遗传修饰的光合生物的高通量筛选的制作方法

专利名称：：遗传修饰的光合生物的高通量筛选的制作方法遗传修饰的光合生物的高通量筛选交叉参考本申请要求下列美国临时申请的优先权和权益=Mayfield等人于2007年6月1日提交的标题为“使用光合生物产生生物燃料”的USSN60/941，452；Mayfield等人于2008年3月20日提交的标题为“使用遗传修饰的生物产生生物质降解酶”的USSN61/070，384;以及Mayfield等人于2008年3月20日提交的标题为“高通量筛选遗传修饰的光合生物”的USSN61/070,437。这些在先申请中的每一个通过引用并入本文。参考并入本说明书提及的所有公开和专利申请通过引用并入本文，其程度如同每个单独的公开或专利申请被具体并单独地指出通过引用并入。
背景技术：
：燃料变得越来越昂贵。同时，燃料精制与污染物的产生和全球温室效应相关。在工业中存在寻找更廉价、更安全以及对环境更加无害的方式产生燃料的日益增加的需要。从生物原料产生燃料的方法的开发是未来能源蓝图的主要部分。从生物原料生产燃料的最重要的因素之一是将某些分子结构例如纤维素消化或还原为可公认为用于燃料产生方法例如发酵的底物的分子种类的能力。分子生物学和基因工程有希望用于大量生物活性分子的生产，所述生物活性分子可用于产生这些燃料。例如，生产能够将有机原料分解为燃料的酶有希望解决对可选的燃料增加的需要。使用基因工程技术用于产生这些酶的主要优势是该方法能够产生大量所期望的蛋白。在许多情况下，从非工程化分泌来源获得足量生物原料的仅有的其它方法是通过从产生该试剂的生物的细胞纯化自然发生的生物原料。因此，在基因工程到来之前，能够降解有机原料的酶只能通过大量培养生物，通常为细菌或真菌物种并提取蛋白来分离。对于用于燃料生产，这些方法通常是复杂的并且经济上受限制的。虽然基因工程提供方法以产生大量生物原料，特别是蛋白和核酸，但是对目前可用的方法有局限性。细菌提供适合于产生这种酶的环境；但是，一些细菌产生的副产品会污染燃料源。因此，即使细菌可用于产生生物原料，可能需要另外的步骤例如纯化或精制以获得生物活性原料和/或生物燃料。而且，非光合系统的使用需要添加昂贵的糖类或其它有机碳源以饲养重组生物。另外，通常存在与建造发酵罐相关的大量的资金投资。重组蛋白还可在真核细胞中产生，包括例如，真菌、昆虫细胞和哺乳动物细胞，其可提供必要的环境将表达的蛋白加工为生物活性剂。但是，这些系统通常要承受同样的成本限制(糖类/有机碳源和发酵罐)。因此，存在这样方法的需要以方便地产生具有生物活性的酶，该方法可产生大量酶和/或提供与产生降解酶相容的宿主生物。发明概述本文提供的是用于产生生物质降解酶和生物燃料的组合物和方法。本文公开的发明提供用于产生生物质降解酶的新的方法，其通常在遗传修饰的光合生物例如藻类和蓝细菌中。本文还提供的是用于转化光合生物的组合物和方法以及筛选转化子的方法。因此，本发明的一方面提供载体，其包括编码生物质降解酶的核酸和设置用于在非维管光合生物中表达核酸的启动子。本发明的载体可含有编码多于一种的生物质降解酶的核酸，以及在其它情况下，可含有编码共价连接生物质降解酶的多肽的核酸。生物质降解酶可包括分解纤维素的酶、分解半纤维素的酶和分解木质素的酶。更具体地，生物质降解酶可以是外切_β_葡聚糖酶、内切_β_葡聚糖酶、β“葡糖苷酶、内切木聚糖酶或木质酶。编码生物质降解酶的核酸可源自真菌或细菌来源，例如，那些编码绿色木霉(Trichodermaviride)中外切-β-葡聚糖酶、里氏木霉(Trichodermareesei)中外切-β-葡聚糖酶、棘孢曲霉(Aspergillusaculeatus)中外切-β-葡聚糖酶、里氏木霉中内切-β-葡聚糖酶、黑曲霉(Aspergillusniger)中内切-β-葡聚糖酶、里氏木霉中β-葡糖苷酶、黑曲霉中β-葡糖苷酶、里氏木霉中内切木聚糖酶和黑曲霉中内切木聚糖酶的核酸。其它编码生物质降解酶的核酸可以是与来自这些生物的基因同源。本发明的载体还可含有选择标记，使得能够直接筛选转化的生物。本发明的载体可以能够在多种光合生物中稳定转化，这些光合生物包括但不限于光合细菌(包括蓝细菌(cyanobacteria))(cyanophyta)(prochlorophyta)(rhodophyta)藻(chlorophyta)、不等If更毛藻(heterokontophyta)、tribophyta、灰@藻(glaucophyta)>chlorarachniophytes、果藻(euglenophyta)、类目艮虫(euglenoids)、If更藻(haptophyta)>金藻(chrysophyta)、β急藻(cryptophyta)、β急滴虫(cryptomonads)、甲藻(dinophyta)、双Ii更·(dinoflagellata)>IiI^(pyrmnesiophyta)>±^(bacillariophyta)>Jt^(xanthophyta)>eustigmatophyta>ft"Ife^(raphidophyta)(phaeophyta)禾口i^iH^S物(phytoplankton)。本发明的其它载体能够在莱茵衣藻(C.reinhardtii)、盐生杜氏藻(D.salina)或雨生红球藻(H.pluvalis)中稳定转化。还有其它载体含有倾向于生物(例如，莱茵衣藻)的密码子偏好的核酸。本发明的具体载体含有本文提供的序列(SEQIDN0.19、SEQIDNO.20、SEQIDNO.21、SEQIDNO.22、SEQIDNO.23、SEQIDNO.24、SEQIDNO.25、SEQIDNO.26或SEQIDNO.27)。还提供包括本发明载体的宿主细胞。在一些情况下，宿主细胞是非维管光合生物，例如，分类为光合细菌(包括蓝细菌)、蓝藻、原绿藻、红藻、绿藻、不等鞭毛藻、tribophyta、灰色藻、chlorarachniophytes、裸藻、类眼虫、鞭藻、金藻、隐藻、隐滴虫、甲藻、双鞭藻、定鞭藻、硅藻、黄藻、eustigmatophyta、针胞藻、褐藻和浮游植物的生物。本发明的宿主细胞也可以是微观藻类物种，包括但不限于莱茵衣藻、盐生杜氏藻或雨生红球藻。在其它情况下，宿主细胞可以是多细胞光合生物的一种或多种细胞。对于一些实施方式，宿主细胞可以在缺乏光照下生长和/或在有机碳源存在下生长。本发明还提供组合物，其含有一种或多种外源生物质降解酶，所述降解酶源自一种或多种非维管光合生物。在一些情况下，这些组合物还可含有非维管光合生物的元件。酶与生物元件的比值(W/V)可以是至少110，或经发现元件可仅以痕量存在。组合物中的一些包括至少一种下列酶外切_β_葡聚糖酶、内切_β_葡聚糖酶、β“葡糖苷酶、内切木聚糖酶和/或木质酶；其中酶或多种酶从一种或多种下列生物分离莱茵衣藻、盐生杜氏藻、雨生红球藻、光合细菌(包括蓝细菌)、蓝藻、原绿藻、红藻、绿藻、不等鞭毛藻、tribophyta、灰色藻、chlorarachniophytes、裸藻、类眼虫、鞭藻、金藻、隐藻、隐滴虫、甲藻、双鞭藻、定鞭藻、硅藻、黄藻、eustigmatophyta、针胞藻、褐藻和浮游植物。对于一些实施方式，生物可以在缺乏光照下生长和/或在有机碳源存在下生长。本发明还提供含有多个载体的组合物，其中每个载体编码不同的生物质降解酶和在叶绿体中用于表达生物质降解酶的启动子。这些组合物可含有编码具体酶的具体载体的多个拷贝。在一些情况下，载体将含有编码分解纤维素的酶、分解半纤维素的酶和/或分解木质素的酶的核酸。更具体地，所述多个载体可含有能够表达外切-β-葡聚糖酶、内切-β-葡聚糖酶、β-葡糖苷酶、内切木聚糖酶和/或木质酶的载体。该实施方式的一些载体能够插入至叶绿体基因组，这些插入可导致破坏转化的叶绿体的光合能力。其它载体插入至叶绿体基因组并不破坏转化的叶绿体的光合能力。一些载体提供用于表达生物质降解酶，其被隔离在转化的叶绿体中。还有其它载体可含有本文提供的特定序列(SEQIDNO.19、SEQIDNO.20、SEQIDNO.21、SEQIDNO.22或SEQIDNO.23、SEQIDNO.24、SEQIDNO.25、SEQIDNO.26或SEQIDNO.27)。本发明还提供含有如上所述的载体组合物的藻类细胞，并具体地提供含有载体组合物的莱茵衣藻、盐生杜氏藻或雨生红球藻细胞。对于一些实施方式，细胞可以在缺乏光照下生长和/或在有机碳源存在下生长。本发明的另一个载体编码多个不同的生物质降解酶和在非维管光合生物中用于表达生物质降解酶的启动子。生物质降解酶可以是一种或多种分解纤维素的、分解半纤维素的或分解木质素的酶。在一些载体中，多个不同的生物质降解酶是外切-β-葡聚糖酶、内切-β-葡聚糖酶、β-葡糖苷酶、木质酶和内切木聚糖酶中的两种或更多种。在一些实施方式中，多个酶是可操作连接的。在其它实施方式中，多个酶是作为一个功能蛋白复合体表达。一些载体插入至宿主细胞基因组并不破坏生物的光合能力。编码多个不同的酶的载体可引起酶的产生，其被隔离在转化的生物的叶绿体中。本发明还提供用编码多个不同的酶的载体转化的藻类细胞或蓝细菌细胞。在一些情况下，藻类细胞是莱茵衣藻、盐生杜氏藻或雨生红球藻。在其它情况下，蓝细菌细胞是集胞藻属(Synechocystis)或聚球菌属(Synechococcus)或螺旋藻属(Athrospira)的种。对于一些实施方式，生物可以在缺乏光照下生长和/或在有机碳源存在下生长。