或转导(参见例如Burke等，2001，Proc.Natl.Acad.Sci.USA98=6289-6294)来实现。向假单胞菌属细胞中导入DNA可以通过例如电穿孔(参见例如Choi等，2006，J.Microbiol.Methods64:391_397)、或接合(参见例如Pinedo和Smets,2005，Appl.Environ.Microbiol.71:51_57)来实现。向链球菌属细胞中导入DNA可以通过例如天然感受态(参见例如Perry和Kuramitsu，1981，Infect.Immun.321295-1297)、原生质体转化(参见例如Catt和Jollick,1991,Microbios.68:189_2070)、电穿孔(参见例如Buckley等，1999，Appl.Environ.Microbiol.653800-3804)、或接合(参见例如Clewell,1981,Microbiol.Rev.45:409_436)来实现。尽管如此，本领域已知的任何用于将DNA导入宿主细胞的方法都可以使用。宿主细胞也可以是真核生物，诸如哺乳动物、昆虫、植物、或真菌细胞。在一个优选的方面，所述宿主细胞是真菌细胞。本文所用的“真菌”包括子囊菌门(Ascomycota)、担子菌门(Basidiomycota)、壶菌门(Chytridiomycota)禾口接合菌门(Zygomycota)(如Hawksworth等在AinsworthandBisby'sDictionaryofTheFungi,第八版，1995，CABInternational,UniversityPress,Cambridge,UK中定义的)，和卵菌门(Oomycota)(如Hawksworth等，1995，同上文，第171页引用的)等门，以及全部有丝分裂孢子真菌(mitosporicfungi)(Hawksworth等，1995，同上文)。在一个更优选的方面，真菌宿主细胞是酵母细胞。本文所用的“酵母”包括产子囊酵母(ascosporogenousyeast)(内孢霉目(Endomycetales))、产担子孢子囊酵母(basidiosporogenousyeast)禾口属于半知菌类(FungiImperfecti)(芽抱纲(Blastomycetes))的酵母。由于酵母的分类在将来可能有所改变，为了本发明的目的，酵母将如BiologyandActivitiesofYeast(Skinner,F.A.,Passmore,S.M.禾口Davenport,R.R.编，Soc.App.Bacteriol.SymposiumSeriesNo.9，1980)中所述加以定义。在一个进一步更优选的方面，酵母宿主细胞是假丝酵母属、汉逊酵母属(Hansenula)、克鲁维酵母属、毕赤酵母属、酵母属、裂殖酵母属或西洋蓍霉属细胞。在一个最优选的方面，酵母宿主细胞是卡尔酵母、酿酒酵母、糖化酵母、道格拉氏酵母、克鲁弗酵母、诺地酵母或卵形酵母细胞。在另一个最优选的方面，酵母宿主细胞是乳克鲁维酵母(Kluyveromyceslactis)细胞。在另一个最优选的方面，酵母宿主细胞是解脂西洋蓍霉(Yarrowialipolytica)细胞。在另一个更优选的方面，真菌宿主细胞是丝状真菌细胞。“丝状真菌”包括真菌(Eumycota)和卵菌(Oomycota)亚门的所有丝状形式(如Hawksworth等，1995，同上文定义)。丝状真菌的一般特征在于由几丁质、纤维素、葡聚糖、壳聚糖、甘露聚糖和其它复杂多糖组成的菌丝壁。营养生长是通过菌丝延伸，且碳分解代谢是专性需氧的。相反，酵母如酿酒酵母的营养生长是通过单细胞菌体的芽殖，且碳分解代谢可以是发酵的。在一个进一步更优选的方面，丝状真菌宿主细胞枝顶孢霉属、曲霉属、短梗霉属、烟管霉属(Bjerkandera)、拟蜡菌属、金孢子属、鬼伞属(Coprinus)、革盖菌属(Coriolus)、隐球菌属、网孢菌属、镰孢属、腐质霉属、梨孢菌属、毛霉属、毁丝霉属、新考玛脂霉属、脉孢菌属、拟青霉属、青霉属、平革菌属、射脉菌属(Phlebia)、瘤胃壶菌属、侧耳属(Pleurotus)、裂褶菌属、踝节菌属、嗜热子囊菌属、梭孢壳属、弯颈霉属、栓菌属(Trametes)、或木霉属细胞。在一个更优选的方面，丝状真菌宿主细胞是泡盛曲霉、烟曲霉、臭曲霉、日本曲霉、构巢曲霉、黑曲霉或米曲霉细胞。在另一个更优选的方面，丝状真菌宿主细胞是杆孢状镰孢、禾谷镰孢、库威镰孢、大刀镰孢、禾本科镰孢、禾赤镰孢、异孢镰孢、合欢木镰孢、尖镰孢、多枝镰孢、粉红镰孢、接骨木镰孢、肤色镰孢、拟分枝孢镰孢、硫色镰孢、圆镰孢、拟丝孢镰孢或镶片镰孢细胞。在另一个最优选的方面，丝状真菌宿主细胞是黑刺烟管菌(Bjerkanderaadusta)>zFifaIif(Ceriporiopsisaneirina)>zFifaIif(Ceriporiopsisaneirina)>Ceriporiopsiscaregiea>Ceriporiopsisgilvescens>Ceriporiopsispannocinta>Ceriporiopsisrivulosa、Ceriporiopsissubrufa、虫拟M菌(Ceriporiopsissubvermispora)、B誉角质金包子菌(Chrysosporiumkeratinophilum)、Chrysosporiumlucknowense、热带金抱子菌(Chrysosporiumtropicum)、Chrysosporiummerdarium、Chrysosporiuminops、Chrysosporiumpannicola、Chrysosporiumqueenslandicum>Chrysosporiumzonatum、灰盖鬼伞(Coprinuscinereus)、毛革盖菌(Coriolushirsutus)、特异腐质霉、疏棉状腐质霉、米赫毛霉、嗜热毁丝霉、粗糙脉孢菌、产紫青霉、黄孢平革菌、辐射射脉菌(Phlebiaradiata)、刺芹侧耳(Pleurotuseryngii)、土生梭孢壳、长绒毛栓菌(Trametesvillosa)、杂色栓菌(Trametesversicolor)、哈茨木霉、康宁木霉、长枝木霉、里氏木霉或绿色木霉细胞。真菌细胞可以用包括方式本身已知的原生质体形成、原生质体转化和细胞壁再生的方法来加以转化。用于曲霉属和木霉属宿主细胞转化的合适方法描述于EP238023禾口Yelton等，1984，ProceedingsoftheNational.AcademyofSciencesUSA81:1470-1474。Malardier等，1989，Gene78:147_156和WO96/00787描述了转化镰孢属的种的合适方法。酵母可用Becker和Guarente在Abelson，J.N.和Simon，M.I.编的GuidetoYeastGeneticsandMolecularBiology,MethodsinEnzymology，第194卷，第182-187页，AcademicPress，NewYork；Ito等，1983，JournalofBacteriology153:163；禾口Hinnen等，1978，ProceedingsoftheNationalAcademyofSciencesUSA75:1920中所述的方法转化。生产方法生产具有纤维素分解增强活性的多肽或具有纤维素分解酶活性的多肽的方法包括(a)在有助于产生多肽的条件下培养细胞，所述细胞以其野生型形式能够产生所述多肽；和(b)回收多肽。或者，生产具有纤维素分解增强活性的多肽或具有纤维素分解酶活性的多肽的方法包括(a)在有助于产生多肽的条件下培养重组宿主细胞；和(b)回收多肽。在产生方法中，用本领域中公知的方法在适于多肽产生的营养培养基中培养细胞。例如，可在实验室或工业发酵罐中通过摇瓶培养、和小规模或大规模发酵(包括连续发酵、分批发酵、分批补料发酵或固态发酵)培养细胞，这在合适的培养基中和使多肽能被表达和/或分离的条件下进行。用本领域中已知的程序，在含有碳源和氮源和无机盐的合适营养培养基中进行培养。合适的培养基可从商业供应商得到或根据公开的组成(例如，于美国典型培养物保藏中心的目录中)制备。如果多肽分泌到营养培养基中，则可直接从培养基中回收该多肽。如果该多肽不被分泌，则可从细胞裂解产物中回收它。具有纤维素分解增强活性或纤维素酶活性的多肽用本文记载的方法检测。得到的发酵液可以直接使用，或者可以使用本领域已知的方法回收所述多肽。例如，可以通过常规方法，包括，但不限于，离心、过滤、抽提、喷雾干燥、蒸发或沉淀将多肽从营养培养基中回收出来。多肽可通过本领域中已知的多种方法进行纯化，所述方法包括，但不限于，层析(例如，离子交换、亲和、疏水、层析聚焦和大小排阻)、电泳方法(例如，制备型等电聚焦)、差示溶解度法(例如，硫酸铵沉淀)、SDS-PAGE、或萃取(见，例如，ProteinPurificationJ.-C.Janson和LarsRyden编，VCHPublishers，NewYork,1989)，来获得基本上纯的多肽。含纤维素材料的加工方法本发明的组合物和方法可以用来将含纤维素材料例如木素纤维素水解(糖化)成可发酵糖，并将可发酵糖转化为许多有用的物质，例如化学品和燃料。从含纤维素材料生产期望的发酵产品通常涉及预处理、酶促水解(糖化)和发酵。本发明的含纤维素材料的加工可以使用本领域已知的方法来完成。此外，本发明的方法可以使用任何为了依照本发明运行而配置的生物质加工装置来实现。单独或同时进行的水解(糖化)和发酵包括，但不限于单独水解和发酵(SHF)、同时糖化和发酵(SSF)、同时糖化和共发酵(SSCF)、混合水解和发酵(hybridhydrolysisandfermentation,HHF)、SHCF(单独水解和共发酵)、HHCF(混合水解和发酵)、及直接微生物转化(DMC)。本文中应当理解，本领域中任何包括预处理、酶促水解(糖化)、发酵或它们的组合的方法都可用于实施本发明的方法。常规装置可以包括补料分批搅拌反应器、分批搅拌反应器、带超滤的连续流动搅拌反应器、和/或连续活塞流动柱反应器(FernandadeCastilhosCorazza,FldvioFariadeMoraes,GisellaMariaZanin禾口IvoNeitzel,2003,Optimalcontrolinfed-batchreactorforthecellobiosehydrolysis,ActaScientiarum.Technology25:33-38；Gusakov,A.V.禾口Sinitsyn,A.P.,1985,Kineticsoftheenzymatichydrolysisofcellulose1.Amathematicalmodelforabatchreactorprocess,Enz.Microb.Technol.7:346_352)、碾磨反应器(Ryu,S.K.禾口Lee,J.M.,1983,Bioconversionofwastecellulosebyusinganattritionbioreactor,Biotechnol.Bioeng.25:53_65)、或具有电磁场诱发的强烈搅拌的反应器(Gusakov,A.V.,Sinitsyn,A.P.，Davydkin，I.Y.，Davydkin，V.Y.,Protas,0.V.,1996,Enhancementofenzymaticcellulosehydrolysisusinganoveltypeofbioreactorwithintensivestirringinducedbyelectromagneticfeld,Appl.Biochem.Biotechnol.56:141_153)。其它反应器类型包括，例如，用于水解和/或发酵的流化床型、厌氧污泥床(upflowblanket)型、固定化型、以及挤出机型反应器。预处理.在本发明的方法的实施中，本领域已知的任何预处理方法都可以用来破坏含纤维素材料的植物细胞壁组分。在预处理之前还可以使用本领域已知的方法对含纤维素材料进行预浸泡、润湿、或调制(conditioning)。常规的预处理包括但不限于蒸汽预处理(有或没有爆破)、稀酸预处理、热水预处理、石灰预处理、湿氧化、湿爆破、氨纤维爆破(ammoniafiberexplosion)、有机溶齐予页处理(organosolvpretreatment)、和生物预处理。其它预处理包括超声、电穿孔、微波、超临界C02、超临界吐0、和氨渗滤(ammoniapercolation)0可以在水解和/或发酵之前预处理含纤维素材料。预处理优选在水解之前进行。或者，预处理可以和水解同时进行，诸如在用一种或多种纤维素分解酶或其它酶活性处理含纤维素材料以释放可发酵糖如葡萄糖和/或麦芽糖的同时进行预处理。在大多数情况下预处理步骤本身会导致一些生物质转化成可发酵糖(即使没有酶存在)。蒸汽预处理.在蒸汽预处理中，将含纤维素材料加热以破坏植物细胞壁组分，包括木质素、半纤维素、和纤维素，以使得纤维素和其它部分如半纤维素(hemicellulase)暴露于酶。使纤维素材料通至或通过反应容器，在那里喷射蒸汽以升温到需要的温度和压力，并在其中保持需要的反应时间。蒸汽预处理优选在140-230°C、更优选160-200°C、最优选170-190°C进行，其中最优的温度范围取决于化学催化剂的添加。蒸汽预处理的停留时间优选1-15分钟、更优选3-12分钟、最优选4-10分钟，其中最优的停留时间取决于温度范围和化学催化剂的添加。蒸汽预处理容许相对较高的固形物载量，使得含纤维素材料在预处理过程中一般仅是轻微潮湿的。蒸汽预处理通常与预处理后对材料的爆破性出料(explosivedischarge)相结合，后者被称为蒸汽爆破(steamexplosion)，即将材料急速瞬时置于大气压和湍流下，以通过碎裂作用增加暴露的表面积(Duff和Murray，1996,BioresourceTechnology8551-33；Galbe禾口Zacchi,2002,Appl.Microbiol.Biotechnol.59:618_628；美国专利申请20020164730)。在蒸汽预处理之前往往添加催化剂如H2S04或S02(典型地为0.3-3%w/w)，催化剂可减少时间和温度，增加收率，以及改善酶促水解(Ballesteros等，2006，Appl.Biochem.Biotechnol.129-132496-508；Varga^,2004,Appl.Biochem.Biotechnol.113-116509-523；Sassner等，2006，EnzymeMicrob.Technol.39:756_762)。化学预处理术语“化学预处理”是指任何可促进纤维素、半纤维素和/或木质素的分离和/或释放的化学预处理。合适的化学预处理过程的例子包括稀酸预处理、石灰预处理、湿氧化、氨纤维/冷冻爆破(AFEX)、氨渗滤(APR)、和有机溶剂预处理。在稀酸预处理中，将含纤维素材料与稀酸，通常是吐504，以及水混合形成浆液，蒸汽加热到希望的温度，然后经过一段停留时间瞬时变化到大气压。稀酸预处理可以用多种反应器设计来实施，例如活塞流动反应器、逆流反应器、或连续逆流收缩床反应器(Duff和Murray，1996，同上文；Schell等，2004，BioresourceTechnol.91:179_188;Lee等，1999，Adv.Biochem.Eng.Biotechnol.65:93_115)。还可以采用数种碱性条件下的预处理方法。这些碱性预处理包括，但不限于石灰预处理、湿氧化、氨渗滤(APR)和氨纤维/冷冻爆破(AFEX)。石灰预处理用碳酸钙、氢氧化钠或氨在85-150°C的低温下进行，停留时间为1小时至数日(Wyman等，2005，BioresourceTechnol.961959-1966；Mosier等，2005，BioresourceTechnol.96:673_686)。W02006/110891、W02006/11899、W02006/11900和W02006/110901公开了使用氨的预处理方法。湿氧化是一种热预处理，典型地在180-200°C进行5_15分钟，同时添加氧化剂如过氧化氢或氧过压(Schmidt和Thomsen，1998，BioresourceTechnol.64139-151；Palonen等，2004，Appl.Biochem.Biotechnol.117:1_17；Varga等，2004，Biotechnol.Bioeng.88567-574;Martin等，2006，J.Chem.Technol.Biotechnol.81:1669-1677)。预处理优选在1-40%干物质、更优选2-30%干物质、最优选5-20%干物质的条件下进行，并且经常通过添加碱，如碳酸钠来提高初始PH。湿氧化预处理方法的一种变化形式，称为湿爆破(湿氧化和蒸汽爆破的结合)，可以处理高达30%的干物质。在湿爆破中，在预处理过程中经过一定的停留时间后引入氧化剂。然后瞬间变化到大气压而终止预处理(W02006/032282)。氨纤维爆破(AFEX)涉及用液态或气态的氨在中等温度如90-100°C和高压如17-20巴的条件下处理含纤维素材料5-10分钟，其中干物质含量可高达60%(Gollapalli等，2002,Appl.Biochem.Biotechnol.9823-35；Chundawat^,2007,Biotechnol.Bioeng.96219-231；Alizadeh^,2005,Appl.Biochem.Biotechnol.1211133-1141；Teymouri等，2005，BioresourceTechnol.96:2014_2018)。有机溶剂预处理通过使用乙醇水溶液(40-60%乙醇)在160-200°C萃取30_60分钟来使含纤维素材料脱木质素(Pan等，2005，Biotechnol.Bioeng.90:473_481；Pan等，2006，Biotechnol.Bioeng.94:851_861；Kurabi等，2005，Appl.Biochem.Biotechnol.121219-230)。通常添加硫酸作为催化剂。在有机溶剂预处理中，大部分的半纤维素被去除。Schell等，2003，Appl.Biochem.andBiotechnol.第105-108卷，第69-85页和Mosier等，2005，BioresourceTechnology96:673_686以及美国专利申请公布2002/0164730描述了其他合适的预处理方法的例子。45在一个方面，化学预处理作为酸处理，更优选作为连续稀酸和/或弱酸(mildacid)处理来实施。所述酸通常是硫酸，但也可以用其它的酸，如乙酸、柠檬酸、硝酸、磷酸、酒石酸、琥珀酸、氯化氢或它们的混合物。弱酸处理在优选1-5，更优选1-4，最优选1-3的pH范围内进行。