专利名称：低过敏原谷蛋白及其用途的制作方法
技术领域：
本发明涉及低过敏原谷蛋白以及低过敏原谷蛋白在预防过敏反应和处于发生此 类过敏反应风险中的年轻哺乳动物对谷蛋白发生过敏反应中的用途。
背景技术：
食物过敏反应在大多数情况下是由于与食物中的蛋白质反应引起的，其中生活中 发生占第一位的是牛奶过敏。在生命的早期，免疫系统仍然处于发育阶段并且可能难以发 生对食物性抗原的耐受性(这还可以描述为口服耐受诱导不足)。结果是婴儿或儿童或年 轻动物发生对膳食蛋白质过渡的免疫响应并且对其发生过敏响应。食物过敏不仅可以影响 人类而且可以影响其它哺乳动物、例如狗和猫。通常食物超敏反应恰在易感婴儿、儿童或年轻动物第一次遇到含有潜在过敏原的 新食物后出现。除其母乳外，人婴儿通常遇到的第一种膳食蛋白质至少是牛奶蛋白质，并且 如上所述，牛奶过敏是人婴儿中最常见的食物过敏。通常可接受的是具有确立的牛奶过敏 的婴儿具有发生特应性疾病和对其它膳食蛋白质、例如鸡蛋和谷蛋白过敏的风险增加，而 甚至那些具有成功发生对牛奶蛋白质口服耐受的婴儿随后可能发生对其它膳食蛋白质、例 如鸡蛋和谷蛋白的过敏，此时这些膳食蛋白质、例如鸡蛋和谷蛋白在断奶时被掺入饮食。这 些过敏反应自身在临床上可以表现为特应性疾病例如特应性皮炎、湿疹和哮喘。从膳食观点来看，存在治疗确立的过敏反应的两种方式_必须完全避免含有过敏 原的食物；或必须处理食物以减少其过敏可能性，例如通过广泛水解。为这一后面的目的生 产含有广泛水解的牛奶蛋白质的婴儿配方(由不超过5种氨基酸组成的肽)。类似地，例如 在美国专利US6403142中已经提出了为预计动物发生食物过敏的陪伴动物制备具有降低 过敏原性的宠物食物。但是，对有助于降低首先发生过敏反应风险的产品存在需求，即它促进对完整蛋 白质的耐受性发生，特别是对认为处于同样情况的儿童而言(即具有至少一位患有过敏反 应的亲近家族成员的儿童)。例如，提出喂养部分水解的牛奶蛋白质以诱导婴儿对牛奶蛋 白质的口服耐受。Fritsch6 等人(J. Allergy Clin. Immunol，第 100 卷，No. 2，第 266-273 页，1997)已经应用动物模型证实具有18%水解度的牛奶蛋白质的酶水解产物能够诱导对 完整牛奶蛋白质的口服耐受，而具有28%水解度的水解产物则不能。这些试验结果显示应 用此类中度水解的牛奶配方(其过敏原性已经比标准配方降低了 100倍以上)预防性喂饲 大鼠抑制了特异性IgE和从肠肥大细胞的介体释放，即即刻型过敏反应的两种参数。已经提出了多种其它手段改善对牛奶蛋白质的口服耐受的诱导并且由此预防了 对其过敏反应的发生，包括如W02003/099037中提出的施用益生菌和如W002/051437中提 出的施用能够增加C0X-2活性的化合物。如上所述，除其母乳外，年轻哺乳动物通常遇到的第一种膳食蛋白质是来自其它 动物的乳蛋白，例如就人婴儿而言是牛奶。通常，然后遇到的膳食蛋白质是在断奶时掺入的 谷蛋白，对人婴儿而言典型地是婴儿谷物的形式。尽管已经成功地掺入了乳蛋白，但是谷蛋 白在第一次掺入年轻哺乳动物膳食时也可能引起过敏反应。特别的是，小麦中的蛋白质白蛋白、球蛋白、麦谷蛋白和麦醇溶蛋白与人婴儿中发生过敏反应相关。这些蛋白质中偶合特 定特征的谷蛋白的特异性过敏原性特性诱导发生从事其过敏原性的特异性过程和产物的 特异性需求。但是，通过与乳蛋白比较，对一级预防对谷蛋白的过敏反应的确立几乎没有给予 关注。实际上，甚至更多给予的关注在于对牛奶蛋白质的过敏反应通常在2岁至5岁之间 自发地消失，而对谷蛋白的过敏反应通常较为缓慢地消失并且甚至可能持续一生。由此谷 蛋白和乳蛋白的过敏原特性是不同的。因此，本发明的目的是提供预防处于风险中的年轻 哺乳动物对谷蛋白的过敏反应的方法。本发明的一个目的是提供一种制品，其基于用于减少过敏反应和/或诱导口服耐 受(特别是在处于通常对蛋白质并且特别是对谷蛋白发生过敏反应的婴儿和年轻哺乳动 物中)的谷蛋白的部分水解产物。