由体细胞产生多能细胞的方法

专利名称：：由体细胞产生多能细胞的方法由体细胞产生多能细胞的方法本申请根据美国法典第35卷第119条(e)款(35U.S.C.§119(e))要求2007年5月30日递交的美国临时专利申请序列号60/932，267的优先权，并将其整体引入作为参考。
背景技术：
：通过核移植(ffakayama,T.；Perry,Α.C.；Zuccotti,Μ.Johnson,K.R.和Yanagimachi,R.(1998)Nature394,369-374；ffilmut,I.；Schnieke,Α.Ε.；Mcffhir,J.；Kind,A.J.和Campbell,K.H.(1997)Nature385,810-813)和细胞融合(Cowan,C.Α.；Atienza,J.；Melton,D.Α.和Eggan，K.(2005)Science309，1369—1373;Tada，Μ.；Takahama,Y.；Abe,K.；Nakatsuji,N.和Tada，Τ·(2001)CurrBiol11,1553-1558)进行的细胞重编程容许在体细胞核内重建多能性状态(Hochedlinger，K.和Jaenisch，R.(2006)NatUre441，1061-1067)。虽然还没有完全阐明核重编程的分子机制，但是细胞融合实验已经暗示重编程因子可在胚胎干细胞(ES)中进行鉴定，并用于在体细胞中直接诱导重编程。实际上，最近推理研究法实现了四种转录因子的鉴定，所述转录因子的表达能够在成人成纤维细胞中诱导多能性状态(Takahashi,K.和Yamanaka，S.(2006)Cell126,663-676)。Yamanaka和同事证明，转录因子0ct4、Sox2、c-Myc和Klf4的逆转录病毒表达同Fbxl5表达的遗传选择相结合，可直接从成纤维细胞培养物中产生诱导性多能干细胞(iPS细胞)。由Fbxl5选定的iPS细胞促成妊娠中期胚胎中的各种组织，然而，这些在妊娠中期死亡的胚胎表明iPS细胞与ES细胞相比其发育潜力受到了限制。与该观察相一致，在iPS细胞中仅表达了部分ES细胞转录组，而0ct4和Nanog启动子染色质状态的甲基化分析证明了介于成纤维细胞和ES细胞的模式之间的表观遗传模式。这些观察对于直接重编程细胞的分子性质和功能性质提出了三个根本性的问题(1)选择对ES细胞状态必要的基因是否可以产生与前述由Fbxl5选定的iPS细胞相比更类似于ES细胞的多能细胞；(2)iPS细胞的多能性状态是否取决于外源因子的持续表达；以及(3)转录因子诱导的重编程是否将成纤维细胞基因组的表观遗传图谱(landscape)重置(reset)成多能细胞的表观遗传图谱。通过核移植或细胞融合成功进行的体细胞重编程被认为需要可靠的表观遗传修饰重塑，例如DNA甲基化作用、组蛋白修饰以及在雌性细胞中沉默X染色体的再活化0^(^0肚，1]\1，第三版工88&11，1(·和JaenischR.(2001)Science293，1093-1098)。认为表观遗传重编程异常是在由核移植所克隆的动物中发现的发育失败和发育异常的主要原因。因此，表观遗传重编程的问题与iPS细胞的潜在治疗应用密切相关，因为表观遗传异常可以导致病理学状况，例如癌症(Gaudet,F.；Hodgson,J.G.；Eden,Α.、Jackson-Grusby,L.；Dausman,J.；Gray,J.W.；Leonhardt,H.禾口Jaenisch，R.(2003)Science300，489—492)。
发明内容本文所述的方法涉及诱导性多能干细胞，即，由包括例如成人成纤维细胞在内的分化细胞中产生或诱导的多能干细胞的选择。在本领域已经表明多能性的诱导可通过诱导有限数量转录因子的表达来实现，并可用于任何哺乳动物细胞、非人哺乳动物细胞或人细胞。本文所述的方法容许在发育重编程期间对哺乳动物(包括例如小鼠和人)多能细胞的产生进行选择。一组指定的转录因子的过表达可将成人体细胞转变为胚胎干细胞(ES)样细胞，但是，该过程通常需要ES细胞特异性基因再活化的遗传选择；不进行选择会导致除ES样细胞之外，还产生许多非ES样细胞。这种遗传选择技术通常不适用于人细胞，并且通常也不适合将要导入人类患者中的细胞。针对这个问题，本文描述了容许选择重编程细胞的新型选择策略，其基于(1)仅仅细胞群形态，以及(2)在雌性细胞中X染色体的再活化。也就是说，不进行遗传选择、化学选择或者两者都不进行。相对于现有的选择手段，基于形态的选择需要长得多的时间进行重编程，大概为加入重编程因子后一到两个月。在这个时间后，可挑选并扩展ES样细胞群。很多非ES样细胞保留在挑选阶段，但是一旦以例如克隆密度使所述细胞传代时，就可容易地回收ES样细胞群，并可产生细胞系。基于X染色体再活化的选择利用了对Hprt基因座(locus)中的突变基因呈杂合的雌性细胞系。本文显示，在由指定的因子进行重编程期间发生X染色体再活化，并且该事件发生在重编程过程的末期(大概3-4周)。在雌性体细胞中，仅有一条X染色体是活性的，而另一条是沉默的。一方面，在Hprt杂合细胞中，在活性X染色体上具有突变Hprt基因的细胞将对6-硫代鸟嘌呤有耐受性。一旦发生重编程和X染色体再活化时，这些细胞就表达出正常的Hprt基因并获得对HAT培养基的耐受性，而丧失了对6-硫代鸟嘌呤的耐受性。本文所述方法的一方面容许诱导性多能干细胞的选择，包括以下步骤所述方法包括(a)将分化的原代细胞重编程为多能表型，其中，当用RT-PCR测定时，所述分化的原代细胞不表达NanogmRNA；(b)重编程之后，在没有选择试剂存在的条件下，培养步骤(a)中所述重编程的细胞；(c)用显微镜观察步骤(b)的培养物，并分离所述培养物中在外观上已经变得光滑且呈圆形的细胞克隆；以及(d)检测所述克隆的细胞对干细胞标记物的表达；其中，将干细胞标记物表达的检出作为所述细胞为诱导性多能干细胞的指示。在本文所述的这个方面及其它所有方面的一个实施方式中，所述的重编程包括以下之一将编码转录因子Oct4、sox2、c-Myc和Klf4的核酸序列导入所述分化的体细胞中，所述序列可操作地连接至用于表达所述因子的调节元件；导入重编程所述细胞分化状态的一个或多个蛋白因子；以及将所述细胞与诱导所述细胞分化状态重编程的小分子相接触。在本文所述的这个方面和所有其它方面的另一个实施方式中，本方法进一步包含将表达干细胞标记物的克隆的细胞导入裸鼠中，并对由所述细胞产生的肿瘤进行组织学研究的步骤，其中，包含来自所有三个胚层的细胞的肿瘤生长进一步表明所述细胞为多能干细胞。在本文所述的这个方面和所有其它方面的另一个实施方式中，所述的培养步骤进一步包括将所述细胞进行传代。在本文所述的这个方面和所有其它方面的另一个实施方式中，所述分化的体细胞具有明显不同于ES细胞的形态。在本文所述的这个方面和所有其它方面的另一个实施方式中，所述分化的原代细胞为成纤维细胞，并且，其中在重编程之前，所述的成纤维细胞是扁平且不规则的形状。在本文所述的这个方面和所有其它方面的另一个实施方式中，所述干细胞标记物选自于由SSEAl、CD9、Nanog、Fbx15、EcatUEsgUEras、Gdf3、Fgf4、Cripto、Dax1、Zpf296、Slc2a3、Rexl、Utfl和0ct4所组成的组。在本文所述的这个方面和所有其它方面的另一个实施方式中，所述方法进一步包括当所述分化的原代细胞来自于雌性个体时，检测克隆的细胞对非活性X染色体再活化的步骤。在本文所述的这个方面和所有其它方面的另一个实施方式中，所述核酸序列包含在病毒载体或质粒中。在本文所述的这个方面和所有其它方面的另一个实施方式中，所述病毒载体为逆转录病毒载体、慢病毒载体或腺病毒载体。在本文所述的这个方面和所有其它方面的另一个实施方式中，本方法进一步包含检测所述克隆的细胞对外源性0ct4、Sox2、c-Myc和/或Klf4表达的步骤。在本文所述的这个方面和所有其它方面的另一个实施方式中，所述的原代细胞包括人细胞。本文所述的另一方面是一种选择诱导性多能干细胞的方法，所述方法包括(a)提供对X染色体上的选择性标记物呈杂合的雌性细胞，其中所述选择性标记物是在活性X染色体上的突变型以及非活性X染色体上的野生型，并且，其中当用RT-PCR测定时，所述细胞不表达NanogmRNA；(b)将所述细胞重编程为多能表型；(c)用选择试剂培养所述细胞，其中，所述的非活性X染色体的再活化容许野生型选择性标记物的表达，并容许细胞在所述选择试剂存在的条件下存活，由此存活的细胞为诱导性多能干细胞。在这个方面的一个实施方式中，本方法进一步包含检测在所述选择试剂存在的条件下存活的细胞对干细胞标记物表达的步骤。在本文所述的这个方面和所有其它方面的另一个实施方式中，所述干细胞标记物选自于由SSEAl、CD9、Nanog、Fbx15、EcatUEsgUEras、Gdf3、Fgf4、Cripto、Dax1、Zpf296、Slc2a3、Rexl、Utfl和0ct4所组成的组。在本文所述的这个方面和所有其它方面的另一个实施方式中，所述的重编程包含下列之一将编码转录因子0ct4、Sox2、c-Myc和Klf4的核酸序列导入所述分化的体细胞中，所述序列可操作地连接至用于表达所述因子的调节元件；导入重编程所述细胞分化状态的一个或多个蛋白因子；以及将所述细胞与诱导所述细胞分化状态重编程的小分子相接触。在本文所述的这个方面和所有其它方面的另一个实施方式中，本方法进一步包含如下步骤将在选择试剂存在的条件下存活的细胞导入裸鼠中，并对由所述细胞产生的肿瘤进行组织学研究的步骤，其中，包含来自所有三个胚层的细胞的肿瘤生长进一步表明所述细胞为多能干细胞。在本文所述的这个方面和所有其它方面的另一个实施方式中，所述细胞为细胞系的细胞。在本文所述的这个方面和所有其它方面的另一个实施方式中，所述细胞对X染色体上的突变Hprt基因呈杂合。在本文所述的这个方面和所有其它方面的另一个实施方式中，所述细胞在导入所述核酸之前为非活性的X染色体上携带野生型Hprt基因，并在所述重编程之前为活性的X染色体上携带突变非功能性Hprt基因。在本文所述的这个方面和所有其它方面的另一个实施方式中，所述细胞在重编程之前对6-硫代鸟嘌呤有耐受性。在本文所述的这个方面和所有其它方面的另一个实施方式中，所述选择试剂包含HAT培养基。在本文所述的这个方面和所有其它方面的另一个实施方式中，所述细胞包括人细胞。本文所述的另一个方面是一种选择诱导性多能干细胞的方法，所述方法包括(a)提供携带X染色体连接的报告子基因的雌性细胞，所述报告子基因通过X失活而沉默，并且，其中当用RT-PCR测定时，所述雌性细胞不表达NanogmRNA；(b)将所述细胞重编程为多能表型；(c)在所述重编程之后培养所述细胞；以及(d)从表达所述X染色体连接的报告子的所述培养物中分离细胞克隆；其中，将所述报告子的表达作为所述克隆包含诱导性多能干细胞的指示。