本发明还另一方面提供产生一种或多种生物质降解酶的遗传修饰的叶绿体。这些酶可以是分解纤维素的、分解半纤维素的或分解木质素的酶，更具体地，可以是外切_β_葡聚糖酶、内切_β_葡聚糖酶、β“葡糖苷酶、内切木聚糖酶、木质酶和/或其组合。在一些实施方式中，一种或多种酶被隔离在叶绿体中。本发明还提供含有本发明的遗传修饰的叶绿体的光合生物。还另一方面提供用于制备生物质降解酶的方法。该方法包括步骤(1)转化光合、非维管生物以产生所述生物质降解酶或增加所述生物质降解酶的产生以及(2)从所述转化的生物收集生物质降解酶。转化可以用组合物进行，所述组合物含有编码不同生物质降解酶的多个不同载体。转化还可用编码多个不同的生物质降解酶的载体进行。任何或所有酶可以是可操作互相连接的。在一些情况下，叶绿体被转化。本发明的该方法可具有一种或多种另外的步骤，其包括(a)收获转化的生物；(b)干燥转化的生物；(c)从细胞培养基收获酶；(d)机械破坏转化的生物；或(e)化学破坏转化的生物。该方法还可包括进一步通过高效液体色谱纯化酶。在一些情况下，转化的生物是藻类或光合细菌，例如蓝细菌。对于一些实施方式，生物可以在缺乏光照下生长和/或在有机碳源存在下生长。本发明还另一个方法能够制备生物燃料。该方法的一个步骤包括用源自光合非维管生物的一种或多种生物质降解酶处理生物质一段足够的时间以降解至少一部分所述生物质。产生的生物燃料可以是乙醇。该方法的酶可含有至少痕量的所述光合非维管生物，所述酶源于所述光合非维管生物。另外，用于该方法一些实施方式的酶包括分解纤维素的、分解半纤维素的和分解木质素的酶。用于该方法一些方面的特定酶包括外切_葡聚糖酶、内切-β-葡聚糖酶、β-葡糖苷酶、内切木聚糖酶和/或木质酶。该方法的生物可包括光合细菌(包括蓝细菌)、蓝藻、原绿藻、红藻、绿藻、不等鞭毛藻、tribophyta、灰色藻、chlorarachniophytes、裸藻、类眼虫、鞭藻、金藻、隐藻、隐滴虫、甲藻、双鞭藻、定鞭藻、硅藻、黄藻、eustigmatophyta、针胞藻、褐藻和浮游植物。用于该方法的其它生物是微观藻类，包括但不限于莱茵衣藻、盐生杜氏藻和雨生红球藻。对于一些实施方式，生物可以在缺乏光照下生长和/或在有机碳源存在下生长。多种类型的生物质——包括农业废弃物、造纸厂废弃物、玉米秸秆、小麦秸秆、大豆秸秆、柳枝稷、浮萍、杨树、木片、木屑、湿酒糟、干酒糟、人类废弃物、新闻纸、回收纸产品或人类垃圾——可以是用本发明的该方法处理。生物质还可源自高-纤维素含量生物，例如柳枝稷或浮萍。用于该方法的酶或多种酶可以从所述生物释放，该释放可涉及化学或机械破坏生物的细胞。在可选的实施方式中，酶或多种酶选自所述生物，然后从培养基中收集。生物质的处理可涉及发酵过程，其可利用微生物而不是产生酶或多种酶的生物。在一些情况下，非维管光合生物可以添加至糖化槽。该本发明的该方法还可包括收集所述生物燃料的步骤。收集可以通过蒸馏进行。在一些情况下，生物燃料与另一种燃料混合。本发明的另外方法提供制备至少一种生物质降解酶，其通过转化叶绿体以制备生物质降解酶。生物质降解酶可以是分解纤维素的酶、分解半纤维素的酶或分解木质素的酶，以及具体地可以是外切_β_葡聚糖酶、内切_β_葡聚糖酶、β“葡糖苷酶、内切木聚糖酶或木质酶。在一些情况下，生物质降解酶被隔离在转化的叶绿体中。该方法可进一步涉及通过化学或机械方法破坏转化的叶绿体以释放生物质降解酶或多种酶。在一些情况下，多种酶将通过转化的叶绿体产生。生物质降解酶可以是真菌或细菌来源，例如，外切葡聚糖酶、内切_β_葡聚糖酶、β“葡糖苷酶、内切木聚糖酶、木质酶或其组合。本发明还另一个方法提供筛选转化的非维管光合生物，其通过从所述生物的叶绿体中扩增第一核酸序列，从所述生物的叶绿体扩增第二核酸序列以及测定所述生物的原生质状态，其基于从所述第一序列和第二序列扩增的结果。在一些情况下，第一和第二扩增步骤同时进行。第一核酸序列可以是内源叶绿体基因组序列，第二核酸序列可以是至少部分来自外源核酸。在一些情况下，来自叶绿体的第三核酸序列可以作为对照扩增。该第三核酸序列可以是野生型序列，其在外源核酸或多个外源核酸整合后保持完整。其中该第三核酸被扩增，该扩增可与第一或第二扩增步骤同时进行或所有三个扩增可以同时进行。对于该方法的扩增，本文提供的特异性引物——SEQIDNO.USEQIDNO.2,SEQIDNO.3,SEQIDNO.4,SEQIDNO.5,SEQIDNO.6,SEQIDNO.7,SEQIDN0.8、SEQIDNO.9,SEQIDNO.10、SEQIDNO.11、SEQIDNO.12、SEQIDNO.13、SEQIDNO.14或SEQIDNO.15-可以使用。第一和/或第二核酸的扩增可利用大于三十个循环的PCR。在一些情况下，测定原生质状态通过视觉分析从扩增步骤得到的产物进行。一种或多种扩增可以使用实时或定量PCR进行。由该方法测定的原生质状态可以是同质性(homoplasmy)，测试的生物可以是微观藻类，具体地，是微观藻类物种莱茵衣藻、盐生杜氏藻或雨生红球藻的其中之一。在该方法中，生物可含有外源核酸，所述外源核酸含有感兴趣的基因和选择标记。感兴趣的基因可编码生物质降解酶，例如分解纤维素的、分解半纤维素的或分解木质素的酶。具体地，生物质降解酶可以是外切_β_葡聚糖酶、内切_β_葡聚糖酶、β“葡糖苷酶、内切木聚糖酶或木质酶。另外，外源核酸可以是本文具体提供的核酸之一——SEQIDNO.19、SEQIDNO.20、SEQIDNO.2USEQIDNO.22、SEQIDNO.23,SEQIDNO.24,SEQIDNO.25,SEQIDNO.26、SEQIDNO.27、SEQIDNO.28、SEQIDNO.29、SEQIDNO.30或SEQIDNO.31。本发明还提供含有同质叶绿体群体的非维管光合生物，其中所述叶绿体群体包括外源核酸以及其中叶绿体群体的同质状态由至少两个不同的PCR反应测定。在一些情况下，叶绿体群体是多于一个的叶绿体。非维管光合生物可以是微观藻类，具体地是莱茵衣藻、盐生杜氏藻或雨生红球藻物种之一。可以使用至少两个同时进行的不同PCR反应筛选生物。这些PCR反应可利用本文公开的具体引物之一——SEQIDN0.1、SEQIDNO.2、SEQIDNO.3,SEQIDNO.4,SEQIDNO.5,SEQIDNO.6,SEQIDNO.7,SEQIDNO.8,SEQIDNO.9、SEQIDNO.10、SEQIDNO.11、SEQIDNO.12、SEQIDNO.13、SEQIDNO.14或SEQIDNO.15。PCR反应可利用大于三十个循环。生物可含有外源核酸，其包括至少一种感兴趣的基因和选择标记。该基因可编码生物质降解酶，具体地是分解纤维素的、分解半纤维素的或分解木质素的酶。甚至更具体地，生物质降解酶可以是外切_β_葡聚糖酶、内切_β_葡聚糖酶、β“葡糖苷酶、内切木聚糖酶或木质酶。存在于本发明该生物中的外源核酸可以是本文具体所述的核酸之一——SEQIDΝ0.19,SEQIDNO.20,SEQIDNO.2USEQIDNO.22,SEQIDNO.23,SEQIDNO.24、SEQIDNO.25、SEQIDNO.26、SEQIDNO.27、SEQIDNO.28、SEQIDNO.29、SEQIDNO.30或SEQIDNO.31。本文提供的另一个方法用于产生遗传修饰的同质非维管光合生物。该方法涉及用外源核酸转化生物的至少一个叶绿体，扩增第一核酸序列和第二核酸序列，以及测定生物的原生质状态，其基于扩增步骤的结果。第一和第二核酸序列可以在叶绿体基因组内。另夕卜，第一核酸序列可以是内源叶绿体序列。第二核酸序列可以至少部分来自外源核酸。该方法还可涉及从叶绿体扩增第三核酸序列作为对照。在一些情况下，第三核酸是野生型序列，其在整合外源核酸后保持完整。该方法可涉及PCR，其使用本文具体公开的引物之一——SEQIDN0.1、SEQIDNO.2、SEQIDNO.3、SEQIDNO.4、SEQIDNO.5、SEQIDNO.6、SEQIDNO.7、SEQIDNO.8、SEQIDNO.9、SEQIDNO.10、SEQIDNO.11、SEQIDNO.12、SEQIDNO.13、SEQIDNO.14或SEQIDNO.15。第一和第二核酸序列的扩增可利用大于三十个循环的PCR。使用该方法的原生质状态测定可涉及视觉分析扩增(多个)步骤的产物。由该方法测定的原生质状态可以是同质性，生物可以是微观藻类，具体地是莱茵衣藻、盐生杜氏藻或雨生红球藻物种之一。外源核酸可含有至少一种感兴趣的基因和选择标记。在一些情况下，感兴趣的基因编码生物质降解酶，具体地编码分解纤维素的、分解半纤维素的或分解木质素的酶。甚至更具体地，生物质降解酶可以是外切_β_葡聚糖酶、内切_β_葡聚糖酶、β“葡糖苷酶、内切木聚糖酶或木质酶。而且，外源核酸可以是本文具体所述之一-SEQIDNO.19、SEQIDNO.20、SEQIDN0.21、SEQIDNO.22、SEQIDNO.23、SEQIDNO.24,SEQIDNO.25、SEQIDNO.26、SEQIDNO.27、SEQIDNO.28、SEQIDNO.29、SEQIDNO.30或SEQIDNO.31。本发明的另一个实施方式是试剂盒，其用于测定遗传修饰的非维管光合生物的原生质状态。