本发明的一个目的是提供液体或易于在水或奶中重构的干燥产品形式的低过敏 原谷制品。本发明的进一步的目的是提供也是低过敏原的基质中的此类制品。发明概述因此，本发明在第一个方面中提供了谷蛋白的部分水解产物，其中该水解产物具 有9至18%之间的水解度。本发明在第二个方面中提供了制备谷蛋白的部分水解产物的方法，该方法包括将 谷物粉与水混合、进行初步加热处理、加入纯化的蛋白酶以及在40至70°C之间的温度下将 该混合物水解30分钟至240分钟，得到具有9至18%之间的水解度的部分水解产物。本发明在第三个方面中提供了谷物产品，包含按干物质的重量百分比计算1至 100%的谷物粉、优选15至100%的谷物粉，其中蛋白质是部分水解的并且具有9至18%之 间的水解度；0至40 %的糖；0至30 %的淀粉；和0至30 %的脂肪；以及1至85 %的水。该 产品可以是流体或者具有粘度和半流质食物的结构。在一个实施方案中，该产品是干燥或 基本上干燥的粉末形式。本发明在第四个方面中提供了一级预防年轻哺乳动物对谷蛋白的过敏反应的方 法，该方法包括给年轻哺乳动物喂饲治疗量的谷蛋白的部分水解产物，该水解产物具有9 至18%之间的水解度。优选谷蛋白的部分水解产物的水解度是11至16%之间。附图简述
图1显示完整和水解的稻米(rice)蛋白的SDS-PAGE分析；图2显示完整和水解的小麦蛋白的SDS-PAGE分析；图3显示本发明的水解的稻米蛋白的残留过敏原性；图4显示本发明的水解的小麦蛋白的残留过敏原性；图5a和5b比较了用本发明的水解的稻米蛋白得到的肠肥大细胞水平与用完整的 稻米蛋白得到的肠肥大细胞水平的体内耐受容量；并且图6比较了用本发明的水解的小麦蛋白得到的肠肥大细胞水平与用完整的小麦 蛋白得到的肠肥大细胞水平的体内耐受容量。图7比较了用不同浓度的本发明的水解的小麦蛋白得到的肠肥大细胞水平与用 完整/天然的小麦蛋白得到的肠肥大细胞水平的体内耐受容量。
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发明详述在本说明书中，下列术语具有如下含义“谷蛋白”指的是在谷物例如稻米、小麦、燕麦、玉米、大麦、黑麦以及它们的混合物 中发现的有膳食价值的任何和所有蛋白质；蛋白质的“水解度”或“DH”指的是表示为百分比的在水解过程中裂解的完整的蛋 白质中的肽键的数量除以完整的蛋白质中的肽键数量；“低过敏原的(HA)谷蛋白”指的是部分水解的谷蛋白，其过敏原性至少低于完整的 谷蛋白的过敏原性100倍(与涉及乳蛋白的EU Directive96/4/EC规定类似)；“ 口服耐受”指的是对通过口服途径递送的抗原的免疫学低响应的活性状态；“对谷蛋白的过敏反应的一级预防”指的是防止此类过敏反应的建立并且包括此 类过敏反应风险的降低；“纯化的蛋白酶”指的是未受到其它能够水解碳水化合物例如α _淀粉酶的酶污染 的蛋白酶；“糖”指的是用于谷物产品以提供甜味的碳水化合物，包括但不限于蔗糖、葡萄糖 和果糖；除非另作陈述，否则所有涉及的百分比均为重量百分比。在上下文本发明产品中 具体成分的“干重百分比”指的是表示为产品中总干物质百分比的成分的量。本发明提供了谷蛋白的部分水解产物，其具有9至18%之间、优选11至16%之间 的DH。该谷物可以是用于膳食目的的任何谷物，包括稻米、小麦、燕麦、玉米、大麦、黑麦以及 它们的混合物。本发明的谷蛋白的部分水解产物可以具有的过敏原性比完整的谷蛋白下降了至 少100倍，正如通过Fritsch6等人所述技术测定的(Int. Arch. Allerand Appl Imm. ,93, 289-293，1990)。因此，可以将这些部分水解的谷蛋白和包含它们的产品描述为低过敏原性 的。可以通过本领域公知的任何适合的方法制备本发明的谷蛋白的部分水解产物。适 合的原料是谷物粉，例如小麦粉或稻米粉。粉的粒度测量并不关键，并且粒度可以在例如 200至500mcm之间不同。