在本文所述的这个方面和所有其它方面的一个实施方式中，本方法进一步包含检测克隆的细胞对干细胞标记物的表达的步骤。在本文所述的这个方面和所有其它方面的另一个实施方式中，所述干细胞标记物选自于由SSEAl、CD9、Nanog、Fbx15、EcatUEsgUEras、Gdf3、Fgf4、Cripto、Dax1、Zpf296、Slc2a3、Rexl、Utfl和0ct4所组成的组。在本文所述的这个方面和所有其它方面的另一个实施方式中，本方法进一步包含将表达所述报告子的细胞导入裸鼠中，并对由所述细胞产生的肿瘤进行组织学研究的步骤，其中，包含来自所有三个胚层的细胞的肿瘤生长进一步表明所述细胞为多能干细胞。在本文所述的这个方面和所有其它方面的另一个实施方式中，所述细胞包括人细胞。定义本文所用的术语“多能”指在不同的条件下，细胞具有分化为超过一种分化的细胞类型、并优选分化为具有所有三个胚细胞层特征的细胞类型的能力。多能细胞的特征主要在于利用例如裸鼠畸胎瘤形成试验(参见本文实施例)分化为超过一种细胞类型、优选分化为所有三个胚层的能力。还通过胚胎干细胞(ES)标记物的表达来显示多能性，不过对多能性的优选检测是显示其分化为所述三个胚层中的每层的细胞的能力。本文所用的术语“重编程”指将终末分化的(terminally-differentiated)体细胞的分化状态变为多能表型的过程。“分化的原代细胞”的意思是指以其天然形式存在的、不具有本文所定义的术语“多能性”的任何原代细胞。应当认识到将很多原代细胞置于培养物中可引起完全分化特征的部分丧失。然而，仅对这种细胞进行培养本身并不会使其具有多能性。转换为多能性需要重编程刺激，其超过在培养物中导致分化特征部分丧失的刺激。重编程后的多能细胞还具有如下特征相对于通常在培养物中只具有有限次分裂能力的原代细胞亲代而言，重编程后的多能细胞能够在不丧失生长潜能的情况下进行长期传代。术语“载体”指可将DNA序列插入其中以导入对所述DNA序列进行复制的宿主细胞中的小的载体DNA分子。“表达载体”为包含基因的特定载体，所述基因具有用于在宿主细胞中进行表达所需要的必要调控区。术语“可操作地连接”指将表达编码序列所必需的调控序列相对于编码序列而言置于DNA分子的适当位置，以便影响编码序列的表达。这一相同的定义有时应用于在表达载体中排列编码序列和转录控制元件(例如启动子、增强子和终止元件)。该定义有时还应用于排列第一核酸分子和第二核酸分子的核酸序列，其中产生杂交核酸分子。图1由Nanog选定的iPS细胞的ES细胞样特征(A)在Nanog-GFP(NGiP)ES细胞、有无持续的嘌呤霉素选择而生长的两种iPS细胞系以及作为附加参照点的野生型ES细胞(V6.5)和小鼠胚胎成纤维细胞(MEF)中的ES细胞标记物基因表达的RT-PCR分析。0ct4和Sox2的引物对于来自各自内源性基因座的转录物来说是特异的。将Natl用作内参照(loadingcontrol)0(B)在iPS细胞系、MEF和NGiP-ES细胞中Nanog、0ct4、Sox2、c_Myc和Klf4表达的Western印迹分析。将抗微管蛋白抗体和抗肌动蛋白抗体用作内参照。(C)在用各自的pMX病毒感染的(1)野生型MEF、⑵野生型ES细胞、(3)来自分类和亚克隆之前的异质性iPS细胞系lA2、(4)lD4iPS、(5)2D4iPS以及(6)MEF中，pMX逆转录病毒转录的定量PCR分析。将转录物水平归一化至β-肌动蛋白。应当注意到在2D4iPS系中的逆转录病毒看上去完全沉默，而异质性1A2系则仍然显示外源因子的大量表达。图2:iPS细胞与体细胞的融合(A)在2D4iPS细胞和携带0ct4Neo选择性等位基因的潮霉素抗性MEF之间的细胞融合的示意图。(B)在嘌呤霉素/潮霉素选择或嘌呤霉素/G418选择下维持的2D4iPS细胞、MEF和2D4/MEF细胞杂交体的DNA含量分析。图3用于维持iPS细胞的外源性0ct4所需要的条件(A)利用0ct4可诱导的成纤维细胞产生iPS细胞的示意图。(B)在没有或存在可被强力霉素诱导的0ct4表达的条件下，由Sox2、c-Myc和Klf4感染的MEF。所示内容为用于碱性磷酸酶染色的平板。(C)在0ct4可诱导的iPS细胞中0ct4水平的定量PCR分析。在未分化的iPS细胞(+LIF，-强力霉素(dox))、分化的iPS细胞(-LIF，-dox)和在撤去LIF5天后再诱导的分化iPS细胞(-LIF，+dox)中，测定来自内源性且可诱导的等位基因的转录物水平。将转录物水平归一化至β-肌动蛋白。将携带可诱导的0ct4等位基因的ES细胞以及野生型MEF作为对照。图4:iPS细胞中基因特异的、整体的DNA甲基化(globalDNAmethylation)状态(A)在ES细胞、2D4iPS细胞和MEF中，0ct4和Nanog启动子区域的亚硫酸氢盐测序。相对于转录起始位点(箭头)而言，图中显示了包含差异性甲基化CpG的启动子区域。空心圆代表未甲基化的CpG；实心圆代表甲基化的CpG。(B)通过iPS2D4细胞和MEF融合产生的细胞杂交体中，Nanog启动子的亚硫酸氢盐测序。嘌呤霉素/潮霉素抗性杂交体的数据如图2C所示。(C)利用卫星重复探针(satelliterepeatprobe)的DNA整体甲基化Southern印迹分析。将来自MEF、雄性Nanog-GFPES细胞、雌性ES细胞、iPS2D4亲代细胞和三个亚克隆的基因组DNA用甲基化敏感的限制酶Hpall消化，然后与微型卫星重复探针杂交。用甲基化不敏感的同裂酶Mspl消化的雄性ES细胞DNA作为对照。低分子量条带是低甲基化的指示。图5:iPS细胞中的X染色体动力学(A)在iPS细胞系2D4、NGiPMEF和雄性对照ES细胞中，Xite基因间转录物的RT-PCR分析。在沿着Xite基因座的不同位置上的转录物被检出(区域5-7)。阳性对照为管家基因Rrm2。雄性ES细胞如同雌性ES细胞一样表达Xite转录物。(B)Ezh2和H3me3K27在分化中的2D4iPS的非活性X染色体(Xi)上的富集。该图显示了具有XistRNA包被的细胞的百分比，显示出在2D4iPS细胞的视黄酸诱导的分化中的不同时间点上，在Xi上与Ezh2或H3me3K27的共定位(对于每个时间点，n>100)。图6在分化来源于尾尖成纤维细胞(TTF)的iPS细胞中的随机X-失活(A)从XGFPXTTF中获得iPS细胞，并随后分析X-失活的流程图。将携带0ct4-NeO等位基因的XGFPXTTF在两次连续传代时进行分类获得GFP阴性细胞群(XiGFPXa;<0.05%绿细胞)。基于ES细胞形态和GFP再活化来选择重编程后的细胞。使用以G418的药物选择来追溯性地证实iPS细胞的重编程状态，而不是选择用于iPS细胞建立。将iPS细胞亚克隆、分化，并通过荧光活化细胞分类(FACS)和Xist荧光原位杂交(XistFISH)来分析。由FACS测定的GFP+或GFP-的细胞数目以橙色表示，而以蓝色表示的数目表明在GFP+和GFP-分化的iPS细胞中，具有Xi的XistRNA包被的细胞的百分比。图7在iPS细胞中的H3K4和H3K27三甲基化的整体分析(A)在所有细胞类型之间的K4和K27三甲基化数据的整体相关性。表格分别显示在细胞类型的所有可能的配对之间和在阵列上的所有基因(16500)的K4和K27三甲基化的二元整体相关性。(B)在所有细胞类型之间E类基因中的K4和K27三甲基化的相关性。将对于每两对细胞类型而言的K4或K27甲基化的相关性值作为从转录起始位点的距离的函数，以500bp的增量来作图。图8可被Nanog选择的iPS细胞的体内发育潜力(A)把携带随机整合的GFP转基因的来自iPS细胞系2D4的细胞注入胚泡。代孕母体产下了GFP阳性幼崽。显示了不表达GFP的非嵌合幼崽。(B)分离自新生的iPS细胞来源的嵌合小鼠的脾和胸腺的造血细胞的流式细胞分析。直方图表示细胞群中在谱系特异性标记物上启动(gated)的GFP阳性细胞的百分比。(C)来源于注入胚泡的2D4iPS细胞的10天龄嵌合小鼠，显示紧挨着野生型同窝出生的仔畜(来源于iPS的细胞决定着刺豚鼠的毛色)。图9在iPS细胞系1A2和2D4中，逆转录病毒整合的DNA印记状态的分析(A)iPS细胞中逆转录病毒整合位点的分析通过Southern印迹分析测定逆转录病毒整合。用BamHI(就0ct4和Klf4而言)或Hindlll(就Sox2而言)或Bglll(就c-Myc而言)消化DNA，并用各自的cDNA探针杂交。图中显示了V6.5ES细胞(野生型)与两个iPS细胞系1A2和2D4的整合。(B)包括用于整合位点分析的内部限制性位点的各自的病毒构建体的示意图。应该注意到cDNA探针将检测由基因组区域中的一个pMX内部切割和一个外部切割产生的限制性片段，所述病毒已经整合到所述基因组区域中。(C)在Igf2r差异性甲基化区域的甲基化状态。利用PvuII和MIUI限制酶消化来自不同细胞类型的DNA，并用Southern印迹分析。图中指出了甲基化(M)和未甲基化(U)的等位基因。在缺乏Dnmtl的ES细胞中或在来源于E12.5胚胎的胚胎生殖(EG)细胞中仅仅检测到未甲基化的等位基因。在iPS细胞中维持印记的事实表明iPS细胞并非来源于可能已经污染了成纤维细胞培养物的稀少的生殖细胞。图10标签基因(signaturegene)分析的统计学意义基于其甲基化样式，在2D4iPS细胞如ES样(E类)中大多数标签基因的分类是高度显著性的。上部图表显示观察到的2D4基因座分布为E类、N类和M类(来自图7A中所示的数据)。为了证实2D4基因座分为E类、M类和N类基因，将2D4甲基化数据排列100次，随机分配给ES-MEF对，并以不同的严格性(p=0.01，p=0.05，p=0.1)进行标签基因再分类(下部图表)。图11在iPS细胞中标签基因的表达(A)通过皮尔森相关性(PearsonCorrelation)测定的、在V6.5ES细胞(ES)、由嘌呤霉素选定的NanogGFPiresPuroES细胞(ESpur。)、NanogGFPiresPuroMEF(MEF)和2D4iPS细胞(iPS)之间全部表达数据组(来自Agilent微阵列)的整体相关性。(B)在(A)中所述的ESpura、MEF和iPS的完整的表达数据组中基因的数目，其显示相对于ES细胞，在表达上超过2倍的变化。(C)在2D4iPS细胞、雌性MEF和V6.5ES细胞中，13个选定的标签基因的转录物水平的实时PCR分析。为了测定相对表达水平，利用QiagenRNA简易试剂盒制备RNA，并利用OmniscriptRT试剂盒(Qiagen)和随机引物逆转录1Pg。通过实时PCR对转录物水平进行定量，并利用AACt方法归一化至Gapdh对照。将ES细胞中的表达任意设置为1，并且误差棒代表重复三次反应的标准偏差。