这种试剂盒可含有扩增引物(多个扩增引物)，用于扩增与内源序列相应的叶绿体基因组的第一核酸序列；以及扩增引物(多个扩增引物)，用于扩增叶绿体基因组的第二核酸序列，其是引入的或非自然发生的序列。试剂盒还可含有PCR缓冲液和/或用于扩增对照核酸序列的扩增引物(多个扩增引物)。试剂盒可含有本文具体公开的一种或多种PCR引物--SEQIDNO.USEQIDNO.2,SEQIDNO.3、SEQIDNO.4,SEQIDNO.5,SEQIDNO.6,SEQIDNO.7,SEQIDNO.8,SEQIDNO.9,SEQIDNO.10,SEQIDNO.IUSEQIDNO.12,SEQIDNO.13,SEQIDNO.14或SEQIDNO.15。本发明试剂盒中用于扩增第一核酸序列的引物(多个引物)可结合至少一部分的psbA5，UTR、psbA编码序列、psbC5，UTR、psbD5，UTR、atpA5’UTR或3HB基因座。在一些情况下，用于扩增第二核酸序列的引物(多个引物)的至少一个可结合编码生物质降解酶的序列的至少一部分，例如分解纤维素的、分解半纤维素的或分解木质素的酶。由第二核酸编码的具体的生物质降解酶可以是外切_葡聚糖酶、内切-β-葡聚糖酶、β-葡糖苷酶、内切木聚糖酶或木质酶。引物可扩增本文具体公开的一种或多种序列的至少一部分——SEQIDΝ0.19、SEQIDNO.20、SEQIDΝ0·21、SEQIDNO.22、SEQIDNO.23、SEQIDNO.24、SEQIDNO.25、SEQIDNO.26、SEQIDNO.27、SEQIDNO.28,SEQIDNO.29、SEQIDNO.30或SEQIDNO.31。另外，试剂盒可含有使用说明书。附图简述本发明的新的特征在所附权利要求中具体说明。可通过参考下列阐明说明性实施方式的详述获得对本发明特征和优势的更好理解，其中利用本发明的原则，附图如下图1图解了藻类细胞的转化、选择、确认和测量酶的产生。图2图解了用于将基因插入至叶绿体基因组的两个构建体。图3图解了用于PCR筛选转化子的引物对以及预期的野生型、异质和同质菌株的条带分布。图4图解了转化内切-β-葡聚糖酶的莱茵衣藻(C.reinhardtii)克隆的PCR筛选和Western印迹分析的结果。图5图解了转化外切-β_葡聚糖酶的莱茵衣藻(C.reinhardtii)克隆的PCR筛选和Western印迹分析的结果。图6图解了转化β-葡糖苷酶的莱茵衣藻(C.reinhardtii)克隆的PCR筛选和Western印迹分析的结果。图7图解了转化内切木聚糖酶的莱茵衣藻(C.reinhardtii)克隆的PCR筛选和Western印迹分析的结果。图8图解了测定由转化的莱茵衣藻(C.reinhardtii)克隆产生的内切-β-葡聚糖酶蛋白的水平。图9是本发明一个实施方式的示意图，其显示产生的用于将多个基因插入至叶绿体基因组的构建体。图10图解了转化内切-β-葡聚糖酶的莱茵衣藻(C.reinhardtii)克隆的PCR筛选和Western印迹分析结果。图11图解了转化β-葡糖苷酶的莱茵衣藻(C.reinhardtii)克隆的PCR筛选和Western印迹分析的结果。图12是用于插入至叶绿体基因组的两个外源DNA构建体的示意图。图13是用于插入至蓝细菌基因组的两个外源DNA构建体的示意图。图14图解了转化内切-β-葡聚糖酶的莱茵衣藻(C.reinhardtii)克隆的PCR筛选和Western印迹分析的结果。图15图解了转化内切木聚糖酶的莱茵衣藻(C.reinhardtii)克隆的PCR筛选和Western印迹分析的结果。图16图解了转化外切-β-葡聚糖酶的莱茵衣藻(C.reinhardtii)克隆的PCR筛选和Western印迹分析的结果。图17图解了细菌产生的生物质降解酶的活性。发明详述本文所用的技术和科学术语具有本发明所属领域普通技术人员通常理解的意思，除非另外定义。本文参考对本领域普通技术人员已知的各种原料和方法。阐明重组DNA技术一般原理的标准参考著作包括Sambrook等，“MolecularCloning:ALaboratoryManual，，,第二版，ColdSpringHarborLaboratoryPress,Plainview,N.Y.,1989；Kaufman等编辑，"HandbookofMolecularandCellularMethodsinBiologyandMedicine，，，CRCPress,BocaRaton,1995；以及McPherson编辑,“DirectedMutagenesis:APracticalApproach",IRLPress,Oxford,19910用于本发明的选择方面，教导酵母遗传学的一般方法和原理的标准参考文献包括=Sherman等“LaboratoryCourseManualMethodsinYeastGenetics，，,ColdSpringHarborLaboratory,ColdSpringHarbor,N.Y.,1986；以及Guthrie等，"GuidetoYeastGeneticsandMolecularBiology",Academic,NewYork,1991。当提供数值范围时，应理解的是除非内容另有说明，在该范围上限限定和下限限定之间的每个介于其间的数值，至下限限定的单位的十分之一也是具体地公开的。包括在所述范围内的任何所述的数值或介于其间的数值与所述范围内的任何其它所述或介于其间的数值之间的每个较小范围。这些较小范围的上限和下限可独立地包括在范围内或排除在范围以外，并且界限之一或两个包括在或两个均不包括在较小范围的每个范围也是被包括的，其中服从于在所述范围内任何具体排除的界限。当所述范围包括界限之一或两个时，排除那些包括的界限之一或两个的范围也是被包括的。本发明涉及通过遗传修饰的生物生产酶，例如，生物质降解酶。本发明另一方面涉及组合物和方法，用于使用生物原料来产生产物，例如乙醇，其使用由光合微生物例如但不限于藻类产生的生物质降解酶。通常地，光合生物不具有降解生物质所有必要的酶。本发明利用将外源核酸引入藻类细胞，特别是引入那些细胞的叶绿体的能力。使用分子生物学和基因工程产生表达酶的和/或表达酶促途径的藻类菌株的一个优势是产生大量活性酶的潜力。构建遗传操作的藻类菌株的一个方法如图1的流程图所示。可见，藻类细胞(例如，莱因衣藻(Chlamydomonasreinhardti)、盐生杜氏藻(Dunaliellasalina)、雨生红球藻(Hematococcuspluvalis))用编码感兴趣的基因——通常为生物质降解酶——的核酸转化。在一些实施方式中，转化可将核酸引入宿主藻类细胞的任何质体(例如，叶绿体)。在引入外源核酸之后，转化的细胞通常铺于选择培养基上。该方法还可包括几个筛选步骤。最初，通常进行初次转化子的筛选以测定克隆哪个具有外源核酸的正确插入。可以取显示正确整合的克隆并再筛选以确保遗传稳定性。这种方法确保转化子含有感兴趣的基因。在许多情况下，这种筛选通过聚合酶链反应(PCR)进行；但是，可以使用任何其它合适的本领域已知的技术。许多不同的PCR方法是本领域已知的(例如，嵌套式PCR、实时PCR)。对于任何给定的筛选，本领域普通技术人员将认识到PCR成分可以变化以获得最佳的筛选结果。例如，当在破坏的藻类细胞上进行PCR时，因为许多这类生物具有镁螯合剂，镁浓度可根据需要向上调节。在这些情况下，镁浓度可根据需要向上或向下调节(与购得的PCR试剂盒中的标准浓度比较)0.1、0·2,0.3,0.4,0.5,0.6,0.7,0.8,0.9,1.0,1.1、1.2,1.3,1.4、1.5,1.6,1.7,1.8、1.9或2.OmM0因此，调节后，PCR反应的最终镁浓度可以是例如0.7,0.8、0.9、1·0、1·1、1·2、1·3、1·4、1·5、1·6、1·7、1·8、1·9、2·0、2·1、2·2、2·3、2·4、2·5、2·6、2·7、2.8,2.9,3.0,3.1,3.2,3.3,3.4,3.5mM或更高。具体的例子在本文所述实施例中使用；但是，本领域普通技术人员将认识到其它PCR技术可用于代替所述的具体方案法。筛选具有外源核酸正确整合的克隆后，通常地筛选存在编码的蛋白的克隆。蛋白表达筛选通常通过Western印迹分析和/或酶活性分析进行。确认核酸整合和/或蛋白表达后，选择的克隆可以进行扩增用于通过生物质降解产生生物燃料，首先以较小的体积:1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、6061、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72，73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100或更多升。在最初扩增后，可以更大数量进行生物质更大规模的降解。部分封闭的生物反应器系统的一个例子显示于图1，第6步。但是，用于生物质降解和/或生物燃料产生的转化的菌株的生长也可以在人造结构中完成，例如水池、沟渠、水槽和/或堆填池。可选地，菌株也可直接在自然发生的水体中生长，例如，在海洋、海水、湖泊或河流。在某些情况下，转化的菌株在乙醇生产工厂或其它设施附近生长。可选地，生物质降解细胞可以在产生CO2的地区附近生长(例如，发电厂、混凝土厂、炼油厂、其它工业设施、城市或高速公路，等等)。