在一个方面，酸浓度在优选0.01-20wt%酸，更优选0.05-10wt%酸，进一步更优选0.l_5wt%酸，最优选0.2-2.0wt%酸的范围。将所述酸与含纤维素材料接触，并在一定温度如160-200°C，优选165-195°C的范围内保持自若干秒到若干分钟不等的时间，例如1秒至60分钟。在另一个方面，预处理作为氨纤维爆破步骤(AFEX预处理步骤)来实施。在另一个方面，预处理在水浆液中进行。在优选的方面，含纤维素材料在预处理过程中以优选10-80wt%之间，更优选20-70wt%之间，最优选30-60wt%之间，诸如50wt%左右的量存在。经过预处理的含纤维素材料可以不予洗涤，或者可以用任何本领域已知的方法洗涤，例如用水洗涤。机械预处理术语“机械预处理”是指各类研磨(grinding)或粉碎(milling)(例如干粉碎，湿粉碎或振动球粉碎(vibratoryballmilling))。物理预处理术语“物理预处理”是指任何可促进纤维素、半纤维素和/或木质素从含纤维素材料分离和/或释放的预处理。例如，物理预处理可涉及辐射(例如微波辐射)、蒸汽处理/蒸汽爆破、湿热分解作用，和它们的组合。物理预处理可涉及高压和/或高温(蒸汽爆破)。在一个方面，高压是指在优选约300-约600psi，更优选约350-约550psi，最优选约400-约500psi的范围，如450psi左右。在另一个方面，高温意指约100-约300°C，优选约140-约235°C范围的温度。在一个优选的方面，机械预处理在使用如上定义的高压及高温的分批过程式蒸汽喷射水解装置系统(batch-process，steamgunhydrolyzersystem)中，如可获自SundsDefibratorAB，Sweden的SundsHydrolyzer中进行。物理和化学联合预处理可以既以物理方式又以化学方式处理含纤维素材料。例如，预处理步骤可涉及稀酸或弱酸处理以及高温和/或高压处理。根据需要，物理预处理和化学预处理可以顺序地或同时地进行。还可以包含机械预处理。于是，在一个优选的方面，对含纤维素材料进行机械、化学、或物理预处理，或它们的任何组合，来促进纤维素、半纤维素和/或木质素的分离和/或释放。生物预处理术语“生物预处理”是指任何可促进纤维素、半纤维素和/或木质素从含纤维素材料分离和/或释放的生物预处理。生物预处理技术可涉及施用溶木质素微生物(参见例如Hsu，T.-A.，1996，Pretreatmentofbiomass,《HandbookonBioethanolProductionandUtilization)),ffyman,C.E.编，Taylor&Francis,Washington,DC,179-212；Ghosh禾口Singh,1993,Physicochemicalandbiologicaltreatmentsforenzymatic/microbialconversionoflignocellulosicbiomass,Adv.Appl.Microbiol.39295-333；McMillan,J.D.，1994,Pretreatinglignocellulosicbiomass:areview,《EnzymaticConversionofBiomassforFuelsProduction》，Himmel,M.E.,Baker,J.0.禾口Overend,R.P.编，ACSSymposiumSeries566,AmericanChemicalSociety,Washington,DC,第15章；Gong,C.S.,Cao,N.J.,Du,J.禾口Tsao,G.T.,1999,Ethanolproductionfromrenewableresources,《AdvancesinBiochemicalEngineering/Biotechnology》，Scheper,T.编，Springer-VerlagBerlinHeidelberg,Germany,65:207-241；Olsson和Hahn-Hagerdal,1996,Fermentationoflignocellulosichydrolysatesforethanolproduction,Enz.Microb.Tech.18:312_331，及Vallander和Eriksson,1990,Productionofethanolfromlignocellulosicmaterials:Stateoftheart,Adv.Biochem.Eng./Biotechnol.42:63_95)。糖化.在水解步骤，又称糖化中，经过预处理的含纤维素材料被水解以将纤维素或者半纤维素降解成可发酵糖，如葡萄糖、木糖、木酮糖、阿拉伯糖、麦芽糖、甘露糖、半乳糖、和/或可溶性寡糖。水解以酶促方式进行，使用本发明的包含有效量的具有纤维素分解增强活性的多肽和水溶性活化性二价金属阳离子的纤维素分解酶组合物。该组合物的酶组分也可以顺序地添加。酶促水解优选在合适的含水环境中于本领域技术人员可容易确定的条件下进行。在一个优选的方面，水解在适合于一种或多种酶的活性的条件，即对一种或多种酶而言最适的条件下进行。水解可以作为补料分批或者连续过程进行，例如经预处理的含纤维素材料(底物)被逐渐添加到例如含酶的水解溶液中。糖化通常在搅拌槽式反应器或发酵罐中在受控的pH、温度和混合条件下进行。合适的过程时间、温度和PH条件可以由本领域技术人员容易地确定。例如，糖化可持续最多达200个小时，但通常进行优选约12个到约96个小时，更优选约16个到约72个小时，最优选约24个到约48个小时。温度范围为优选约25°C-约70°C，更优选约30°C-约65°C，更优选约40°C-60°C，尤其是约50°C。pH范围为优选约3-约8，更优选约3.5-约7，最优选约4-约6，尤其是大约pH5。干固形物含量范围为优选约5-约50wt%，更优选约10-约40wt%，最优选约20-约30wt%。具有纤维素分解增强活性的酶和多肽的最适量取决于数种因素，包括但不限于作为成分的纤维素分解蛋白的混合物，含纤维素底物，含纤维素底物的浓度，含纤维素底物的一种或多种预处理，温度，时间，PH，以及发酵生物的选用(例如用于同时糖化和发酵的酵母)。在一个优选的方面，一种或多种纤维素分解蛋白对含纤维素材料的有效量为大约0.5-约50mg，优选约0.5-约40mg，更优选约0.5-约25mg，更优选约0.75-约20mg，更优选约0.75-约15mg，进一步更优选约0.5-约10mg，最优选约2.5-约10mg每克含纤维素材料。在另一个优选的方面，具有纤维素分解增强活性的多肽对含纤维素材料的有效量为约0.5-约50mg，优选约0.5-约40mg，更优选约0.5-约25mg，更优选约0.75-约20mg，更优选约0.75-约15mg，进一步更优选约0.5-约10mg，最优选约2.5-约10mg每克含纤维素材料。在另一个优选的方面，具有纤维素分解增强活性的一种或多种多肽对含纤维素材料的有效量为约0.01-约50.Omg,优选约0.01-约40mg，更优选约0.01-约30mg，更优选约0.01-约20mg,更优选约0.01-约10mg,更优选约0.01-约5mg,更优选约0.025-约1.5mg，更优选约0.05-约1.25mg,更优选约0.075-约1.25mg,更优选约0.1-约1.25mg,进一步更优选约0.15-约1.25mg，最优选约0.25-约1.Omg每克含纤维素材料。在另一个优选的方面，一种或多种具有纤维素分解增强活性的多肽对纤维素分解蛋白的有效量为约0.005-约1.0g，优选约0.01-约1.0g，更优选约0.15-约0.75g，更优选约0.15-约0.5g，更优选约0.1-约0.5g，进一步更优选约0.1-约0.5g，最优选约0.05-约0.2g每克一种或多种纤维素分解蛋白。皿.对于从经过预处理和水解的含纤维素材料获得的可发酵糖，可以用一种或多种能够直接或间接将糖发酵为期望的发酵产物的发酵微生物来加以发酵。“发酵”或“发酵过程”是指任何发酵过程或任何包含发酵步骤的过程。发酵过程还包括生物燃料工业、食用酒精工业(例如啤酒和葡萄酒)、乳品工业(例如发酵乳产品)、皮革工业及烟草工业上使用的发酵过程。发酵条件取决于期望的发酵产物及发酵生物，可以由本领域技术人员容易地予以确定。在发酵步骤中，作为预处理和酶促水解步骤的结果从含纤维素材料释放的糖被发酵生物如酵母发酵成产物，例如乙醇。水解(糖化)和发酵可以分别或同时进行。这样的方法包括，但不限于，分别水解和发酵(SHF)、同时糖化和发酵(SSF)、同时糖化和共发酵(SSCF)、混合水解和发酵(HHF)、SHCF(分别水解和共发酵)、HHCF(混合水解和发酵)、以及直接微生物转化(DMC)。任何合适的经水解的含纤维素材料都可以用于本发明实施中的发酵步骤。如本领域中公知的，所述材料的选择通常基于期望的发酵产物，即要通过发酵获得的物质，以及所采用的过程。术语“发酵培养基”在本文中理解为指添加一种或多种发酵微生物之前的培养基，例如由糖化过程得到的培养基，以及例如在同时糖化和发酵过程(SSF)中使用的培养基。“发酵微生物”是指适合在期望的发酵过程中使用来产生发酵产物的任何微生物，包括细菌和真菌生物。发酵微生物可以是(6和/或(5发酵生物，或它们的组合。(6和(5发酵生物都是本领域中公知的。合适的发酵微生物能够将糖类，如葡萄糖、木糖、木酮糖、阿拉伯糖、麦芽糖、甘露糖、半乳糖或寡糖，直接或间接发酵，即转化成期望的发酵产物。Lin等，2006，Appl.Microbiol.Biotechnol.69:627_642记载了产生乙醇的细菌及真菌发酵微生物的例子。能够发酵C6糖的发酵微生物的例子包括细菌和真菌生物，如酵母。优选的酵母包括酵母属一些种，优选酿酒酵母的菌株。能够发酵C5糖的发酵微生物的例子包括细菌和真菌生物，如酵母。优选的发酵C5的酵母包括毕赤酵母属的菌株，优选树干毕赤酵母(Pichiastipitis)，如树干毕赤酵母CBS5773;假丝酵母属的菌株，优选博伊丁假丝酵母(Candidaboidinii)、芸苔假丝酵母(Candidabrassicae)、休哈塔假丝酵母(Candidasheatae)、迪丹斯假丝酵母(Candidadiddensii)、假热带假丝酵母(Candidapseudotropicalis)或产朊假丝酵母(Candidautilis)。其它发酵生物包括发酵单孢菌属(Zymomonas)如运动发酵单胞菌(Zymomonasmobilis)的菌株；汉逊酵母属(Hansenula)如异常汉逊酵母(Hansenulaanomala)的菌株；克鲁维酵母属如脆壁克鲁维酵母(K.fragiliS)的菌株；裂殖酵母属如粟酒裂殖酵母的菌株；以及大肠杆菌，尤其是已经过遗传修饰而改善了乙醇产率的大肠杆菌菌株。在一个优选的方面，所述酵母是酵母属的一些种(Saccharomycesspp)。在一个更优选的方面，所述酵母是酿酒酵母。在另一个更优选的方面，所述酵母是糖化酵母。在另一个更优选的方面，所述酵母是葡萄汁酵母(Saccharomycesuvarum)。在另一个优选的方面，所述酵母是克鲁维酵母。在另一个更优选的方面，所述酵母是马克斯克鲁维酵母(Kluyveromycesmarxianus)。在另一个更优选的方面，所述酵母是脆壁克鲁维酵母。在另一个优选的方面，所述酵母是假丝酵母。在另一个更优选的方面，所述酵母是博伊丁假丝酵母。在另一个更优选的方面，所述酵母是芸苔假丝酵母。在另一个更优选的方面，所述酵母是迪丹斯假丝酵母。在另一个更优选的方面，所述酵母是假热带假丝酵母。在另一个更优选的方面，所述酵母是产朊假丝酵母。在另一个优选的方面，所述酵母是棍孢属(Clavispora)。在另一个更优选的方面，所述酵母是葡萄牙棍孢(Clavisporalusitaniae)。在另一个更优选的方面，所述酵母是仙人掌棍孢(Clavisporaopuntiae)0在另一个优选的方面，所述酵母是管囊酵母属(Pachysolen)。在另一个更优选的方面，所述酵母是嗜鞣管囊酵母(Pachysolentannophilus)0在另一个优选的方面，所述酵母是毕赤酵母。在另一个更优选的方面，所述酵母是树干毕赤酵母。在另一个优选的方面，所述酵母是酒香酵母属(Bretarmomyces)。在另一个更优选的方面，所述酵母是克劳森酒香酵母(Bretannomycesclausenii)(Philippidis,G.P.，1996，Cellulosebioconversiontechnology,ffyman,C.E.编白勺〈〈HandbookonBioethanol:ProductionandUtilization〉〉中，Taylor&Francis,Washington,DC,179-212)。能够高效地将己糖和戊糖发酵成乙醇的细菌包括，运动发酵单胞菌和热纤维梭菌(Clostridiumthermocellum)(Philippidis，1996，同上文)。在一个优选的方面，所述细菌是发酵单胞菌。在一个更优选的方面，所述细菌是运动发酵单胞菌。在另一个优选的方面，所述细菌是梭菌。在另一个更优选的方面，所述细菌是热纤维梭菌。适用于乙醇生产的商品化酵母包括，例如，ETHAN0LRED酵母(可获自Fermentis/Lesaffre,USA)、FALI(可获自Fleischmann，sYeast，USA)，SUPERSTART和THERM0SACC鲜酵母(可获自EthanolTechnology,WI,USA)、BI0FERMAFT和XR(可获自NABC-NorthAmericanBioproductsCorporation,GA,USA),GERTSTRAND(可获自GertStrandAB,Sweden)，以及FERMI0L(可获自DSMSpecialties)。在一个优选的方面，所述发酵微生物经过了遗传修饰来提供发酵戊糖的能力，例如利用木糖的、利用阿拉伯糖的、以及共利用木糖和阿拉伯糖的微生物。通过克隆异源基因到各种发酵微生物中，已经构建出了能够将己糖和戊糖转化为乙醇(共发酵)的生物(Chen和Ho，1993，CloningandimprovingtheexpressionofPichiastipitisxylosereductasegeneinSaccharomycescerevisiae,Appl.Biochem.Biotechnol.39-40135-147；Ho等，1998,GeneticallyengineeredSaccharomycesyeastcapableofeffectivelycofermentingSaccharomycescerevisiaeandxylose,Appl.Environ.Microbiol.641852-1859；KotterandCiriacy,1993,XylosefermentationbySaccharomycescerevisiae,Appl.Microbiol.Biotechnol.38:776_783；ffalfridsson等，1995,Xylose-metabolizingSaccharomycescerevisiaestrainsoverexpressingtheTKL1andTALIgenesencodingthepentosephosphatepathwayenzymestransketolaseandtransaldolase,Appl.Environ.Microbiol.614184-4190；Kuyper等，2004,MinimalmetabolicengineeringofSaccharomycescerevisiaeforefficientanaerobicxylosefermentation:aproofofprinciple,FEMSYeastResearch4:655_664;Beall等，1991,ParametricstudiesofethanolproductionfromxyloseandothersugarsbyrecombinantEscherichiacoli,Biotech.Bioeng.38:296_303;Ingram等，1998,Metabolicengineeringofbacteriaforethanolproduction,Biotechnol.Bioeng.58204-214；Zhang等，1995,MetabolicengineeringofapentosemetabolismpathwayinethanologenicZymomonasmobilis,Science267:240_243；Deanda等，1996,Developmentofanarabinose-fermentingZymomonasmobi1isstrainbymetabolicpathwayengineering,Appl.Environ.Microbiol.624465-4470)。在一个优选的方面，所述经过了遗传修饰的发酵微生物是酿酒酵母。在另一个优选的方面，所述经过了遗传修饰的发酵微生物是运动发酵单胞菌。在另一个优选的方面，所述经过了遗传修饰的发酵微生物是大肠杆菌。在另一个优选的方面，所述经过了遗传修饰的发酵微生物是产酸克雷伯氏菌(Klebsiellaoxytoca)0通常将一种或多种发酵微生物添加到经降解的纤维素或水解产物中，进行约8小时至约96小时，例如约24-约60小时的发酵。温度通常为约26°C-约60°C，尤其是约32°C或50°C,pH为约3-8，如大约pH4-5，6，或7左右。在一个优选的方面，将一种或多种发酵微生物施加到经降解的纤维素或水解产物，并进行大约12小时至大约96小时，如通常24-60小时的发酵。在一个优选的方面，温度优选为大约20°C至大约60°C，更优选大约25°C至大约50°C，最优选大约32°C至大约50°C，特别是大约32°C或50°C，pH—般为大约pH3至大约pH7，优选pH4_7左右。然而，某些发酵微生物如细菌发酵生物，具有更高的最适发酵温度。一种或多种发酵微生物施加的量优选为每ml发酵液大约IO5至1012，优选大约IO7至101(1，特别是大约2XIO8个活细胞计数。关于使用酵母进行发酵的更多指导可见例如“TheAlcoholTextbook"(K.Jacques,Τ·P.Lyons禾口D.R.Kelsall编，NottinghamUniversityPress,UnitedKingdom1999),本文援引并入该文献。为了生产乙醇，在发酵之后将经发酵的浆液蒸馏以提取乙醇。依照本发明的方法获得的乙醇可以用作，例如，燃料乙醇、饮用乙醇即可饮用酒精(potableneutralspirits)；或工业乙醇。发酵刺激物(fermentationstimulator)可与本文描述的任何酶促过程组合使用以进一步改进发酵方法，特别是发酵微生物的性能，诸如速率提高和乙醇产量。