在表3中给出了引物序列。请注意Y轴标度的不同。尽管基于其组蛋白修饰模式将它们归类于MEF样基因，与我们的全基因组范围的表达数据相一致，三个检测基因中的两个属于M类的基因(Vgll4，HoxDIO)在2D4iPS细胞中表现ES样表达模式(在ES和iPS细胞中比在MEF中更低表达)。为此，在这些基因座上对组蛋白甲基化更为精细的人工检查显示，相对于MEF，在2D4iPS细胞中所见的抑制与在2D4iPS细胞中的这些启动子上的K4甲基化的减少有关。所有其它基因显示了仅K4甲基化与相对较高的表达、仅K27甲基化与相对较低的表达、以及组蛋白H3、K4和K27甲基化的二价与较低的表达之间的密切联系。图12:iPS细胞体外分化为造血系统(hematopoieticlineages)(A，B)通过流式细胞光度计分析来源于iPS细胞系2D4和野生型V6.5ES细胞的7天龄胚状体(EB)，来检测造血标记物⑶41和c-kit标记的不成熟造血细胞(A)，以及⑶45和c-kit标记的成熟造血细胞(B)。图中给出了双阳性细胞的百分比。请注意在产生EB的过程中，与V6.5ES细胞系相比，将更大量的输入细胞用于iPS细胞系，其可解释在分化细胞百分比数量上的差异。(C)由iPS细胞产生的解离的7天龄EB的甲基纤维素培养物获得成熟造血细胞。图中展示了多种造血细胞，包括成髓细胞(i)、巨噬细胞(ii)、肥大细胞(iii、iv)以及早期血红细胞(v、vi)。为了产生血细胞，利用预铺板除去饲养细胞之后，应用悬滴法产生EB(Geijsen，N.；Horoschak,M.；Kim,K.；Gribnau,J.；Eggan,K.禾口Daley，G.Q.(2004)Nature427，148-154)。在三天之后，将EB铺板，然后在第7天用胶原酶IV将EB解离成单细胞悬液用于造血标记物(具有附表3中所述的抗体)的FACS分析或者用于进一步体外分化。就甲基纤维素培养物而言，将第7天EB的单细胞悬液与补充有造血生长因子(M3434，StemCellTechnologies)的甲基纤维素混合，并以每一培养物1X105细胞进行接种。在培养物中10天之后，挑选代表性的造血细胞群来制备细胞离心涂片(cytospin)，其用May-GruenwaldGiemsa进行复染。具体实施例方式在没有选择试剂存在的条件下，诱导性多能干细胞的分离一方面，本文所述的方法涉及诱导性多能干细胞的选择，其不依靠利用选择性试剂来鉴定或富集已经变成多能细胞的那些细胞，而是依靠当细胞呈现较少分化的ES样多能表型时发生的原始细胞形态上的改变。在这个方面，本发明涉及一种选择诱导性多能干细胞的方法，所述方法具有如下步骤第一步涉及将分化的原代细胞重编程为较少分化或多能的状态。可以例如通过将细胞核移植到卵母细胞(参见例如Wilmut等人，1997，Nature385:810_813)，或通过与现有的胚胎干细胞融合(参见例如Cowan等人，2005，Science3091369-1373；以及Tada等人，2001，Curr.Biol.11:1553_1558)实现重编程。还可以通过例如将编码转录因子0ct4、Sox2、c-Myc和Klf4的核酸序列导入例如成纤维细胞中来进行这类重编程，所述序列可操作地连接至用于表达所述因子的调节元件。虽然优选这些因子，但是还可以使用其它的转录因子或这些因子的亚型(参见例如Takahashi&Yamanaka，2006，Cell126:663_676，将其并入本文作为参考)。在一个实施方式中，所述转录因子由病毒载体或质粒进行编码。所述病毒载体可为例如逆转录病毒载体、慢病毒载体或腺病毒载体。还可以将本领域技术人员已知的导入核酸的非病毒途径用于本文所述的方法。或者，可使用编码所述转录因子的内源性基因的活化。在另一个选择性方案中，可将对所述细胞分化状态进行重编程的一种或多种蛋白因子导入细胞。例如，可通过使用HIV-TAT融合将蛋白因子(尤其是，例如c-MyC、0Ct4、SOX2和/或Klf4)导入所述细胞中。TAT多肽具有容许其穿过细胞的特征，并已经用于将外源性因子导入细胞(参见例如Peitz等人，2002，Proc.Natl.Acad.Sci.USA994489-94)。可使用该方法来导入对细胞分化状态进行重编程的因子。最后，可通过将所述细胞与诱导所述细胞分化状态重编程的小分子相接触来实现重编程(参见例如Sato等人，2004，NatureMed.1055-63)。虽然优选成纤维细胞，但是也可使用其它原代细胞类型。优选亲代细胞具有明显不同于ES细胞的形态，以便于根据形态学变化进行选择。“明显不同”的意思是指，至少就粘附细胞而言，当在培养物中生长时，亲代细胞的形状是不规则的而非圆形的。就非粘附的原代细胞而言，可以优先选择粘附性，然后选择圆形的ES形态。本领域技术人员已知ES细胞的形态特征，当在相差显微镜下观察时，其趋向于成为圆形而非扁平状，并且趋向于光滑的而非粗糙的。此外，所述亲代细胞可来自于任何哺乳动物物种，其非限制性实例包括鼠、牛、猿、猪、马、羊或人的细胞。所述亲代细胞不应表达ES细胞标记物例如NanogmRNA或其它的ES标记物。为了简明，本文方法的描述涉及成纤维细胞作为亲代细胞，但是应当理解的是可容易地将本文所述的所有方法用于其它的原代亲代细胞类型。当使用成纤维细胞时，在重编程之前，所述成纤维细胞是扁平且形状不规则的形状，且不表达NanogmRNA。起始的成纤维细胞优选不表达其它的胚胎干细胞标记物。可通过例如RT-PCR测定ES细胞标记物的表达。或者，可以通过例如免疫荧光或其它的免疫学检测方法来测定，所述检测方法检测具有ES表型特征的多肽的存在。在下一步骤中，在导入核酸序列后，将成纤维细胞在没有选择试剂的条件下进行培养。术语“在没有选择试剂的条件下”指不存在对诱导性多能干细胞表型进行选择的选择试剂，例如不存在对已经去分化以表达一种或多种ES细胞标记物的细胞进行选择的选择试剂。虽然优选不存在任何种类的选择试剂，但是可以存在对编码转录因子0ct4、Sox2、c-Myc和Klf4的核酸的存在的选择试剂，尽管这些因子的持续表达对于维持多能表型并非是绝对必需的(见下文)。该方法包括对在分离的克隆中导入的转录因子的存在或表达进行检测。在下一步骤中，在显微镜下(例如在普通的相差光学显微镜或其它适当的光学装置下)观察在不存在选择试剂的条件下培养的细胞，从而鉴定在培养物中的细胞，所述细胞已经失去了亲代细胞形状不规则的特征，例如成纤维细胞的扁平且不规则的形态，并且在外观上已经变为光滑且呈圆形。随着所述细胞经历到多能性的转变，其变圆但保持存活。可将所述细胞传代以便于通过形态学进行选择。通过例如在多孔板中有限稀释并进行培养的方法或本领域技术人员已知的其它方法，分离显示圆形形态的活细胞的克隆。在进一步的步骤中，检测分离出的克隆对干细胞标记物的表达。这种表达将细胞确定为诱导性多能干细胞。干细胞标记物可选自于包括SSEAl、CD9、Nanog,Fbxl5、EcatUEsgl、Eras、Gdf3,Fgf4,Cripto、Daxl、Zpf296、Slc2a3、Rexl、Utfl和Natl的非限制性的组。检测这种标记物表达的方法可包括例如RT-PCR和检测编码的多肽存在的免疫学方法。可以通过很多评价ES标记物表达和分化为三胚层中每种细胞的能力的检测中的任意方法来证实所分离出的细胞的多能干细胞特性。作为一个实施例，可将在裸鼠中畸胎瘤的形成用于评价所分离出的克隆的多能特性。将所述细胞导入裸鼠中，并对由所述细胞产生的肿瘤进行组织学研究。包含来自全部三个胚层的细胞的肿瘤生长进一步表明该细胞为多能干细胞。在另一个实施方式中，其中所述细胞为雌性，可将对非活性X染色体再活化的评价作为去分化作用和多能性的量度。通过监测X-再活化进行的选择在雌性中X染色体之一的失活是远离多能性的分化的标志。当通过表达例如0ct4、Sox2、c-Myc和Klf4将细胞诱导为多能态时，非活性X染色体被再活化。本文所述方法的另一个方面使用分化的雌性细胞的非活性X染色体的再活化来选择诱导性多能干细胞。在这个方面，提供了一种选择诱导性多能干细胞的方法，该方法具有如下步骤首先，提供对χ染色体上选择性标记物呈杂合的雌性细胞，其中所述选择性标记物在活性χ染色体上是突变型，并且在非活性X染色体上是野生型。所述雌性细胞不表达NanogmRNA，并且优选不表达其它的ES细胞标记物。或者，所述选择性标记物可以整合到例如转基因动物或转基因细胞的非活性X染色体中，以便如果X再活化的话则仅仅观察到标记物的表达。这种标记物可以包括例如任何阳性选择性标记物。这个替代方案的优选实施方式使用了绿色荧光蛋白(GFP)(参见本文下列实施例)。在其它的优选实施方式中，所述选择性标记物为例如次黄嘌呤磷酸核糖转移酶(Hprt)。对Hprt呈杂合的雌性细胞系包括，例如DR4小鼠细胞(参见ATCCSCRC-1045)、人TK6淋巴母细胞样细胞系(ECACC87020507)、成纤维细胞(Rinat等人，2006，Mol.Genet.Metab.87:249_252所述)以及淋巴细胞(Rivero等人，2001，Am.J.Med·Genet.10348-55和Hakoda等人，1995，Hum.Genet.96674-680所述)，将以上每篇文献并入本文作为参考。在下一步骤中，将所述雌性细胞重编程为如本文作为本发明其它方面所述的多能表型。然后用选择试剂培养重编程的细胞，其中非活性X染色体的再活化容许野生型选择性标记物的表达，并且容许细胞在存在选择试剂的条件下存活。所述存活的细胞为诱导性多能干细胞。在这个方面的一个实施方式中，本方法进一步包含检测在所述选择试剂存在的条件下存活的细胞对干细胞标记物表达的步骤。所述干细胞标记物可选自于例如由SSEA1、CD9、Nanog、Fbxl5、Ecatl>Esgl>Eras、Gdf3>Fgf4>Cripto、Daxl>Zpf296>Slc2a3、Rexl>Utfl和0ct4所组成的组。在另一个实施方式中，重编程包括下列过程之一将编码转录因子0ct4、Sox2、c-Myc和Klf4的核酸序列导入所述细胞中，所述序列可操作地连接至用于表达所述因子的调节元件；导入重编程所述细胞分化状态的一个或多个蛋白因子；以及将所述细胞与诱导所述细胞分化状态重编程的小分子相接触。在另一个实施方式中，本方法进一步包含将在选择试剂存在的条件下存活的细胞导入裸鼠中，并对由所述细胞产生的肿瘤进行组织学研究的步骤，其中，包含来自所有三个胚层的细胞的肿瘤生长进一步表明所述细胞为多能干细胞。在另一个实施方式中，所述细胞来源于细胞系。在另一个实施方式中，所述细胞对X染色体上的突变Hprt基因呈杂合。在另一个实施方式中，所述细胞在导入所述核酸之前为非活性的X染色体上携带野生型Hprt基因，并在所述重编程之前为活性的X染色体上携带突变非功能性Hprt基因。