同样，本文公开的方法进一步考虑商业方法，用于在制造和催化燃料生产的同时，通过在乙醇生产厂附近培养本文所述的一种或多种修饰的生物，将碳信用(carboncredit)销售给乙醇厂或其它设施或产生CO2的地区。本发明考虑通过转化宿主细胞(例如，藻类细胞例如莱茵衣藻、盐生杜氏藻、雨生红球藻和蓝细菌细胞)和/或生物——包括具有编码一种或多种不同生物质降解酶(例如，分解纤维素的酶、分解半纤维素的酶、木聚糖酶、木质酶和纤维素酶)的核酸的宿主细胞——制造生物质降解酶。在一些实施方式中，可生产单个酶。例如，可产生将预处理的纤维素片段分解为双葡萄糖分子(纤维二糖)的纤维素酶或将纤维二糖分解为葡萄糖的纤维素酶。一些宿主细胞可以用编码一种或多种酶的多个基因转化。例如，单个转化的细胞可含有编码整个生物降解途径的外源核酸。途径的一个例子可包括编码外切_葡聚糖酶(作用于纤维素末端链)、内切_葡聚糖酶(作用于纤维素链的内部)、β_葡糖苷酶(避免反应抑制剂/降解纤维二糖)和内切木聚糖酶(作用于半纤维素交联)的基因。这种转化了整个途径的细胞和/或从它们中提取的酶可降解生物质的某些组分。构建体可含有相同基因的多拷贝，和/或编码来自不同生物的相同酶的多个基因，和/或在编码序列的一个或多个部分具有突变的多个基因。可选地，通过用途径的各个酶转化宿主细胞，然后将产生各个酶的细胞组合可产生生物质降解途径。通过改变多个转化的菌株的相对比例，该方法可进行酶的组合使其更具体地与感兴趣的生物质匹配。例如，将两倍于表达途径中第一种酶的细胞可添加至混合物，其中反应途径的第一步骤是限制性步骤。在用编码酶的构建体转化后，培养宿主细胞和/或生物。可以从生物/细胞收集生物质降解酶。可以通过本领域已知的任何方法收集，包括但不限于浓缩细胞、机械或化学破坏细胞以及从细胞培养物和/或细胞裂解液纯化酶。可使细胞和/或生物生长，然后通过任何方式收集酶或多种酶。提取酶的一个方法是通过收获宿主细胞或一组宿主细胞，然后干燥宿主细胞。然后通过粉碎细胞以暴露酶收获来自干燥的宿主细胞的酶或多种酶。然后将粉碎的细胞的总产物用于降解生物质。许多从天然细胞提取蛋白的方法是本领域熟知的，也是本文考虑的(例如，引入外源核酸构建体，其中编码酶的序列可操作地连接至编码分泌信号的序列——分泌的酶从生长培养基分离)。从细胞/生物和/或周围培养基提取蛋白后，可从粗提取物纯化蛋白，以使该酶可包括总蛋白的百分之1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、30、40、50、60、70、80、90、95、99或更高。纯化步骤包括但不限于使用HPLC、亲和柱和基于抗体的纯化方法。提取和利用生物质降解酶也可通过在宿主细胞中表达含有编码生物质产生_调节分子的核酸的载体来完成。在该实施方式中，宿主细胞产生生物质，也产生生物质降解酶。然后生物质降解酶可降解宿主细胞产生的生物质。在一些情况下，用于生产生物质降解酶的载体可以不必持续地具有活性。这些载体可包括一个或多个可活化的启动子和一个或多个生物质降解酶。这些启动子激活生物质降解酶的产生，例如，在生物质已生长至足够密度或达到某种成熟度时。本发明的方法可通过将重组核酸分子引入叶绿体进行，其中该重组核酸分子包括第一多核苷酸，其编码至少一个多肽(即，1、2、3、4或更多)。在一些实施方式中，多肽可操作地连接至第二、第三、第四、第五、第六、第七、第八、第九、第十和/或随后的多肽。例如，在生物降解途径中的几个酶可以是直接或间接连接的，以使一旦由途径中的一个酶产生产物，该产物接近途径中的下一个酶。对于叶绿体转化，本发明的一个主要优势是利用重组核酸构建体，其含有选择标记和一个或多个感兴趣的基因。通常地，通过用两个构建体共转化叶绿体来对叶绿体进行转化，这两个构建体一个含有选择标记，第二个含有感兴趣的基因。这种转化子的筛选由于多种原因是费力和费时的。首先，使一些转化的生物生长所需要的时间长。第二，必须同时存在选择标记和感兴趣基因的情况下筛选转化子。通常，通过Southern印迹对感兴趣基因进行二次筛选(参见，例如PCT/US2007/072465)。本发明的构建体(图2、图9和图12)可进行基于PCR的筛选方法，其中可使用对插入和野生型序列特异的引物组合筛选转化子(图3，道G-基因特异反应；C-对照反应；WT-野生型反应；M-多重)。该方法提供快速筛选方法并比旧的技术先进。例如，对接收未连接的标记的转化子的选择固有地产生较低百分比的具有转基因的克隆。由于这个原因，从初次转化获得同质系的可能性很低。通过将标记和感兴趣的基因连接，获得具有该转基因的转基因克隆，特别是同质克隆的可能性在第一次传代(pass)时提高。筛选转化子的具体PCR方案在以下实施例中详述，但是本领域普通技术人员应认识到可以改变这些方案以提供转化子的定量分析。例如，可以利用不同比例的具体反应的引物以将插入拷贝数与对照反应比较。可以进行这样的变化，其中多重反应(图3，M排)同时或分开进行。插入拷贝数的测定在一些实施方式中可能是重要的，其中感兴趣的外源基因最佳的表达水平部分地由基因拷贝数确定。例如，藻类宿主细胞(例如，莱茵衣藻、盐生杜氏藻、雨生红球藻)的转化，其引起外源核酸并入在细胞中小于一半的叶绿体基因组拷贝中，可产生感兴趣的基因较少的或不可检测的表达。可选地，外源核酸并入在细胞叶绿体基因组所有拷贝中可产生较少的或不可检测的感兴趣基因的表达，其中存在很少的基因组原始拷贝(例如，定量PCR分析应可进行同质克隆的排除，其具有较低的插入拷贝数，并因此可能不能产生足够多的感兴趣基因和/或多肽)。在其它实施方式中，可以是外源核酸并入的最优水平。在一些情况下，外源DNA可编码蛋白，其中当它存在于拷贝数具体范围之中时，无论通过转录、翻译或其它控制机制，被最优产生。因此，这种外源DNA拷贝数的测定——例如通过定量PCR，可进行转化的生物的选择和/或产生，其以有效水平产生感兴趣的蛋白。另外，本发明的重组核酸分子可以被可操作地连接至第二和/或其后的核苷酸序列。例如，编码生物降解途径酶的核苷酸序列可以被可操作地连接以使这些序列的表达可以用单个诱导刺激控制或由单个转录激活子控制。这些系统与细菌操纵子(例如，大肠杆菌(EscherischiacolDLac操纵子)相似。但是，本发明中可操作地连接的核苷酸序列的这些分组是合成的并被设计为在植物质体中发挥功能，优选地被并入叶绿体基因组。如本文所用，术语“可操作地连接”意思是两个或多个分子互相关联定位以使它们作为单个单元发挥作用并影响归因于一个或两个分子或其组合的功能。例如，编码多肽的多核苷酸可以可操作地连接至转录或翻译调控元件，在这种情况下，该元件赋予其调控多核苷酸的作用，其类似于该调控元件影响在细胞中与其正常相连的多核苷酸序列的方式。第一多核苷酸编码序列还可以可操作地连接至第二(或更多)编码序列，以使嵌合多肽可以从可操作地连接的编码序列表达。从这样的构建体产生的嵌合多肽可以是融合蛋白，其中两个(或更多)编码的肽被翻译为单个多肽，即，通过肽键，或直接地或带有短的间隔区地共价连接。在叶绿体中，基因表达调控通常地发生在转录后和通常在翻译起始过程中。该调控取决于叶绿体翻译装置，以及核-编码的调控因子(参见Barkan和Goldschmidt-Clermont,Biochemie82:559_572，2000；Zerges,Biochemie82:583_601，2000)。叶绿体翻译装置通常地类似细菌中的装置；叶绿体含有70S核糖体；具有缺乏5'帽和通常不含有3'多聚腺嘌呤化的尾的mRNA(Harris等，Microbiol.Rev.58=700-754,1994)；以及通过选择试剂例如氯霉素在叶绿体和细菌中抑制翻译。本发明的一些方法利用核糖体结合序列(RBS)相对于编码序列的适当定位。以前已注意到RBS的这种设置引起植物叶绿体中的粗放翻译(参见美国申请2004/0014174，通过引用并入本文)，也注意到该多肽在叶绿体中表达多肽的优势是该多肽不通过通常由核基因表达的多肽穿越的细胞区室进行，并且因此，不进行某些翻译后修饰例如糖基化。同样，由本发明的一些方法产生的多肽和蛋白复合体可预期的不经这些翻译后修饰而产生。仅通过背景方式提供下列讨论，并且申请人不试图将公开的发明以范围或通过理论限制于叶绿体基因调控机制的公开。在叶绿体中，核糖体结合和适合的翻译起始位点选择被认为至少部分由顺式作用RNA元件调节。潜在调控子的一个例子已在叶绿体mRNA的5'UTR'中鉴定(Alexander等，Nucl.AcidsRes.26:2265_2272，1998；Hirose和Sugiura,EMBOJ.151687-1695，1996；Mayfield等，J.CellBiol.1271537-1545，1994；Sakamoto等，PlantJ.6:503_512，1994，其中每个通过引用并入本文)。这些元件可与核-编码的因子相互作用。许多叶绿体mRNA含有类似原核生物RBS元件的元件(Bonham-Smith和Bourque，Nucl.AcidsRes.17:2057_2080，1989；Ruf和Kossel，FEBSLett.240:41_44，1988，其中每个通过引用并入本文)。