“发酵刺激物”指用于发酵微生物特别是酵母的生长的刺激物。优选的用于生长的发酵刺激物包括维生素和矿物质。维生素的实例包括多种维生素(multivitamins)、生物素、泛酸、烟酸、内消旋肌醇(meso-inositol)、硫胺素、吡哆醇、对氨基苯甲酸、叶酸、核黄素、及维生素A、B、C、D禾口E。参见例如Alfenore等，ImprovingethanolproductionandviabilityofSaccharomycescerevisiaebyavitaminfeedingstrategyduringfed-batchprocess，Springer-Verlag，2002，本文援引并入该文献。矿物质的实例包括能够提供营养的矿物质和矿物质盐，包括P、K、Mg、S、Ca、Fe、Zn、Mn和Cu。发酵产物发酵产物可以是任何来源于发酵的物质。所述发酵产物包括，但不限于，醇类(例如阿拉伯糖醇、丁醇、乙醇、甘油、甲醇、1，3_丙二醇、山梨糖醇和木糖醇)；有机酸(例如乙酸、醋酮酸、己二酸、抗坏血酸、柠檬酸、2，5-二酮-D-葡糖酸、甲酸、富马酸、葡糖二酸、葡糖酸、葡糖醛酸、戊二酸、3-羟基丙酸、衣康酸、乳酸、苹果酸、丙二酸、草酸、丙酸、琥珀酸和木糖酸)；酮类(例如丙酮)；醛类(例如甲醛)；氨基酸(例如天冬氨酸、谷氨酸、甘氨酸、赖氨酸、丝氨酸和苏氨酸)；和气体(例如甲烷、氢(H2)、二氧化碳(CO2)和一氧化碳(CO))。发酵产物还可以是作为高价值产物的蛋白质。在一个优选的方面，所述发酵产物是醇。应理解的是术语“醇”涵盖含有一个或多个羟基部分的物质。在一个更优选的方面，所述醇是阿拉伯糖醇。在另一个更优选的方面，所述醇是丁醇。在另一个更优选的方面，所述醇是乙醇。在另一个更优选的方面，所述醇是甘油。在另一个更优选的方面，所述醇是甲醇。在另一个更优选的方面，所述醇是1，3_丙二醇。在另一个更优选的方面，所述醇是山梨糖醇。在另一个更优选的方面，所述醇是木糖醇。参见例如Gong,C.S.、Cao,N.J.、Du,J.和Tsao,G.Τ.，1999，Ethanolproductionfromrenewableresources,在《AdvancesinBiochemicalEngineering/Biotechnology》中，Scheper,Τ.编，Springer-VerlagBerlinHeidelberg,Germany,65:207_241；Silveira,Μ.Μ.,禾口Jonas,R.,2002,Thebiotechnologicalproductionofsorbitol,Appl.Microbiol.Biotechnol.59400-408；Nigam,P.,禾口Singh，D.，1995,Processesforfermentativeproductionofxylitol-asugarsubstitute,ProcessBiochemistry30(2):117_124；Ezeji,T.C.、Qureshi,N.禾口Blaschek,H.P.,2003,Productionofacetone,butanolandethanolbyClostridiumbeijerinckiiBA101andinsiturecoverybygasstripping,WorldJournalofMicrobiologyandBiotechnology19(6):595_603。在另一个优选的方面，所述发酵产物是有机酸。在另一个更优选的方面，所述有机酸是乙酸。在另一个更优选的方面，所述有机酸是醋酮酸。在另一个更优选的方面，所述有机酸是己二酸。在另一个更优选的方面，所述有机酸是抗坏血酸。在另一个更优选的方面，所述有机酸是柠檬酸。在另一个更优选的方面，所述有机酸是2，5-二酮-D-葡糖酸。在另一个更优选的方面，所述有机酸是甲酸。在另一个更优选的方面，所述有机酸是富马酸。在另一个更优选的方面，所述有机酸是葡糖二酸。在另一个更优选的方面，所述有机酸是葡糖酸。在另一个更优选的方面，所述有机酸是葡糖醛酸。在另一个更优选的方面，所述有机酸是戊二酸。在另一个优选的方面，所述有机酸是3-羟基丙酸。在另一个更优选的方面，所述有机酸是衣康酸。在另一个更优选的方面，所述有机酸是乳酸。在另一个更优选的方面，所述有机酸是苹果酸。在另一个更优选的方面，所述有机酸是丙二酸。在另一个更优选的方面，所述有机酸是草酸。在另一个更优选的方面，所述有机酸是丙酸。在另一个更优选的方面，所述有机酸是琥珀酸。在另一个更优选的方面，所述有机酸是木糖酸。参见例如Chen，R.，禾口Lee，Y.Y.，1997，Membrane-mediatedextractivefermentationforlacticacidproductionfromcellulosicbiomass,Appl.Biochem.Biotechnol.63-65:435_4480在另一个优选的方面，所述发酵产物是酮。可以理解的是术语“酮”涵盖含有一个或多个酮部分的物质。在另一个更优选的方面，所述酮是丙酮。参见例如Qureshi和Blaschek,2003,同上文。在另一个优选的方面，所述发酵产物是醛。在另一个更优选的方面，所述醛是甲醛。在另一个优选的方面，所述发酵产物是氨基酸。在另一个更优选的方面，所述有机酸是天冬氨酸。在另一个更优选的方面，所述氨基酸是谷氨酸。在另一个更优选的方面，所述氨基酸是甘氨酸。在另一个更优选的方面，所述氨基酸是赖氨酸。在另一个更优选的方面，所述氨基酸是丝氨酸。在另一个更优选的方面，所述氨基酸是苏氨酸。参见例如Richard，A.，禾口Margaritis，A.，2004，Empiricalmodelingofbatchfermentationkineticsforpoly(glutamicacid)productionandothermicrobialbiopolymers,BiotechnologyandBioengineering87(4):501_515o在另一个优选的方面，所述发酵产物是气体。在另一个更优选的方面，所述气体是甲烷。在另一个更优选的方面，所述气体是H2。在另一个更优选的方面，所述气体是C02。在另一个更优选的方面，所述气体是CO。参见例如Kataoka，N.、A.Miya，和K.Kiriyama,1997,Studiesonhydrogenproductionbycontinuousculturesystemofhydrogen-producinganaerobicbacteria,WaterScienceandTechnology36(6-7)41-47；及GunaseelanV.N.,BiomassandBioenergyVol.13(1—2)，第83—114页，1997，Anaerobicdigestionofbiomassformethaneproduction:Areview。Mi^.任选地可以使用任何本领域已知的方法从发酵培养基回收一种或多种发酵产物，这些方法包括但不限于层析(例如离子交换、亲和、疏水、层析聚焦、和大小排阻)、电泳程序(例如制备性等电聚焦)、差异溶解度(例如硫酸铵沉淀)、蒸馏、或萃取。例如，从经过发酵的含纤维素材料通过常规蒸馏方法分离乙醇并纯化。可以获得纯度最高达约96vo1%的乙醇，它可以用作，例如，燃料乙醇、饮用乙醇即可饮用酒精(po)，或工业乙下面用实施例进一步描述本发明，这些实施例不应解释为对本发明范围的限制。实施例材料用作缓冲剂和底物的化学品是至少试剂级的商品。DNA测序DNA测序使用染料终止物化学(dyeterminatorchemistry)(Giesecke等，1992，JournalofVirol.Methods38:47—60)MAppliedBiosystemsModel3130XGeneticAnalyzer(AppliedBiosystems,FosterCity,CA,USA)进行。序列使用phred/phrap/consed(UniversityofWashington,Seattle,WA,USA)用序列特异性引物进行装配。培养基NNCYP培养基的组成为每升5.0gNH4N03、0.5gMgS047H20、0.3gCaCl2、2.5g柠檬酸、l.Og细菌用蛋白胨(BactoP印tone)、5.0g酵母提取物、COVE痕量金属溶液以及足量的K2HP04使最终pH达到约5.4。COVE痕量金属溶液的组成为每升0.04gNa2B40710H20、0.4gCuS045H20、1.2gFeS047H20、0.7gMnS04H20、0.8gNa2Mo022H20和lOgZnS047H20。YP培养基的组成为每升lOg酵母提取物和20g细菌用胰蛋白胨。纤维素酶诱导培养基的组成为每升20g纤维素、10g玉米浸浆固形物、1.45g(NH4)2S04、2.08gKH2P04、0.28gCaCl2、0.42gMgS047H20禾口0.42ml痕量金属溶液。52痕量金属溶液的组成为每升216gFeCl36H20、58gZnS047H20、27gMnS04H20、lOgCuS045H20、2.4gH3BO3和336g柠檬酸。STC的组成为1M山梨醇、lOmMCaCl2禾口lOmMTris-HCl,pH7.5。COVE平板的组成为每升342g蔗糖、10mlCOVE盐溶液、10ml1M乙酰胺、lOmll.5MCsCl和25g诺布尔琼脂(Nobleagar)。COVE盐溶液的组成为每升26gKCl、26gMgS04、76gKH2P04和50mlC0VE痕量金属溶液。C0VE2平板的组成为每升30g蔗糖、20mlCOVE盐溶液、25g诺布尔琼脂和lOmllM乙酰胺。PDA平板的组成为每升39克马铃薯葡萄糖琼脂。LB培养基的组成为每升10g胰蛋白胨、5g酵母提取物、5g氯化钠。2XYT-Amp平板的组成为每升10g胰蛋白胨、5g酵母提取物、5g氯化钠和15g细菌用琼脂，然后在高压灭菌后加入2ml50mg/ml的氨苄青霉素的过滤除菌溶液。MDU2BP培养基的组成为每升45g麦芽糖、lgMgS047H20、lgNaCl、2gK2HS04、12gKH2P04、2g尿素和500u1AMG痕量金属溶液，将pH调至5.0并随后用0.22ym过滤元件进行过滤除菌。AMG痕量金属溶液的组成为每升14.3gZnS047H20、2.5gCuS045H20、0.5gNiCl26H20、13.8gFeS04H20、8.5gMnS047H20和3g柠檬酸。基本培养基(minimalmedium)平板的组成为每升6gNaN03、0.52KC1、1.52gKH2P04、lmlCOVE痕量金属溶液、20g诺布尔琼脂、20ml50%葡萄糖、2.5ml20%MgS04'7H20和20ml生物素贮存溶液。生物素贮存溶液的组成为每升0.2g生物素。S0C培养基的组成为2%胰蛋白胨、0.5%酵母提取物、10mMNaCl、2.5mMKClUOmMMgCl2和lOmMMgS04，高压灭菌后加入过滤除菌的葡萄糖至20mM。实施例1:pMJ04表达载体的构建使用如下所示的引物993429(反义)和993428(有义)从里氏木霉RutC30基因组DNAPCR扩增了里氏木霉外切纤维二糖水解酶1基因(cbhl，CEL7A)终止子，构建了表达载体PMJ04。经过工程改造，所述反义引物在5’末端具有一个PacI位点，有义引物在3’末端具有一个Spel位点。引物993429(反义)5，-AACGTTAATTAAGGAATCGTTTTGTGTTT-3，(SEQIDNO29)引物993428(有义)5，-AGTACTAGTAGCTCCGTGGCGAAAGCCTG-3，(SEQIDNO30)用DNEASYPlantMaxiKit(QIAGENInc.,Valencia,CA,USA)分离里氏木霉RutC30基因组DNA。扩增反应物(50ii1)组成为IXThermoPolReactionBuffer(ThermoPol反映缓冲液)(NewEnglandBiolabs,Beverly,MA,USA)、0.3mMdNTPUOOng里氏木霉RutC30基因组DNA、0.3iiM引物993429、0.3iiM引物993428和2单位的VentDNA聚合酶(NewEnglandBiolabs,Beverly,MA,USA)。将所述反应物在如下编程的EPPENDORFMASTERCYCLER5333(EppendorfScientific,Inc.，ffestbury,NY,USA)中温育进行94°C30秒、50°C30秒、72°C60秒的循环5次，然后进行94°C30秒、65°C30秒、72°C120秒的循环25次(最终延伸5分钟)。反应产物在1.0%琼脂糖凝胶电泳上用40mMTris碱-20mM乙酸钠-ImMEDTA二钠(TAE)缓冲液分离，从凝胶上切下229bp的产物条带，使用QIAQUICKGelExtractionKit(QIAQUICK凝胶提取试剂盒)(QIAGENInc.，Valencia,CA，USA)依照制造商的说明进行纯化。所得的PCR片段用PacI和Spel消化后，用RapidLigationKit(快速连接试剂盒)(Roche,Indianapolis,IN,USA)连接到经相同的限制酶消化的pAlLol(W005/067531)中产生pMJ04(图1)。实施例2:PCaHj568的构建从pCaHjl70(美国专利5，763，254)和pMT2188出发构建质粒pCaHj568。质粒PCaHjl70包含特异腐质霉内切葡聚糖酶V(CEL45A)全长编码区(SEQIDN0:31，编码SEQIDNO32的氨基酸序列)。pMT2188的构建最先是用如下所示的引物142779和142780从pCaHj483(W098/00529)PCR扩增出pUC19复制起点。引物142780在PCR片段中引入BbuI位点引物1427795，-TTGAATTGAAAATAGATTGATTTAAAACTTC-3，(SEQIDNO33)引物1427805，-TTGCATGCGTAATCATGGTCATAGC-3，(SEQIDNO34)该扩增使用EXPANDPCRSystem(RocheMolecularBiochemicals,Basel,Switzerland)依照制造商的说明进行。在琼脂糖凝胶上分离PCR产物，使用JetquickGelExtractionSpinKit(离心式快速凝胶提取试剂盒)(Genomed,ffielandstr,Germany)分离并纯化出一个1160bp的片段。使用如下所示的引物140288和142778，利用EXPANDPCRSystem从通用酿酒酵母克隆载体pYES2(Invitrogen，Carlsbad，CA，USA)中扩增出URA3基因。引物140288在PCR片段中引入一个EcoRI位点。引物1402885，-TTGAATTCATGGGTAATAACTGATAT-3，(SEQIDNO35)引物1427785，-AAATCAATCTATTTTCAATTCAATTCATCATT-3，(SEQIDNO36)在琼脂糖凝胶上分离PCR产物，使用JetquickGelExtractionSpinKit(离心式快速凝胶提取试剂盒)分离并纯化出一个U26bp的片段。通过混合所述两个PCR片段并用如上所示的引物142780和140288依照重叠剪接(overlapsplicing)法(Horton等，1989，Gene77:61_68)进行扩增，将这两个片段融合起来。在琼脂糖凝胶上分离PCR产物，使用JetquickGelExtractionSpinKit(离心式快速凝胶提取试剂盒)分离并纯化出一个2263bp的片段。所得的片段用EcoRI和Bbul消化，并使用标准规程连接到用相同的限制酶消化过的pCaHj483的最大片段中。将连接混合物转化到依照Mandel和Higa,1970，J.Mol.Biol.45:154的方法制成感受态的pyrF阴性大肠杆菌菌株DB6507(ATCC35673)中。在每升添加了lg酪蛋白氨基酸、500iig硫胺素和10mg卡那霉素的M9培养基(Sambrook等，1989,MolecularCloning,ALaboratoryManual,2ndedition,ColdSpringHarborLaboratoryPress)上选择转化子。分离了来自于一个转化子的质粒，命名为PCaHj527(图2)。使用EXPANDPCRSystem并依照制造商的说明，通过PCR对PCaHj527上存在的NA2-tpi启动子进行定点诱变。利用如下所示的诱变引物141223，将核苷酸134-144从GTACTAAAACC(SEQIDNO37)转变为CCGTTAAATTT(SEQIDNO:38)。引物1412235，-GGATGCTGTTGACTCCGGAAATTTAACGGTTTGGTCTTGCATCCC-3，(SEQIDNO39)利用如下所示的诱变引物141222，将核苷酸423-436从ATGCAATTTAAACT(SEQIDNO40)转变为CGGCAATTTAACGG(SEQIDN041)。引物1412225，-GGTATTGTCCTGCAGACGGCAATTTAACGGCTTCTGCGAATCGC-3，(SEQIDNO42)所得的质粒命名为pMT2188(图3)。将特异腐质霉内切葡聚糖酶V编码区从PCaHjl70作为BamHi-SalI片段转移到用BamHI和XhoI消化过的pMT2188中，生成pCaHj568(图7)。质粒pCaHj568包含与特异腐质霉内切葡聚糖酶V全长编码序列可操作地连接的突变的NA2-tpi启动子。实施例3:pMJ05的构建质粒pMJ05的构建是通过使用如下所示的引物HiEGV-F和HiEGV-R从PCaHj568PCR扩增出915bp的特异腐质霉内切葡聚糖酶V全长编码区。引物HiEGV-F(有义)5，-AAGCTTAAGCATGCGTTCCTCCCCCCTCC-3，(SEQIDNO43)引物HiEGV-R(反义)5’-CTGCAGAATTCTACAGGCACTGATGGTACCAG-3，(SEQIDNO44)扩增反应物(50u1)的组成为IXThermoPolReactionBuffer(ThermoPol反应缓7中液)(NewEnglandBiolabs,Beverly,MA,USA)>0.3mMdNTPUOng/u1pCaHj568>0.3uMHiEGV-F引物、0.3iiMHiEGV-R引物、和2单位VentDNA聚合酶(NewEnglandBiolabs,Beverly,MA,USA)0将这些反应物在如下编程的EPPENDORFMASTERCYCLER5333中温育进行94°C30秒、50°C30秒、72°C60秒的循环5次，然后进行94°C30秒、65°C30秒、72°C120秒的循环25次(最终延伸5分钟)。