在另一个实施方式中，所述细胞在所述重编程之前对6-硫代鸟嘌呤有耐受性。在另一个实施方式中，该选择试剂包含HAT培养基。在另一个方面，提供了一种选择诱导性多能干细胞的方法。所述方法包含下列步骤(a)提供携带X染色体连接的报告子基因的雌性细胞，所述报告子基因通过X失活而沉默，并且，其中当用RT-PCR测定时，所述雌性细胞不表达NanogmRNA；(b)将所述细胞重编程为多能表型；(c)在重编程步骤之后，再对所述细胞进行培养；以及(d)从表达所述X染色体连接的报告子的所述培养物中分离细胞克隆。将所述报告子的表达作为所述克隆包含诱导性多能干细胞的指示。在一个实施方式中，本方法进一步包含检测所述克隆的细胞对干细胞标记物的表达的步骤。所述干细胞标记物可选自于例如由SSEAl、CD9、Nanog、Fbxl5、Ecatl、Esgl、Eras、Gdf3、Fgf4、Cripto、Daxl、Zpf296、Slc2a3、Rexl、Utf1和0ct4所组成的组。在另一个实施方式中，本方法进一步包含将表达所述报告子的细胞导入裸鼠中，并对由所述细胞产生的肿瘤进行组织学研究的步骤。包含来自所有三个胚层的细胞的肿瘤生长进一步表明所述细胞为多能干细胞。通过对已经历X-再活化的细胞进行选择来对多能干细胞进行选择可提供用于对例如重编程步骤的小分子调节剂如促进重编程的小分子进行筛选的体系。换句话说，以这种方式得到的多能干细胞提供了用于筛选将干细胞再分化为所希望的表型的小分子或其它调节剂的方法。本发明进一步通过下列实施例进行说明，这些实施例不应视为对本发明的限定。实施例转录因子0ct4、Sox2、c-Myc和Klf4的异位表达足以在成纤维细胞基因组上赋予多能状态，产生诱导性多能干细胞(iPS细胞)。现在仍然不知道由这四种因子诱导的核重编程是否能够整体重置分化细胞和多能细胞之间的表观遗传差异。在本文中，利用新的选择方法，已经由成纤维细胞产生iPS细胞来表征其表观遗传状态。雌性iPS细胞显示体细胞沉默的X染色体的再活化，并且一旦分化就经历随机X失活。两个关键组蛋白修饰的全基因组范围的分析表明，iPS细胞高度类似于ES细胞。与这些观察一致，iPS细胞产生存活的高度嵌合体以促成生殖细胞系。这些数据显示转录因子诱导的重编程引起体细胞表观基因组整体转变到ES样状态。这些结果提供了用于研究伴随核重编程的表观遗传修饰的范例，并表明异常的表观遗传重编程不会造成iPS细胞治疗应用的问题。这些数据现已由Maherali,N.等人(2007)Cell-StemCell1:55_70所公开，以其整体并入本文。实验方法成纤维细胞的产生将Nanog-GFP-iresPuro构建体(Hatano等人，2005)靶向导入雄性V6.5ES细胞中，用标准Southern印迹分析确认正确靶向的克隆，然后产生小鼠。从0ct4_新霉素小鼠与pgk-潮霉素小鼠间的互交中获得0ct4-新霉素/潮霉素选择性小鼠。从Oct-Neo小鼠和X-连接的绿色荧光蛋白小鼠(X-linkedGFPmice)间的互交中获得携带Xgfp和0ct4-neo等位基因的TTF(Hadjantonakis等人，1998)。可诱导的0ct4小鼠如前所述(Hochedlinger等人，2005)。MEF产生于胎龄第14.5天的胚胎，并且TTF产生于长达一周龄的小鼠。逆转录病毒生成和MEF的感染将0ct4、Sox2、c-Myc(T58A突变型)和Klf4的cDNA克隆到逆转录病毒pMX载体中，并利用Fugene(Roche)转染入PlatE包装细胞系(Morita，S.；Kojima，T.和Kitamura，Τ.(2000)GeneTher7，1063-1066)。在转染后48h，将病毒上清液用于感染在ES培养基中培养的靶MEF。进行二至三轮的过夜感染，在7天之后将细胞分到经过辐射处理过的饲养细胞层上，并在标明的时间内用1μg/mL嘌呤霉素(Sigma)或300μg/mLG418(Roche)进行选择。细胞培养和体外分化在经过辐射处理过的小鼠胚胎成纤维细胞(饲养细胞)上，在标准ES培养基(补充有15%FBS、非必需氨基酸、L-谷氨酰胺、青霉素-链霉素、β-巯基乙醇和1000U/mLLIF的DMEM)中生长iPS细胞和ES细胞。为了标记用于胚泡注射的2D4iPS细胞，用Rosa-GFP-Neo靶向载体对细胞进行电穿孔，并用Southern印迹分析来验证。为了从Xgfp/X0ct4-NeoiPS细胞中产生亚克隆，将细胞用线性化pgk-Hygro质粒进行电穿孔。在脉冲处理之后24h，分别用G418(300yg/mL)或潮霉素(140μg/mL)开始进行选择。为了研究X染色体的状态，将iPS细胞在ES培养基中传代一次到涂有明胶的培养皿上来减少饲养细胞的数目，并用40ng/ml全反式视黄酸在缺乏LIF的ES培养基中诱导分化。为了分析X失活的随机性，一旦EB形成后就诱导分化。为了分离卵母细胞，将雌性嵌合体用PMS和hCG进行超数排卵，在注射hCG之后13小时分离卵母细胞。为了诱导单性生殖的活化，在补充有IOmM氯化锶和5μg/ml细胞松弛素B的无钙CZB培养基中培养卵母细胞五小时，然后在37°C、5%CO2下在KSOM培养基中进行培养。DNA整体甲基化Southern印迹分析用HpaII或MspI消化10μg的基因组DNA，并在0.8%琼脂糖凝胶上分离片段。将DNA印迹到HybondXL膜(AmershamBiosciences)上，并与如前所述的pMR150探针杂交(Meissner,A.；Gnirke,A.；Bell,G.W.；Ramsahoye,B.；Lander,Ε.S.禾口Jaenisch,R.(2005).NucleicAcidsRes33,5868-5877)。亚硫酸氢盐测序按照制造商的说明，利用EpiTect亚硫酸氢盐试剂盒(Qiagen)进行DNA的亚硫酸氢盐处理。引物序列如前所述；0ct4(Blelloch，R.；Wang，Ζ.；Meissner,Α.；Pollard,S.；Smith,Α.和Jaenisch,R(2006),StemCells24(9):2007_13)和Nanog(Takahashi和Yamanaka，2006)。扩增产物利用凝胶过滤柱进行纯化，然后克隆到pCR2.1-T0P0载体(Invitrogen)中，并用M13正、反向引物进行测序。RT-PCR分析为了检测来自内源性基因座的多能基因的表达，将总RNA用无DNA的试剂盒(DNA-freeKit)(Ambion,Austin,TX)处理，并按照制造商的说明，利用寡聚dT引物以Superscript第一链合成系统(Invitrogen)进行逆转录。全部的引物序列如表3所示。Western分析，免疫染色和碱性磷酸酶(AP)染色用于本文所述方法的抗体列于表3。利用VectorRed底物试剂盒(VectorLabs)进行碱性磷酸酶染色。按照Plath等人(2003)的方法进行免疫染色。FISH分析如前所述进行FISH(Panning，B.；Dausman，J.和Jaenisch，R.(1997)Cell90，907-916)。利用Cy3-dUTP(PerkinElmer)或FITC-dUTP(Amersham)和Bioprime试剂盒试剂(Invitrogen)，由随机引发分别从XistcDNA模板和包含17kbPgkl序列的基因组克隆中通过随机引物法产生Xist、Tsix和Pgkl双链DNA探针。在存在FITCUTP的条件下，通过体外转录从Xist外显子1和外显子6模板中产生特异性检测Tsix或Xist的链特异性RNA探针。当免疫荧光法之后进行FISH时，在FISH步骤开始前，用4%的多聚甲醛(PFA)固定细胞，并且封闭缓冲液包含lmg/ml的tRNA和RNA酶(RNAse)抑制剂。细胞融合按照制造商的说明，将四百万iPS细胞与四百万MEF混合，并用PEG-1500(Roche)进行细胞融合。在融合后24h，利用嘌呤霉素(lyg/mL)和潮霉素(140yg/mL)开始进行选择。就涉及Neo选择的试验而言，以300μg/mL使用G418。利用碘化丙啶在FACSCalibur(BD)上进行细胞周期分析；将信号面积用作DNA含量的量度。染色质免疫沉淀反应(ChIP)和微阵列杂交按照mm.upstate,com上的方案，用大约一百万细胞讲行全基因组范围的染饩质分析Chip。利用全基因组扩增试剂盒(Sigma)扩增IOng每一免疫沉淀反应的样品和相应的输入物(input)，并利用Bioprime试剂盒(Invitrogen)用Cy3或Cy5(PerkinElmer)标记2yg扩增原料。按照制造商的说明，向小鼠启动子阵列(Agilent-G4490)上进行杂交、冲洗和扫描。利用特征提取软件获取探针信号(对数比)，利用Chip分析软件的Lowess归一化来进行归一化，并如本文所述进行统计学分析。全基因组表达分析按照制造商的说明，将来自V6.5ES细胞、雌性NGiPMEF、由嘌呤霉素选定的2D4iPS细胞和由嘌呤霉素选定的对照NGiPES细胞的500ngRNA的两份平行样品利用Agilent低RNA扩增和单色标记试剂盒并使用Cy3进行扩增并标记。将标记的RNA杂交到Agilent小鼠全基因组阵列(G4122F)并进行分析。流式细胞计数法就嵌合体分析而言，按照如前所述将脾、胸腺和骨髓分离(Ye，Μ.；Iwasaki,H.；Laiosa,C.V.；Stadtfeld,M.；Xie,H.；Heck,S.；Clausen,B.；Akashi,K.禾口Graf,T.(2003)Immunity19,689-699)；将细胞用抗体染色，并用FACS进行分析。将0ct4_NeoXGFP/X尾尖成纤维细胞在两次连续传代时进行分类，并重新分析来证实纯GFP阴性细胞群。一旦EB发生分化，将细胞分类为GFP+/GFP-细胞群，并用于FISH分析。在BDFACSARIA(BDPharmingen)上获得细胞，并利用Flowjo软件(TreeStar公司)分析数据。畸胎瘤形成将每一细胞系的两百万细胞通过皮下注射到经过异氟烷麻醉的SCID小鼠的脊侧。在注射后三到四周回收畸胎瘤，在10%福尔马林中固定过夜，石蜡包埋，并用苏木精和曙红或用特定的抗体进行处理。在嵌合小鼠中GFP表达的组织学和免疫组织化学分析通过随后在4%PFA和20%蔗糖中培养组织，随后将其包埋在OCT化合物中，并在低温恒温器上切片(IOym厚)来得到冷冻切片。用Vectashield封固剂和DAPI盖住切片，然后直接目测GFP信号。iPS细胞产生的效率用12μg的四种因子(每种因子3μg)或用12μg总量的、混合比为13的GFP载体与空载体的混合物来转染病毒包装的PlatE细胞。将Nanog-GFPMEF接种于50%汇合度(confluence)处，并用来自所述包装细胞的上清液感染。