专利名称：用于改良蛋白质性能的方法
技术领域：
本发明提供了用于改造蛋白质以优化其在某些目的环境条件下的性能的方法。在某些实施方案中，本发明提供了用于改造酶以优化其在特定环境条件下的催化活性的方 法。在某些优选实施方案中，本发明提供了用于改变酶(例如，金属蛋白酶或丝氨酸蛋白 酶)的净表面电荷和/或表面电荷分布的方法，以获得与起始或亲本酶比较在洗涤剂制剂 中表现出改良性能的酶变体。
背景技术：
蛋白质在其天然环境外工作时，性质通常是次佳的。例如，酶(例如，蛋白酶、月旨 肪酶、淀粉酶、纤维素酶等)通常用于衣物洗涤剂中清洁织物上的污渍，所述衣物洗涤剂一 般包括活性成分的复杂组合。事实上，大多数清洁用品包括表面活性剂系统、漂白剂、助洗 齐U、抑泡剂、污垢悬浮剂、污垢释放剂、荧光增白剂、软化剂、分散剂、染料转移抑制化合物、 磨料、杀菌剂和香料，以及用于清洁的酶。因此，尽管目前洗涤剂的复杂性，但仍存在难以完 全去除的许多污渍，部分原因就在于亚最佳的酶性能。尽管有许多酶开发研究，但本领域仍 需要改造蛋白质以用于特定用途和条件的方法。事实上，本领域仍需要快速且系统地修改 蛋白质的静电性质以优化其在商业应用中的性能的方法。特别地，本领域仍需要改造在工 业上有用的酶的方法，所述酶包括但不限于脂肪酶、淀粉酶、角质酶、甘露聚糖酶、氧化还原 酶、纤维素酶、果胶酶、蛋白酶和其他酶，以便在清洁溶液中提供改良的活性、稳定性和溶解 性。发明概述本发明提供用于改造蛋白质以优化其在某些目的环境条件下的性能的方法。在某 些实施方案中，本发明提供用于改造酶以优化其在特定环境条件下的催化活性的方法。在 某些优选实施方案中，本发明提供用于改变酶(例如，金属蛋白酶或丝氨酸蛋白酶)的净表 面电荷和/或表面电荷分布、以获得与起始或亲本酶比较在洗涤剂制剂中显示改良性能的 酶变体的方法。在某些实施方案中，本发明提供用于在蛋白质，特别是酶中进行电荷置换的方法。 在某些优选实施方案中，本发明提供产生具有改良的洗涤性能的酶的方法。本发明可以用 于改造各种酶以及其他蛋白质。特别地，本发明可以用于开发改良的工业有用酶，所述工业 包括但不限于清洁(例如，衣物、餐具、硬表面等)。然而，本发明不旨在局限于任何具体酶 或蛋白质。本发明提供用于产生与亲本中性金属蛋白酶比较，具有改良的洗涤性能的中性金 属蛋白酶变体的方法，其包括置换亲本中性金属蛋白酶中一个或多个位置处的氨基酸残 基，以产生与亲本比较具有更多正电荷或更多负电荷的中性金属蛋白酶变体。在某些特别优选的实施方案中，该方法进一步包括通过比较亲本和变体去除污渍的能力，测试变体的 洗涤性能，其中亲本的洗涤性能被定为值1.0，具有改良的洗涤性能的变体达到大于1. 0的 值。在进一步的实施方案中，本发明提供用于产生具有改良的洗涤性能的变体的方法。在 某些实施方案中，亲本中性金属蛋白酶是野生型成熟形式的中性金属蛋白酶。在某些其他 实施方案中，变体衍生自芽孢杆菌科(Bacillaceae)中性金属蛋白酶。在某些优选实施方 案中，变体衍生自芽孢杆菌属(Bacillus)中性金属蛋白酶。在某些特别优选的实施方案 中，洗涤性能在具有6. 5-12. OpH的粉末或液体洗涤剂组合物中进行测试。在某些优选实施 方案中，洗涤性能在具有碱性PH的液体衣物洗涤剂中进行测试。