制备本发明的部分谷物水解产物的方法的实例如下将谷物粉与水混合并且将该 混合物加热至60至65°C的温度范围达10分钟，然后冷却至55°C。加入蛋白酶例如细菌 丝氨酸内切蛋白酶枯草杆菌蛋白酶(例如在商标Alcalase 下销售)，并且将该混合物在 55°c下保持2小时。然后将温度升至70至75°C并且在此处保持10分钟。再次将混合物冷却 至55°C，并且加入不同的蛋白酶例如来自解淀粉芽胞杆菌(Bacillus amyloliquefaciens) 和地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)的细菌蛋白酶的混合物(购自NovozymesA/S Bagsvaerd, Denmark,商标ProtameX )。将该混合物在55°C下再保持2小时，然后将温 度升至85至95°C之间并且保持在此处30分钟，以使酶失活并且终止水解。由此得到的部 分水解的谷蛋白是液体形式并且可以以这种状态应用或者可以通过本领域公知的任何适 合的技术干燥例如滚筒干燥、喷雾干燥或挤出。可以通过挤出步骤进一步加工本发明的部分谷物水解产物或由其制备的产品。可 以应用任何本领域一般公知的挤出方法和设备。但是，优选挤出步骤应用双螺杆挤出机进
5行，速度为200至260rpm，温度在130°C至150°C之间，产品流速在6至8kg/小时之间，水流 速为7至IlmL/分钟，并且压力在50至150巴之间。挤出步骤能够得到产品的特别结构， 其具有特别的物理特征，例如溶出时间、一旦重构的粘度等。用于制备本发明谷蛋白的部分水解产物的特别优选的方法包括将谷物粉与水和 缓冲剂(优选pH在7. 0至8. 0之间)混合、进行预先(首次)加热处理(不过是任选的)、 加入纯化的蛋白酶并且将该混合物在40至80°C之间或40°C至70°C之间的温度下(第二次 加热处理)保持30分钟至240分钟，得到具有9至18%之间的水解度的部分水解产物。在本发明的一个实施方案中，预先(首次)加热处理在40°C至90°C之间、优选在 60°C至80°C之间进行1至8小时之间、优选2至3小时之间的时间期限。在本发明的一个实施方案中，上述第二次加热处理被进行性加热处理代替将温 度历经2至5小时之间、优选3至4小时之间的时间期限从环境温度缓慢升至70°C或80°C。 温度增加速率可以为0. 05 0C /分钟至0. 40 0C /分钟之间、优选0. 08至0. 3°C /分钟之间并 且最优选0. IO0C /分钟至0. 15°C /分钟之间。任选平台期可以用于使水解产物在进一步 的时间期限过程中(1、2、3或5小时)在加热处理的最终温度下保持。加热处理的最佳温度高度取决于所用的谷蛋白和酶的性质。注意到高于70°C酶活 性可能下降。纯化的蛋白酶可以是细菌蛋白酶，其没有被α -淀粉酶污染，所述的α -淀粉酶例 如在商标Alcalase AF (Novozymes A/S Bagsvaerd,Denmark)下销售的酶,或者动物来 源的蛋白酶例如胰蛋白酶。正如本领域技术人员可以理解的，预先加热处理的目的在于促进蛋白质分子解折 叠，从而使它们更易于进行随后的酶水解。预先加热处理可以包括例如在50至130°C之间 的温度在热交换器中加热15秒至10分钟或者应用直接注入蒸汽。优选水解在50至80°C之间的温度进行30至180分钟、优选60分钟至120分钟。 但是，也可以考虑较长时间期限，例如4或5小时。在某些情况中，极短时间期限(10或15 分钟)可能有益。可以应用本发明的谷蛋白的部分水解产物代替年轻哺乳动物例如人婴儿和幼儿 以及年轻陪伴动物例如狗和猫的食物产品中的完整的谷蛋白。本发明扩展至产品，该产品包含按干物质重量百分比计算，1至100%的谷物粉、 优选15%至100%，其中蛋白质是部分水解的并且具有9至18%的水解度；0至40%的糖； 和0至30%的脂肪；以及1至85%的水。本发明的产品可以包含天然或水解的淀粉。水解的淀粉可以自然增加水解的蛋白 质谷物的量。本发明的产品可以是流体(液体)形式。