在感染七天后，将四种因子感染的细胞以12的比例分到经过辐射处理过的饲养细胞上，并置于选择性(1μg/mL嘌呤霉素)或非选择性条件下。将GFP感染的细胞进行计数(5.3X106)并用FACS分析。将GFP+细胞的百分比(15%)作为用一种因子感染的频度，因此，四种因子全部感染的频度是0.154，得到2700细胞群的理论产量。在选择性条件下四周后，20个AP阳性puro-抗性细胞群形成，得到0.74%的效率。在非选择性的条件下，240个细胞群形成，得到9%的效率。染色质免疫沉淀反应使用对饲养细胞有依赖性的雄性ES细胞系V6.5(129/B16)、对饲养细胞无依赖性的雄性ES细胞系E14(129/ola)和来源于129/B16小鼠的原代雄性和雌性MEF，以及在嘌呤霉素存在下生长的2D4iPS细胞系。对V6.5和2D4细胞的情况，在不加入额外的饲养细胞的情况下进行细胞的最后传代来减少成纤维细胞污染。在这些条件下，所述细胞维持其未分化状态(图1，数据未显示)。将细胞在室温下与甲醛交联10分钟，随后在含有1%SDS、pH8.0的IOmMTris-EDTA中裂解，并15秒的脉冲、脉冲间隔为45秒在冰上超声处理6次。在4°C下，将澄清后的剪切染色质与H3me3K4(Abcam8580)或H3me3K27(Upstate07-449)的抗体进行免疫沉淀过夜，用蛋白A珠收集2小时，进行两次5分钟的冲洗，并用缓冲液(在Upstate网站上的配方)洗脱。将洗脱物反向交联，用RNA酶和蛋白酶K处理，并利用QiagenPCR纯化试剂盒纯化DNA。含有兔IgG抗体的ChIP未发现任何富集(数据未显示)。用组蛋白甲基化数据分析基因组的统计学方法以500bp窗口步进(window-step-wise)的方式获取平均探针信号。基于以500bp窗口的方式至少有50%的区域被探针覆盖的标准选择16339种基因。在ES细胞和MEF细胞之间H3me3K4模式和H3me3K27模式具有显著差异的基因被作为标签基因进行过滤。就每一基因而言，将在两种细胞类型之间组蛋白修饰模式的差异由16-窗口信号矢量的欧几里德距离进行定义。假定在两种ES细胞系或两种MEF细胞系之间的差异小，则将两种ES细胞系的自我距离(E14与V6.5的距离)和两种原代MEF细胞系(雄性(M)与雌性(F)的距离)的自我距离(self-distance)合并以形成零分布。将在X染色体和Y染色体上编码的基因从分析中排除。就所有的标签基因而言，任何ES-MEF对的距离(E14与M的距离；E14与F的距离；V6.5与M的距离V6.5与F的距离)必须大于先前定义的标签基因的阈值(SigT)，所述阈值为上述零分布的99%分位数(对应于0.01的ρ值)。为了将2D4细胞系中标签基因的甲基化模式分类为Es样基因(E类)、MEF样基因(M类)和中性基因(N类；对ES细胞或MEF不显示明显更强偏爱的基因)，用计算机计算了2D4和ES细胞之间的平均距离(2D4与ES的距离)以及2D4和MEF之间的平均距离(2D4与MEF的距离)。将偏爱得分(PreferenceScore)PS_2D4=(2D4与ES的距离-2D4与MEF的距离)用作在2D4细胞中特定基因的组蛋白甲基化模式如何强烈地“偏爱”的指标并推测模拟ES细胞模式。此外，以如下方式形成PS的零分布。将每个ES细胞系的数据组与另一个ES细胞系的数据组以及MEF的数据组相比较。用计算机计算并集中来自所有16339种基因的PS_ES(E14与V6.5的距离-E14与MEF的距离)和(V6.5与E14的距离-V6.5与MEF的距离)。将95%分位数用作E类阈值(ET)。将PS_2D4大于ET的任何标签基因称作“M类”。M阈值(MT)与E类定义相似。将PS-2D4落在MT和ET之间的基因称作“N类”。利用微软Excel中的correl函数，在不同细胞类型之间对8kb区域内每一500bp窗口计算其甲基化数据的皮尔森相关系数。基因表达分析利用特征提取软件(Agilent)获取表达数据。将原始数据进行log2转换，并将来源于相同基因的多个探针的信号进行平均。将每个阵列进行归一化以使平均值为0而标准偏差为1。将来自重复试验的数据进行平均。选择在MEF与ES细胞之间表达上有两倍改变的基因，结果确定有2473种基因(从共计33376种基因中)是在这两种细胞类型之间表达最为不同的。将无偏系统聚类法(unbiasedhierarchicalclustering)用于对这2473种基因针对ES细胞、MEF、由puro选定的NGiPES细胞和iPS细胞的表达模式进行分组。另夕卜，以ES与MEF的比例或者是iPS与MEF的比例来用计算机计算标签基因的表达模式，并与甲基化数据共同绘图。实施例1利用可被Nanog诜择的成纤维细胞产牛iPS细胞在内源性Nanog基因座中的携带GFP-IRES-Puro盒的雌性小鼠胚胎成纤维细胞(MEF)禾尔为Nanog-GFP-puro(Hatano,S.Y.；Tada,M.；Kimura,H.；Yamaguchi,S.；Kono,T.；Nakano,T.；Suemori,H.；Nakatsuji,N.和Tada，T.(2005)MechDev122，67-79)，将其用编码0ct4、Sox2、c-Myc-T58A突变型和Klf4的cDNA进行逆转录病毒感染，所述c_Myc_T58A突变型使所述蛋白保持稳定(Sears,R.；Nuckolls,F.；Haura,E.；Taya,Y.；Tamai,K.禾口Nevins,J.R.(2000)GenesDev14,2501-2514)。与以前报导的在感染之后3天进行的Fbxl5选择(Takahashi和Yamanaka，2006)相反，在感染之后3天Nanog表达的选择不产生细胞群，表明Fbxl5和Nanog基因的再活化动力学有所不同。当在感染之后7天或更多天进行选择时，可重现地出现抗性细胞群。在所扩展的五种细胞系(参见表1)中，两种细胞系保持同质性培养物，所述培养物看上去与ES细胞相同，并表达ES细胞表面标记物SSEAl和CD9(数据未显示)。相反，另外三种克隆在多次传代之后产生异质性培养物，所述培养物包含ES样细胞群以及迅速分裂的、小的圆形细胞的独立细胞群。将Nanog-GFP、SSEA-I和CD9进行FACS分类，随后亚克隆，足以除去这些圆形细胞，表明该细胞群与ES样细胞不同。有趣的是，两种同质性细胞系选择的起始发生在感染后三周，而异质性细胞系在感染后一周就已经历了选择，表明延迟的选择可能有利于获得更纯净的iPS细胞群。后来的研究集中在同质性ES样细胞系2D4和经再分类并亚克隆的细胞系1A2上，它们在本文中称为iPS细胞。逆转录病毒整合位点的Southern印迹分析显示在两种iPS细胞系中都存在所有的四种逆转录病毒编码的基因，并且基因组印记试验证实iPS细胞并非来源于稀少的原始生殖细胞，所述原始生殖细胞可能已存在于成纤维细胞培养物中(图9)。与由Fbx15选定的iPS细胞(Takahashi和Yamanaka,2006)相反，可被Nanog选择的iPS细胞显示不依赖于饲养细胞的生长，因为在没有饲养细胞和嘌呤霉素选择的条件下，其仍然保持ES样形态、Nanog表达和碱性磷酸酶(AP)活性(数据未显示)。撤去LIF引起所预计的向相似于原始内胚层的、表达GATA-4的细胞的分化(数据未显示)，并且所述分化作用伴随有Nanog表达的损失(数据未显示)。RT-PCR分析表明了来自内源性基因座的0ct4和Sox2的表达，伴随着另外的ES细胞标记物Nanog、ERas和Cripto的表达(图1A)。四种逆转录病毒表达基因的定量PCR分析表明在用各自的逆转录病毒感染的成纤维细胞中显示出较强的表达，但在同质性iPS细胞中得到了有效的沉默(图1C)。在iPS细胞和对照ES细胞之间，0ct4、Sox2、c-Myc和Klf4的蛋白水平相似(图1B)，并且免疫荧光法显示一旦发生视黄酸诱导的分化就有效地下调了0ct4和Sox2，证明病毒编码的转录因子基因在分化细胞中保持有效沉默(数据未显示)。将2D4iPS细胞注射入SCID小鼠，产生包含代表三个胚层特征的细胞类型的畸胎瘤，证实其多能性(数据未显示)。这些数据表明逆转录病毒表达的0ct4、Sox2、c-Myc和Klf4与Nanog再活化的选择相结合，可以产生与ES细胞有很多共同特性的iPS细胞。实施例2可被Nanog诜择的iPS细胞在体细胞上赋予ES细胞样表型为了确定可被Nanog选择的iPS细胞是否具有与ES细胞相似的功能属性，测试了在细胞融合的情况下，将ES样表型强加于体细胞的能力。细胞来自于嘌呤霉素抗性2D4iPS细胞系与潮霉素抗性MEF(图2A)。在融合之后两周，回收具有ES细胞样形态并继续表达Nanog-GFP的七种双倍抗性四倍体杂交克隆(图2B并且数据未显示)。当将对照Nanog-GFP-puroES细胞与潮霉素抗性MEF融合时，回收一种杂交细胞群。为了检测多能性，将杂交细胞注射到免疫功能低下的小鼠中；在四周之后，分离到包含代表所有三个胚层特征的细胞类型的畸胎瘤(数据未显示)。作为体细胞基因组重编程的检测，在内源性0ct4基因座(称为0ct4-NeO等位基因)控制下，用MEF重复融合试验，所述MEF包含组成性潮霉素抗性基因和新霉素选择性标记物。如果将G418用于初始的选择过程，则不能获得克隆，表明如同内源性Nanog基因座一样，体细胞0ct4基因座的重编程是一个逐步的过程。所以，在对所述嘌呤霉素/潮霉素抗性杂交体进行嘌呤霉素/G418选择之前，将其扩展来检测体细胞0ct4基因的再活化。所有的嘌呤霉素/潮霉素抗性细胞群都可在嘌呤霉素/G418选择下存活，表明体细胞基因组已经在内源性0ct4基因座上进行了重编程(数据未显示)。这些结果表明由Nanog选定的细胞类似于ES细胞，携带重编程的活性，并可赋予体细胞基因组以ES样状态。实施例3异位0ct4表达对于iPS细胞的维持而言是非必需的由Fbxl5选定的2D4iPS细胞显示了0ct4和Sox2的持续逆转录病毒表达，其从各自内源性基因座的表达可以忽略，表明对外源提供因子的持续需求来维持iPS细胞的自我更新和多能性(Takahashi和Yamanaka，2006)。为了证实表明在iPS细胞中有效逆转录病毒基因沉默的基因表达数据，决定利用在其基因组中携带强力霉素可诱导的0ct4转基因的成纤维细胞，就持续0ct4表达对于维持iPS细胞而言是否必需进行遗传检测(Hochedlinger，K.；Yamada,Y.；Beard,C禾口Jaenisch,R.(2005)Cell121,465-477)(图3A)。为了最初确定是否可利用0ct4可诱导的体系获得细胞群，将0ct4可诱导的MEF用Sox2、c-Myc和Klf4逆转录病毒感染而不进行任何选择。在没有强力霉素的条件下，没有回收到AP阳性细胞群，而在强力霉素存在的条件下，出现了几百个AP阳性细胞群，表明AP阳性细胞群的建立严格依靠转基因0ct4的表达(图3B)。