在某些备选优选实施方案 中，亲本中性金属蛋白酶中的一个或多个位置是具有大于约50%的溶剂可及表面(SAS)的 位置。在某些另外的优选实施方案中，亲本中性金属蛋白酶中的一个或多个位置是具有大 于约65%的溶剂可及表面(SAS)的位置。本发明还提供用于产生与亲本中性金属蛋白酶比较，具有改良的洗涤性能的中性金属蛋白酶变体的方法，其包括置换亲本中性金属蛋白酶中一个或多个位置处的氨基酸 残基，以产生与亲本比较具有更多正电荷或较少负电荷的中性金属蛋白酶变体；和置换亲 本中性金属蛋白酶中一个或多个位置处的氨基酸残基，以产生与亲本比较具有更多负电荷 或较少正电荷的中性金属蛋白酶变体。在某些特别优选的实施方案中，该方法进一步包括 通过比较亲本和变体去除污渍的能力，测试变体的洗涤性能，其中亲本的洗涤性能被定为 值1.0，具有改良的洗涤性能的变体达到大于1. 0的值。在再其它实施方案中，该方法包括 产生具有改良的洗涤性能的变体。这些步骤旨在以任何合适的顺序进行。在某些实施方案 中，亲本中性金属蛋白酶是野生型成熟形式的中性金属蛋白酶。在某些其他实施方案中，变 体衍生自芽孢杆菌科中性金属蛋白酶。在某些优选实施方案中，变体衍生自芽孢杆菌属中 性金属蛋白酶。在某些特别优选的实施方案中，洗涤性能在具有6. 5-12. OpH的粉末或液体 洗涤剂组合物中进行测试。在某些优选实施方案中，洗涤性能在具有碱性PH的液体衣物洗 涤剂中进行测试。在某些备选优选实施方案中，亲本中性金属蛋白酶中的一个或多个位置 是具有大于约50%的溶剂可及表面(SAS)的位置。在某些另外的优选实施方案中，亲本中 性金属蛋白酶中的一个或多个位置是具有大于约65%的溶剂可及表面(SAS)的位置。在某 些优选实施方案中，至少一个酸性氨基酸残基用至少一个碱性氨基酸残基置换，而在其他 实施方案中，至少一个酸性氨基酸残基用至少一个中性氨基酸残基置换，并且在某些另外 的实施方案中，至少一个中性氨基酸残基用碱性氨基酸残基置换。在某些实施方案中，提供 各种置换组合。在另外的实施方案中，至少一个碱性氨基酸残基用至少一个酸性氨基酸残 基置换，而在其他实施方案中，至少一个碱性氨基酸残基用至少一个中性氨基酸残基置换， 并且在再其它实施方案中，至少一个中性氨基酸残基用至少一个酸性氨基酸残基置换。在 其他另外的实施方案中，亲本中性金属蛋白酶中的至少一个中性氨基酸残基用至少一个中 性氨基酸残基置换，以产生与亲本比较具有相同电荷的中性金属蛋白酶变体。本发明不旨 在局限于任何具体的置换组合。所述置换也不旨在以任何特定顺序执行。本发明提供用于产生与亲本丝氨酸蛋白酶比较，具有改良的洗涤性能的丝氨酸蛋 白酶变体的方法，其包括置换亲本丝氨酸蛋白酶中一个或多个位置处的氨基酸残基，以产 生与亲本比较具有更多正电荷或更多负电荷的丝氨酸蛋白酶变体。在某些特别优选的实施 方案中，该方法进一步包括通过比较亲本和变体去除污渍的能力，测试变体的洗涤性能，其中亲本的洗涤性能被定为值1.0，具有改良的洗涤性能的变体达到大于1. 0的值。在进一步 的实施方案中，本发明提供用于产生具有改良的洗涤性能的变体的方法。在某些实施方案 中，亲本丝氨酸蛋白酶是野生型成熟形式的丝氨酸蛋白酶。在某些其他实施方案中，变体衍 生自芽孢杆菌科丝氨酸蛋白酶。在某些优选实施方案中，变体衍生自芽孢杆菌属丝氨酸蛋 白酶。在某些特别优选的实施方案中，洗涤性能在具有6. 