但是，如几项研究已显示，叶绿体翻译中这些RBS序列的功能利用性还不清楚，其区分这些元件在翻译上的作用(Betts和Spremulli，J.Biol.Chem.26926456-26465,1994；Hirose等，FEBSLett.430257-260,1998；Fargo等，Mol.Gen.Genet.257:271_282，1998；Koo和Spremulli,J.Biol.Chem.269:7494_7500，1994；Rochaix,PlantMol.Biol.32:327_341，1996)。由于缺乏叶绿体RBS元件的共有序列以及由于产生的以研究这些推定的RBS序列的突变可能已改变5'UTR中其它重要序列的内容，这些结果的解释十分复杂。本发明的一些方面(例如，载体)可包括RBS。这些RBS可化学合成，或可从自然发生的核酸分子分离(例如，从叶绿体基因分离)。另外，对于RBS，具有5'UTR的实施方式可包括转录调控元件，例如启动子。对于本发明所用的RBS，5'UTR可以是化学合成的或可从自然发生的核酸分子分离。可用于本发明的5'UTR的非限制性例子包括但不限于atpA5'UTR、psbC5'UTR、psbD5'UTR、psbA5'UTR、rbcL5’UTR禾口/或16SrRNA5'UTR0核糖核苷酸序列可进一步包括起始密码子(例如，AUG密码子)，其可操作地连接至RBS。起始密码子可以是内源的(例如，在克隆的基因中自然发生的)或可合成的(例如，在连接多肽或PCR引物中插入)。可通过本领域已知的任何方法获得分离的核糖核苷酸序列，方法包括但不限于化学合成，使用酶促方法产生(例如，使用依赖DNA的RNA聚合酶或依赖RNA的RNA聚合酶从DNA或RNA模板产生)。编码本发明核糖核苷酸的DNA模板可化学合成，可从自然发生的DNA分子分离，或可源自被修饰为具有所需要特征的自然发生的DNA序列。在本文中广泛使用的术语“多核苷酸”或“核苷酸序列”或“核酸分子”意思是通过磷酸二酯键连接在一起的两个或多个脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸的序列。同样，这些术语包括RNA和DNA，其可以是基因或其部分、cDNA、合成的多聚脱氧核糖核酸序列或类似物，并且可以是单链或双链，以及DNA/RNA杂交。而且，本文所用的术语包括自然发生的核酸分子，其可从细胞分离，以及合成的多核苷酸，其可由例如化学合成的方法或酶促方法例如聚合酶链式反应(PCR)制备。应认识到的是，使用不同术语仅为了讨论方便，以便区分例如组合物的不同组分，除了本文所用的术语“合成的多核苷酸”是指已被修饰的以反映叶绿体密码子使用的多核苷酸。通常，包括多核苷酸的核苷酸是自然发生的脱氧核糖核苷酸，例如连接至2'-脱氧核糖的腺嘌呤、胞嘧啶、鸟嘌呤或胸腺嘧啶，或连接至核糖的核糖核苷酸，例如腺嘌呤、胞嘧啶、鸟嘌呤或尿嘧啶。但是，根据使用，多核苷酸也可含有核苷酸类似物，包括非自然发生的合成的核苷酸或修饰的自然发生的核苷酸。核苷酸类似物是本领域熟知的并且是可购得的，如作为含有这些核苷酸类似物的多核苷酸(Lin等，Nucl.AcidsRes.225220-5234,1994Jellinek等，Biochemistry3411363-11372,1995；Pagratis等，NatureBiotechnol.15:68_73，1997)。通常，磷酸二酯键连接本发明多核苷酸的核苷酸，但是可以利用其它键，包括硫二酯键、硫代磷酸酯键、肽-样键和本领域已知的任何其它键以产生合成的多核苷酸(Tam等，Nucl.AcidsRes.22:977_986，1994；Ecker和Crooke，BioTechnology13:351360，1995)。多核苷酸，其包括自然发生的核苷酸和磷酸二酯键，可化学合成或可使用重组DNA方法，使用合适的多核苷酸作为模板产生。作为比较，多核苷酸——其包括核苷酸类似物或共价键而不是磷酸二酯键，通常是化学合成的，虽然酶例如T7聚合酶可将某些类型的核苷酸类似物并入多核苷酸，因此，可用于从合适的模板重组地产生这种多核苷酸(Jellinek等，上文，1995)。用于实践本发明方法的多核苷酸可以从任何生物分离。通常地，用于实践本发明的生物降解酶由来自细菌或真菌的核苷酸序列编码。这种酶和其它们来源的非限制性例子显示于表I。这些多核苷酸可以通过本领域已知的任何方法分离和/或合成，所述方法包括但不限于克隆、亚克隆和PCR。编码多核苷酸的一个或多个密码子可偏向于反映叶绿体密码子使用。大部分氨基酸由两个或多个不同(简并)密码子编码，并被充分意识到各种生物优选于其它密码子来利用某些密码子。这些优选的密码子使用，也在叶绿体中使用，在本文是指“叶绿体密码子使用”。已报道莱因衣藻(Chlamydomonasreinhardtii)的密码子偏好。参见美国申请2004/0014174。当用于指密码子时，术语“偏好”意思是多核苷酸中密码子序列已被改变以使密码子是在靶中优选使用的一个，靶偏好是例如，藻类细胞、叶绿体或类似物。偏好叶绿体密码子使用的多核苷酸可重头合成，或可使用常规重组DNA技术——例如通过位点定向突变方法——进行遗传修饰以改变一个或多个密码子以使它们偏好叶绿体密码子使用。叶绿体密码子偏好可在不同植物中有不同偏爱，其包括例如，与烟草相比在藻类叶绿体中。通常，选择的叶绿体密码子偏好反映植物的叶绿体密码子使用，该植物用本发明核酸转化。例如，如果莱茵衣藻(C.reinhardtii)是宿主，那么叶绿体密码子使用偏向于反映藻类叶绿体密码子使用(在第三密码子位置约74.6%AT偏好)。本发明的一种方法可使用编码第一多肽和至少第二多肽的多核苷酸进行。因此，多核苷酸可编码例如第一多肽和第二多肽；第一多肽、第二多肽和第三多肽；等等。而且，任何或所有编码的多肽可相同或不同。微观藻类莱茵衣藻(C.reinhardtii)叶绿体中表达的多肽可以组装以形成功能多肽和蛋白复合体。因此，本发明的方法提供产生功能蛋白复合体的方法，包括例如二聚体、三聚体和四聚体，其中复合体的亚基可相同或不同(例如，分别为同源二聚体或异源二聚体)。术语“重组核酸分子”用于本文是指由人为干预操作的多核苷酸。重组核酸分子可含有两个或多个核苷酸序列，其以这样的方式连接以使在自然界的细胞中未发现该产物。具体地，两个或多个核苷酸序列可以可操作地连接，以及例如，可编码融合多肽或可包括编码核苷酸序列和调控元件。重组核酸分子还可基于但被操作以使其不同于自然发生的多核苷酸(例如叶绿体密码子使用偏好、限制酶位点插入、启动子插入、复制起点插入)。重组核酸分子可进一步含有肽标签(例如，His-6标签)，其可便于鉴定在细胞中的多肽表达。另外的标签包括例如FLAG表位、c-myc表位、生物素以及谷胱甘肽S-转移酶。这些标签可通过本领域已知的任何方法(例如，抗-标签抗体、链霉亲和素)检测。这些标签还可用于分离可操作连接的多肽，例如通过亲和层析。鉬合物核酸本文的组合物包括编码一种或多种不同生物质降解酶和/或一种或多种不同生物质-产生调节剂的核酸以及这些核酸的载体。核酸对它们插入的光合宿主细胞可以是异源的。载体可包括编码生物质降解酶的核酸的一个或多个拷贝和/或编码生物质_产生调节剂的核酸的一个或多个拷贝。当使用多个拷贝时，核酸(例如，编码单个生物质降解酶)的至少2、3、4、5、6、7、8、9或10个拷贝可插入至单个载体。这可在宿主细胞中增加它们产生的水平。用于本发明方法的重组核酸分子可包含在载体中。而且，当使用第二(或更多)重组核酸分子进行该方法时，第二重组核酸分子还可包含在载体中，其可以但不必与含有第一重组核酸分子的载体相同。载体可以是可用于将多核苷酸引入叶绿体的任何载体，优选地包括叶绿体基因组DNA的核苷酸序列，其足够与叶绿体基因组DNA进行同源重组，例如这样的核苷酸序列——其包括叶绿体基因组DNA的约400至1500或更多个的基本上连续的核苷酸。叶绿体载体和选择叶绿体基因组用作载体的区域的方法是熟知的(参见，例如，Bock，J.Mol.Biol.312:425-438，2001；还参见，Staub和Maliga，PlantCell4:39-45，1992；Kavanagh等，Genetics152:1111_1122，1999，其中每个通过引用并入本文)。在一些情况下，这样的载体包括启动子。用于本发明的启动子可来自任何来源(例如，病毒、细菌、真菌、原生生物、动物)。本文考虑的启动子可以对光合生物、非维管光合生物和维管光合生物(例如，藻类、开花植物)是特异的。如本文所用，术语“非维管光合生物”是指任何宏观的或微观的生物，其包括但不限于藻类、蓝细菌和光合细菌，其不具有例如在高等植物中发现的维管系统。在一些情况下，上述核酸被插入至包括光合生物例如藻类启动子的载体。启动子可以是在叶绿体和/或其它质体中用于表达的启动子。在一些情况下，核酸是基于叶绿体的。考虑用于将本文的任何核酸插入至叶绿体的启动子的例子包括美国申请号2004/0014174公开的启动子。启动子可以是组成型启动子或诱导型启动子。启动子通常地包括接近转录起始位点的必要核酸序列(例如，TATA元件)。“组成型”启动子是在大部分环境和发育条件下有活性的启动子。“诱导型”启动子是在环境或发育调控下有活性的启动子。诱导型启动子/调控元件的例子包括例如硝酸盐-诱导的启动子(Back等，PlantMoI.Biol.179(1991))或光-诱导的启动子(Feinbaum等，MoIGen.Genet.226:449(1991)；Lam和Chua，Science248471(1990))或热响应启动子(Muller等，Gene111:165-73(1992))。