随后，由携带0ct4可诱导的等位基因和0ct4-NeO等位基因的尾尖成纤维细胞(TTF)产生iPS细胞来证实所得到的细胞的重编程状态(图3A)。在强力霉素存在的条件下，用S0X2、c-Myc和Klf4感染靶细胞。基于上述观察的结果，延迟开始药物选择是有利的，尝试仅基于ES细胞样形态而不开始选择来建立iPS细胞群。在感染之后三周时，挑选48个独立的ES样细胞群，其中两个在连续存在强力霉素的条件下长成稳定的ES细胞样细胞系。重新铺板到G418培养基中之后，两个细胞系全部存活，表明内源性0ct4基因已经被再活化并已经产生了iPS细胞。重要的是，当将强力霉素从培养基撤去时，在存在G418的条件下，这些细胞可以传代很多次而不改变其生长行为或形态(数据未显示)。为了排除在没有强力霉素存在的条件下的病毒插入和畸变0ct4转基因活化作用的可能性，进行内源性和诱导性0ct4表达的定量PCR分析，以对在分化和诱导期间的表达水平进行分析(图3C)。未分化的iPS细胞显示出高水平的内源性0ct4表达，并且完全没有转基因的表达。在没有LIF存在的条件下0ct4水平下降，而一旦给予强力霉素时就再次出现，这分别表明内源性0ct4表达的下调具有分化依赖性而细胞对强力霉素的应答具有持续性(图3C)。形成分化良好的畸胎瘤的能力证明了这些细胞的多能性(数据未显示)。因此，由这四种转录因子足以将内源性0ct4基因座重编程以便在没有外源性0ct4表达的条件下保持iPS细胞的多能状态。t施例4在iPS细胞与ES细胞,少间，某因特异的、整体的DNA甲某化作用是相似尥基于重编程成纤维细胞的ES细胞样特性，讨论iPS细胞是否已获得类似于ES细胞的表观遗传状态。通过核移植或细胞融合进行的体细胞基因组的重编程伴随有表观遗传变化，例如在其启动子区域多能性基因的DNA脱甲基化(Cowan等人，2005；Tada等人，2001)。使用亚硫酸氢盐测序来评价0ct4和Nanog启动子的甲基化状态，之前已经显示所述启动子在由Fbxl5选定的iPS细胞中被不完全地脱甲基化(Takahashi和Yamanaka，2006)。在由Nanog选定的iPS细胞和ES细胞中，MEF中甲基化的两个启动子元件显示出脱甲基化作用，这表明这两个多能性基因的正确的表观遗传重编程(图4A)。此外，在通过iPS细胞与MEF融合产生的细胞杂交体中发生的Nanog启动子脱甲基化作用证实，iPS细胞具有重编程活性，并可以在分化细胞中诱导表观遗传变化。与雄性ES细胞和分化细胞相反，雌性ES细胞显示基因组的DNA整体低甲基化，其归因于两条活性X染色体(Xa)的存在(Zvetkova，I.；Apedaile,A.；Ramsahoye,B.；Mermoud,J.E.；Crompton,L.A.;John,R.；Feil,R.禾口Brockdorff，N.(2005)NatGenet37，1274-1279)。应用甲基化敏感限制酶试验，在2D4iPS细胞系中检测到微小卫星重复序列(minorsatelliterepeats)的整体低甲基化，这与雌性对照ES细胞类似(图4C)。这些结果表明iPS细胞获得了类似于雌性ES细胞的表观遗传状态。实施例5在雌性可被Nanog选择的iPS细胞中的X-失活在iPS细胞中的DNA整体低甲基化表明在雌性iPS细胞中非活性X染色体(Xi)发生了再活化。X-失活是在哺乳动物细胞中异染色质形成的最显著的实例之一，并且X-失活由两种非编码RNA(Xist及其反义转录物Tsix)所调节，Xist和Tsix为交互表达(Thorvaldsen,J.L.；Verona,R.I.和Bartolomei，Μ.S.(2006)DevBiol298，344—353)。未分化的雌性ES细胞携带两个Xa，并从两条X染色体上表达Tsix来抑制Xist的表达。一旦发生分化，在未来的Xi上，Xist变得强烈上调以诱导沉默，而Tsix消失，不存在于体细胞中。在Tsix样模式中表达Xite基因座，它是位于Tsix下游、对于X失活很重要的第三个基因座(Ogawa，Y.和Lee，J.Τ.(2003)MolCell11,731-743)首先利用荧光原位杂交(FISH)评价雌性Nanog-GFP-puroMEF中的X失活状态，以便分析XistRNA定位和X连接的基因表达。与Xi的存在相符，96%的成纤维细胞携带XistRNA包被的X染色体，并显示来自另一条X染色体的Pgkl基因的表达(数据未显示)。2D4iPS细胞系显示Xist、Tsix和Pgkl表达的模式很容易使人想起未分化的ES细胞(数据未显示)。也就是说，Tsix和Pgkl以高水平进行双等位基因(bi-allelically)表达而无法检测到XistRNA，证明两个Xa的存在。另外，RT-PCR分析在ES细胞和2D4iPS细胞中检测到来自的Xite基因座的转录物，而在亲代成纤维细胞群中则未检出(图5A)。一旦X失活开始时，就将特性染色质修饰施加于未来的Xi，其确保X-染色体的稳定沉默(Heard,Ε.(2005)CurrOpinGenetDev15,482-489；Ng,K.；Pullirsch,D.；Leeb,M.和Wutz，A.(2007)EMBORep8,34-39)将免疫荧光用于分析在iPS细胞中Xi连接的染色质修饰的存在。对于在赖氨酸27处发生三甲基化的组蛋白H3、在赖氨酸20处发生单甲基化的组蛋白H4以及负责调控H3K27三甲基化的Polycomb组(PcG)蛋白Ezh2，雌性Nanog-GFP-puroMEF显示Xi样富集的期待频率。相反，iPS细胞如同ES细胞，对于没有Xi样富集的这些染色质标记物显示出大量而均一的核染色(数据未显示)。总的来说，这些数据表明四种转录因子与Nanog选择结合起来足以诱导Xi的转录再活化，足以重置对调控X失活必要的三种非编码转录物的表达模式，并且足以除去特异于Xi的染色质修饰。然后，检测2D4细胞是否一旦分化就会经历X失活。与iPS细胞使其X之一沉默的能力一致，在经历视黄酸诱导的分化的2D4iPS细胞中，检测到XistRNA包被的X-染色体(数据未显示)。所述Xist包被的X-染色体显示与RNA聚合酶II没有重叠，这与该X的沉默状态是一致的(数据未显示)。此外，类似于分化的雌性ES细胞，一旦X失活开始时，在iPS细胞中XistRNA包被的X-染色体通常与H3me3K27及其甲基转移酶Ezh2的富集区域几乎相一致(图5B)。在Xi上Ezh2积聚和H3me3K27富集的一致是X失活早期的标志(Plath，K.；Fang,J.；Mlynarczyk-Evans,S.K.；Cao,R.；fforringer,K.A.；Wang,H.；delaCruz,C.C.；Otte,A.P.；Panning,B.禾口Zhang，Y.(2003)Science300,131-135；Silva,J.；Mak,W.；Zvetkova,I；Appanah,R.；Nesterova,Τ.B.；Webster,Ζ.；Peters,Α.H.；Jenuwein,Τ.；Otte,Α.P.和Brockdorff，N.(2003)DevCell4，481-495)。因此，在雌性iPS细胞中X染色体失活显示出与在雌性ES细胞中相同的动力学。实施例6在分化的iPS细胞中随机的X失活在胚胎外系统和早期预植入胚胎中，非随机地发生X染色体失活，而在外胚层和分化中的ES细胞中，其是随机的。在克隆的小鼠胚胎中X失活的分析显示在核移植期间将体细胞Xi重编程以便在胚细胞中发生随机的X失活，而将Xi的记忆维持在胚胎外组织中，在胚胎外组织中Xi的记忆代替了配子印记(Eggan等人，2000)。为此，对转录因子诱导的重编程是否可以消除体细胞性失活的Xi的记忆从而使得在分化中的iPS细胞中发生随机的X失活进行检测。因为不可能区分在可被Nanog选择的2D4iPS细胞中的两条X染色体，所以iPS细胞由携带X-连接的报告子转基因(XeFP)的雌性成纤维细胞产生，所述报告子转基因具有驱动绿色荧光蛋白(GFP)表达的巨细胞病毒启动子(Hadjantonakis，Α.K.；Gertsenstein,M.；Ikawa,M.；Okabe,Μ.和Nagy，A.(1998)NatGenet19，220—222)(图6A)。该报告子受X-失活作用而沉默，并因而容许在分化中的iPS细胞中测定沉默的X染色体。TTF分离自对GFP转基因呈杂合的雌性小鼠，并携带0ct4-NeO等位基因。与在成纤维细胞群中随机的X失活一致，34%的TTF细胞为GFP阳性(XaGFP/Xi)，而66%的TTF细胞为GFP阴性(XieFP/Xa)(图6A，数据未显示)。预计到X失活的少许偏离，并可能在两条X染色体的遗传背景中反映出差异。用编码四种转录因子的逆转录病毒感染由两轮FACS分类分离的GFP阴性细胞，并且基于GFP再表达来筛选所产生的ES样细胞群中XiGFP的再活化。分离四个完全呈绿色的细胞群，也发现一旦重新铺板后就对G418具有抗性，因而表明除了沉默X染色体再活化之外的0ct4基因座的活化作用。Xist和Tsix表达的ES细胞样模式证实了X重编程(数据未显示)。假定这些雌性iPS细胞如同ES细胞，当在培养物中持续保存时具有失去X的倾向，将XawpXaiPS细胞亚克隆以确保对纯系的iPS克隆细胞群X失活的随机性进行分析。通过胚状体形成诱导亚克隆的分化，然后用FACS将分化细胞分为GFP阳性和GFP阴性细胞群，并用FISH分析(图6A)。与X失活的随机模式一致，平均38%的细胞是GFP阳性，而62%的细胞是GFP阴性，两种细胞群的大多数都具有与Xi的XistRNA包被一致的Xist信号(数据未显示)。随机X失活证实，鉴别体细胞中的活性X染色体(Xa)和Xi的表观遗传标记物一旦在体外重编程后即可除去，并一经随后的体外分化后，即可在任一X上重建。实施仿I丨7在iPS细胞冲_蛋白甲某仆Jt式的_体重编禾早然后，讨论除了0ct4和Nanog启动子的DNA脱甲基化和Xi的再活化之外，在iPS细胞诱导期间整个成纤维细胞基因组是否已经被表观遗传性地重编程为ES样状态。在哺乳动物发育和细胞分化期间，组蛋白甲基化在基因表达的表观遗传调控中起重要的作用。通常，所转录的基因与H3K4三甲基化有关(BernsteinB.Ε.；Kamal,Μ.；Lindblad-Toh，K.；Bekiranov,S.；Bailey,D.K.；Huebert,D.J.；McMahon,S.；Karlsson,Ε.K.；Kulbokas,Ε.J.,3rd；Gingeras,Τ.R.等人(2005)Cell120,169-181；Kim,Τ.H.；Barrera,L.0.；Zheng,Μ.；Qu,C.；Singer,Μ.Α.；Richmond,Τ.Α.；ffu,Y.；Green,R.D.