它们可以易于销售给消费者(无需进一 步稀释)。本发明的产品可以是脱水的粉末形式，其通过用水或奶重构制备用于消耗。本发明的产品可以是挤出的零食产品形式，特别是用于幼儿消费。当本发明的产品是用液体(水或奶)重构的脱水即食用粉末或液体谷物产品的形 式时，本发明覆盖的粘度范围为OmPa · s至4000mPa · s、优选在1000至3500mPa · s之间。 就断奶后食物而言，优选达到的粘度在2000至3000mPa · s之间。可以通过任何已知的标准方法进行粘度测量。对用水稀释的15.6%固体的产品在601、5011)111、10分钟测量上述值。本发明的脱水的谷物粉优选包含70至80%的谷物粉、10至30%的糖(优选15% 至20% )、2至10%的脂肪和1至3%的水(优选2%至3% )。此类产品还可以包括至多 20%的淀粉。它们以脱水形式销售并且通过与液体奶(或者奶粉和水的混合物)混合再水 化，形成易于消费的半流质食物。优选应用本发明的谷物产品、水和低过敏原性婴儿配方奶粉(即包含部分水解的 乳蛋白的婴儿配方)并且依据Directive 96/4/EC的要求制备半流质食物。可选择的是，如 果可利用，则备用喂养液体HA婴儿配方可以用于重构谷物产品。这具有提供基于谷物的过 敏原性基本上降低的断奶后食物的优点，因为食物中的所有蛋白质均已进行了部分水解。还可以通过将本发明的谷物产品与其它包含蛋白质的低过敏原性制品混合制备 半流质食物。在本发明的一个实施方案中，提供了本发明的谷蛋白的部分水解产物与低过敏原 性蛋制品。在另一个实施方案中，其它低过敏原性制品可以包括低过敏原性奶或低过敏原性 婴儿配方。在另一个实施方案中，本发明的谷蛋白的部分水解产物包括低过敏原性蛋制品和 低过敏原性奶或婴儿配方。低过敏原性蛋制品可以如专利公开文献EP1867237A1和W02007/144397A1中所述。低过敏原性婴儿配方可以是包含部分水解的乳蛋白并且依据DirectiVe96/4/EC 要求的婴儿配方。这具有提供基于谷物_蛋的过敏原性基本上降低的断奶后食物的优点， 因为食物中的所有蛋白质均已进行了部分水解。在另一个实施方案中，谷物产品进一步包含乳固体。可以通过与水混合制备这种 用于简单消费的产品。此外，如果存在，则优选乳固体由低过敏原性婴儿配方提供。本发明的液体谷物产品优选包含5至10%的谷物粉、2至7%的乳固体、至多15% 的脂肪、至多的30%糖、至多的5%淀粉和75至90%的水。可以将这种产品命名为谷物乳 饮品并且典型地易于以单一服务用纸版盒或瓶消费的形式销售。乳固体优选由低过敏原性 婴儿配方提供。本发明的谷物产品可以包含淀粉。如果存在淀粉，则它可以是天然淀粉或如本领 域公知的方式制备的部分水解的淀粉，例如来自美国专利US4，374，860。淀粉的水解度可以 包括DE 5至55之间或DE 20至45之间并且最终在DE 25至35之间。优化淀粉的水解度 以得到本发明最终应用的正确感觉和理化特性。如果期望具有部分水解的淀粉和部分水解 的蛋白的产品，则用作原料的谷物粉可以进行两次水解，一次涉及淀粉并且另一次涉及蛋 白质。这些水解可以同时或依次进行。除例如如上所述那些谷物产品外，本发明的谷蛋白的部分水解产物还可以用作例 如谷物粉形式的成分，其中在通常包含谷物粉的任何食物产品例如意大利面食、面包、蛋 糕、饼干等中蛋白质是部分水解的并且具有9至18%之间的水解度。如上所述，对谷蛋白过敏发生的一级预防依赖于对蛋白质的口服耐受的成功诱导。本发明人认为这反过来可以通过攻击部分水解的蛋白质残留的过敏原性与其诱导口服 耐受的能力之间的平衡实现。通常，水解的蛋白质的残留过敏原性应当至少低于完整蛋白 质过敏原性100倍。不受理论约束，本发明人已经证实蛋白质的性质显著影响能够增强过敏反应一级 预防和诱导口服耐受的最佳水解度。蛋白质不仅在分子量上不同，而且特别地在其序列、疏 水-亲水度、三维结构、PKa和许多其它特征方面不同。因此，即使可能，预测口服耐受也是 困难的。