莱茵衣藻(C.reinhardtii)的整个叶绿体基因组在万维网(worldwideweb)上是公众可获得的，其URL为"biology,duke.edu/chlamy_genome/-chloro.html，，(参见"viewcompletegenomeastextfile，，链接禾口"mapsofthechloroplastgenome，，链接)，其中每个通过引用并入本文(J.Maul，J.W.Lilly和D.B.Stern，未公开的结果；2002年1月28日修订；将作为GenBankAcc.No.AF396929公开)。通常，选择叶绿体基因组DNA的核苷酸序列以使其不是基因的部分，包括调控序列或编码序列，特别是这样的基因，即如果由于同源重组事件被破坏将产生对于叶绿体有害作用的基因，例如，对于叶绿体基因组复制或对于含有叶绿体的植物细胞。在这方面，含有莱茵衣藻(C.reinhardtii)叶绿体基因组序列的网站还提供显示叶绿体基因组编码和非-编码区域的图谱，从而便于选择用于构建本发明载体的序列。例如，叶绿体载体P322，其用于本文公开的实验，是从大约位置143.Ikb的Eco(EcoRI)位点延伸至大约位置148.5kb的Xho(XhoI)位点的克隆(参见，万维网，其URL为"biology,duke,edu/chlamy_genome/chloro.html，，并点击"mapsofthechloroplastgenome”链接和"140_150kb”链接；也可在万维网，URL为"biology,duke.edu/chlam-y/chloro/chlorol40.html”上直接获得；还参见实施例1)。用于本发明实践的载体也可含有一个或多个另外的核苷酸序列，其在载体上赋予期望的特征，包括例如序列，例如便于载体操作的克隆位点、指导载体复制或其中含有的核苷酸序列转录的调控元件、编码选择标记的序列，等等。同样，载体可含有例如，一个或多个克隆位点，例如多克隆位点，其可但不必被定位以使异源多核苷酸可插入至载体并可操作地连接至所期望的元件。载体也可含有原核生物复制起点(ori)，例如，大肠杆菌复制起点或黏粒复制起点，从而使载体如所期望地在原核生物宿主细胞以及植物的叶绿体中传代。调控元件，如本文所用术语，广泛地指调节多核苷酸转录或翻译或可操作地连接的多肽定位的核苷酸序列。例子包括但不限于RBS、启动子、增强子、转录终止子、起始(start)密码子、内含子切除和正确读码框维持的剪接信号、STOP密码子、amber或ochre密码子、IRES。另外，细胞区室化信号(即，将多肽靶向至胞质、核、叶绿体膜或细胞膜的序列)。这些信号是本领域熟知的并已广泛报道(参见，例如，美国专利号5，776，689)。载体或其它重组核酸分子可包括编码报告子多肽或其它选择标记的核苷酸序列。术语“报告子”或“选择标记”是指赋予可检测表型的多核苷酸(或编码的多肽)。报告子通常编码可检测的多肽，例如绿色荧光蛋白或酶例如荧光素酶，其中，当与合适的试剂接触时(分别为特定波长的光或荧光素)，产生可目测或使用合适的仪器检测的信号(Giacomin，PlantSci.11659-72,1996；Scikantha,J.Bacteriol.178121,1996；Gerdes,FEBSLett.38944-47,1996；还参见，Jefferson，EMBOJ.6:3901_3907，1997，f1-葡糖苷酸酶)。选择标记通常地是分子，当其在细胞中存在或表达时，提供给含有标记的细胞选择的优势(或劣势)，例如，在试剂存在的情况下生长的能力，否则该试剂将杀死细胞。选择标记可提供工具以获得表达标记的原核生物细胞或植物细胞或二者，因此，可用作本发明载体的组分(参见例如，Bock，上文，2001)。选择标记的例子包括但不限于赋予抗代谢物抗性的标记，例如，二氢叶酸还原酶，其赋予对甲氨蝶呤的抗性(ReiSS，PlantPhysiol.(LifeSci.Adv.)13=143-149,1994)；新霉素磷酸转移酶，其赋予对氨基糖苷新霉素、卡那霉素和嘌呤霉素的抗性(Herrera-Estrella，EMBOJ.2=987-995,1983)；hygro,其赋予对潮霉素的抗性(Marsh，Gene32=481-485,1984)；trpB，其可使细胞利用吲哚来替代色氨酸；hisD，其可使细胞利用组胺醇来替代组氨酸(Hartman，Proc.Natl.Acad.Sci.，USA85=8047,1988)；甘露糖_6_磷酸异构酶，其可使细胞利用甘露糖(W094/20627)；鸟氨酸脱羧酶，其赋予对鸟氨酸脱羧酶抑制剂2-(二氟甲基)-DL-鸟氨酸的抗性(DFMO；McConlogue,1987,InCurrentCommunicationsinMolecularBiology,ColdSpringHarborLaboratoryed.)；以及来自土曲霉(Aspergillusterreus)的脱氨酶，其赋予对杀稻瘟菌素S的抗性(Tamura，Biosci.Biotechnol.Biochem.59:2336_2338，1995)。另外的选择标记包括那些赋予除草剂抗性的选择标记，例如，草胺膦乙酰转移酶基因，其赋予对草胺膦的抗性(White等，Nucl.AcidsRes.18:1062，1990；Spencer等，Theor.Appl.Genet.79625-631,1990)；突变的EPSPV-合成酶，其赋予草甘膦抗性(Hinchee等，Biotechnology91=915-922,1998)；突变的乙酰乳酸合成酶，其赋予咪唑啉(imidazolione)或磺酰尿抗性(Lee等，EMBOJ.7=1241-1248,1988)；突变的psbA，其赋予对绣去津的抗性(Smeda等，PlantPhysiol.103:911-917，1993)，或突变原卟啉原氧化酶(参见美国专利号5，767，373)，或其它标记，其赋予对除草剂例如草丁磷的抗性。选择标记包括多核苷酸，其赋予对真核细胞的二氢叶酸还原酶(DHFR)或新霉素抗性，和四环素；对原核生物例如大肠杆菌的氨苄青霉素抗性；以及植物中博来霉素、庆大霉素、草甘膦、潮霉素、卡那霉素、甲氨蝶呤、福来霉素、草铵磷、大观霉素、链霉素、氨磺酰和磺酰尿抗性(参见，例如，Maliga等，MethodinPlantMolecularBiology,ColdSpringHarborLaboratoryPress，1995，第39页)。报告基因已成功用于高等植物的叶绿体，并已报道重组蛋白高水平表达。另外，报告基因已用于莱茵衣藻的叶绿体，但是，在大多数情况下，产生极低量的蛋白。报告基因大大增强在大量生物有机体中监控基因表达的能力。在高等植物叶绿体中，葡糖苷酸酶(uidA，Staub和Maliga，EMBOJ.12:601_606，1993)、新霉素磷酸转移酶(nptII，Carrer等，Mol.Gen.Genet.241:49_56，1993)、腺苷-3-腺嘌呤转移酶(aadA,Svab和Maliga,Proc.Natl.Acad.Sci.，USA90:913_917，1993)和维多利亚多管发光水母(Aequoreavictoria)GFP(Sidorov等，PlantJ.19:209_216，1999)已用作报告基因(Heifetz,Biochemie82655-666,2000)。这些基因的每一个均已成为叶绿体基因表达的有用的报告子，例如分析简便、灵敏度、或原位检测表达的能力。基于这些研究，其它异源蛋白已在高等植物叶绿体中表达，例如苏云金芽孢杆菌(BacillusthuringiensisKry毒素，其赋予昆虫食草动物抗性(Kota等，Proc.Natl.Acad.Sci.，USA961840-1845，1999)，或人生长激素(Staub等，Nat.Biotechnol.18=333-338,2000)——一种潜在的生物药物。几种报告基因已表达在真核绿色藻类——莱茵衣藻的叶绿体中，包括aadA(Goldschmidt-Clermont，Nucl.AcidsRes.19:4083-40891991；Zerges和Rochaix,Mol.CellBiol.14:5268_5277，1994))、uidA(Sakamoto等，Proc.Natl.Acad.Sci.，USA90:477_501，19933，Ishikura等，J.Biosci.Bioeng.87:307_3141999)、花虫型荧光素酶(Minko等，Mol.Gen.Genet.262421-425,1999)和鲍曼不动杆菌(Acinetobacterbaumanii)的氨基糖苷磷酸转移酶aphA6(Bateman禾口Purton，Mol.Gen.Genet263:404_410，2000)。在一些情况下，本发明的载体应含有元件例如大肠杆菌或酿酒酵母(S.cerevisiae)复制起点。这些特征，与合适的选择标记组合，可使载体在靶宿主细胞和细菌和/或酵母细胞之间“穿梭”。本发明的穿梭载体在二级宿主中传代的能力可使得对载体特征进行更方便的操作。例如，含有载体和推定的插入的感兴趣多核苷酸的反应混合物可转化至原核生物宿主细胞例如大肠杆菌，使用常规方法扩增和收集并检测以鉴定含有感兴趣的插入体或构建体的载体。