禾口Ren，B.(2005)Nature436，876-880)，而很多沉默基因与H3K27三甲基化有关(Boyer，L.Α.；Plath,K.；Zeitlinger,J.；Brambrink,T.；Medeiros,L.A.；Lee,Τ.I.；Levine,S.S.；ffernig,M.；Tajonar,A.；Ray,Μ.K.等人(2006)Nature441(7091):349_53；Lee,Τ.I；Jenner,R.G.；Boyer,L.Α.；Guenther,Μ.G.；Levine,S.S.；Kumar,R.Μ.；Chevalier,B.；Johnstone,S.Ε.；Cole,Μ.F.；Isono，K.等人(2006)Cell125(2):301_13)。应用染色质免疫沉淀反应，在由Nanog选定的2D4iPS细胞系、雌性和雄性MEF和两种雄性ES细胞系中进行K4和K27三甲基化的全基因组定位分析，随后与小鼠启动子阵列杂交。在该阵列上的探针覆盖了从转录起始位点上游-5.5kb到下游+2.5kb的大约16，500个基因。为了确定2D4iPS细胞系与ES细胞更为相似还是与MEF更为相似，界定了在组蛋白甲基化模式方面在ES细胞和MEF之间明显不同的一组基因。在高严格性(ρ=0.01)下，将957个基因确定为在ES细胞和MEF之间不同，并归类为“标签”基因(参见试验步骤)。值得注意的是，在20415细胞中，94.4%的标签基因携带着与ES细胞基本一致的甲基化模式(E类基因)，而仅有0.7%的基因以更类似于MEF样模式进行甲基化(M类基因)。由于差异太小不足以产生显著性差异(数据未显示)，故将基因座剩余的4.9%分入N类基因(中性)。即使当严格性降低到ρ=0.05以包含更大的标签基因组时，iPS基因座的大多数(91%)仍保持在E类中(数据未显示)。如随机排列的检测所证实，分布到E、M和N基因中是具有高度显著性的(图10)。在甲基化模式上，属于非标签类的基因显示在MEF、ES细胞和iPS细胞之间几乎没有差别(数据未显示)，表明iPS细胞系在ES细胞或MEF中均未发现获得全新的表观遗传同一性。总的来说，这些结果表明体外重编程可以将成纤维细胞基因组的表观遗传记忆逆转成与ES细胞高度相似的方式。在尝试确定K4和K27甲基化模式在重编程期间是否重置到不同程度的过程中，分别针对在阵列上的全部16，500个基因的每个甲基化标记计算了皮尔森相关性(图7A)。该分析显示iPS细胞和ES细胞在其K27甲基化模式方面相似，如同两个ES细胞系彼此相似那样，而MEF则明显不同于来自iPS和ES细胞的相同程度。有趣的是，在所有细胞类型之间K4甲基化更相似，表明重编程主要与K27而不是K4三甲基化的改变有关。来自该整体分析的一个预测是在K27甲基化方面的改变应该在E类标签基因中较为显著。为了检测这一点，在所有可能的细胞类型之间沿着8kb启动子区以500bp间隔进行成对方式的相关性分析，就每一比较而言产生16个相关值(图7B)。沿着整个分析区域，在ES细胞和2D4iPS细胞之间，归类为E基因的基因在其K4和K27甲基化模式中确实非常相似，而MEF与这两种细胞类型却始终显著不同。在整体相关性进一步的一致性上，与K4甲基化相比，K27甲基化在MEF和ES/iPS细胞之间更显著地不同。基于前述在鼠ES细胞中发育基因是PcG介导的K27甲基化的最重要的靶群的观察(Boyer等人，2006)，决定检测这些基因座是否富集于标签基因内。实际上，基因本体论分析显示，发育基因是在E类标签基因中最显著富集的基因群(P=Sxe"10)。这些发现表明与K4甲基化方面的改变相比，K27甲基化方面的改变对于从MEF重编程到iPS细胞更为显著，并且表明PcG蛋白在重编程中的重要作用。为了检测iPS与ES细胞组蛋白甲基化模式的相关性是否如实地捕捉到在iPS细胞的转录状态中的改变，应用Agilent微阵列以全基因组的水平对ES细胞、2D4iPS细胞和MEF进行表达分析。如通过皮尔森相关性所测定的，在整体水平上，ES和iPS细胞在表达模式上显示了极高的相关性(图IlA和11B)。在ES细胞和MEF之间在表达上具有两倍以上差异的基因在ES和iPS细胞之间几乎同等表达(数据未显示)。因此，这些数据表明，如由表观遗传数据所预料的那样，iPS细胞在转录上与ES细胞完全具有可比性。通过实时RT-PCR证实了随机选择的13个标签基因子集的水平(图11C)。所有的检测基因在iPS细胞和ES细胞中以相似的水平表达。在ES、iPS细胞和MEF之间标签基因表达的差异与组蛋白甲基化模式中观察到的差异紧密相关(数据未显示)，表明K4和K27甲基化是那些基因表达状态的重要决定因素。总的来说，这些数据证明由四种转录因子的核重编程可以诱导成纤维细胞基因组的整体转录和表观遗传的重置。实施例8来源于MEF和TTF的iPS细胞分化为包括生殖细胞在内的很多细胞类型推测iPS细胞的可靠表观遗传重编程将会产生可与ES细胞相比的发育潜能。将来源于GFP标记的MEF的2D4iPS细胞注射到二倍体胚泡中，产生具有明显GFP荧光的三个新生嵌合体(图8A，表2)。来自新生幼崽的组织切片显示iPS细胞广泛地促成软骨、腺体结构、肝、心脏和肺的无性繁殖(clonal)(数据未显示)。来源于新生幼崽的造血细胞的FACS分析显示脾脏的B细胞和巨噬细胞以及胸腺的⑶4+和⑶8+T细胞的18-28%都来源于iPS细胞(图8B)。此外，可能从该嵌合幼崽中分离来源于iPS细胞的尾部成纤维细胞和神经球(neurosphere)培养物，与来源于宿主的成纤维细胞和神经球相比，其显示出相似的生长速率和细胞因子依赖性(数据未显示)。发育到成熟期的一个嵌合体显示毛色嵌合性，表明iPS细胞分化为功能性黑素细胞(图8C)。然后讨论除了来源于MEF的iPS细胞之外，来源于雌性TTF的iPS细胞是否也可以支持发育。将基于XieppR基因的再表达来选择的两个不同的iPS克隆进行胚泡注射，每一细胞系产生一个产后(postnatal)动物(参见表2)。嵌合动物显得健康，并正常生长为成年鼠。这些结果表明来源于TTF的iPS细胞同来源于胎儿成纤维细胞的iPS细胞一样，产生外表正常的产后嵌合体。生殖系转化被认为是细胞多能性的最严格检测之一。为了评估来源于XiGFP/XTTF的iPS细胞是否促成生殖系，将16个卵母细胞从一个超排卵iPS嵌合体中分离出来，其中4个是明显的GFP阳性，表明iPS细胞促成雌性生殖系(数据未显示)。用氯化锶和细胞松弛素B对这些卵母细胞的处理产生成功的孤雌激活作用，并随后裂解进入胚泡阶段，因而证明卵母细胞的功能性(数据未显示)。ES细胞直接分化为成熟细胞类型具有明确的治疗潜能。为了测定iPS细胞在体外是否产生成熟细胞，产生EB并将其外植到培养物中来诱导造血细胞死亡。实际上，检测到细胞类型表达未成熟和成熟的血细胞的标记物，因而显示iPS细胞在再生药品中的应用前景(图12)。直接从成纤维细胞培养物中产生多能细胞，表明对于理解支配核重编程的机制获得重大进展(Takahashi和Yamanaka，2006)。本文提供了第一个证据，即基因组的可靠表观遗传重置伴随有转录因子诱导的重编程。回收在表观基因组方面与ES细胞非常相似的iPS细胞。例如，雌性iPS细胞显示在关键多能性基因的启动子上正确的脱甲基作用，其使一旦分化就经历随机X失活的、体细胞性沉默的X染色体再活化，并且其具有与ES细胞大致相同的组蛋白整体甲基化模式。iPS细胞还显示了其它的ES样特性，包括生长因子应答性、在细胞融合中作为重编程供体的能力、以及在体外和体内均经历ES样分化的能力，促成高级的产后嵌合体包括一个生殖系嵌合体。对于维持iPS细胞不需要转基因0ct4表达的发现表明，内源性基因表达程序已经足以再活化以确保维持多能性。这表明0ct4以及同时可能的Sox2、c-Myc和Klf4的外源性表达可能仅仅在重编程的起始步骤期间对于触发产生多能性的转录和表观遗传变化是必需的。支持这个观点的是，这四种因子的逆转录病毒表达在感染的供体成纤维细胞中较高，而在iPS细胞中沉默。因此，可将这四种因子短暂地供给体细胞，产生不包含逆转录病毒或转基因元件的稳定重编程细胞，其可分别导致插入性诱变或基因表达假象。令人惊讶的是，由Nanog选定的iPS细胞在表型和分子上不同于此前报导的由Fbxl5选定的iPS细胞。Nanog对胚胎发育是必不可少的，并且对于通过抑制分化为原始内胚层而维持多能性是需要的(Chambers,I.；Colby,D.；Robertson,Μ.；Nichols,J.；Lee,S.；Tweedie,S.禾口Smith，Α.(2003)Cell113,643-655；Mitsui,K.；Tokuzawa,Y.；Itoh,H.；Segawa,K.；Murakami,Μ.；Takahashi,K.；Maruyama,Μ.；Maeda,Μ.禾口Yamanaka,S.(2003)Cell113，631-642)。相反，尽管Fbxl5在ES细胞中唯一表达，但其对于多能性(Tokuzawa,Y.；Kaiho,Ε.；Maruyama,Μ.；Takahashi,K.；Mitsui,K.；Maeda,Μ.；Niwa,H.和Yamanaka，S.(2003)MolCellBiol23,2699-2708)。虽然不希望受理论的约束，但是对于在由Fbxl5选定的iPS细胞和本文所述的iPS细胞之间定性的差异存在几种可能的解释。一种可能性是与Fbxl5选择相比，Nanog选择产生具有更大发育潜能的不同的多能细胞类型。与之相一致，大多数由Fbxl5选定的iPS细胞不表达Nanog(Takahashi和Yamanaka，2006)，这可以解释为什么在没有MEF存在的条件下其不适当地分化，并且没有产生足龄的嵌合体。进一步支持此观点的是观察到在并非所有0ct4表达细胞对于正常ES细胞培养物中的Nanog呈阳性，表明在ES细胞群内的异质性(Hatano等人，2005)。有趣的是，来源于其中的ES细胞的胚泡的内部肥大细胞对于0ct4和Nanog显示相似的异质性表达模式(Chazaud,C.；Yamanaka，Y.；Pawson,T.禾口Rossant，J.(2006)DevCell10，615-624)。仍然不希望受理论的约束，对于Nanog选择在生成的iPS细胞的质量上的作用的替代性解释可以是Nanog蛋白本身在可靠的表观遗传重编程上起决定性的作用。与这个观点相一致，在ES细胞和体细胞之间的细胞融合试验显示当在ES细胞中过表达Nanog时，产生200倍数量的细胞群(Silva，J.；Chambers,I；Pollard,S.禾ΠSmith，Α.(2006)Nature441,997-1001)。虽然Nanog对于在体细胞中诱导多能性不是必需的，但是其在评估在重编程过程中，Nanog的过表达是否增强获得iPS细胞的效率以及Nanog是否影响iPS细胞的发育能力方面是有益的。