5-12. OpH的粉末或液体洗涤剂组 合物中进行测试。在某些优选实施方案中，洗涤性能在具有碱性PH的液体衣物洗涤剂中进 行测试。在某些备选优选实施方案中，亲本丝氨酸蛋白酶中的一个或多个位置是具有大于 约50%的溶剂可及表面(SAS)的位置。在某些另外的优选实施方案中，亲本丝氨酸蛋白酶 中的一个或多个位置是具有大于约65%的溶剂可及表面(SAS)的位置。本发明还提供用于产生与亲本丝氨酸蛋白酶比较，具有改良的洗涤性能的丝氨酸蛋白酶变体的方法，其包括置换亲本丝氨酸蛋白酶中一个或多个位置处的氨基酸残基，以 产生与亲本比较具有更多正电荷或较少负电荷的丝氨酸蛋白酶变体；和置换亲本丝氨酸 蛋白酶中一个或多个位置处的氨基酸残基，以产生与亲本比较具有更多负电荷或较少正电 荷的丝氨酸蛋白酶变体。在某些特别优选的实施方案中，该方法进一步包括通过比较亲本 和变体去除污渍的能力，测试变体的洗涤性能，其中亲本的洗涤性能被定为值1.0，具有改 良的洗涤性能的变体达到大于1.0的值。在再进一步的实施方案中，该方法包括产生具有 改良的洗涤性能的变体。所述步骤旨在以任何合适的顺序进行。在某些实施方案中，亲本 丝氨酸蛋白酶是野生型成熟形式的丝氨酸蛋白酶。在某些其他实施方案中，变体衍生自微 球菌亚目(Micrococcineae)丝氨酸蛋白酶。在某些优选实施方案中，变体衍生自纤维单 胞菌属(Cellulomonas)丝氨酸蛋白酶。在某些特别优选的实施方案中，洗涤性能在具有 6. 5-12. OpH的粉末或液体洗涤剂组合物中进行测试。在某些优选实施方案中，洗涤性能在 具有碱性PH的液体衣物洗涤剂中进行测试。在某些备选优选实施方案中，亲本丝氨酸蛋白 酶中的一个或多个位置是具有大于约50%的溶剂可及表面(SAS)的位置。在某些另外的 优选实施方案中，亲本丝氨酸蛋白酶中的一个或多个位置是具有大于约65 %的溶剂可及表 面(SAS)的位置。在某些优选实施方案中，至少一个酸性氨基酸残基用至少一个碱性氨基 酸残基置换，而在其他实施方案中，至少一个酸性氨基酸残基用至少一个中性氨基酸残基 置换，并且在某些另外的实施方案中，至少一个中性氨基酸残基用碱性氨基酸残基置换。在 某些实施方案中，提供各种置换组合。在另外的实施方案中，至少一个碱性氨基酸残基用至 少一个酸性氨基酸残基置换，而在其他实施方案中，至少一个碱性氨基酸残基用至少一个 中性氨基酸残基置换，并且在再其它实施方案中，至少一个中性氨基酸残基用至少一个酸 性氨基酸残基置换。在其他另外的实施方案中，亲本丝氨酸蛋白酶中的至少一个中性氨基 酸残基用至少一个中性氨基酸残基置换，以产生与亲本比较具有相同电荷的丝氨酸蛋白酶 变体。本发明不旨在局限于任何具体的置换组合。这些置换也不旨在以任何特定的顺序执 行。本发明还提供用于产生与亲本丝氨酸蛋白酶比较，具有改良的洗涤性能的丝氨酸 蛋白酶变体的方法，其包括置换亲本丝氨酸蛋白酶中一个或多个位置处的氨基酸残基，以 产生与亲本比较具有更多正电荷或较少负电荷的丝氨酸蛋白酶变体；置换亲本丝氨酸蛋白 酶中一个或多个位置处的氨基酸残基，以产生与亲本比较具有更多负电荷或较少正电荷的 丝氨酸蛋白酶变体；和获得通过这些步骤产生的丝氨酸蛋白酶变体。在另外的实施方案中，该方法包括通过比较亲本和变体去除污渍的能力，测试变体的洗涤性能，其中亲本的洗涤性能被定为值1.0，具有改良的洗涤性能的变体达到大于1. 