反应产物通过1.0%琼脂糖凝胶电泳用TAE缓冲液分离，从凝胶上切下937bp的产物条带，使用QIAQUICKGelExtractionKit依照生产商的说明进行纯化。用937bp的纯化片段作为模板DNA继续用下述引物进行扩增引物HiEGV-R(反义)5’-CTGCAGAATTCTACAGGCACTGATGGTACCAG-3，(SEQIDNO45)引物HiEGV-F-overlap(有义)5'-ACCGCGGACTGCGCATCatgcgttcctcccccctcc-3，(seqidno46)斜体表示的引物序列与里氏木霉纤维二糖水解酶I基因(cbhl)(W091/17243)的启动子的17bp同源，下划线的引物序列与特异腐质霉内切葡聚糖酶V编码区的29bp同源。启动子和编码序列之间36bp的重叠使得包含里氏木霉cbhl启动子的994bp片段能够精确的融合于包含特异腐质霉内切葡聚糖酶V编码区的918bp片段。扩增反应物(50ill)的组成为IXThermoPolReactionBuffer(ThermoPol反应缓冲液)、0.3mMdNTP、1ii1纯化的937bpPCR片段、0.3uMHiEGV-F-overlap引物、0.3iiMHiEGV-R引物、和2单位VentDNA聚合酶。将这些反应物在如下编程的EPPENDORFMASTERCYCLER5333中温育进行94°C30秒、50。C30秒、72°C60秒的循环5次，然后进行94°C30秒、65°C30秒、72°C120秒的循环25次(最终延伸5分钟)。反应产物通过1.0%琼脂糖凝胶电泳用TAE缓冲液分离，从凝胶上切下945bp的产物条带，使用QIAQUICKGelExtractionKit依照生产商的说明进行纯化。另外使用如下所示的引物(该有义引物经工程改造在5’末端具有一个Sail限制位点)进行PCR，来从里氏木霉RutC30基因组DNA扩增里氏木霉cbhl启动子序列，该序列从所述基因的ATG起始密码子上游994bp开始延伸。里氏木霉RutC30基因组DNA是用DNeasyPlantMaxiKit白勺。引物TrCBHIpro-F(有义)5，-AAACGTCGACCGAATGTAGGATTGTTATC-3，(SEQIDNO47)引物TrCBHIpro-R(反义)5，-GATGCGCAGTCCGCGGT-3，(SEQIDNO48)扩增反应物(50iil)的组成为IXThermoPolReactionBuffer(ThermoPol反应缓冲液)、0.3mMdNTP、100ng/ii1里氏木霉RutC30基因组DNA、0.3uMTrCBHIpro-F引物、0.3iiMTrCBHIpro-R引物、和2单位VentDNA聚合酶。将这些反应物在如下编程的EPPENDORFMASTERCYCLER5333中温育94V30秒、55V30秒、72°C120秒的循环30次(最终延伸5分钟)。将反应产物通过1.0%琼脂糖凝胶电泳用TAE缓冲液分离，从凝胶上切下998bp的产物条带，使用QIAQUICKGelExtractionKit(QIAqUICK凝胶提取试剂盒)依照生产商的说明进行纯化。用纯化的998bpPCR片段作为模板DNA继续用下述引物进行扩增。引物TrCBHIpro-F5，-AAACGTCGACCGAATGTAGGATTGTTATC-3，(SEQIDNO49)引物TrCBHIpro-R-overlap5，-GGAGGGGGGAGGAACGCATGATGCGCAGTCCGCGGT_3，(SEQIDN050)斜体表示的序列与里氏木霉cbhl启动子的17bp同源，下划线的序列与特异腐质霉内切葡聚糖酶V编码区的29bp同源。启动子和编码序列之间36bp的重叠使得包含里氏木霉cbhl启动子的994bp片段能够精确的融合于包含特异腐质霉内切葡聚糖酶V全长编码区的918bp片段。扩增反应物(50ill)的组成为IXThermoPolReactionBuffer(ThermoPol反应缓冲液)、0.3mMdNTPUU1纯化的998bpPCR片段、0.3iiMTrCBHlpro-F引物、0.3yMTrCBHlpro-R-overlap引物、和2单位VentDNA聚合酶。将这些反应物在如下编程的EPPENDORFMASTERCYCLER5333中温育进行94°C30秒、50V30秒、72°C60秒的循环5次，然后进行94°C30秒、65°C30秒、72°C120秒的循环25次(最终延伸5分钟)。反应产物通过1.0%琼脂糖凝胶电泳用TAE缓冲液分离，从凝胶上切下1017bp的产物条带，使用QIAQUICKGelExtractionKit(QIAQUICK凝胶提取试剂盒)依照生产商的说明进行纯化。用1017bp里氏木霉cbhl启动子PCR片段和945bp特异腐质霉内切葡聚糖酶VPCR片段作为模板DNA继续用下述引物进行扩增，以利用重叠PCR精确地将994bpcbhl启动子融合于918bp内切葡聚糖酶V全长编码区。引物TrCBHIpro-F5，-AAACGTCGACCGAATGTAGGATTGTTATC-3，(SEQIDNO51)引物HiEGV-R:5，-CTGCAGAATTCTACAGGCACTGATGGTACCAG-3，(SEQIDNO52)扩增反应物(50μ1)的组成为IXThermoPolReactionBuffer(ThermoPolβ.应缓冲液)、0.3mMdNTP.O.3μΜTrCBHlpro-F引物、0·3μMHiEGV-R引物和2单位VentDNA聚合酶。将这些反应物在如下编程的EPPENDORFMASTERCYCLER5333中温育进行94°c30秒、50°C30秒、72°C60秒的循环5次，然后进行94°C30秒、65°C30秒、72°C120秒的循环25次(最终延伸5分钟)。反应产物通过1.0%琼脂糖凝胶电泳用TAE缓冲液分离，从凝胶上切下1926bp的产物条带，使用QIAQUICKGelExtractionKit(QIAQUICK凝胶提取试剂盒)依照生产商的说明进行纯化。将所得的1926bp片段使用ZEROBLUNTTOPOPCRCloningKit(ZEROBLUNTTOPOPCR克隆试剂盒)(Invitrogen，Carlsbad,CA,USA)依照制造商的规程克隆到pCR-Blunt-II-TOPO载体(Invitrogen，Carlsbad,CA,USA)中。所得的载体用NotI和SalI消化，使用QIAQUICKGelExtractionKit(QIAQUICK凝胶提取试剂盒)凝胶纯化1926bp片段，然后使用T4DNA连接酶(Roche,Indianapolis,IN,USA)连接到pMJ04(其也用同样两种限制酶消化过)中，产生PMJ05(图8)。质粒pMJ05包含与特异腐质霉内切葡聚糖酶V全长编码序列可操作地连接的里氏木霉纤维二糖水解酶I启动子及终止子。实施例4:PSMail30表达载体的构建从作为模板的pJaL660(W02002/095014)用如下所示的引物993467(有义)和993456(反义)PCR扩增了米曲霉β-葡糖苷酶全长编码序列(cDNA序列SEQIDNO15；推定的氨基酸序列SEQIDNO16；大肠杆菌DSM14240)中从ATG起始密码子直到TAA终止密码子的2586bp的DNA片段。一个SpeI位点被工程构建到反义引物的5’末端以便于连接。斜体字的引物序列与里氏木霉cbhl启动子的24bp同源，下划线的序列与米曲霉β-葡糖苷酶编码区的22bp同源。引物"!Μ67:5，-ATAGTCAACCGCGGACTGCGCATCatgaagcttggttggatcgagg-3，(seqIDNO53)引物"!Μ56:5，-ACTAGTTTACTGGGCCTTAGGCAGCG-3，(SEQIDNO54)扩增反应物(50μ1)的组成为Pfx扩增缓冲液(Invitrogen,Carlsbad,CA,USA),0.25mMdNTP,IOngpJaL660，6.4μM引物993467，3.2μM引物993456，ImMMgCl2禾口2.5单位PfxDNA聚合酶(Invitrogen，Carlsbad,CA,USA)。将这些反应物在如下编程的EPPENDORFMASTEHGYCLEU5333中温育进行94°c1分钟、55°C1分钟、72°C3分钟的循环30次(最终延伸15分钟)。反应产物通过1.0%琼脂糖凝胶电泳用TAE缓冲液分离，从凝胶上切下2586bp的产物条带，使用QIAQUICKGelExtractionKit(QIAQUICK凝胶提取试剂盒)依照生产商的说明进行纯化。另外使用如下所示的引物993453(有义)和引物993463(反义)进行PCR，来扩增里氏木霉cbhl启动子序列(其从该基因ATG起始密码子上游IOOObp处开始延伸)，产生一个IOOObp的PCR片段。引物"!Μ53:5，-GTCGACTCGAAGCCCGAATGTAGGAT-3，(SEQIDNO55)引物993463:5'-CCTCGATCCAACCAAGCTTCATGATGCGCAGTCCGCGGTTGACTA_3，(SEQIDNO56)斜体表示的引物序列与里氏木霉cbhl启动子的24bp同源，下划线的引物序列与米曲霉β-葡糖苷酶全长编码区的22bp同源。启动子和编码序列之间46bp的重叠使得包含里氏木霉cbhl启动子的IOOObp片段能够精确的融合于包含米曲霉β-葡糖苷酶编码区的2586bp片段。扩增反应物(50μ1)的组成为Pfx扩增缓冲液、0.25mMdNTP、IOOng里氏木霉RutC30基因组DNA、6.4μM引物993453、3.2μM引物993463、ImMMgCl2和2.5单位PfxDNA聚合酶。将这些反应物在如下编程的;EPP￡MDGRFMASTERGYCLER5333中温育进行94°C1分钟、55°C1分钟、72°C3分钟的循环30次(最终延伸15分钟)。反应产物通过1.0%琼脂糖凝胶电泳用TAE缓冲液分离，从凝胶上切下IOOObp的产物条带，使用QIAQUICKGelExtractionKit(QIAQUICK凝胶提取试剂盒)依照生产商的说明进行纯化。用纯化的片段作为模板DNA，进一步通过使用上文所示的引物993453(有义)和引物993456(反义)的重叠PCR进行扩增，来将包含里氏木霉cbhl启动子的IOOObp片段精确地融合于包含米曲霉β-葡糖苷酶全长编码区的2586bp片段。扩增反应物(50μ1)的组成为Pfx扩增缓冲液、0.25mMdNTP,6.4μM引物99353、3.2μM引物993456、ImMMgCl2和2.5单位PfxDNA聚合酶。将这些反应物在如下编程的EPPENDORFMASTERCYCLER5333中温育进行94°C1分钟、60°C1分钟、720C4分钟的循环30次(最终延伸15分钟)。将所得的3586bp片段用SalI和SpeI消化，并连接到用同样两种限制酶消化过的PMJ04中，产生pSMail30(图6)。质粒pSMail30包含与米曲霉天然β-葡糖苷酶信号序列及编码序列(即全长米曲霉葡糖苷酶编码序列)可操作地连接的里氏木霉纤维二糖水解酶I基因启动子及终止子。实施例5:pSMail35的构建从作为模板的pJaL660利用如下所示的引物993728(有义)及引物993727(反义)PCR扩增出从Lys-20到TAA终止密码子的米曲霉β-葡糖苷酶成熟编码区(减去天然信号序列，见图7；SEQIDNO57和58代表信号肽和它的编码序列)。引物993728:5，-TGCCGGTGTTGGCCCTTGCCaaggatgatctcgcgtactccc-3，(seqidno59)引物993727:5，-gactagtcttactgggccttaggcagcg-3，(seqidno60)斜体字的序列与特异腐质霉内切葡聚糖酶V信号序列的20bp同源，下划线的序列与米曲霉β-葡糖苷酶编码区的22bp同源。将一个SpeI位点工程化到反义引物的5’端中。扩增反应物(50μ1)的组成为Pfx扩增缓冲液、0.25mMdNTP、IOng/μlpJaL660、6.4μM引物993728、3.2μM引物993727、ImMMgCl2和2.5单位PfxDNA聚合酶。将这些反应物在如下编程的EPPENDORFMASTERCYCLER5333中温育进行94°C1分钟、55°C1分钟、72°C3分钟的循环30次(最终延伸15分钟)。反应产物通过1.0%琼脂糖凝胶电泳用TAE缓冲液分离，从凝胶上切下2523bp的产物条带，使用QIAQUICKGelExtractionKit(QIAQUICK凝胶提取试剂盒)依照生产商的说明进行纯化。另外使用如下所示的引物993724(有义)和引物993729(反义)进行PCR扩增来扩增里氏木霉cbhl启动子的IOOObp和特异腐质霉内切葡聚糖酶V信号序列的63bp(ATG起始密码子到Ala-21,图8，SEQIDNO61和62)。引物993724:5，-acgcgtcgaccgaatgtaggattgttatcc-3，(seqidno63)引物“37295，-gggagtacgcgagatcatccttGGCAAGGGCCAACACCGGCA_3，(seqidno64)斜体字的引物序列与特异腐质霉内切葡聚糖酶V信号序列的20bp同源，下划线的引物序列与米曲霉β“葡糖苷酶编码区的22bp同源。用包含cbhl启动子控制下的特异腐质霉内切葡聚糖酶V编码区的质粒pMJ05作为模板，产生了一条包含里氏木霉cbhl启动子和特异腐质霉内切葡聚糖酶V信号序列片段的1063bp片段。里氏木霉cbhl启动子和特异腐质霉内切葡聚糖酶V信号序列与米曲霉β-葡糖苷酶成熟编码序列之间有42bp的重叠，以提供所述启动子与2523bp米曲霉β-葡糖苷酶编码区的ATG起始密码子之间的完美连结。扩增反应物(50μ1)的组成为Pfx扩增缓冲液、0.25mMdNTP、IOng/μlpMJ05、6.4μM引物993728、3.2μM引物993727、ImMMgCl2和2.5单位PfxDNA聚合酶。将这些反应物在如下编程的EPPENDORFMASTERCYCLER5333中温育进行94°C1分钟、60°C1分钟、72°C4分钟的循环30次(最终延伸15分钟)。反应产物通过1.0%琼脂糖凝胶电泳用TAE缓冲液分离，从凝胶上切下1063bp的产物条带，使用QIAQUICKGelExtractionKit(QIAQUICK凝胶提取试剂盒)依照生产商的说明进行纯化。用纯化的重叠片段作为模板，用如上所述的引物993724(有义)和引物993727(反义)进行扩增，通过重叠PCR将所述包含里氏木霉cbhl启动子和特异腐质霉内切葡聚糖酶V信号序列的1063bp片段精确地融合于所述包含米曲霉β-葡糖苷酶成熟编码区框的2523bp片段。扩增反应物(50μ1)的组成为Pfx扩增缓冲液、0.25mMdNTP、6.4μM引物993724、3.2μM引物993727、ImMMgCl2和2.5单位PfxDNA聚合酶。将这些反应物在如下编程的EPPENDORFMASTERCYCLER5333中温育进行94°C1分钟、60°C1分钟、720C4分钟的循环30次(最终延伸15分钟)。反应产物通过1.0%琼脂糖凝胶电泳用TAE缓冲液分离，从凝胶上切下3591bp的产物条带，使用QIAQUICKGelExtractionKit(QIAQUICK凝胶提取试剂盒)依照生产商的说明进行纯化。将所得的3591bp片段用SalI和SpeI消化，连接到用相同的限制酶消化过的PMJ04中产生pSMail35(图9)。质粒pSMail35包含可操作地连接于特异腐质霉内切葡聚糖酶V信号序列和米曲霉β_葡糖苷酶成熟编码序列的里氏木霉纤维二糖水解酶I基因启动子和终止子。实施例6带有特异腐质霉内切葡聚糖酶V分泌序列的米曲霉β-葡糖苷酶的表达通过PEG-介导的转化(Penttila等，1987，Gene61155-164)将编码与特异腐质霉内切葡聚糖酶V分泌序列连接的成熟米曲霉β-葡糖苷酶的质粒pSMail35(图8)导入里氏木霉RutC30中。该质粒含有构巢曲霉amdS基因，使得转化子可以利用乙酰胺作为唯一氮源生长。将里氏木霉RutC30在25ml添加了2%(w/v)葡萄糖和IOmM尿苷的YP培养基中27°C、90rpm条件下培养17个小时。用VacuumDrivenDisposableFiltrationSystem(—次性真空驱动过滤系统)(Millipore，Bedford,MA,USA)过滤收集菌丝体，用去离子水和1.2M山梨醇各洗涤两次。将经过洗涤的菌丝体重悬在含15mg/mlGLUCANEX(NovozymesA/S，Bagsvaerd,Denmark)禾口0.36单位/ml壳多糖酶(SigmaChemicalCo.，St.Louis,M0,USA)的20ml1.2M山梨醇中，90rpm轻柔震荡下34°C温育15-25分钟来生成原生质体。400xg离心7分钟收集原生质体，用冷的1.2M山梨醇洗涤两次。原生质体用血细胞计数器计数后重悬于STC中至终浓度1XIO8个原生质体/ml。多余的原生质体在CryolCFreezingContainer(1C冷冻柜)(Nalgene，Rochester，NY，USA)中-80°C保存。将大约7μg经PmeI消化的pSMail35加入100μ1原生质体溶液中，轻柔混合，然后加入260μ1PEG缓冲液，混合，室温温育30分钟。然后加入STC(3ml)，混合，将转化溶液涂布到使用构巢曲霉amdS选择的COVE平板上。将平板在28°C温育5_7天。将转化子分培到C0VE2平板上，使其在28°C生长。将用PSMail35获得的67个转化子(称为SMA135)分培到含有乙酰胺的新鲜平板上，让它们在28°C产生孢子7天。将这67个SMA135里氏木霉转化子在含25mlpH6.0纤维素酶诱导培养基的125ml带挡板烧瓶中培养，其中用所述转化子的孢子接种培养基，在28°C、200rpm条件下温育7天。用里氏木霉RutC30作为对照。在第7天取出培养液样品。将每种培养液Iml在微量离心管中15，700xg离心5分钟，将上清液转移到新管中。样品保存在4°C直到进行酶测定。用对硝基苯基-D-吡喃葡萄糖苷作为底物测定上清液的葡糖苷酶活性，如下所述。β-葡糖苷酶活性测定在环境温度下进行，使用25μ1等份的在50mM琥珀酸盐(succinate)pH5.0中110稀释过的培养上清液，在作为底物的200μ10.5mg/ml对硝基苯基-β-D-吡喃葡萄糖苷(溶于50mM琥珀酸盐pH5.0)中实施。温育15分钟后加入100μIlMTris-HClρΗ8.0终止反应，用分光光度计读取405nm吸光度。1个单位的β-葡糖苷酶活性对应于环境温度、PH5.0条件下每升每分钟产生1μmol对硝基苯。