如果期望，载体可进一步被操作，例如，通过对插入的多核苷酸进行位点定向诱变，然后再扩增和选择具有感兴趣的突变多核苷酸的载体。然后，可将穿梭载体引入至植物细胞叶绿体，其中可表达感兴趣的多肽，如果期望，可根据本发明的方法分离。使用本领域已知的任何方法，可将本发明的多核苷酸或重组核酸分子引入至植物叶绿体。通过多种方法可将多核苷酸引入细胞，这些方法是本领域熟知的并部分地基于具体宿主细胞选择。例如，使用直接的基因转移方法，例如电穿孔或微粒介导的(生物射弹)转化，使用粒子枪或“玻璃珠方法”或通过花粉介导的转化、脂质体-介导的转化、使用创伤的或酶_降解的未成熟胚或创伤的或酶_降解的胚胎发生的愈伤组织进行的转化，可将多核苷酸引入至植物细胞(Potrykus,Ann.Rev.Plant.Physiol.PlantMol.Biol.42205-225,1991)。术语“外源的”以比较的含义用于本文以表明核苷酸序列(或多肽)是指来自不是参考来源的来源，或连接至通常不被连接的第二核苷酸序列(或多肽)或被修饰以使其以一种在参考材料中通常不相关的形式。例如，编码生物质降解酶的多核苷酸相对于植物叶绿体核苷酸序列是异源的，其是重组核酸分子的组分，其包括例如，可操作地连接至第二核苷酸序列的第一核苷酸序列，其是引入至叶绿体的突变的多核苷酸，其中突变的多核苷酸通常未在叶绿体中发现。质体转化是常规和熟知的方法，用于将多核苷酸引入植物细胞叶绿体(参见美国专利号5,451,513,5,545,817和5，545,818；W095/16783；McBride等，Proc.Natl.Acad.Sci,USA91:7301-7305,1994)。在一些实施方式中，叶绿体转化涉及引入所期望的核苷酸序列侧翼的叶绿体DNA区域，以使外源DNA同源重组入靶叶绿体基因组。在一些情况下，可以使用叶绿体基因组DNA侧翼的1至1.5kb的核苷酸序列。使用该方法，在叶绿体16SrRNA和rpsl2基因中的点突变——其赋予大观霉素和链霉素抗性，可用作转化的选择标记(Svab等，Proc.Natl.Acad.Sci.，USA87:8526_8530，1990)并可产生稳定的同质转化子，其以每100个靶叶片轰击大约一个的频率。微粒介导的转化还可用于将多核苷酸引入至植物细胞叶绿体(Klein等，Nature327:70-73，1987)。该方法利用微粒例如金或钨，其通过氯化钙、亚精胺或聚乙二醇沉淀用所期望的多核苷酸包被。使用设备例如生物射弹PD-1000粒子枪(BioRad；HerculesCalif.)，将微粒粒子以高速加速至植物组织。使用生物射弹方法用于转化的方法是本领域熟知的(参见，例如；Christou,TrendsinPlantScience1=423-431,1996)已使用微粒介导的转化，例如，以产生大量转基因植物物种，包括棉花、烟草、玉米、杂交白杨和番木瓜。重要的谷类作物，例如小麦、燕麦、大麦、高粱和水稻也已使用微粒介导的递送转化(Dimn等，NatureBiotech.14494-498,1996；Shimamoto,Curr.Opin.Biotech.5158-162,1994)。用上述方法转化大多数双子叶植物是可能的。单子叶植物的转化也可使用例如上述生物射弹方法、原生质体转化、部分透化的细胞电穿孔、使用玻璃纤维引入DNA、玻璃珠搅拌方法等等转化。可以用显性选择标记包括但不限于细菌aadA基因代替隐性rRNA或r_蛋白抗生素抗性基因提高转化频率(Svab和Maliga，Proc.Natl.Acad.Sci.，USA90:913_917，1993)。转化后通常需要大约15至20个细胞分裂周期以达到同质状态。对本领域普通技术人员显而易见的是叶绿体可含有其基因组的多拷贝，因此，术语“同质的”或“同质性”是指感兴趣的具体基因座的所有拷贝是基本上相同的状态。质体表达一其中基因通过同源重组插入至存在于每个植物细胞中的环形质体基因组的所有几千个拷贝，利用与核-表达的基因相比巨大的拷贝数优势以使表达水平能够容易超过全部可溶植物蛋白的10%。使用微观藻类——莱茵衣藻来示例本发明的方法。根据本发明的方法使用微观藻类表达多肽或蛋白复合体提供了大量的微观藻类可生长的优势，其包括商业用途(CyanotechCorp.；KaiIua-KonaHI)，从而产生大量所期望的产物，以及如果期望，可分离大量所期望的产物。但是，在任何植物的叶绿体中表达例如功能性哺乳动物多肽——包括蛋白复合体——的能力可产生这些植物的作物，并因此，具有方便地产生大量多肽的能力。因此，可使用任何具有叶绿体的植物实践本发明的方法，包括例如，大型藻类、例如，海洋藻类和海草，以及生长在土壤中的植物，例如，玉米(Zeamays)、芸苔属某种(例如，B.napus,B.rapa,B.juncea)——特别是用作种子油来源的芸苔属物种、紫花苜蓿(Medicagosativa)、7_K禾苗(Oryzasativa)、黑麦(Secalecereale)、高梁(Sorghumbicolor、Sorghumvulgare)、稷(歹Ij女口，珍珠稷(Pennisetumglaucum)、黄米(Panicummiliaceum)>小米(Setariaitalica)、禾參子(Eleusinecoracana))、向日葵(Helianthusannuus)、红花(Carthamustinctorius)、小麦(Triticumaestivum)、大豆(Glycinemax)、烟草(Nicotianatabacum)、马铃薯(Solanumtuberosum)、花生(Arachishypogaea)、棉花(Gossypiumbarbadense、Gossypiumhirsutum)、舌甘马铃薯(Ipomoeabatatus)、cassaya(Manihotesculenta)、助P口非(CofeaMft)>#(Cocosnucifera)>(Ananascomosus)、柑橘树(Citrus属些某禾中)、可可(Theobromacacao)、茶(Camelliasinensis)、香蕉(Musa属某些种)、鍔梨(Perseaultilane)、无花果(Ficuscasica)、(Psidiumguajava)>τ^(Mangiferaindica)>(Oleaeuropaea)>(Caricapapaya)>^(Anacardiumoccidentale)>(Macadamiaintegrifolia)>树(Prunusamygdalus)、甜菜(Betavulgaris)、甘蔴(Saccharum属某些种)、燕麦、浮萍(Lemna)、大麦、西红棉(Lycopersiconesculentum)、莴苣(例如，Lactucasativa)、绿J3.(Phaseolusvulgaris)、禾U马豆(Phaseoluslimensis)>i^SL(Lathyrus属某些禾中)，禾口Cucumis属的成员例如黄瓜(C.sativus)、香瓜(C.cantalupensis)，禾口甜瓜(C.melo)。观赏植物，例如杜鹃(Rhododendron属某些种)、八仙花(Macrophyllahydrangea)、木槿(Hibiscusrosasanensis)、玫瑰(Rosa属某些种)、郁金香(Tulipa属某些种)、水仙花(NarcissusMIiS禾中),Μ^Ψ(Petuniahybirda)(Dianthuscaryophyllus)、猩猩木(Euphorbiapulcherrima)和菊花也包括在内。用于实践本发明方法的另外的观赏植物包括凤仙花、海棠、天竺葵、堇菜、仙客来、马鞭草、长春花、万寿菊、报春花、非洲堇英、藿香蓟、苋菜、金鱼草、耧斗菜、瓜叶菊、苜蓿、Cosmo、豇豆、大丽花、曼陀罗、飞燕草、非洲菊、剑兰、孤挺花、松叶菊、Salpiglossos和百日菊。可以应用于实践本发明的针叶类包括例如，松树，例如火炬松(Pinustaeda)、沼泽松(Pinuselliotii)、西黄松(Pinusponderosa)、黑丰公(Pinuscontorta)禾口寸公(Pinusradiata)丰公(Pseudotsugamenziesii)；Westernhemlock(Tsugaultilane)；Sitkaspruce(Piceaglauca)；^X^·(Sequoiasempervirens)；真冷杉例如银揪(Abiesamabilis)和胶揪(Abiesbalsamea)；以及雪松例如西红雪松(Thujaplicata)和阿拉斯加黄雪松(Chamaecyparisnootkatensis)。用于实践本发明方法的豆科植物包括豆和豌豆。豆包括瓜尔豆、刺槐豆、胡芦巴、大豆、青刀豆、豇豆、绿豆、利马豆、蚕豆、小扁豆、鹰嘴豆等等。豆科植物包括但不限于落花生(Arachis)，例如花生、蚕豆(Vicia)，例如冠野豌豆、巢菜、赤豆、绿豆和鹰嘴豆、羽扇豆(Lupinus)，例如扁豆、三叶草、菜豆(Phaseolus)，例如、菜豆和利马豆，Pisum例如田野豆，草木樨(Melilotus)例如三叶草，苜蓿(Medicago)例如紫花苜蓿，莲花(Lotus)例如三叶草，lens例如小扁豆和紫穗槐。本发明方法中使用的优选饲料和草坪草包括紫花苜蓿、果园草、高羊茅、多年生黑麦草、剪股颖和糠草。