0的值。在进一步的实施方案 中，该方法包括产生具有改良的洗涤性能的变体。所述步骤旨在以任何合适的顺序进行。在 某些实施方案中，亲本丝氨酸蛋白酶是野生型成熟形式的丝氨酸蛋白酶。在某些其他实施 方案中，变体衍生自微球菌亚目丝氨酸蛋白酶。在某些优选实施方案中，变体衍生自纤维单 胞菌属丝氨酸蛋白酶。在某些特别优选的实施方案中，洗涤性能在具有6. 5-12. OpH的粉末 或液体洗涤剂组合物中进行测试。在某些优选实施方案中，洗涤性能在具有碱性PH的液体 衣物洗涤剂中进行测试。在某些备选优选实施方案中，亲本丝氨酸蛋白酶中的一个或多个 位置是具有大于约50%的溶剂可及表面(SAS)的位置。在某些另外的优选实施方案中，亲 本丝氨酸蛋白酶中的一个或多个位置是具有大于约65%的溶剂可及表面(SAS)的位置。在 某些优选实施方案中，至少一个酸性氨基酸残基用至少一个碱性氨基酸残基置换，而在其 他实施方案中，至少一个酸性氨基酸残基用至少一个中性氨基酸残基置换，并且在某些另 外的实施方案中，至少一个中性氨基酸残基用碱性氨基酸残基置换。在某些实施方案中，提 供各种置换组合。在另外的实施方案中，至少一个碱性氨基酸残基用至少一个酸性氨基酸 残基置换，而在其他实施方案中，至少一个碱性氨基酸残基用至少一个中性氨基酸残基置 换，并且在再其它实施方案中，至少一个中性氨基酸残基用至少一个酸性氨基酸残基置换。 在其他另外的实施方案中，亲本丝氨酸蛋白酶中的至少一个中性氨基酸残基用至少一个中 性氨基酸残基置换，以产生与亲本比较具有相同电荷的丝氨酸蛋白酶变体。本发明不旨在 局限于任何具体的置换组合。这些置换也不旨在以任何特定的顺序执行。本发明提供用于产生与亲本蛋白质比较，具有改良的洗涤性能的至少一种蛋白 质变体的方法，其包括修饰亲本蛋白质中一个或多个位置处的至少一个氨基酸残基，以产 生与亲本蛋白质比较，具有更多正电荷、更多负电荷、更少正电荷或更少负电荷的至少一种 蛋白质变体。在某些实施方案中，所述修饰包括置换、添加和/或缺失，而在其他实施方 案中，修饰包括化学修饰。在某些实施方案中，蛋白质是酶。在某些特别优选的实施方案 中，酶是蛋白酶、淀粉酶、纤维素酶、聚酯酶、酯酶、脂肪酶、角质酶、果胶酶、氧化酶、转移酶、 alkalase或过氧化氢酶。在某些进一步特别优选的实施方案中，蛋白酶是丝氨酸蛋白酶或 中性金属蛋白酶。在某些另外的实施方案中，使用至少一种目的测验，评估至少一种蛋白 质变体的性能。在某些进一步的实施方案中，所述至少一种目的测验包括测量底物结合、 酶抑制、表达水平、洗涤剂稳定性、热稳定性、反应速率、反应进度(extentof reaction)、热 活性、淀粉液化、酯水解、酶促漂白、洗涤性能、生物质降解、溶解性、螯合剂稳定性和/或糖 化。在某些其他另外的实施方案中，与亲本蛋白质比较，至少一种蛋白质变体在至少一种目 的测验中显示改良的性能。本发明还提供用于产生与亲本酶比较，具有改良的洗涤性能的至少一种酶变体的 方法，其包括修饰亲本酶中一个或多个位置处的至少一个氨基酸残基，以产生与亲本酶比 较，具有更多正电荷、更多负电荷、更少正电荷或更少负电荷的至少一种酶变体。在某些实 施方案中，修饰包括置换、添加和/或缺失，而在备选实施方案中，修饰包括化学修饰。