另外，过敏原性的分布/潜能在蛋白质家族之间和内部显著不同。另外，蛋白质/ 宿主相互作用和免疫系统反应在不同蛋白质之间可以极为不同。因此，有关例如乳蛋白的 知识不能直接再应用于谷蛋白。现在参照下列实施例进一步描述本发明。部分谷物水解产物的制备实施例1将IOkg稻米粉(根据美国专利US4，374，860预处理以部分水解碳水化合 物内容物)和23kg水混合并且在55°C下加热。制备缓冲试剂(Na(OH)2或K(OH)2或 Ca(OH)2)的溶液并且加入至混合物中以进行PH调节。加入5e/oProtamex 酶(批号 PW2A1006, Novozymes A/S Bagsvaerd, Denmark)并且将混合物在 55°C下保持 2 小时。第 一次水解步骤后，将混合物在90°C下加热10分钟。然后将该混合物冷却至55°C，加入 50/oFlaVOUrzyme 1000L 酶(批号 400904，Novozymes A/S Bagsvaerd, Denmark)并且
将混合物在55°C下保持2小时。第二次水解步骤后，将混合物在90°C下加热30分钟，然后 喷雾干燥，得到包含部分水解的稻米蛋白的具有DH 14. 2%的粉末，将其包装在铝袋中。实施例2将IOkg稻米粉(根据美国专利US4，374，860预处理以部分水解碳水混合物内容 物)和23kg水混合并且在55°C下加热。制备缓冲试剂(Na(OH)2或1((0!1)2或Ca(OH)2)的 溶液并且加入至混合物中以进行PH调节(至pH7.8)。加入10G/oAlcalase 2.4 IJI (批 号500357，Novozymes A/S Bagsvaerd, Denmark)并且将混合物在55°C下保持2小时。这第 一次水解步骤后，将混合物在90°C下加热10分钟。然后将混合物冷却至55°C，再加入10% Alcalase酶并且将混合物在55°C下保持2小时。这第二次水解步骤后，将混合物在90°C下 加热30分钟，然后喷雾干燥，得到包含部分水解的稻米蛋白的具有DH 15. 9%的粉末，将其 包装在铝袋中。实施例3将IOkg稻米粉(根据美国专利US4，374，860预处理以部分水解碳水化合物内容 物)和23kg水混合并且在55°C下加热。制备缓冲试剂(Na(OH)2或1((0!1)2或Ca(OH)2)的 溶液并且加入至混合物中以进行PH调节(pH7.8)。加入5β/ο Alcalase 2.4 L酶(批 号 500357，Novozymes A/S Bagsvaerd, Denmark)并且将混合物在 55°C下保持 2 小时。这 第一次水解步骤后，将混合物在90°C下加热10分钟。然后将混合物冷却至55°C，再加入 5%Protamex 酶(批号 PW2A1006，Novozymes A/S Bagsvaerd, Denmark)并且将混合 物在55°C下保持2小时。这第二次水解步骤后，将混合物在90°C下加热30分钟，然后喷雾 干燥，得到包含部分水解的稻米蛋白的具有DH 11. 2%的粉末，将其包装在铝袋中。实施例4
将15kg小麦粉(根据美国专利US4，374，860预处理以部分水解碳水化合 物内容物)和70kg水混合并且在55 °C下加热。制备缓冲试剂(Na(OH)2或K(OH)2或 Ca(OH)2)的溶液并且加入至混合物中以进行PH调节。加入SG/eProtamex 酶(批号 PW2A1006, Novozymes A/S Bagsvaerd, Denmark)并且将混合物在 55°C下保持 2 小时。这 第一次水解步骤后，将混合物在90°C下加热10分钟。然后将混合物冷却至55°C，加入 5%Flavourzyme IOOOl酶(批号 400904，Novozymes A/S Bagsvaerd, Denmark)并 且将混合物在55°C下保持2小时。这第二次水解步骤后，将混合物在90°C下加热30分钟， 然后喷雾干燥，得到包含部分水解的小麦蛋白的具有DH 12. 