仍然不希望受理论的约束，在此前报导的iPS细胞与本文所述的iPS细胞之间所观察到的差异的另一个可能性可能是选择的时机。当在感染后三天进行选择时，不可能从Nanog-GFP-puroMEF中得到iPS细胞，可将其与Yamanaka及其同事的发现相对比，他们能够在这个时机进行Fbxl5表达的选择。因此，在感染后一周开始选择，或仅仅基于ES细胞形态或沉默X连接的GFP转基因的再活化来分离iPS细胞，随后应用0ct4-NeO等位基因对多能性进行追溯性的证实。根据嵌合分布和ES细胞样表观遗传特征，所有没有进行初始药物选择所得到的iPS细胞显得比此前报导的由Fbxl5选定的iPS细胞更好。假定重编程是需要花费几天或几周的逐步过程，并取决于需要再活化的基因的级联。在这种推测下，在核重编程期间，Nanog再活化可能比Fbxl5再活化发生得更晚。因此，Fbxl5的早期选择可能使还没有完成核重编程的细胞群扩展，从而除去了将在重编程过程中更晚出现的、潜在的更好的重编程细胞；对于Nanog的较晚选择可能达到重编程更完全的阶段。探索该假说的一种方式是检测对于Fbxl5表达的较晚选择是否产生与ES细胞更相似的iPS细胞。对于ES样细胞群的形态学选择而非药物选择可足以获得iPS细胞的观察对于人体内的直接重编程具有重要意义，因为将报告子转基因导入人细胞是技术上的挑战，并可能导致插入性诱变。将细胞直接重编程为多能性具有明确的治疗含义，并且因此其对于确定iPS细胞是否如ES细胞一样以相同的表观遗传状态存在至关重要。这些数据表明异常的表观遗传重编程不应损害直接重编程细胞的治疗效用。实施例9可在没有选择的条件下产生人iPS细胞用四种(0Ct4、SOX2、C-MyC、Klf4)或五种(4+Nanog)重编程因子感染患者特异性的成纤维细胞或角质化细胞，所述重编程因子由四环素可诱导的慢病毒系统表达。所述病毒与表达逆四环素反式激活因子(rtTA)的慢病毒共感染。将细胞传代至饲养细胞上，并用强力霉素诱导；在前3天将所述细胞保持在成纤维细胞培养基中，然后转为人ES细胞条件。在4天之内，小的细胞群样结构变为可见；到第30天，具有人ES细胞形态的细胞群出现，且具有明显的hES样鹅卵石外形(数据未显示)。还出现了具有非hES细胞形态的细胞群，但是不妨碍hES样细胞群的产生。将所述hES样细胞群进行挑选、扩展并表征。如同人ES细胞一样，其具有多能性(形成畸胎瘤)，表达关键的多能性基因，并显示出表观遗传修饰的正确重置。另外，其还使慢病毒转基因沉默。将所有参考文献，包括在本说明书中引用的任何专利或专利申请以及附图和表格并入本文作为参考。本文并未承认任何参考文献构成现有技术。对参考文献的讨论陈述了各自作者的主张，而本申请人保留对所引用文献的准确性和相关性进行质疑的权利。可以清楚地理解，虽然本文涉及了很多现有技术出版物，但是该引用不构成对于这些文献的任何一篇成为在美国或在其它任何国家中本领域公知常识的一部分的认可。表1.表Si.获得的iPS细胞系一览表<table>tableseeoriginaldocumentpage26</column></row><table>*将细胞根据GFP、SSEA-I和⑶9分成三类，然后亚克隆获得纯系稳定的ES样细胞群。**在分成三类之后进行的分析；ND=未进行测定。表2.表S2.在来源于iPS细胞的小鼠中，足孕发育的效率和估计的嵌合度<table>tableseeoriginaldocumentpage27</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage28</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage29</column></row><table>=I=OgawaY.禾口Lee.J.T.Xite,X-inactivationintergenictranscriptionelementsthatregulatetheprobabilityofchoice.Mol.Cell.200311:731_743。表3.续<table>tableseeoriginaldocumentpage29</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage30</column></row><table>权利要求一种选择诱导性多能干细胞的方法，所述方法包括(a)将分化的原代细胞重编程为多能表型，其中，当用RT-PCR测定时，所述分化的原代细胞不表达NanogmRNA；(b)重编程之后，在没有选择试剂存在的条件下，培养步骤(a)中所述重编程的细胞；(c)用显微镜观察步骤(b)的培养物，并分离所述培养物中在外观上已经变得光滑且呈圆形的细胞克隆；以及(d)检测所述克隆的细胞对干细胞标记物的表达；其中，将干细胞标记物表达的检出作为所述细胞为诱导性多能干细胞的指示。2.如权利要求1所述的方法，其中，所述重编程包含下列之一将编码转录因子0ct4、Sox2、c-Myc和Klf4的核酸序列导入所述分化的体细胞中，所述序列可操作地连接至用于表达所述因子的调节元件；导入重编程所述细胞分化状态的一个或多个蛋白因子；以及将所述细胞与诱导所述细胞分化状态重编程的小分子相接触。3.如权利要求1所述的方法，所述方法进一步包含将表达干细胞标记物的所述克隆的细胞导入裸鼠中，并对由所述细胞产生的肿瘤进行组织学研究的步骤，其中，包含来自所有三个胚层的细胞的肿瘤生长进一步表明所述细胞为多能干细胞。4.如权利要求1所述的方法，其中，所述的培养步骤进一步包括将所述细胞进行传代。5.如权利要求1所述的方法，其中，所述分化的体细胞具有明显不同于ES细胞的形态。6.如权利要求1所述的方法，其中所述分化的原代细胞为成纤维细胞，并且，其中在所述重编程之前，所述的成纤维细胞是扁平且不规则的形状。7.如权利要求1所述的方法，其中，所述干细胞标记物选自于由SSEA1、⑶9、Nanog,Fbxl5、Ecatl、Esgl、Eras、Gdf3>Fgf4>Cripto、DaxUZpf296、Slc2a3、RexUUtfl禾口0ct4所组成的组。8.如权利要求1所述的方法，所述方法进一步包括当所述分化的原代细胞来自于雌性个体时，检测所述克隆的细胞对非活性X染色体再活化的步骤。9.如权利要求2所述的方法，其中，所述核酸序列包含在病毒载体或质粒中。10.如权利要求9所述的方法，其中，所述病毒载体为逆转录病毒载体、慢病毒载体或腺病毒载体。11.如权利要求1所述的方法，所述方法进一步包含检测所述克隆的细胞对外源性0ct4、Sox2、c-Myc和/或Klf4表达的步骤。12.如权利要求1所述的方法，其中，所述细胞包括人细胞。13.一种选择诱导性多能干细胞的方法，所述方法包括(a)提供对X染色体上的选择性标记物呈杂合的雌性细胞，其中所述选择性标记物是在活性X染色体上的突变型以及非活性X染色体上的野生型，并且，其中当用RT-PCR测定时，所述细胞不表达NanogmRNA；(b)将所述细胞重编程为多能表型；(c)用选择试剂培养所述细胞，其中，所述的非活性X染色体的再活化容许野生型选择性标记物的表达，并容许细胞在所述选择试剂存在的条件下存活，由此存活的细胞为诱导性多能干细胞。14.如权利要求13所述的方法，所述方法进一步包含检测在所述选择试剂存在的条件下存活的细胞对干细胞标记物表达的步骤。15.如权利要求14所述的方法，其中，所述干细胞标记物选自于由SSEA1、⑶9、Nan0g、Fbxl5、Ecatl、Esgl、Eras、Gdf3>Fgf4>Cripto、DaxUZpf296、Slc2a3、RexUUtfl禾口0ct4所组成的组。16.如权利要求13所述的方法，其中，所述重编程包含下列之一将编码转录因子0ct4,Sox2,c-Myc和Klf4的核酸序列导入所述分化的体细胞中，所述序列可操作地连接至用于表达所述因子的调节元件；导入重编程所述细胞分化状态的一个或多个蛋白因子；以及将所述细胞与诱导所述细胞分化状态重编程的小分子相接触。17.如权利要求13所述的方法，所述方法进一步包含将在选择试剂存在的条件下存活的细胞导入裸鼠中，并对由所述细胞产生的肿瘤进行组织学研究的步骤，其中，包含来自所有三个胚层的细胞的肿瘤生长进一步表明所述细胞为多能干细胞。18.如权利要求13所述的方法，其中，所述细胞为细胞系的细胞。19.如权利要求13所述的方法，其中，所述细胞对X染色体上的突变Hprt基因呈杂合。20.如权利要求19所述的方法，其中，所述细胞在导入所述核酸之前为非活性的X染色体上携带野生型Hprt基因，并在所述重编程之前为活性的X染色体上携带突变非功能性Hprt基因。21.如权利要求13所述的方法，其中，所述细胞在所述重编程之前对6-硫代鸟嘌呤有耐受性。22.如权利要求13所述的方法，其中，所述选择试剂包含HAT培养基。23.如权利要求13所述的方法，其中，所述细胞包括人细胞。24.一种选择诱导性多能干细胞的方法，所述方法包括(a)提供携带X染色体连接的报告子基因的雌性细胞，所述报告子基因通过X失活而沉默，并且，其中当用RT-PCR测定时，所述雌性细胞不表达NanogmRNA；(b)将所述细胞重编程为多能表型；(c)在所述重编程之后培养所述细胞；以及(d)从表达所述X染色体连接的报告子的所述培养物中分离细胞克隆；其中，将所述报告子的表达作为所述克隆包含诱导性多能干细胞的指示。25.如权利要求24所述的方法，所述方法进一步包含检测所述克隆的细胞对干细胞标记物表达的步骤。26.如权利要求25所述的方法，其中，所述干细胞标记物选自于由SSEA1、⑶9、Nan0g、Fbxl5、Ecatl、Esgl、Eras、Gdf3>Fgf4>Cripto、DaxUZpf296、Slc2a3、RexUUtfl禾口0ct4所组成的组。27.如权利要求24所述的方法，所述方法进一步包含将表达所述报告子的细胞导入裸鼠中，并对由所述细胞产生的肿瘤进行组织学研究的步骤，其中，包含来自所有三个胚层的细胞的肿瘤生长进一步表明所述细胞为多能干细胞。28.如权利要求24所述的方法，其中，所述细胞包括人细胞。全文摘要本发明公开了在发育重编程期间对小鼠和人的多能干细胞的产生进行选择的方法。本发明所述的方法涉及选择诱导性多能干细胞，即无需遗传选择，即可从分化细胞中产生或诱导出多能干细胞。本发明所述内容为用于基于(1)细胞群形态或(2)在雌性细胞中X染色体再活化来选择重编程细胞的特定实施方式。文档编号C12N5/074GK101802172SQ200880101024公开日2010年8月11日申请日期2008年5月30日优先权日2007年5月30日发明者尼梅特·马赫拉里,康拉德·霍希德林根申请人:通用医疗公司;哈佛大学校长及研究员协会