在某 些另外的实施方案中，该方法进一步包括测试酶变体和亲本酶的洗涤性能，以提供关于酶 变体和亲本酶的性能指数。在某些实施方案中，酶变体的性能指数具有大于1.0的值，而亲 本酶的洗涤性能具有1.0的性能指数。在某些特别优选的实施方案中，该方法进一步包括产生具有改良的洗涤性能的变体酶。在某些另外的实施方案中，酶是蛋白酶、淀粉酶、纤维 素酶、聚酯酶、酯酶、脂肪酶、角质酶、果胶酶、氧化酶、转移酶、alkalase或过氧化氢酶。在某 些优选实施方案中，蛋白酶是丝氨酸蛋白酶或中性金属蛋白酶。在某些特别优选的实施方 案中，蛋白酶是芽孢杆菌属蛋白酶。在某些再进一步的实施方案中，洗涤性能在具有5-12. O 的PH的粉末或液体洗涤剂组合物中进行测试。在某些实施方案中，洗涤性能在具有碱性PH 的液体衣物洗涤剂中进行测试，而在某些其他实施方案中，洗涤性能在包含碱性PH的冷水液体洗涤剂中进行测试。在某些实施方案中，置换发生在亲本酶中具有大于约25%的溶剂 可及表面(SAS)的位置中。在某些进一步的实施方案中，置换发生在亲本酶中具有大于约 50%或大于约65%的溶剂可及表面(SAS)的位置中。本发明还提供用于产生与亲本酶比较，具有改良的洗涤性能的酶变体的方法，其 包括a)修饰亲本酶中一个或多个位置处的至少一个氨基酸残基，以产生与亲本酶比较， 具有更多正电荷、更多负电荷、更少正电荷或更少负电荷的第一酶变体；和b)修饰亲本酶 中一个或多个位置处的至少一个氨基酸残基，以产生与亲本酶比较，具有更多正电荷、更多 负电荷、更少正电荷或更少负电荷的第二酶变体。在某些实施方案中，修饰包括置换、添加 和/或缺失，而在其他实施方案中，修饰包括化学修饰。在某些另外的实施方案中，重复这 些步骤以产生多种酶变体。在某些进一步的实施方案中，亲本酶是蛋白酶、淀粉酶、纤维素 酶、聚酯酶、酯酶、脂肪酶、角质酶、果胶酶、氧化酶、转移酶、alkalase或过氧化氢酶。在某 些优选实施方案中，蛋白酶是中性金属蛋白酶或丝氨酸蛋白酶。在某些特别优选的实施方 案中，亲本酶是芽孢杆菌属蛋白酶。在某些进一步的实施方案中，该方法进一步包括测试变 体酶和亲本酶的洗涤性能，并且在该洗涤性能测验中比较亲本和变体酶去除污渍的能力， 其中亲本酶的洗涤性能被定为值1. 0，具有改良的洗涤性能的变体酶达到大于1. 0的值。在 某些实施方案中，该方法进一步包括产生与亲本酶比较具有改良的洗涤性能的酶变体。在 某些优选实施方案中，亲本酶是丝氨酸蛋白酶。在某些特别优选的实施方案中，丝氨酸蛋白 酶是芽孢杆菌属丝氨酸蛋白酶或纤维单胞菌属丝氨酸蛋白酶。在某些进一步的实施方案 中，洗涤性能在具有5-12. 0的pH的粉末或液体洗涤剂组合物中进行测试。在某些另外的 实施方案中，洗涤性能在具有碱性PH的液体衣物洗涤剂中进行测试。在再进一步的实施方 案中，洗涤性能在包含碱性PH的冷水液体洗涤剂中进行测试。在某些备选实施方案中，置 换发生在亲本酶中具有大于约25%的溶剂可及表面(SAS)的位置中，而在某些其他实施方 案中，置换发生在亲本酶中具有大于约50%或大于约65%的溶剂可及表面(SAS)的位置 中。