用黑曲霉β-葡糖苷酶(N0V0ZYM188,NovozymesA/S,BagSVaerd5Denmark)作为酶标准品。若干个SMA135转化子产生了比里氏木霉RutC30高数倍的β-葡糖苷酶活性。转化子SMA135-04产生了最高的β-葡糖苷酶活性。用CRITERION系统(Bio-Rad，Hercules,CA,USA)使用CRITERIONTris-HCl(5%分离型)凝胶(Bio-Rad，Hercules，CA，USA)进行SDS-PAGE。将5μ1第7天上清液(见上文)重悬在2Χ浓度的LaemmliSampleBuffer(Laemmli样品缓冲液)(Bio-Rad,Hercules,CA,USA)中，在5%β-巯基乙醇存在下煮沸3分钟。将上清液样品加载到聚丙烯酰胺凝胶上，用IXTris/甘氨酸/SDS作为运行缓冲液(Bio-Rad，Hercules，CA，USA)进行电泳。所得的凝胶用BIO-SAFECoomassieStain(考马斯染料)(Bio-Rad，Hercules，CA,USA)染色。总的说来，38个里氏木霉SMA135转化子中的26个产生了一个大约IlOkDa的蛋白质，其未见于作为对照的里氏木霉RutC30中。转化子里氏木霉SMA135-04产生的β-葡糖苷酶水平最高。实施例7表达载体pSMail40的构建表达载体pSMail40通过用NcoI消化质粒pSATelllBG41(W004/099228)而构建，质粒pSATelllBG41携带米曲霉β-葡糖苷酶变体BG41全长编码区(SEQIDΝ0:25，其编码SEQIDNO26的氨基酸序列)。所得1243bp的片段用TAE缓冲液通过1.O%的琼脂糖凝胶电泳分离并使用QIAQUICKGelExtractionKit根据制造商的说明进行纯化。表达载体pSMail35用NcoI消化，8286bp的片段用TAE缓冲液通过1.0%的琼脂糖凝胶电泳分离并使用QIAQUICKGelExtractionKit根据制造商的说明进行纯化。然后用T4DNA连接酶(Roche，Indianapolis,IN,USA)根据制造商的规程将1243bp经NcoI消化的米曲霉β-葡糖苷酶变体BG41片段与8286bp的载体片段连接产生表达载体pSMail40(图10)。质粒pSMai140包含与特异腐质霉内切葡聚糖酶V信号序列以及米曲霉β-葡糖苷酶变体的成熟编码序列可操作地连接的里氏木霉纤维二糖水解酶I(CEL7A)基因启动子和终止子。实施例8用pSMai140转化里氏木霉RutC30用PmeI将质粒pSMai140线性化并如实施例6所述转化入里氏木霉RutC30菌株。从4个独立的转化实验中共获得100个转化体，将所有转化体在摇瓶中在纤维素酶诱导性培养基上培养，然后如实施例6所述从转化体的培养基中测定β-葡糖苷酶活性。许多里氏木霉SMA140转化体显示比里氏木霉RutC30高数倍的β-葡糖苷酶活性。通过实施例6所述的SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳和Coomassie染色从分析过酶活性的同样13个培养物上清检测到培养基中米曲霉葡糖苷酶变体BG41蛋白质的存在。所有13个具有高葡糖苷酶活性的转化体也以不同产率表达约IlOkDa的米曲霉β-葡糖苷酶变体BG41。将经过β-葡糖苷酶活性测定和SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳评价的表达最高β-葡糖苷酶变体的转化体命名为里氏木霉SMA140-43。实施例9表达载体pSaMe-Fl的构建用pMJ05作为模板与下述引物PCR扩增包含209bp的里氏木霉纤维二糖水解酶I基因启动子和特异腐质霉内切葡聚糖酶V基因的核心域(SEQIDN0:31的核苷酸1-702，其编码SEQIDNO32的氨基酸1-234，W091/17243)的DNA片段。引物9%103:5，-cccaagcttagccaagaaca-3，(SEQIDNO65)引物995137:5'-gggggaggaacgcatgggatctggacggc-3'(SEQIDNO66)扩增反应物(50μ1)的组成为IXPfx扩增缓冲液、IOmMdNTP、50mMMgS04、IOng/μ1pMJ05、50皮摩尔995103引物、50皮摩尔995137引物和2单位PfxDNA聚合酶。所述反应物在如下编程的EPPENDORFMAS丁ERCYOLKI5333中温育进行94°C30秒、55°C30秒和72°C60秒的循环30次(3分钟最后延伸)。反应产物用TAE缓冲液通过1.0%琼脂糖凝胶电泳分离，将911bp的产物条带从凝胶上切下，并根据制造商的说明用QIAQUICKGelExtractionKit纯化。用pSMail40作为模板与下述引物PCR扩增包含806bp米曲霉β-葡糖苷酶变体BG41基因的DNA片段。引物995I33:5，-gccgtccagatccccatgcgttcctccccc-3，(SEQIDNO67)引物995111:5，-ccaagcttgttcagagtttc-3，(SEQIDNO68)扩增反应物(50μ1)的组成为IXPfx扩增缓冲液、IOmMdNTPs、50mMMgS04、IOOngpSMail40、50皮摩尔995133引物、50皮摩尔995111引物和2单位PfxDNA聚合酶。所述反应物在如下编程的EPPENDORFMASTERCYCLER5333中温育进行94°C30秒、55°C30秒和72°C120秒的循环30次(3分钟最后延伸)。反应产物用TAE缓冲液通过1.0%琼脂糖凝胶电泳分离，将806bp的产物条带从凝胶上切下并根据制造商的说明用QIAQUICKGelExtractionKit纯化。然后将以上两个PCR片段进行重叠PCR。使用纯化的重叠片段作为扩增模板，用于使用上述引物995103(有义)和引物995111(反义)进行扩增，以将包含209bp的里氏木霉纤维二糖水解酶I基因启动子和特异腐质霉内切葡聚糖酶V核心序列的702bp片段与包含米曲霉β-葡糖苷酶变体BG41—部分编码区的806bp片段通过重叠PCR精确融合。扩增反应物(50μ1)的组成为IXPfx扩增缓冲液、IOmMdNTP、50mMMgS04、2.5μ1的每一种片段(20ng/y1)、50皮摩尔995103引物、50皮摩尔995111引物和2单位的高保真PfxDNA聚合酶。所述反应物在如下编程的EPPENDORFMASTERCYCLER5333中温育进行95°C初始变性3分钟，进行1分钟变性、60°C1分钟退火和72°C3分钟延伸的每个循环30次。反应产物用TAE缓冲液通过1.0%琼脂糖凝胶电泳分离，将1.7kb的产物条带从凝胶上切下并根据制造商的说明用QIAQUICKGelExtractionKit纯化。根据制造商的说明将1.7kb的片段连入pCR4平末端载体(Invitrogen，Carlsbad,CA,USA)。然后根据制造商的快速化学转化步骤将构建体转化入ONESHOTTOPlO化学感受态大肠杆菌细胞(Invitrogen，Carlsbad,CA,USA)。用质粒分离与消化的方法选择与分析菌落，其中消化使用HindIII进行以释放1.7kb的重叠PCR片段。同样用HindIII消化质粒pSMail40以线性化质粒。两个消化的片段根据制造商的说明在使用RapidDNALigationKit的连接反应中组合起来产生pSaMe-Fl(图11)。将大肠杆菌XLl-BlueSubcloning-GradeCompetentCells(大肠杆菌XLl-蓝色亚克隆级感受态细胞)(Stratagene，LaJolla,CA,USA)用连接产物转化。构建体的身份通过对从转化的大肠杆菌中纯化的质粒进行DNA测序来确认，所测序列为里氏木霉纤维二糖水解酶I基因启动子、特异腐质霉内切葡聚糖酶V信号序列、特异腐质霉内切葡聚糖酶V核心、特异腐质霉内切葡聚糖酶V信号序列、米曲霉β-葡糖苷酶变体BG41和里氏木霉纤维二糖水解酶I基因终止子序列。一个包含重组质粒的克隆被命名为pSaMe-Fl。质粒PSaMe-Fl包含里氏木霉纤维二糖水解酶I基因启动子和终止子，还有特异腐质霉内切葡聚糖酶V信号肽序列，特异腐质霉内切葡聚糖酶V信号肽序列直接与特异腐质霉内切葡聚糖酶V核心多肽连接，特异腐质霉内切葡聚糖酶V核心多肽直接与特异腐质霉内切葡聚糖酶V信号肽融合，特异腐质霉内切葡聚糖酶V信号肽直接与米曲霉β-葡糖苷酶变体BG41成熟编码序列连接。米曲霉β-葡糖苷酶变体BG融合蛋白的DNA序列和推定的氨基酸序列如图12A、12B、12C和12D(分别为SEQIDNO25和26)所示。实施例10用pSaMe-Fl转化里氏木霉RutC30含有25ml添加了2%葡萄糖和IOmM尿苷的YP培养基的摇瓶用5X107个里氏木霉RutC30的孢子接种。在27°C，90rpm的条件下大约16小时温育过夜之后，用真空驱动的抛弃式过滤系统收集菌丝。菌丝在100ml去离子水中洗涤两次，在1.2M的山梨醇中洗涤两次。如实施例6所述那样产生原生质体。将两微克经PmeI线性化的pSaMe-FlDNA，100μ1的里氏木霉RutC30原生质体和50%PEG(4000)混合并在室温下温育30分钟。然后加入3mlSTC并将内容物倒至添加了IOmM尿苷的COVE平板上。然后将平板在28°C温育。转化体在第6天开始出现并被挑出至C0VE2平板上在28°C生长6天。回收了22个里氏木霉转化体。将转化体在摇瓶中在纤维素酶诱导性培养基上培育，如实施例6所述测定β-葡糖苷酶活性。许多PSaMe-Fl转化体都产生β-葡糖苷酶活性。一个命名为里氏木霉SaMeFl-9的转化体产生最大量的β_葡糖苷酶，与表达米曲霉β_葡糖苷酶变体的菌株(实施例9)相比，其具有两倍的活性。内切葡聚糖酶的活性根据Beguin，1983，AnalyticalBiochem.131(2):333_336用羧甲基纤维素(CMC)涂覆测定法测定。将从5个培养液样品(那些具有最高葡糖苷酶活性的)中得到的5μg总蛋白用NativeSampleBuffer(天然样品缓冲液)(Bio-Rad,Hercules,CA,USA)稀释并用10XTris/甘氨酸运行缓冲液(Bio-Rad，Hercules,CA,USA)在CRITERION8-16%Tris-HCl凝胶(Bio-Rad，Hercules,CA,USA)上运行，然后将凝胶铺在含有羧甲基纤维素(carboxymethylcellulose，CMC)的平板上。在37°C温育1小时后，将凝胶用0.1%CongoRed染色20分钟。然后用IMNaCl为平板脱色以鉴定指示内切葡聚糖酶活性的澄清区域。两个澄清区域可见，一个为约IlOkDa的上方区域，另一个为约25kDa的下方区域。特异腐质霉内切葡聚糖酶V和米曲霉β-葡糖苷酶变体BG41融合蛋白的预测蛋白质大小是118kDa，如果两个蛋白质未被切割而是保持为单个多肽的话；单个内切葡聚糖酶V核心结构域和β-葡糖苷酶的糖基化导致单个蛋白质迁移到比根据一级序列预测的更高的分子量。如果两个蛋白质被切割，那么特异腐质霉内切葡聚糖酶V核心结构域的预测大小是24kDa而米曲霉β-葡糖苷酶变体BG41的预测大小是94kDa。由于IlOkDa处有澄清区域，这一结果显示最起码内切葡聚糖酶和葡糖苷酶融合蛋白群体作为单个的大蛋白保持完整。下方澄清区域很可能代表内源的内切葡聚糖酶活性，可能是由于特异腐质霉内切葡聚糖酶V核心结构域与米曲霉β-葡糖苷酶的部分断裂而额外导致的。所述结果证明特异腐质霉内切葡聚糖酶V核心是有活性的，即使是将其连接到米曲霉葡糖苷酶。此外，葡糖苷酶活性的提高似乎是由于相对于非融合的葡糖苷酶的分泌效率，蛋白质分泌的分泌效率有所提高所致。通过将米曲霉葡糖苷酶变体BG41序列连接到高效分泌的特异腐质霉内切葡聚糖酶V核心，使更多的β-葡糖苷酶被分泌。实施例11载体pSaMe-FX的构建质粒pSaMe-FX通过修饰pSaMe_Fl而构建。用BstZ17和EcoRI消化质粒PSaMe-Fl以产生含有β-葡糖苷酶变体BG41编码序列的Ikb片段和包含质粒剩余部分的9.2kb片段。所述片段用TAE缓冲液通过1.0%琼脂糖凝胶电泳分离，将9.2kb的片段根据制造商的说明用QIAQUICKGelExtractionKit切下并纯化。质粒pSMail35也用BstZ17和EcoRI消化以产生含有与米曲霉β-葡糖苷酶变体BG41编码序列同源的碱基的Ikb片段和含有质粒剩余部分的8.5kb片段。如上分离和纯化Ikb片段。根据制造商的说明用RapidDNALigationKit在连接反应中组合9.2kb和Ikb的片段以产生pSaMe-FX，除了它含有野生型β-葡糖苷酶成熟编码序列而不是变体成熟编码序列之外，其与PSaMe-Fl相同。用连接产物转化大肠杆菌SURE感受态细胞(Stratagene,LaJolla,CA,USA)。构建体的身份通过DNA测序从经转化的大肠杆菌中纯化的质粒来确定，证明里氏木霉纤维二糖水解酶I基因启动子、特异腐质霉内切葡聚糖酶V信号序列、特异腐质霉内切葡聚糖酶V核心序列、特异腐质霉内切葡聚糖酶V信号序列、米曲霉β-葡糖苷酶成熟编码序列和里氏木霉纤维二糖水解酶I基因终止子序列的存在。将一个含有重组质粒的克隆命名为PSaMe-FX(图13)。米曲霉β-葡糖苷酶融合蛋白的DNA序列和推定的氨基酸序列如图14A、14B、14C和14D(分别为SEQIDNO27和28)所示。实施例12木霉转化体的转化和表达如实施例10所述用PmeI线性化pSaMe-FX构建体并将其转化入里氏木霉RutC30菌株。单次转化共获得63个转化体。转化体在摇瓶中的纤维素酶诱导性培养基上培养并如实施例6所述测定β-葡糖苷酶活性。许多pSaMe-FX转化体产生了β-葡糖苷酶活性。一个命名为SaMe_FX16的转化体与里氏木霉SaMeFl_9(实施例10)相比产生了两倍量的β-葡糖苷酶活性。实施例13里氏木霉转化体的分析如实施例9所述那样通过融合特异腐质霉内切葡聚糖酶V核心(包含其自身的天然信号序列)和与特异腐质霉内切葡聚糖酶V信号序列连接的米曲霉葡糖苷酶变体BG41成熟编码序列来构建融合蛋白。和与特异腐质霉内切葡聚糖酶V信号序列连接的米曲霉β-葡糖苷酶变体BG41成熟编码序列相比，该融合构建体导致分泌的β-葡糖苷酶的活性提高了两倍。第二个融合构建体如实施例11所述产生，其由与米曲霉野生型β-葡糖苷酶编码序列(该序列与特异腐质霉内切葡聚糖酶V信号序列连接)融合的特异腐质霉内切葡聚糖酶V核心(包括其自身信号序列)组成，而这导致葡糖苷酶活性的进一步提高。用野生型融合蛋白转化的菌株相对于用葡糖苷酶变体BG41融合蛋白转化的菌株具有两倍的分泌的葡糖苷酶活性。实施例14将β-葡糖苷酶融合蛋白编码序列克隆入米曲霉表达载体设计如下所示的两个合成寡核苷酸引物，用以从编码葡糖苷酶融合蛋白的PSaMeFXPCR扩增全长开放式读码框。PCR正向引物5'-GGACTGCGCAGCATGCGTTC-3'(SEQIDNO69)PCR反向引物5'-AGTTAATTAATTACTGGGCCTTAGGCAGCG-3'(SEQIDNO70)黑体字母代表编码序列。正向引物中带有下划线的“G”表示引入的用以产生SphI限制性位点的碱基改变。剩余的序列与PSaMeFX插入位点相比具有序列同一性。反向引物中带有下划线的序列表示添加的PacI限制性位点，其有助于向表达载体PAlLo2中的克隆(W004/099228)。在终体积为50μ1的PCR反应中使用50皮摩尔的以上每种引物，所述PCR反应包含50ngpSaMeFXDNAUXPfx扩增缓冲液、6μIlOmMdATP、dTTP、dGTP和dCTP的混合物、2.5单位PLATINUMPfxDNA聚合酶，和Ιμ50mMMgS04。用如下设定程序的EPPENDORFMASTERCYCLER5333扩增片段进行95°C2分钟的1个循环；和960C30秒、61°C30秒和68°C3分钟的循环35个。35个循环之后，反应物在68°C温育10分钟，然后于10°C冷却备用。用TAE缓冲液和0.1μg/ml溴化乙锭在0.8%GTG-琼脂糖凝胶(CambrexBioproductsOneMeadowlandsPlazaEastRutherford,NJ,USA)上分离3.3kb的PCR反应产物。为了避免UV-诱导的突变，借助DARKREADER(ClareChemicalResearch,Dolores,CO,USA)使DNA可视化。用一次性剃刀片将3.3kb的DNA条带切下并根据制造商的说明用υΤΚΑΡΚΕΕ-0Α离心杯(spincup)(Millipore,Billerica,MA,USA)纯化。将纯化的3.3kbPCR产物克隆入pCR4Blunt_TOPO载体(Invitrogen，Carlsbad,CA,USA)。将4微升纯化的PCR产物与1μ12M氯化钠溶液和1μ1TOPO载体混合。反应物在室温下温育15分钟，然后根据制造商的说明用2μ1反应物转化OneShotT0P10化学感受态大肠杆菌细胞。将每个转化反应的三个83μ1的等份样品涂布在添加了100μg/ml氨苄青霉素的三个150mm2XYT平板上并在37°C温育过夜。用8个重组菌落为含有添加了100μg/ml氨苄青霉素的3mlLB培养基接种。用BIOROBOT9600(QIAGENInc.,Valencia,CA,USA)从这些培养物中制备质粒DNA。克隆用PacI限制酶消化进行分析。将来自每个克隆的质粒DNA用PacI消化并用TAE缓冲液通过1.0%琼脂糖凝胶电泳分析。所有的8个克隆都具有期望的限制性酶切图式，选择克隆5、6、7和8进行测序以确认在克隆的插入物中没有突变。对它们的5’和3’末端的序列分析显示所有的4个克隆都具有正确的序列。选择克隆5和7进行后续测序。两个克隆都测序为PhredQ值超过40以确保没有PCR导致的错误。克隆5和7显示具有期望的序列而选择克隆5重克隆入PAlLo2。通过SphI消化将来自克隆5的质粒DNA线性化。然后通过加入1.2ullOmM的dATP、dTTP、dGTP和dCTP的混合物和6单位的T4DNA聚合酶(NewEnglandBioloabs,Inc.，Ipswich,MA,USA)将线性化的克隆平末端化。所述混合物在12°C温育20分钟，然后通过加入1ill0.5MEDTA停止反应并在75°C加热20分钟使酶失活。编码0-葡糖苷酶融合蛋白的3.3kb片段如上所述通过凝胶电泳和超滤纯化。通过用NcoI消化使载体PAlLo2线性化。然后通过加入0.5yl10mM的dATP、dTTP、dGTP和dCTP的混合物和1单位的DNA聚合酶I使线性化的载体平末端化。在25°C将混合物温育15分钟，然后通过加入1Pi0.5MEDTA停止反应并在75°C加热15分钟使酶失活。然后用PacI消化载体。平末端化的载体如上所述通过凝胶电泳和超滤纯化。