7 %的粉末，将其包装在铝袋 中。实施例5 (并非本发明的组成部分)将15kg小麦粉(根据美国专利US4，374，860预处理以部分水解碳水化合物内容 物)和70kg水混合并且在55°C下加热。制备缓冲试剂(Na(OH)2或K(OH)2或Ca(OH)2)的 溶液并且加入至混合物中以进行PH调节。加入10%Alcalase 2.4 L酶(批号500357， Novozymes A/S Bagsvaerd, Denmark)并且将混合物在55°C下保持2小时。这第一次水解步 骤后，将该混合物在90°C下加热10分钟。然后将混合物冷却至55°C，再加入10% Alcalase 酶并且将混合物在55°C下保持2小时。这第二次水解步骤后，将混合物在90°C下加热30分 钟，应用4kDa膜进行超滤，然后喷雾干燥，得到包含广泛水解的小麦蛋白的具有DH 20. O % 的粉末，将其包装在铝袋中。实施例6将15kg稻米粉、70kg水和用于pH调节的缓冲试剂(Na (OH) 2或K (OH) 2或Ca (OH) 2) 的溶液混合并且通过蒸汽注入加热几秒。加入5e/oAIcalase 2.4 L AF酶(批号 RBN00013, Novozymes A/S Bagsvaerd, Denmark)并且将混合物在 60°C下保持 1 小时。该水 解步骤后，将混合物通过蒸汽注入再次加热几秒。然后将混合物滚筒干燥，得到包含部分水 解的稻米蛋白的具有DH 13. 2 %的粉末，将其包装在铝袋中。实施例7将15kg小麦粉、70kg水和用于pH调节的缓冲试剂(Na (OH) 2或K (OH) 2或Ca (OH) 2) 的溶液混合并且通过蒸汽注入加热几秒。加入5e/oAlcalase 2.4 L AF酶(批号 RBN00013, Novozymes A/S Bagsvaerd, Denmark)并且将混合物在 60°C下保持 2 小时。该水 解步骤后，将混合物通过蒸汽注入再次加热几秒。然后将混合物滚筒干燥，得到包含部分水 解的小麦蛋白的具有DH 11 %的粉末，将其包装在铝袋中。实施例8将15kg谷物粉混合物(稻米、小麦)、70kg水和用于pH调节的缓冲试 剂(Na(OH)2或K(OH)2或Ca(OH)2)的溶液混合并且通过蒸汽注入加热几秒。加入 5%Alcalase 2.4 L AF酶(批号 RBN00013，Novozymes A/SBagsvaerd, Denmark)并 且在60°C下将混合物泵送通过连续管道，保持时间1小时。该水解步骤后，将混合物通过蒸 汽注入再次加热几秒。然后将混合物喷雾干燥，得到包含部分水解的稻米和谷蛋白的具有 DH 9. 2%的粉末，将其包装在铝袋中。实施例9将25kg小麦粉和70kg水混合并且在130 °C下加热。加入
95%Alcalase 2.4 L AF酶(批号 RBN00013，批号 500357，Novozymes A/SBagsvaerd, Denmark)并且将混合物温度从60°C增加至80°C达3小时( 0. 11°C /分钟)。该水解步 骤后，将混合物在90°C下加热15分钟。然后将混合物冷却至60°C以用于配制步骤，然后进 行滚筒干燥，得到包含部分水解的小麦蛋白的粉末，将其包装在铝袋中。实施例10将15kg谷物粉(稻米、小麦)和乳蛋白以及70kg水和用于pH调节的缓冲 试剂(Na(OH)2或K(OH)2或Ca(OH)2)的溶液混合并且通过蒸汽注入加热几秒。加入 50/oAlcalase 2.4 L AF酶(批号 RBN00013，Novozymes A/SBagsvaerd, Denmark)并且 将混合物在60°C下保持1小时。该水解步骤后，将混合物通过蒸汽注入再次加热几秒。然 后将混合物进行滚筒干燥，得到水解的谷物粉末，将其包装在铝袋中。