在某些实施方案中，至少一个酸性氨基酸残基用至少一个碱性氨基酸残基置换，而在其 他实施方案中，至少一个酸性氨基酸残基用至少一个中性氨基酸残基置换，至少一个中性 氨基酸残基用至少一个碱性氨基酸残基置换，至少一个碱性氨基酸残基用至少一个酸性氨 基酸残基置换，至少一个碱性氨基酸残基用至少一个中性氨基酸残基置换，至少一个中性 氨基酸残基用至少一个酸性氨基酸残基置换，和/或亲本酶中的至少一个中性氨基酸残基 用至少一个中性氨基酸残基置换以产生与亲本酶比较具有相同电荷的酶变体。本发明旨在 按需使用任何合适的置换组合。本发明还提供用于产生与亲本蛋白质比较，具有改良的洗涤性能的至少一种蛋白 质变体的方法，其包括修饰亲本蛋白质中一个或多个位置处的至少一个氨基酸残基，以产 生与亲本蛋白质比较，具有更多正电荷、更多负电荷、更少正电荷或更少负电荷的至少一种蛋白质变体，并且其中该一个或多个位置具有大于约25%的溶剂可及表面(SAS)。在某些 实施方案中，一个或多个位置在包含亲本蛋白质和至少一种另外蛋白质的同源蛋白质序列 氨基酸比对中是非保守的。在某些优选实施方案中，亲本蛋白质是酶。在某些特别优选的实 施方案中，酶是蛋白酶、淀粉酶、纤维素酶、聚酯酶、酯酶、脂肪酶、角质酶、果胶酶、氧化酶、 转移酶、alkalase或过氧化氢酶。在某些进一步的实施方案中，改良的性能包括选自下述的 一种或多种性能的增加底物结合、酶抑制、表达、洗涤剂中的稳定性、热稳定性、反应速率、 反应进度、热活性、淀粉液化、生物质降解、糖化、酯水解、酶促漂白、洗涤性能、溶解性、螯合 剂稳定性和/或纺织品变性(textilemodification)。在某些另外的实施方案中，修饰包括 置换、添加和/或缺失，而在其他实施方案中，修饰包括化学修饰。在某些实施方案中，至少 一个置换包含，相对于亲本蛋白质，0、-1或-2的净电荷改变，而在其他实施方案中，至少一 个置换包含，相对于亲本蛋白质，+1或+2的净电荷改变。在某些进一步的实施方案中，亲 本蛋白质中的至少一个置换包含O、-1或-2的电荷改变，并且其中亲本蛋白质中的至少一 个另外置换包含，相对于亲本蛋白质，+1或+2的电荷改变。在某些备选实施方案中，相对于亲本蛋白质，蛋白质变体具有+1或+2的净电荷改变，而在其他实施方案中，相对于亲本 蛋白质，蛋白质变体具有0、-1或-2的净电荷改变。在某些另外的实施方案中，置换发生在 亲本酶中具有大于约50%或大于约65%的溶剂可及表面(SAS)的位置中。附图简述图IA描述了在AATCC液体洗涤剂(实心三角)以及匹配pH和传导性的缓冲液 (空心三角)(5mM HEPES pH8. 0,2. 5mM NaCl)中测量的，随着相对于野生型ASP的净电荷改 变，ASP变体的血液、乳、墨(BMI)微型布样(microswatch)相对活性(基于最佳性能者进行 标准化后)。相似地，图IB描述了随着相对于野生型的电荷改变，ASP组合电荷文库(CCL) 的BMI微型布样相对活性。图2描述了在具有各种NaCl浓度——2. 5mM(空心圆圈)、16mM(灰色圆圈)禾口 IOOmM(黑色圆圈)——的5mM HEPES pH8. 0中测量的，随着相对于野生型ASP的电荷改变， ASP变体的相对BMI微型布样活性(基于最佳性能者进行标准化后)。图3A描述了随着电荷改变，FNA CCL在北美衣物洗涤剂中的BMI清洁性能。相似 地，图3B描述了随着电荷改变，GG36 CCL在北美衣物洗涤剂中的BMI清洁性能。图4A描述了随着电荷改变，FNA CCL在西欧液体衣物洗涤剂中的BMI清洁性能。 