将编码0-葡糖苷酶融合蛋白的3.3kb片段克隆入经线性化和纯化的PAlLo2载体，所述克隆是用快速RapidLigationKit进行的。根据制造商的说明用1yl反应样品转化大肠杆菌XL10SOLOPACKGold细胞(Stratagene，LaJolla,CA，USA)。在回收阶段之后，将来自转化反应的2个100yl等份样品涂布在添加了100ug/ml氨苄青霉素的2个150mm2XYT平板上并在37°C温育过夜。从选择平板上随机挑选一组8个推定的重组克隆并用BIOROBOT9600从每个克隆制备质粒DNA。选择克隆1-4用PA1L02特异性引物测序以确认连接载体/插入序列具有正确的序列。克隆3具有完美的载体/插入序列连接并被命名为PAlLo47(图15)。为了获得无标记的表达菌株，进行限制性内切酶消化将赋予氨苄青霉素(抗生素)抗性的blaA基因与表达构建体的其它部分分离。用PmeI消化30微克PAlLo47。然后将经消化的DNA如上所述用琼脂糖凝胶电泳纯化。用剃刀片将含有表达构建体但缺少blaA基因的6.4kbDNA条带切下并用QIAQUICKGelExtractionKit纯化。实施例15特异腐质霉/米曲霉cel45A-Cel3A融合基因在米曲霉JaL355中的表达根据Christensen等，1988，Bio/Technology6:1419_1422的方法制备米曲霉JaL355(W000/240694)的原生质体。使用10微升实施例14的经纯化的表达构建体转化米曲霉JaL355原生质体。米曲霉JaL355的转化产生大约90个转化体。分离50个转化体至单独的PDA平板上并在34°C温育5天。用3ml0.01%TWEEN80洗涤48个铺满的孢子平板，并用孢子悬浮液接种125ml玻璃摇瓶中的25mlMDU2BP培养基。转化体培养物在34°C温育并以200rpm持续摇动。5天之后，将每个培养物的lml等份样品在12，000xg下离心并收集其上清。5iU的每种上清与等体积的2X上样缓冲液(10%0-巯基乙醇)混合并上样至1.5mm8%-16%Tris-甘氨酸SDS-PAGE凝胶，用BIO-SAFECoomassieBlueG250蛋白染料(Bio-Rad，Hercules,CA,USA)染色。培养液的SDS-PAGE谱显示，48个转化体中的33个能够表达表观分子量与期望的118kDa非常相近的新蛋白质。转化体21具有最佳产率并被选择进行进一步研究。实施例16米曲霉JaL355转化体21的单孢子分离将米曲霉JaL355转化体21的孢子涂布在PDA平板上并在34°C温育5天。铺满孢子的平板上的一小块区域用0.5ml0.01%TWEEN80洗涤以重悬孢子。将孢子悬浮液100u1的等份样品用5ml0.01%TWEEN80稀释至终体积5ml。借助血球计数器(hemocytometer)测定孢子浓度并将其稀释至终浓度为每微升0.1个孢子。将孢子稀释液200u1的等份样品涂布在150mm基础培养基平板上并在34°C温育2_3天。将出现的克隆从平板上切下转移至PDA平板并在34°C温育3天。然后将孢子涂布在平板上并在34°C温育5天。将铺满孢子的平板用3ml0.01%TWEEN80洗涤并用孢子悬浮液接种125ml玻璃摇瓶中的25mlMDU2BP培养基。单孢子培养物在34°C下温育并以200rpm持续摇动。5天之后，将每个培养物的lml等份样品以12，000xg离心并收集其上清。5yl的每种上清与等体积的2X上样缓冲液(10%3-巯基乙醇)混合并上样至1.5mm8%-16%Tris-甘氨酸SDS-PAGE凝胶，用BI0-SAFECoomassieBlueG250蛋白染料染色。培养液的SDS-PAGE谱显示所有的8个转化体都能够以非常高的水平表达3-葡糖苷酶融合蛋白，而将产生最高产率的培养物之一命名为米曲霉JaL355AlLo47。实施例17:pCW087的构建设计如下所示的2个合成多核苷酸引物以从质粒pDZA2-7(W02005/074656)中PCR扩增橙色嗜热子囊菌GH61A多肽基因。正向引物产生平的5’末端而反向引物在3’末端引APacI位点。正向引物5，-ATGTCCTTTTCCAAGATAATTGCTACTG-3，(SEQIDNO71)反向引物5，-GCTTAATTAACCAGTATACAGAGGAG-3，(SEQIDNO72)将50皮摩尔的以上各种引物用于终体积为50iU的PCR反应中，所述反应的组成为50ngpDZA2-7、lii110mMdATP、dTTP、dGTP禾口dCTP混合物、5u110XACCUTAQDNA聚合酶缓冲液(Sigma-Aldrich，St.Louis,M0,USA)和5单位ACCUTAQDNA聚合酶(Sigma-Aldrich,St.Louis,M0,USA)。用程序设定如下的EPPENDORFMASTERCYCLER5333扩增DNA片段95°C3分钟，1个循环；94°C45秒、55°C60秒和72°C1分30秒，30个循环。25个循环之后，将反应在72°C温育10分钟然后冷却至4°C等待后续处理。用PacI消化橙色嗜热子囊菌GH61APCR片段的3’末端。根据制造商的说明用MINELUTEReactionCleanupKit(QIAGENInc.,Valencia,CA,USA)纯化消化产物。利用5’末端平的NcoI位点和3’末端的PacI位点将GH61A片段直接克隆入pSMail55(W02005/074647)。质粒pSMail55用NcoI和PacI消化。然后用Klenow酶将NcoI位点变平以填补NcoI位点的5，凹陷。Klenow反应由20u1pSmal55消化混合物加ImMdNTP和liUKlenow酶组成，短暂地在室温温育。将刚刚线性化的pSMail55质粒根据制造商的说明用MINELUTEReactionCleanupKit纯化。这些反应导致与新产生的GH61A片段相适应的5’平末端和3’PacI位点。然后根据制造商的说明用RapidDNALigationKit(Roche,Indianapolis,IN,USA)将GH61A片段克隆入pSMail55表达载体。用连接产物转化大肠杆菌XLl-BlueSubcloning-Grade感受态细胞(Stratagene，LaJolla，CA，USA)。构建体的身份通过DNA测序来自质粒的GH61A编码序列加以确认，该质粒是从经转化的大67肠杆菌中纯化的。含有重组质粒的一个大肠杆菌克隆被命名为PCW087-8。实施例18:pSaMe-Ta61A的构建表达载体pSaMe_Ta61通过用NsiI消化含有amdS选择标记的质粒pMJ09(W02005/056772)，释放2.7kb的amdS片段而构建。然后用TAE缓冲液通过1.0%琼脂糖凝胶电泳分离2.7kb的amdS片段并用QIAQUICKGelExtractionKit纯化。用NsiI消化表达载体pCW087，将4.7kb的片段用TAE缓冲液通过1.0%琼脂糖凝胶电泳分离并用QIAQUICKGelExtractionKit纯化。然后根据制造商的方案用T4DNA连接酶(Roche,Indianapolis,IN,USA)将2.7kb的amdS片段与4.7kb的载体片段连接以产生表达载体pSaMe-Ta61A。质粒pSaMe-Ta61A包含可操作地连接到橙色嗜热子囊菌GH61A成熟编码序列的里氏木霉纤维二糖水解酶I(CEL7A)基因的启动子和终止子。实施例19里氏木霉菌株SaMe_MF268的构建用共转化将质粒pSaMe-FX和pSaMe_Ta61A导入里氏木霉RutC30。质粒pSaMe_FX和pSaMe-Ta61A是通过PEG-介导的转化(Penttila等，1987，同上)导入里氏木霉RutC30的。每个含有构巢曲霉amdS基因的质粒使转化体能够用乙酰胺作为唯一氮源生长。里氏木霉RutC30在27°C和90rpm条件下在添加了2%(w/v)葡萄糖和10mM尿苷的25mlYP培养基中培养17小时。用真空驱动的抛弃式过滤系统通过过滤收集菌丝并用去离子水洗涤2次，1.2M山梨醇洗涤2次。用含有15mg/mlGLUCANEX(NovozymesA/S,Bagsv^rd,Denmark)和0.36单位/ml壳多糖酶(SigmaChemicalCo.，St.Louis,M0,USA)的20ml1.2M山梨醇悬浮洗涤后的菌丝并在34°C90rpm的条件下轻摇15-25分钟以产生原生质体。通过在400xg的条件下离心7分钟收集原生质体并用冷的1.2M山梨醇洗涤2次。原生质体用血细胞计数器计数并在STC中重悬至终浓度1X108个原生质体/ml。将过量的原生质体C存在_80°C下的Cryo1°CFreezingContainer(Nalgene,Rochester,NY,USA)中。用PmeI消化各约4ig的质粒pSaMe_FX和PSaMe_Ta61A以有助于去除抗生素抗性标记，ampR。PmeI消化之后，将线性片段用TAE缓冲液在1%琼脂糖凝胶上运行以分离不同的片段。将来自pSaMe-FX的7.5kb片段和来自pSaMe-Ta61A的4.7kb片段从凝胶上切下并根据制造商的说明用QIAQUICKGelExtractionKit纯化。这些纯化的片段含有amdS选择性标记盒、里氏木霉cbhl基因启动子和终止子；此外，所述片段包括特异腐质霉EGV核心/米曲霉BG融合编码序列或橙色嗜热子囊菌GH61A编码序列。转化中使用的片段不包含抗生素抗性标记，因为ampR片段通过这一凝胶纯化步骤被去除。然后将纯化的片段加至100u1原生质体溶液并轻柔混合，然后加入260u1PEG缓冲液，混合，并在室温下温育30分钟。然后加入STC(3ml)并混合，将转化溶液涂布在使用amdS进行选择的COVE平板上。将平板在28°C温育5-7天。将转化体分培(sub-culture)到C0VE2平板上并在28°C下生长。将超过400个转化体分培至新鲜的含有乙酰胺的平板上并允许其在28°C形成孢子7天。里氏木霉转化体在含有用转化体孢子接种的25mlpH6.0纤维素酶诱导性培养基的125ml带挡板摇瓶中培养，并在28°C和200rpm条件下温育5天。将里氏木霉RutC30作68为对照。在第5天将培养液样品除去。在15，700xg条件下在微离心管中离心Iml的各种培养液5分钟并将上清转移至新管。用CRITERIONTris-HCl(5%分离型)(resolving)凝胶和CRITERION系统进行SDS-PAGE。用2X浓度的LaemmliSampleBuffer(Bio-Rad，Hercules,CA,USA)悬浮5μ1的第5天上清(见上)并在5%巯基乙醇存在下煮沸3分钟。将上清样品上样至聚丙烯酰胺凝胶并用IXTris/甘氨酸/SDS作为运行缓冲液(Bio-Rad，Hercules，CA，USA)进行电泳。所得凝胶用BIO-SAFECoomasSie染料染色。将SDS-PAGE凝胶可视化后可观察到显示出同时表达橙色嗜热子囊菌GH61A多肽和由特异腐质霉内切葡聚糖酶V核心(Cel45A)与米曲霉β-葡糖苷酶融合组成的融合蛋白的转化体，然后在PCS水解反应中测试所述转化体以鉴定产生最佳水解液的菌株。实施例20里氏木霉菌株SaMe_MF268的鉴定显示同时表达橙色嗜热子囊菌GH61A多肽以及米曲霉β-葡糖苷酶融合蛋白的转化体在含有25mlpH6.O的纤维素酶诱导性培养基的125ml带挡板摇瓶中培养，其中将培养基用转化体的孢子接种，并在28°C和200rpm下温育5天。将摇瓶培养液以6000xg离心并在水解前用STERICUPEXPRESS(Millipore,Bedford,MA,USA)过滤至0.22μm。培养液的活性可以通过其水解PCS并产生糖的能力来测定，所述糖可以通过化学测定其还原端来检测。在美国能源部国家可再生能源实验室(U.S.D印artmentofEnergyNationalRenewableEnergyLaboratory(NREL),Boulder,CO,USA)用稀硫酸预处理玉米秸秆。用以下条件进行预处理0.048g硫酸/g干生物质，190°C和25%w/w干固体，约1分钟。预处理的玉米秸秆(pretreatedcornstover,PCS)中的水不溶固体包含59.2%纤维素，其通过极限消化PCS释放葡萄糖和纤维二糖来确定。酶促水解之前，用大体积的双去离子水(doubledeionizedwater)洗涤PCS；水洗后PCS的干重为17.73%。将Ikg量的PCS重悬在约20升双去离子水中，在PCS沉降之后将水倒出。重复这一操作直到洗涤用水在PH4.O以上，同时还原性的糖低于每升0.06g。如果是小量实验(如1ml)，沉降后的浆(slurry)用100目的网过筛以确保能够吸取。洗涤后PCS的百分比干重含量通过在105°C的烘箱干燥样品至少24小时(直至恒重)并与湿重比较而测定。PCS水解在Iml体积的96深孔板(AxygenScientific)上进行，用ALPS300自动实验室平板密封机(automatedlabplatesealer)(ABgeneInc.,Rochester,NY,USA)进行加热密封。在pH5.O的50mM乙酸钠中，PCS浓度为每升10g。PCS水解在50°C进行，除在上述的取样期间搅动以外不用额外地搅动。每个反应一式三份进行。释放的还原糖用下述的对羟基苯甲酸酰胼(p-hydroxybenzoicacidhydrazide,PHBAH)试剂分析。将体积为0.8ml的PCS(每升水中12.5g)移液至96深孔板的每个孔中，然后是0.IOmlpH5.0的0.5M乙酸钠，然后是0.IOml稀释的酶溶液以起始终反应体积为1.0ml、PCS浓度为每升IOg的反应。将平板密封。反应混合物在水解开始时和记录每个样品时间点(takingeachsampletimepoint)前通过颠倒深孔板进行混合。在每个样品时间点，将平板混合然后将深孔板在2000rpm离心(SORVALLRT7withRTH-250rotor)10分钟，然后将20μ1水解物(上清)移出并加至96孔微量滴定板中的180μ10.4%NaOH中。在必要时，将这种反应已停止的溶液进一步稀释至合适的还原糖的范围。释放的还原糖用对羟基苯甲酸酰胼试剂(PHBAH，Sigma,4-hydroxybenzyhydrazide)测定将50μ1的PHBAH试剂(1.5%)与100μ1样品在V型底的96孔THERMOWELL平板(Costar6511)中混合，在95°C的平板加热块上温育10分钟，然后向每个孔加入50μ1双去离子水，混合，然后转移100μ1至另一个平底的96孔板(Costar9017)并在410nm处读取吸光度。还原糖使用同样条件下的葡萄糖校准曲线(calibrationcurve)进行计算。纤维素转化为还原糖的百分比转化如下计算%转化=还原糖(mg/ml)/(所加纤维素(mg/ml)X1.11)因子1.11可修正将纤维素水解为葡萄糖的重量增加。Iml的PCS水解测试之后，根据以下方案将最佳候选者在发酵罐中一式两份培养。将IOOml如下的摇瓶培养基加入500ml摇瓶。该摇瓶培养基的组成为每升20g葡萄糖、IOg玉米浆固体、1.45g(NH4)2SO4,2.08gKH2P04、0.36gCaCl2,0.42gMgSO4·7Η20和0.42ml痕量金属溶液。痕量金属溶液的组成为每升216gFeCl3-6H20,58gZnSO4-7H20,27gMnS04-H2OUOgCuSO4·5Η20、2.4gH3BOjP336g柠檬酸。用2块来自里氏木霉SMA135-04固体平板培养物的琼脂块接种摇瓶，温育在轨道摇床上以200rpm在28°C进行48小时。用50ml摇瓶培养液接种含有1.8升发酵分批培养基的3升发酵罐，所述发酵分批培养基的组成为每升30g纤维素、4g葡萄糖、IOg玉米浆固体、3.8g(NH4)2SO4,2.8gKH2PO4,2.64gCaCl2、l.63gMgSO4.7H20、1.8ml消泡剂和0.66ml痕量金属溶液。痕量金属溶液的组成为每升216gFeCl3-6H20,58gZnSO4·7H20、27gMnSO4·H2OUOgCuSO4·5Η20、2·4gH3BO3禾口336g柠檬酸。发酵补料培养基(fermentationfeedmedium)由葡萄糖和纤维素组成，其以0_4g/l/hr定量提供165小时。将发酵容器的温度保持在28°C，pH控制在调定点4.75+/-0.1。以Ivvm的速率向罐中加入空气，用以1100-1300rpm旋转的Rushton叶轮(impeller)搅动发酵液。测定总蛋白浓度并在50g的PCS水解反应中再次测试发酵液，如下所述。每次实验之前，酶稀释剂从储存在4°C的贮存酶溶液中新鲜地制备。PCS的水解在125ml的上有旋塞的Erlenmeyer烧瓶(VWR，WestChester,PA,USA)中用50g总反应质量根据NRELLaboratoryAnalyticalProtocol#008进行。在这一规程中PCS的水解(约11.4%的PCS和在pH5.0的50mM乙酸钠缓冲液中6.8%的纤维素)用不同蛋白质加载量(表达为mg蛋白质/g纤维素)的2升发酵液样品进行，如上所述。PCS水解能力的测定用INNOVA4080培养箱(NewBrunswickScientific,Edison,NJ,USA)在50°C以150rpm的轨道摇动进行。在水解过程中的72、120和168小时取等份样品并离心，使用MULTISCREENHV0.45μπι膜(Millipore，Billerica,ΜΑ,USA)在SORVALLRT7平板离心机(ThermoFisherScientific,ffaltham,MA,USA)上2000rpm离心10分钟用以过滤上清液。不即刻使用时，将过滤的糖的等份样品在-20°C冷冻。通过在65°C以每分钟0.4ml的流速用0.005MH2SO4洗脱4.6X250mmAMINEXHPX-87H柱(Bio-Rad，Hercules，CA，USA)来测定在0.005MH2SO4中稀释后的样品中糖的浓度，其数值是通过整合葡萄糖和纤维二糖信号得到的，该信号得自经纯糖样品校准的、使用CHEMSTATIONAGILENT1100HPLC(AgilentTechnologies,SantaClara,CA,USA)进行的折射率(refractiveindex)检测。所得当量(equivalent)用以计算每个反应的百分比纤维素转化。用以下等式计算纤维素转化为葡萄糖加纤维二糖的程度(转化，％)转化率(%)=(葡萄糖+纤维二糖X1.053)(mg/ml)X100X162/(纤维素(mg/ml)X180)=(葡萄糖+纤维二糖X1.053)(mg/ml)X100/(纤维素(mg/ml)XLIll)在此等式中，因子1.111反映将纤维素转化为葡萄糖时的重量增加，而因子1.053反映将纤维二糖转化为葡萄糖时的重量增加。