用于本发明的其它植物包括金合欢(Acaci)、莳萝、朝鲜蓟、芝麻、黑莓、油菜、香菜、小柑橘、莴苣菜、桉树、茴香、葡萄柚、蜜露、豆薯、猕猴桃、柠檬、酸橙、蘑菇、坚果、黄秋葵、柑橘、欧芹、柿子、车前草、石榴、杨树、辐射松、菊苣、南方松、枫香树、橘子、黑小麦、葡萄、甘薯、苹果、梨、榲梓、樱桃、杏、甜瓜、麻、荞麦、葡萄、山莓、藜、蓝莓、油桃、桃、李、草莓、西瓜、茄子、胡椒、花椰菜、芸苔(Brassica)、例如椰菜、卷心菜、ultilansprouts、洋葱、胡萝卜、韭菜、甜菜、蚕豆、芹菜、萝卜、南瓜、菊苣、葫芦、大蒜、食荚菜豆、菠菜、南瓜、芜箐、ultilane、菊苣、落花生和西葫芦。因此，本文考虑的组合物包括宿主生物，其包括上述任何核酸。宿主生物可以是任何含有叶绿体的生物。在本文中广泛使用的术语“植物”是指含有质体，特别是叶绿体的真核生物，并包括在任何发育阶段的任何这种生物或植物的部分，包括植物切块、植物细胞、植物细胞培养物、植物器官、植物种子和小植株。植物细胞是植物的结构和生理单位，其包括原生质体和细胞壁。植物细胞可以是分离的单个细胞或培养的细胞的形式，或可以是较高组织单位的部分，例如，植物组织、植物器官或植物。因此，植物细胞可以是原生质体、产生细胞的配子或可再生为整个植物的细胞或细胞集合。同样，种子——其包括多植物细胞并能够再生为整个植物，被认为是用于本公开目的的植物细胞。植物组织或植物器官可以是种子、原生质体、愈伤组织或植物细胞的任何其它组群，其可被组织成结构或功能单位。特别有用的植物部分包括可收获的部分和用于繁殖后代植物的部分。植物可收获的部分可以是植物任何有用的部分，例如，花、花粉、幼苗、块茎、叶、茎、果实、种子、根等等。植物用于繁殖的部分包括例如，种子、果实、切块、幼苗、块茎、根状茎等等。本发明的方法可产生植物，其含有被遗传修饰的叶绿体以含有稳定整合的多核苷酸(Hager和Bock，Appl.Microbiol.Biotechnol.54:302_310，2000)。因此，本发明进一步提供转基因(转质体，transplastomic)植物，例如莱茵衣藻，其包括一个或多个含有编码一种或多种异源多肽的多核苷酸的叶绿体，所述多肽包括可特异地结合以形成功能蛋白复合体的多肽。在一些情况下，包括编码具体生物降解途径(例如，纤维素途径)单个酶的重组多核苷酸的转化子和/或转质体植物可与包括编码生物降解途径的其它酶的重组多核苷酸的转化子组合。例如，如果生物化学途径利用四个酶以从底物产生产物，可将四个转化系组合以提供那个途径的酶。这些组合可含有必要的多个转化系以包括产生整个酶途径或其部分的细胞混合物。另外，这些组合可包括不同比例的不同转化子的细胞。例如，如果降解途径的一个酶是该途径的限速步骤，细胞的组合可含有2、3、4、5、6、7、8、9、10倍或更大数量的产生限速酶的细胞。本领域普通技术人员应认识到转化子比例的多种组合可以通过简单方法获得(例如，称重干燥的转化子并组合)。可选地，单个酶可以从转化子分离(例如，“裂解”藻类转化子以分离被隔离的酶)并在分离后组合。这些方法可将酶浓度适应于不同生物质或其它底物原料，其可含有底物或其它成分的不同的相对比例。在一些情况下，由本发明转基因生物产生的蛋白在它产生后被分离。因此，本发明还考虑在叶绿体或转基因植物中产生异源多肽或蛋白复合体的方法，其可包括从植物细胞叶绿体分离表达的多肽或蛋白复合体的步骤。如本文所用，术语“分离的”或“基本上纯化”意思是所指的多肽或多核苷酸以相对不含与其天然结合的蛋白、核酸、脂类、碳水化合物或其它物质的形式。分离的多肽(或多核苷酸)可构成样品的至少百分之1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99或100。可从叶绿体分离多肽或蛋白复合体，其使用任何适合于具体多肽或蛋白复合体的方法，包括例如，盐分馏方法和层析方法例如亲和层析方法，使用特异结合多肽或蛋白复合体的配体或受体。根据本发明的方法测定产生的多肽或蛋白复合体是以分离的形式，其可使用熟知的方法进行，例如进行电泳和鉴定具体分子作为相对不连续的条带或鉴定具体复合物为一系列条带之一。因此，本发明还提供通过本发明的方法产生的分离的多肽或蛋白复合体。在一些情况下，可产生本发明的酶但被隔离在叶绿体中。在这些实施方式中，可以在“裂解”含有酶的细胞(例如，使用机械、化学和/或生物方法以破坏细胞壁)后到达有活性的酶。这些裂解的时机可计划为在由细胞产生的酶用于发挥它们的酶学能力时发生。在其它情况下，酶可以是由宿主细胞分泌。在这些情况下，酶可以直接地从生物体的培养基收集。这些培养基中存在的酶可不经纯化直接使用，可干燥(例如，空气干燥、冻干)和/或可以进行通过本领域已知的任何方法(例如，亲和层析、高效液相层析)纯化。生物质降解酶和编码那些酶的核酸的例子显示于表I。生物质降解酶的非限制性例子包括分解纤维素的酶、分解半纤维素的酶、分解果胶的酶、木聚糖酶、分解木质素的酶、纤维素酶、纤维二糖酶、软化酶(例如，内切多聚半乳糖醛酸酶)、淀粉酶、脂肪酶、蛋白酶、RNAse,DNAse、菊粉酶、裂解酶、磷酸脂肪酶、果胶酶、支链淀粉酶、葡萄糖异构酶、内切木聚糖酶、β-木糖苷酶、α-L-阿拉伯糖呋喃糖苷酶、α-葡糖苷酸酶、α-半乳糖苷酶、乙酰木聚糖酯酶和阿魏酸酯酶。编码这些酶的基因的例子包括但不限于淀粉酶、纤维素酶、半纤维素酶(例如，葡糖苷酶、内切纤维素酶、外切纤维素酶)、外切葡聚糖酶、内切-β-葡聚糖酶和木聚糖酶(内切木聚糖酶和外切木聚糖酶)。分解木质素的酶的例子包括但不限于来自黄孢原毛平革菌(Phanerochaetechryososporium)的木质素过氧化酶和锰过氧化酶。本领域普通技术人员应认识到，这些酶仅是可用于本发明的酶的部分列举。表1.生物质降解酶的例子<table>tableseeoriginaldocumentpage24</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage25</column></row><table>生物质-产生调节剂包括如在光合生物的生物中增加生物质产生的试剂。宿主细胞/生物本发明还考虑用本文的一种或多种核酸转化的宿主细胞。在优选的实施方式中，宿主细胞是光合成的。在某些情况下，宿主细胞是光合的和非维管的。在其它情况下，宿主细胞是光合和有维管的。宿主细胞可以是真核或原核的。用本文所述的载体转染宿主细胞(例如，包括一种或多种生物质降解酶和/或一种或多种生物质-产生调节剂的载体)。载体可含有质体启动子或核启动子，用于转染宿主细胞叶绿体或其它质体。载体还可编码选择性地将载体产物靶向至叶绿体或其它质体的融合蛋白或试剂。宿主细胞的转染可使用本领域已知的任何方法发生。宿主生物是包括宿主细胞的生物。在优选的实施方式中，宿主生物是光合成的。光合生物是一种天然地光合成(具有质体)的生物或被遗传工程化的或另外被修饰成光合成的生物。在一些情况下，光合生物可以是用本发明的构建体转化，其补偿了不能操作的全部或部分光合装置。在一些情况下，它是非维管和光合成的。宿主细胞可以是原核的。本发明的一些原核生物的例子包括但不限于蓝细菌(例如，聚球菌(Synechococcus)、集胞藻(Synechocystis)、螺旋藻(Athrospira))。宿主生物可以是单细胞或多细胞的。在大部分实施方式中，宿主生物是真核的(例如绿色藻类)。本文考虑的生物的例子包括但不限于红藻、绿藻、不等鞭毛藻、tribophyta、灰色藻、chlorarachniophytes、类眼虫、鞭藻、隐滴虫、双鞭藻和浮游植物。宿主生物可以在允许进行光合成的条件下生长，但是，这不是必需的(例如，宿主生物可以在缺乏光照下生长)。在一些情况下，宿主生物可以是遗传修饰的，以降低和/或破坏光合能力的方式进行遗传修饰(参见以下例子)。在宿主生物不能进行光合成的生长条件下(例如，由于缺乏光和/或遗传修饰)，通常地，应给生物提供必要的营养物以支持其在缺乏光合成条件下的生长。例如，向生物生长其中(或其上)的培养基中可添加任何所需的营养物，包括有机碳源、氮源、磷源、维生素、金属、脂质、核酸、微营养物或生物特异性需要。有机碳源包括宿主生物能够代谢的任何碳源，包括但不限于醋酸盐、简单的碳水化合物(例如，葡萄糖、蔗糖、乳糖)、复杂的碳水化合物(例如，淀粉、糖原)、蛋白和脂质。本领域普通技术人员应认识到，不是所有的生物都能够充分代谢特定的营养物，以及从一种生物到另一种生物可能需要修饰营养物混合物以提供合适的营养物混合物。宿主生物可生长在陆地上，例如，水池、沟渠、堆填池或封闭或部分封闭的生物反应器系统。本文的宿主生物也可直接生长在水中，例如，在海洋、海水、湖泊、河流、水库等等。在藻类大量培养的实施方式中，藻类可在高密度光生物反应器中生长。大量培养藻类的方法是已知的。例如，藻类可以在高密度光生物反应器(参见，例如，Lee等，Biotech.Bioengineering44:1161_1167，1994)和其它生物反应器(例如用于污水和废水处理的反应器)(例如，Sawayama等，Appl.Micro.Biotech.,41:729_731，1994)中生长。另外，藻类可以被大量-培养以去除重金属(例如，Wilkinson，Biotech.Letters,11:861_864，1989)、氢(例如，美国专利申请发明者B·奥奈尔,K·米克尔森,M·门德斯,S·梅菲尔德,Y·潘申请人:蓝宝石能源公司;斯克里普斯研究学院