相似地，图4B描述了随着电荷改变，GG36 CCL在西欧液体衣物洗涤剂中的BMI清洁性能。图5A描述了随着电荷改变，FNA CCL在日本粉末衣物洗涤剂中的BMI清洁性能。 相似地，图5B描述了随着电荷改变，GG36 CCL在日本粉末衣物洗涤剂中的BMI清洁性能。图6A描述了随着电荷改变，FNA CCL在自动餐具洗涤的洗涤剂中的烤蛋黄清洁性 能。相似地，图6B描述了随着电荷改变，GG36 CCL在自动餐具洗涤的洗涤剂中的烤蛋黄清 洁性能。图7A描述了随着电荷改变，AmyS-S242Q CCL在BODIPY淀粉上的比酶活性。类似 地，图7B针对与亲本AmyS酶相比跨越-12至+4的电荷改变梯度的AmyS表面电荷变体，描 述了玉米淀粉液化后的粘度。图8描述了随着相对于野生型ASP的净电荷改变，ASP变体在枯草芽孢杆菌 (Bacillus subtilis)中的表达水平。
图9描述了随着相对于亲本FNA的净电荷改变，FNA变体的LAS/EDTA稳定性。
图10描述了随着相对于野生型ASP的净电荷改变，ASP变体的热稳定性。图11描述了随着相对于野生型AmyS的电荷改变，第一 AmyS电荷梯的热稳定性。图12提供随着pH的改变，第一 AmyS电荷梯的稻淀粉清洁活性。pH3. 0-4. 25是 200mM 甲酸钠 +0. 01% Tween-80。pH4. 25-5. 5 是 200mM 乙酸钠 +0. 01% Tween-80。数据拟 合成滴定曲线，各自具有单个pKa值。图13提供依据相对于野生型AmyS的电荷改变绘制的在图12中测定的pKa值。发明_既述本发明提供用于改造蛋白质以优化其在某些目的环境条件下的性能的方法。在某 些实施方案中，本发明提供用于改造酶以优化其在特定环境条件下的催化活性的方法。在 某些优选实施方案中，本发明提供用于改变酶(例如，金属蛋白酶或丝氨酸蛋白酶)的净表 面电荷和/或表面电荷分布的方法，以获得与起始或亲本酶比较在洗涤剂制剂中显示改良 性能的酶变体。蛋白酶枯草杆菌蛋白酶是在衣物洗涤剂中使用的主要酶，并且可能是全世界最广 泛使用的酶。大约20年前，注意到表面静电效应可能调节枯草杆菌蛋白酶的催化活性(参 见例如，Russell和Fersht，Nature 328 :496_500[1987])。较为近来，观察到涉及改变枯 草杆菌蛋白酶的净电荷的突变显著影响在洗涤剂中的洗涤性能(参见例如，引入本文作为 参考的EP专利号0479870B1)。这个有利效应被认为是使枯草杆菌蛋白酶pi (等电点)朝 向洗涤液的PH迁移的结果。然而，随后的工作证实这个结论并非总是适用(参见例如，引 入本文作为参考的美国专利号6，673，590B1)。如本专利中指出的，枯草杆菌蛋白酶中电荷 突变的效应显著地依赖于洗涤剂浓度，其中降低亲本枯草杆菌蛋白酶的pi的突变提供在 低洗涤剂浓度下更有效的酶，而提高pi的突变提供在高洗涤剂浓度下更有效的酶。这具有 极大用途，因为洗涤液中的洗涤剂浓度在全世界范围内变化极大。因此，对于本领域技术人 员已经显而易见的是，对于枯草杆菌蛋白酶的洗涤性能，存在依赖于洗涤液中的pH和洗涤 剂浓度的最适pi。改善枯草杆菌蛋白酶在衣物洗涤剂中的活性的其它努力已经描述(参见 美国专利
发明者A·肖, J·T·小凯利斯, L·G·卡斯考-佩雷拉, W·埃赫勒 申请人:丹尼斯科美国公司