表1显示上述50g烧瓶测定中PCS水解反应的结果。产生性能最佳培养液的一个菌株被命名为里氏木霉SaMe-MF268。表1:168小时时间点时转化为糖的百分比相对于蛋白质加载量的百分比转化率(葡萄糖加纤维二糖)培养液ID-菌株名称2.5mg/g纤维素40mg/g纤维素XCL-461-SaMe-MF26866.2980.08XCL-465-SaMe-MF26869.1382.80XCL-462-SaMe-MF33062.9877.99XCL-466-SaMe-MF33063.3477.90XCL-463-SaMe-MF37764.0378.45XCL-467-SaMe-MF37764.1979.06实施例21含有橙色嗜热子囊菌多肽GH61A和米曲霉葡糖苷酶融合蛋白的里氏木霉发酵液的制备如实施例20所述而制备的发酵液样品通过在9500xg离心约20分钟除去细胞碎片。然后用MILLEXGPExpress膜，聚醚砜(polyethersulfone)，0.22um(Millipore,Bedford,MA,USA)过滤澄清发酵液样品。然后用HIPREP26/10脱盐柱(AKTA，GEHealthcare,Piscataway,NJ,USA)将过滤后的发酵液样品脱盐。已脱盐材料的蛋白质浓度用BCA蛋白质测定试剂盒(Pierce，Rockford,IL，USA)测定，其中牛血清清蛋白被用作蛋白质标准以计算滤后发酵液中的蛋白质。通常用8-16%CRITERIONSDS-PAGE凝胶(Bio-Rad,Hercules,CA；200V，1小时)分析等份样品，其中包括PRECISIONPLUSPROTEIN分子量标准(Bio-Rad,Hercules,CA,USA)。用BIO-SAFECoomassie染料(Bio-Rad,Hercules,CA,USA)为凝胶中的蛋白质染色，用去离子水脱色。对橙色嗜热子囊菌GH61A多肽和含有特异腐质霉GH45核心蛋白和米曲霉0-葡糖苷酶的融合蛋白的量的估计是通过对凝胶染色后扫描进行量化或EXPERI0N毛细管电泳(Bio-Rad，Hercules，CA，USA)分析后的峰值大小作出的。实施例22:当与金属离子和橙色嗜热子囊菌多肽GH61A结合时，含有米曲霉葡糖苷酶融合蛋白的里氏木霉发酵液中纤维素分解活性的提高在美国能源部国家可再生能源实验室(NREL)的玉米秸秆用稀硫酸预处理。预处理使用如下条件1.4wt%硫酸195°C4.5分钟。根据用过量纤维素酶进行的极限消化，预处理后的玉米秸秆(PCS)中的水不溶固体包含59.2%纤维素。酶促水解之前，用大量去离子水洗涤PCS直到可溶性的酸和糖被除去。水洗后PCS的干重为19.6%。PCS的水解使用125ml的上有旋塞的Erlenmeyer烧瓶(VWR，WestChester,PA,USA)以50g总反应质量根据NRELLaboratoryAnalyticalProtocol#008进行。在这一规程中PCS的水解(约11.3%的PCS和6.7%的纤维素，在pH5.0的50mM乙酸钠缓冲液中)用里氏木霉发酵液的不同蛋白质加载量(表达为mg蛋白质/g纤维素)进行，所述发酵液包含具有纤维素分解增强活性的橙色嗜热子囊菌GH61A多肽和米曲霉0-葡糖苷酶融合蛋白，加入或不加入表1所示形式的10mM终浓度的二价金属阳离子。PCS水解能力的测定用INNOVA4080培养箱(NewBrunswickScientific,Edison,NJ,USA)在50°C以150rpm的轨道摇动进行。在水解过程中的72和120小时取等份样品。将等份样品离心并使用MULTISCREENHV0.45um膜在SORVALLRT7平板离心机上以2000rpm离心15分钟来过滤上清液。不即刻使用时，将过滤的糖的等份样品在-20°C冷冻。通过在65°C以每分钟0.4ml的流速用0.005MH2S04洗脱4.6X250mmAMINEXHPX-87H柱来测定经0.005MH2S04稀释后的样品中糖的浓度，其数值是通过整合葡萄糖和纤维二糖信号得到的，该信号得自经纯糖样品校准的、使用CHEMSTATIONAGILENT1100HPLC(AgilentTechnologies,SantaClara,CA,USA)进行的折射率检测。所得当量(equivalent)用以计算每个反应的纤维素转化百分比。用以下等式计算纤维素转化为葡萄糖加纤维二糖的程度(转化，％)转化率(%)=(葡萄糖+纤维二糖X1.053)(mg/ml)X100X162/(纤维素(mg/ml)X180)=(葡萄糖+纤维二糖X1.053)(mg/ml)X100/(纤维素(mg/ml)XLIll)在此等式中，因子1.111反映将纤维素转化为葡萄糖时的重量增加，而因子1.053反映将纤维二糖转化为葡萄糖时的重量增加。PCS中的纤维素是通过PCS的极限消化释放葡萄糖和纤维二糖来测定的。每次实验前，酶稀释液从储存在4°C的酶贮存溶液中新鲜制备。表2所示结果证明添加10mMMnS04与仅有等量(以蛋白质水平计)的发酵液相比，使所得的转化为葡萄糖的转化从每克纤维素4mg提高至8mg。相似地，加至10mM的&(12、1%(12或&)(12与仅有等量(以蛋白质水平计)的发酵液相比，使所得的转化为葡萄糖的转化从每克纤维素4mg提高至8mg。其它二价金属阳离子盐，如10mM2冗12或？必04的加入，或者10mMEDTA(二价阳离子螯合剂)的加入降低了葡萄糖和纤维二糖的产率。72小时水解的结果如图16所示。因此，与加入其它金属盐相比，向含有纤维素酶的溶液加入10mMMnS04、CaCl2、|%(12或&)(12在水解经酸预处理后的玉米秸秆(PCS)时提高葡萄糖和纤维二糖的产率。表2实际％实际％实际总酶与金属的生物质纤维素蛋白72hr转化120hr转实验号混合物含量含量mg/g纤率化率(w/)r/w)维素1SaMeMF26811.326.704.0074.1084.622SaMeMF26811.326.706.0084.5991.943SaMeMF26811.326.708.0088.6895.20SaMeMF268711.326.704.0074.7986.Ca++SaMeMF2688l1．326．706．oo85．7795．1lCa++SaMeMF2689l1．326．708．oo89．5496．29Ca++]SaMeMF26810l1．326．704．oo75．3l87．08Mg++SaMeMF268lll1．326．706．oo86．9995．12Mg++12SaMeMF268l1．326．708．oo90．4997．56Mg++SaMeMF26813l1．326．704．oo79．3086．77Mn++SaMeMF26814l1．336．706．oo91．6595．23Mn++SaMeMF26815l1．326．708．oo98．0398．70Mn++SaMeMF26816l1．326．704．oo56．oo63．38Zn++SaMeMF26817l1．326．706．oo65．7975．03Zn++SaMeMF26818l1．326．708．oo74．8884．22Zn++SaMeMF26819l1．326．704．oo33．8035．83Fe++SaMeMF26820l1．326．706．0042．5044．88Fe++SaMeMF2682122232425262711.32Fe++SaMeMF268Co++SaMeMF268Co++SaMeMF268Co++SaMeMF268EDTASaMeMF268EDTASaMeMF268EDTA11.3311.3211.3211.3111.3211.326.706.706.706.706.696.706.708.004.006.008.004.006.008.0049.7475.9887.8694.2657.9467.6772.8550.2185.8894.3397.0565.9474.3577.69实施例23当与金属离子结合时经脱盐的里氏木霉发酵液中米曲霉葡糖苷酶纤维素分解活性的提高对包含多肽GH61A的混合物是特异的根据W02005/074656在米曲霉JaL250中重组产生具有纤维素分解增强活性的橙色嗜热子囊菌多肽GH16A。在里氏木霉菌株SMA135-04中重组产生表达米曲霉0-葡糖苷酶和里氏木霉纤维素酶的真菌发酵液。如下所述对这些蛋白质进行发酵。将100ml摇瓶培养基加入500ml摇瓶进行涉及米曲霉的发酵。摇瓶培养基的组成为每升50g蔗糖、10gKH2P04、0.5gCaCl2、2gMgS047H20、2gK2S04、2g尿素、lOg酵母提取物、2g柠檬酸和0.5ml痕量金属溶液。痕量金属溶液的组成为每升13.8gFeS04-7H20U4.3gZnS047H20、8.5gMnS04H20、2.5gCuS045H20和3g柠檬酸。用来自米曲霉固体平板培养物的2个凝胶块接种摇瓶，温育在轨道摇床上以200rpm在34°C进行24小时。用50ml摇瓶发酵液接种含有1.8升发酵分批培养基的3升发酵容器，所述发酵分批培养基的组成为每升10g酵母提取物、24g蔗糖、5g(NH4)2S04、2gKH2P04、0.5gCaCl22H20、2gMgS04.7H20、lg柠檬酸、2gK2S04、0.5ml消泡剂和0.5ml痕量金属溶液。痕量金属溶液的组成为每升13.8gFeS047H20U4.3gZnS047H20、8.5gMnS04H20、2.5gCuS045H20和3g柠檬酸。发酵补料培养基由麦芽糖和消泡剂组成。发酵补料培养基以0-4.4g/l/hr的速率定量提供185小时。将发酵容器的温度保持在34°C，pH控制在调定点6.1+/-0.1。以lvvm的速率向罐中加入空气，用以1100-1300rpm旋转的Rushton叶轮搅动发酵液。如实施例20所述进行里氏木霉的发酵。粗发酵液样品通过在9500xg离心约20分钟除去细胞碎片。然后用MILLEXGPExpress膜，聚醚砜，0.22μm过滤澄清发酵液。然后用HIPREP26/10脱盐柱为过滤后的发酵液脱盐。已脱盐材料的蛋白质浓度用BCA蛋白质测定试剂盒测定，其中牛血清清蛋白被用作蛋白质标准以计算滤后发酵液中的蛋白质。通常用8-16%CRITERIONSDS-PAGE凝胶(200V，1小时)分析等份样品，其中包括PRECISIONPLUSPROTEIN分子量标准。用BIO-SAFECoomassi染料为凝胶中的蛋白质染色，用去离子水脱色。蛋白质制备时也通过脱盐(如上)除去溶于发酵液中的金属离子，其通过表3和4中所见的前缀ds指示。PCS的水解在125ml上有旋塞的Erlenmeyer烧瓶中用50g总反应质量根据NRELLaboratoryAnalyticalProtocol#008进行。在这一规程中PCS的水解(约11.3%的PCS，和6.7%的纤维素，在pH5.0的50mM乙酸钠缓冲液中)用恒定蛋白质加载总量(表达为mg酶/g纤维素)的发酵液进行，所述发酵液含有里氏木霉发酵液(其包含米曲霉葡糖苷酶)，所述发酵液加入或不加入橙色嗜热子囊菌GH61A多肽，加入或不加入表2所示形式的ImM终浓度的二价金属阳离子。PCS水解能力的测定如实施例22所述进行。纤维素转化为葡萄糖加纤维二糖的程度(％转化率)用实施例22所述等式计算。每次实验前从储存在4°C的贮存酶溶液新鲜地制备酶稀释液。表3所示结果证明仅添加ImM二价阳离子与不加入具有纤维素分解增强活性的橙色嗜热子囊菌GH61A多肽的等量发酵液相比，不会提高获得的葡萄糖转化率。相似地，力口入GH61A多肽而不加入二价金属阳离子也没有提高葡萄糖转化率。图17以图标示了72小时水解的结果。因此，向含有具有纤维素分解增强活性的橙色嗜热子囊菌GH61A多肽的含纤维素酶的溶液中加入ImMMnSO4或CaCl2在水解经酸预处理后的玉米秸秆(PCS)时，提高了葡萄糖和纤维二糖的产率。所述提高依赖于橙色嗜热子囊菌GH61A多肽的存在。添加ImM的其它金属例如Zn++和Fe++或者用ImMEDTA螯合的金属在水解经酸预处理后的玉米秸秆(PCS)时降低了葡萄糖和纤维二糖的产率。表372hr120hr转化转化实验号酶和金属的混合物率率56dsSMA13554.4262.6558dsSMA135Ca++55.4861.5260dsSMA135Mn++45.1960.1162dsSMA135EDTA49.6559.5264dsSMA135Zn++37.6143.5965dsSMA135+GH61A56.9776.4166dsSMA135+GH61ACa++63.2377.7967dsSMA135+GH61AMn++67.4384.0268dsSMA135+GH61AEDTA49.0357.4969dsSMA135+GH61AZn++47.3958.01实施例24与MnSO4和MgCl2结合时含有米曲霉β-葡糖苷酶融合蛋白和橙色嗜热子囊菌GH61A多肽的里氏木霉发酵液纤维素分解活性的提高如实施例20所述在里氏木霉SaMeMF268中重组产生具有纤维素分解增强活性的橙色嗜热子囊菌GH61A多肽和由特异腐质霉GH45A核心和米曲霉β-葡糖苷酶组成的融合蛋白。粗发酵液样品通过在9500xg离心培养物约20分钟除去细胞碎片。然后用MILLEXGPExpress膜，聚醚砜，0.22μm过滤澄清发酵液。然后用HIPREp26/10脱盐柱为过滤后的发酵液样品脱盐。已脱盐材料的蛋白质浓度用BCA蛋白质测定试剂盒测定，其中牛血清清蛋白被用作蛋白质标准以计算滤后发酵液中的蛋白质。通常用8-16%CRITERIONSDS-PAGE凝胶(200V，1小时)分析等份样品，其中包括PRECISIONPLUSPROTEIN分子量标准。用BIO-SAFECoomassie染料为凝胶中的蛋白质染色，用去离子水脱色。也通过脱盐(如上)除去溶于发酵液中的金属离子来制备蛋白质。PCS的水解在125ml上有旋塞的Erlenmeyer烧瓶中用50g总反应质量根据NRELLaboratoryAnalyticalProtocol#008进行。在这一规程中，PCS的水解(约11.3%的PCS，和6.7%的纤维素，在pH5.0的50mM乙酸钠缓冲液中)用恒定总蛋白加载量(表达为mg酶/g纤维素)的经脱盐或未脱盐的里氏木霉发酵液进行，所述发酵液包含米曲霉葡糖苷酶融合蛋白，不包含橙色嗜热子囊菌GH61A多肽，加入表4所示的终浓度增加的MnSO4和MgCl2。PCS水解能力的测定如实施例22所述进行。纤维素转化为葡萄糖加纤维二糖的程度(转化率，％)用实施例22中所述等式计算。每次实验前从储存在4°C的贮存酶溶液新鲜地制备酶稀释液。表4所示结果证明加入0.001、0.01、0.1、1或IOmM的浓度渐增的MnSO4和MgCl2与不加入MnSO4W等量里氏木霉SaMeMF268得到的相比提高了葡萄糖转化率。相似地，力口入0.001、0.01、0.1、1或IOmM的浓度渐增的MnSO4时，在将约ImM加入脱盐的里氏木霉SaMeMF268发酵液之前都没有显示提高。图18显示了72小时水解的结果。因此，以每种金属离子0.001,0.01、0.1、1或IOmM的终浓度向含有里氏木霉SaMeMF268的发酵液加入MnSO4和MgCl2时，提高了水解经酸预处理的玉米秸秆(PCS)时葡萄糖和纤维二糖的产率。表4实际总实际％生实际％纤蛋白酶和金属的物质含量维素含mg/g72hr转120hr实验号混合物(w/w)量(w/w)纤维素化率转化率46SaMeMF26811.326.704.0369.2080.61SaMeMF268470.OlmM离子11.326.704.0373.5682.98SaMeMF268480.ImM离子11.316.694.0374.5984.82SaMeMF26849ImM离子11.216.634.0375.6284.56SaMeMF26850IOmM离子10.296.094.0376.0284.4551dsSaMe11.326.704.0270.9379.11MF268dsSaMeMF2680.0152mM离子11.326.704.0271.1683.63dsSaMeMF2680.153mM离子11.316.694.0270.8883.30dsSaMeMF2681mM54离子11.216.634.0274.9083.22dsSaMeMF2681055mM离子10.296.094.0274.1779.01生物材料的保藏以下生物材料已经按照布达佩斯条约在北方区域研究中心农业研究机构专利培养物保藏中心，1815UniversityStreet，Peoria，Illinois，61604进行了保藏，并被给予下列保藏号保藏物保藏号保藏日大肠杆菌菌株pEJG120NRRLB-306992004年3月2日大肠杆菌菌株pTter61CNRRLB-308132005年1月21日大肠杆菌菌株pTter61DNRRLB-308122005年1月21日大肠杆菌菌株pTter61ENRRLB-308142005年1月21日大肠杆菌菌株pTter61GNRRLB-308112005年1月21日大肠杆菌菌株pDZA2-7NRRLB-307042004年1月30日大肠杆菌菌株pTr3337NRRLB-308782005年9月20日大肠杆菌T0P10(pEJGl13)NRRLB-306952003年10月17日大肠杆菌TOPlOpKKABNRRLB-308602005年7月8日NN049573DSM142402001年4月19日所述菌株在这样的条件下被保藏，以确保在本专利申请的审批过程中，由美国专利与商标局长根据联邦法规汇编第37编第1.14节及美国法典第35编第122条的规定确定为有资格者可获取该培养物。所述保藏物代表被保藏菌株的基本上纯的培养物。本主题申请在其它国家提交了对应申请或其子申请的，该保藏物可应这些国家专利法的要求予以提供。然而应当理解，提供保藏物并不构成对于实施本发明而损害由政府授予的专利权的行为的许可。本文中所描述并要求保护的发明的范围不应受到本文中公开的具体方面的限制，因为公开这些方面是为了举例说明本发明的一些方面。任何等同的方面都应落入本发明的范围。事实上，除了本文中显示和描述的那些之外，本领域技术人员根据前面的说明书可以容易地想到本发明的各种修改。这些修改也应落入本发明的范围。在冲突的情况下，应以包括定义在内的本公开内容为准。本文引用了多种参考文献，它们以其整体纳入本文参考。权利要求提高具有纤维素分解增强活性的多肽的活性的方法，包括向含有具有纤维素分解增强活性的多肽的组合物中加入可溶性活化性二价金属阳离子，其中所述可溶性活化性二价金属阳离子在降解或转化含纤维素材料的过程中以优选约0.001mM-约50mM、更优选约0.01mM-约25mM、更优选约0.1mM-约25mM、更优选约0.1mM-约10mM、进一步更优选约0.3mM-约5mM、最优选约0.3mM-约2.5mM、进一步最优选约0.3mM-约1mM的有效浓度存在，与没有可溶性活化性二价金属阳离子的具有纤维素分解增强活性的多肽相比，可溶性活化性二价金属阳离子和具有纤维素分解增强活性的多肽的存在使纤维素分解酶组合物对含纤维素材料的降解或转化提高。2.权利要求1的方法，其中所述可溶性活化性二价金属阳离子选自下组Mn++、Co+\Mg++、Ca++及其组合。3.权利要求1的方法，其中所述具有纤维素分解增强活性的多肽选自下组(a)含有[ILMV]-P-X(4,5)-G-X-Y-[ILMV]-X-R-X-[EQ]-X(4)-[HNQ]和[Fff]-[TF]-K-[AIV]的具有纤维素分解增强活性的多肽，其中X是任何氨基酸，X(4，5)是在4或5个邻接位置上的任何氨基酸，而X(4)是在4个邻接位置上的任何氨基酸；和(b)含有[ILMV]-P-x(4，5)-G-x-Y-[ILMV]-x-R-x-[EQ]-x(3)-A-[HNQ]的具有纤维素分解增强活性的多肽，其中x是任何氨基酸，x(4,5)是在4或5个邻接位置上的任何氨基酸，而x(3)是在3个邻接位置上的任何氨基酸；其中含有[ILMV]-P-X(4,5)-G-X-Y-[ILMV]-X-R-X-[EQ]-X(4)-[HNQ]和[Fff]-[TF]-K-[AIV]的具有纤维素分解增强活性的多肽还任选包含H-X(1，2)-G-P-X(3)-[Yff]-[AILMV]、[EQ]-X-Y-X(2)-C-X-[EHQN]-[FILV]-X-[ILV]或H-X(1，2)-G-P-X(3)-[Yff]-[AILMV]和[EQ]-X-Y-X(2)-C-X-[EHQN]-[FILV]-X-[ILV]，其中X是任何氨基酸，X(l，2)是在1个位置或2个邻接位置上的任何氨基酸，X(3)是在3个邻接位置上的任何氨基酸，而X(2)是在2个邻接位置上的任何氨基酸。4.权利要求1的方法，其中所述具有纤维素分解增强活性的多肽选自下组(a)含有与SEQIDN0:2、SEQIDNO:4、SEQIDNO:6、SEQIDN0:8或SEQIDNO:10、SEQIDN0:12或SEQIDNO:14的成熟多肽具有优选至少60%、更优选至少65%、更优选至少70%、更优选至少75%、更优选至少80%、更优选至少85%、进一步更优选至少90%、最优选至少95%同一性的氨基酸序列的多肽；(b)由在优选至少中严紧度条件、更优选至少中-高严紧度条件、最优选至少高严紧度条件下与(i)SEQIDN0:1、SEQIDNO:3、SEQIDNO:5、SEQIDNO:7、SEQIDNO:9、SEQIDN0:11或SEQIDNO:13的成熟多肽编码序列，(ii)SEQIDNO:1、SEQIDNO:3、SEQIDNO:5或SEQIDNO11的成熟多肽编码序列中含有的cDNA序列，或者包含SEQIDNO:7、SEQIDN09或SEQIDNO13的成熟多肽编码序列的基因组DNA序列，或者(iii)(i)或(ii)的全长互补链杂交的多核苷酸编码的多肽；(c)由如下多核苷酸编码的多肽该多核苷酸包含与SEQIDN0:1、SEQIDNO:3、SEQIDN0:5、SEQIDN0:7、SEQIDNO:9、SEQIDN0:11或SEQIDNO:13的成熟多肽编码序列具有优选至少60%、更优选至少65%、更优选至少70%、更优选至少75%、更优选至少80%、更优选至少85%、进一步更优选至少90%、最优选至少95%同一性的核苷酸序列；(d)SEQIDNO:2、SEQIDNO:4、SEQIDNO:6、SEQIDNO8或SEQIDNO:10、SEQIDN0:12或SEQIDNO:14的成熟多肽包含一个或多个氨基酸的取代、缺失和/或插入的变体；和(e)含有SEQIDNO:2、SEQIDNO:4、SEQIDNO:6、SEQIDNO8或SEQIDNO:10、SEQIDNO12或SEQIDNO14的成熟多肽或由SEQIDN0:2、SEQIDNO:4、SEQIDNO6、SEQIDNO8或SEQIDNO:10、SEQIDNO:12或SEQIDNO14的成熟多肽组成的具有纤维素分解增强活性的多肽；或其具有纤维素分解增强活性的片段。5.权利要求4的方法，其中所述具有纤维素分解增强活性的多肽是由大肠杆菌NRRLB-30699中所含的质粒PEJG120、大肠杆菌NRRLB-30813中所含的质粒pTter61C、大肠杆菌NRRLB-30812中所含的质粒pTter61D、大肠杆菌NRRLB-30814中所含的质粒pTter61E、大肠杆菌NRRLB-30811中所含的质粒pTter61G、大肠杆菌NRRLB-30704中所含的质粒PDZA2-7或大肠杆菌NRRLB-30878中所含的质粒pTr3337中包含的多核苷酸编码的。6.降解或转化含纤维素材料的方法，包括用有效量的纤维素分解酶组合物处理含纤维素材料，所述纤维素分解酶组合物包含有效量的具有纤维素分解增强活性的多肽和可溶性活化性二价金属阳离子，其中所述可溶性活化性二价金属阳离子以优选约0.OOlmM-约50mM、更优选约0.OlmM-约25mM、更优选约0.ImM-约25mM、更优选约0.ImM-约10mM、进一步更优选约0.3mM-约5mM、最优选约0.3mM-约2.5mM、进一步最优选约0.3mM-约ImM的有效浓度存在。7.权利要求6的方法，其中所述可溶性活化性二价金属阳离子选自下组:Mn++、Co+\Mg++、Ca++及其组合。8.权利要求6的方法，其中所述具有纤维素分解增强活性的多肽选自下组(a)包含[ILMV]-P-X(4,5)-G-X-Y-[ILMV]-X-R-X-[EQ]-X(4)-[HNQ]禾口[Fff]-[TF]-K-[AIV]的具有纤维素分解增强活性的多肽，其中X是任何氨基酸，X(4，5)是在4或5个邻接位置上的任何氨基酸，而X(4)是在4个邻接位置上的任何氨基酸；和(b)含有[ILMV]-P-x(4，5)-G-x-Y-[ILMV]-x-R-x-[EQ]-x(3)-A-[HNQ]的具有纤维素分解增强活性的多肽，其中x是任何氨基酸，x(4,5)是在4或5个邻接位置上的任何氨基酸，而x(3)是在3个邻接位置上的任何氨基酸；其中含有[ILMV]-P-X(4,5)-G-X-Y-[ILMV]-X-R-X-[EQ]-X(4)-[HNQ]禾口[Fff]-[TF]-K-[AIV]的具有纤维素分解增强活性的多肽还任选包含H-X(1，2)-G-P-X(3)-[Yff]-[AILMV]、[EQ]-X-Y-X(2)-C-X-[EHQN]-[FILV]-X-[ILV]或H-X(1，2)-G-P-X(3)-[Yff]-[AILMV]禾口[EQ]-X-Y-X(2)-C-X-[EHQN]-[FILV]-X-[ILV]，其中X是任何氨基酸，X(l，2)是在1个位置或2个邻接位置上的任何氨基酸，X(3)是在3个邻接位置上的任何氨基酸，而X(2)是在2个邻接位置上的任何氨基酸。9.权利要求6的方法，其中所述具有纤维素分解增强活性的多肽选自下组(a)含有与SEQIDN0:2、SEQIDNO:4、SEQIDNO:6、SEQIDNO:8或SEQIDNO:10、SEQIDN0:12或SEQIDNO:14的成熟多肽具有优选至少60%、更优选至少65%、更优选至少70%、更优选至少75%、更优选至少80%、更优选至少85%、进一步更优选至少90%、最优选至少95%同一性的氨基酸序列的多肽；(b)由在优选至少中严紧度条件、更优选至少中-高严紧度条件、最优选至少高严紧度条件下与(i)SEQIDN0:1、SEQIDNO:3、SEQIDNO:5、SEQIDNO:7、SEQIDNO:9、SEQIDN0:11或SEQIDNO:13的成熟多肽编码序列，(ii)SEQIDNO:1、SEQIDNO:3、SEQIDNO:5或SEQIDNO11的成熟多肽编码序列中含有的cDNA序列，或者包含SEQIDNO:7、SEQIDN09或SEQIDNO13的成熟多肽编码序列的基因组DNA序列，或者(iii)(i)或(ii)的全长互补链杂交的多核苷酸编码的多肽；(c)由如下多核苷酸编码的多肽该多核苷酸包含与SEQIDN0:1、SEQIDNO:3、SEQIDN0:5、SEQIDN0:7、SEQIDNO:9、SEQIDN0:11或SEQIDNO:13的成熟多肽编码序列具有优选至少60%、更优选至少65%、更优选至少70%、更优选至少75%、更优选至少80%、更优选至少85%、进一步更优选至少90%、最优选至少95%同一性的核苷酸序列；(d)SEQIDNO:2、SEQIDNO:4、SEQIDNO:6、SEQIDNO8或SEQIDNO:10、SEQIDN0:12或SEQIDNO:14的成熟多肽包含一个或多个氨基酸的取代、缺失和/或插入的变体；和(e)含有SEQIDNO:2、SEQIDNO:4、SEQIDNO:6、SEQIDNO8或SEQIDNO:10、SEQIDNO:12或SEQIDNO14的成熟多肽或由SEQIDN0:2、SEQIDNO:4、SEQIDNO6、SEQIDNO8或SEQIDNO:10、SEQIDNO:12或SEQIDNO14的成熟多肽组成的具有纤维素分解增强活性的多肽；或其具有纤维素分解增强活性的片段。10.权利要求9的方法，其中所述具有纤维素分解增强活性的多肽是由大肠杆菌NRRLB-30699中所含的质粒pEJG120、大肠杆菌NRRLB-30813中所含的质粒pTter61C、大肠杆菌NRRLB-30812中所含的质粒pTter61D、大肠杆菌NRRLB-30814中所含的质粒pTter61E、大肠杆菌NRRLB-30811中所含的质粒pTter61G、大肠杆菌NRRLB-30704中所含的质粒pDZA2-7或大肠杆菌NRRLB-30878中所含的质粒pTr3337中包含的多核苷酸编码的。11.权利要求6-10中任一项的方法，其还包括用有效量的葡糖苷酶处理含纤维素材料。12.权利要求6-11中任一项的方法，其还包括用有效量的一种或多种选自下组的酶处理含纤维素材料半纤维素酶、酯酶、蛋白酶、漆酶、过氧化物酶或其混合物。13.权利要求6-12中任一项的方法，其还包括补充可溶性活化性二价金属阳离子的浓度以维持可溶性活化性二价金属阳离子的有效浓度为优选约0.OOlmM-约50mM、更优选约0.OlmM-约25mM、更优选约0.ImM-约25mM、更优选约0.ImM-约10mM、进一步更优选约0.3mM-约5mM、最优选约0.3mM-约2.5mM、进一步最优选约0.3mM-约ImM。14.权利要求6-13中任一项的方法，其还包括回收经降解的含纤维素材料。15.产生发酵产物的方法，包括(a)用有效量的包含有效量的具有纤维素分解增强活性的多肽和可溶性活化性二价金属阳离子的纤维素分解酶组合物糖化含纤维素材料，其中所述可溶性活化性二价金属阳离子以优选约0.OOlmM-约50mM、更优选约0.OlmM-约25mM、更优选约0.ImM-约25mM、更优选约0.ImM-约10mM、进一步更优选约0.3mM-约5mM、最优选约0.3mM-约2.5mM、进一步最优选约0.3mM-约ImM的有效浓度存在；(b)用一种或多种发酵微生物发酵步骤(a)中经糖化的含纤维素材料以产生发酵产物；和(c)从发酵回收发酵产物。16.权利要求15的方法，其中所述可溶性活化性二价金属阳离子选自下组:Mn++、Co+\Mg++、Ca++及其组合。17.权利要求15的方法，其中所述具有纤维素分解增强活性的多肽选自下组(a)包含[ILMV]-P-X(4,5)-G-X-Y-[ILMV]-X-R-X-[EQ]-X(4)-[HNQ]禾口[Fff]-[TF]-K-[AIV]的具有纤维素分解增强活性的多肽，其中X是任何氨基酸，X(4，5)是在4或5个邻接位置上的任何氨基酸，而X(4)是在4个邻接位置上的任何氨基酸；和(b)含有[ILMV]-P-x(4，5)-G-x-Y-[ILMV]-x-R-x-[EQ]-x(3)-A-[HNQ]的具有纤维素分解增强活性的多肽，其中x是任何氨基酸，x(4,5)是在4或5个邻接位置上的任何氨基酸，而x(3)是在3个邻接位置上的任何氨基酸；其中含有[ILMV]-P-X(4,5)-G-X-Y-[ILMV]-X-R-X-[EQ]-X(4)-[HNQ]禾口[Fff]-[TF]-K-[AIV]的具有纤维素分解增强活性的多肽还任选包含H-X(1，2)-G-P-X(3)-[Yff]-[AILMV]、[EQ]-X-Y-X(2)-C-X-[EHQN]-[FILV]-X-[ILV]或H-X(1，2)-G-P-X(3)-[Yff]-[AILMV]禾口[EQ]-X-Y-X(2)-C-X-[EHQN]-[FILV]-X-[ILV]，其中X是任何氨基酸，X(l，2)是在1个位置或2个邻接位置上的任何氨基酸，X(3)是在3个邻接位置上的任何氨基酸，而X(2)是在2个邻接位置上的任何氨基酸。18.权利要求15的方法，其中所述具有纤维素分解增强活性的多肽选自下组(a)含有与SEQIDN0:2、SEQIDNO:4、SEQIDNO:6、SEQIDN0:8或SEQIDNO:10、SEQIDN0:12或SEQIDNO:14的成熟多肽具有优选至少60%、更优选至少65%、更优选至少70%、更优选至少75%、更优选至少80%、更优选至少85%、进一步更优选至少90%、最优选至少95%同一性的氨基酸序列的多肽；(b)由在优选至少中严紧度条件、更优选至少中-高严紧度条件、最优选至少高严紧度条件下与(i)SEQIDN0:1、SEQIDNO:3、SEQIDNO:5、SEQIDNO:7、SEQIDNO:9、SEQIDN0:11或SEQIDNO:13的成熟多肽编码序列，(ii)SEQIDNO:1、SEQIDNO:3、SEQIDNO:5或SEQIDNO11的成熟多肽编码序列中含有的cDNA序列，或者包含SEQIDNO:7、SEQIDN0:9或SEQIDNO13的成熟多肽编码序列的基因组DNA序列，或者(iii)(i)或(ii)的全长互补链杂交的多核苷酸编码的多肽；(c)由如下多核苷酸编码的多肽该多核苷酸包含与SEQIDN0:1、SEQIDNO:3、SEQIDN0:5、SEQIDN0:7、SEQIDNO:9、SEQIDN0:11或SEQIDNO:13的成熟多肽编码序列具有优选至少60%、更优选至少65%、更优选至少70%、更优选至少75%、更优选至少80%、更优选至少85%、进一步更优选至少90%、最优选至少95%同一性的核苷酸序列；(d)SEQIDN0:2、SEQIDNO:4、SEQIDNO:6、SEQIDNO:8或SEQIDN0:10、SEQIDN0:12或SEQIDNO:14的成熟多肽包含一个或多个氨基酸的取代、缺失和/或插入的变体；和(e)含有SEQIDNO:2、SEQIDNO:4、SEQIDNO:6、SEQIDNO8或SEQIDNO:10、SEQIDNO:12或SEQIDNO14的成熟多肽或由SEQIDN0:2、SEQIDNO:4、SEQIDNO6、SEQIDNO8或SEQIDNO:10、SEQIDNO:12或SEQIDNO14的成熟多肽组成的具有纤维素分解增强活性的多肽；或其具有纤维素分解增强活性的片段。19.权利要求18的方法，其中所述具有纤维素分解增强活性的多肽是由大肠杆菌NRRLB-30699中所含的质粒PEJG120、大肠杆菌NRRLB-30813中所含的质粒pTter61C、大肠杆菌NRRLB-30812中所含的质粒pTter61D、大肠杆菌NRRLB-30814中所含的质粒pTter61E、大肠杆菌NRRLB-30811中所含的质粒pTter61G、大肠杆菌NRRLB-30704中所含的质粒PDZA2-7或大肠杆菌NRRLB-30878中所含的质粒pTr3337中包含的多核苷酸编码的。20.权利要求15-19中任一项的方法，其还包括用有效量的葡糖苷酶处理含纤维素材料。21.权利要求15-20中任一项的方法，其还包括用有效量的一种或多种选自下组的酶处理含纤维素材料半纤维素酶、酯酶、蛋白酶、漆酶、过氧化物酶或其混合物。22.权利要求15的方法，其还包括补充可溶性活化性二价金属阳离子的浓度以维持可溶性活化性二价金属阳离子的有效浓度为优选约0.OOlmM-约50mM、更优选约0.OlmM-约25mM、更优选约0.ImM-约25mM、更优选约0.ImM-约10mM、进一步更优选约0.3mM-约5mM、最优选约0.3mM-约2.5mM、进一步最优选约0.3mM-约ImM。23.权利要求15-22中任一项的方法，其中所述发酵产物为醇、有机酸、酮、醛、氨基酸或气体。24.包含具有纤维素分解增强活性的多肽和可溶性活化性二价金属阳离子的纤维素分解酶组合物，其中所述可溶性活化性二价金属阳离子在降解或转化含纤维素材料的过程中以优选约0.OOlmM-约50mM、更优选约0.OlmM-约25mM、更优选约0.ImM-约25mM、更优选约0.ImM-约10mM、进一步更优选约0.3mM-约5mM、最优选约0.3mM-约2.5mM、进一步最优选约0.3mM-约ImM的有效浓度存在，与没有可溶性活化性二价金属阳离子的具有纤维素分解增强活性的多肽相比，可溶性活化性二价金属阳离子和具有纤维素分解增强活性的多肽的存在使纤维素分解酶组合物对含纤维素材料的降解或转化提高。25.权利要求24的纤维素分解酶组合物，其中所述可溶性活化性二价金属阳离子选自下组Mn++、Co+\Mg++、Ca++及其组合。26.包含具有纤维素分解增强活性的多肽和可溶性活化性二价金属阳离子的组合物，其中所述可溶性活化性二价金属阳离子在降解或转化含纤维素材料的过程中以优选约0.OOlmM-约50mM、更优选约0.OlmM-约25mM、更优选约0.ImM-约25mM、更优选约0.ImM-约10mM、进一步更优选约0.3mM-约5mM、最优选约0.3mM-约2.5mM、进一步最优选约0.3mM-约ImM的有效浓度存在，与没有可溶性活化性二价金属阳离子的具有纤维素分解增强活性的多肽相比，可溶性活化性二价金属阳离子和具有纤维素分解增强活性的多肽的存在使纤维素分解酶组合物对含纤维素材料的降解或转化提高。27.权利要求26的组合物，其中所述可溶性活化性二价金属阳离子选自下组Mn++、C0++、Mg++、Ca++及其组合。全文摘要本发明涉及提高具有纤维素分解增强活性的多肽的活性的方法，包括向含有具有纤维素分解增强活性的多肽的组合物加入可溶性活化性二价金属阳离子，其中与没有可溶性活化性二价金属阳离子的具有纤维素分解增强活性的多肽相比，可溶性活化性二价金属阳离子和具有纤维素分解增强活性的多肽的存在使纤维素分解酶组合物对含纤维素材料的降解或转化提高。本发明还涉及组合物、降解或转化含纤维素材料的方法，以及产生发酵产物的方法。文档编号C12N9/42GK101809150SQ200880101442公开日2010年8月18日申请日期2008年5月30日优先权日2007年5月31日发明者保罗·哈里斯,基思·麦克法兰申请人:诺维信股份有限公司