实施例11将20kg小麦粉(根据美国专利US4，374，860预处理以部分水解碳水化合物内容 物)和30kg水以及用于pH调节的缓冲试剂(Na(OH)2或K(OH)2或Ca(OH)2)的溶液混合，加 入50/oAlcalase 2.4 L AF酶(批号 RBN00013，NOVOZYMES A/S Bagsvaerd, Denmark) 并且将混合物在60°C下保持2小时。该水解步骤后，将混合物加热至90°C达15分钟。在 混合物中加入蔗糖、淀粉和脂肪；将最终混合物通过蒸汽注入加热处理几秒，然后进行滚筒 干燥并且研磨，得到水解的谷物粉末，将其包装在铝袋中。实施例12将20kg小麦粉(根据美国专利US4，374，860预处理以部分水解碳水化合物内容 物)和30kg水以及用于pH调节的缓冲试剂(Na(OH)2或K (OH) 2或Ca (OH)2)的溶液与4kg未 处理的小麦粉混合并且通过蒸汽注入加热几秒；加入5e/oAlcalase 2.4 L AF酶(批 号 RBN00013,NOVOZYMES A/SBagsvaerd,Denmark)并且将混合物在 60°C下保持 2 小时。该 水解步骤后，将混合物加热至90°C达15分钟。在混合物中加入蔗糖、淀粉和脂肪；将最终 混合物通过蒸汽注入加热处理几秒，然后进行滚筒干燥并且研磨，得到水解的谷物粉末，将 其包装在铝袋中。包含谷蛋白的部分水解产物的谷物产品实施例13本发明的谷物产品的组合物的实施例如下(非水成分的重量基于干物质给出)具有部分水解的蛋白质内容物的稻米粉(实施例6) 60%糖12%天然马铃薯淀粉15%脂肪混合物10%维生素/矿物预混合物0. 5 %水2.5%实施例14本发明的谷物产品的组合物的另一个实施例如下(非水成分的重量基于干物质 给出)具有部分水解的蛋白质内容物的米粉(实施例6) 75%糖15%
脂肪混合物 7%维生素/矿物预混合物 0. 5%水 2. 5%实施例13和14的产品可以通过将实施例6 (对于实施例13)或实施例3和4 (对 于实施例14)中得到的产物混合而制备，在脂肪和糖的情况中不进行最终干燥步骤。如对 于常规的谷物产品，将混合物加热处理，滚筒干燥并且研磨。在这点上可以通过干燥混合加 入任何热或湿度敏感性成分，例如维生素或益生菌。实施例15本发明的谷物产品的组合物的另一个实施例如下(非水成分的重量基于干物质 给出)具有部分水解的蛋白质内容物的小麦粉(实施例7) 75%糖15%脂肪混合物7%维生素/矿物预混合物0. 5 %水2.5%实施例16本发明的液体谷物产品的组合物的实施例如下(非水成分的重量作为干物质百 分比指定)具有部分水解的蛋白质内容物的稻米粉(实施例3) 0. 5%具有部分水解的蛋白质内容物的小麦粉(实施例4) 5%HA 婴儿配方12.5%天然淀粉1.5%维生素/矿物预混合物0. 5 %/K80%实施例17本发明的液体谷物产品的组合物的实施例如下(非水成分的重量作为干物质百 分比指定)具有部分水解的蛋白质内容物的稻米粉(实施例3) 0. 5%具有部分水解的蛋白质内容物的小麦粉(实施例4) 5%水解的乳清蛋白1.5%脂肪混合物3.5%乳糖7.5%天然淀粉1.5%维生素/矿物预混合物0. 5 %/K80%实施例16和17的产品可以通过在水中将部分水解的稻米和小麦粉与水解的乳 清蛋白、乳糖、淀粉以及矿物和维生素预混合物混合而制备。然后将产物混合物预温热至 70°C，在线上加入脂肪混合物(仅实施例17)并且将产物进行UHT处理，然后冷却。在冷却 期过程中，将产物在250/50下勻化，然后进一步冷却至环境温度，然后在无菌条件下包装
11入纸板盒等容器中,
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实施例18
本发明的谷物产品的组合物的另-
卜实施例如下(非水成分的重量基于干物质
具有部分水解的蛋白质和淀粉内容物的小麦粉(实施例12)75%
马铃薯淀粉19%
脂肪混合物2%
酶0. 5%
维生素/矿物预混合物0.4% 缓冲盐 0.1% 水 3% 实施例19
本发明的谷物产品的组合物的另一个实施例如下(非水成分的重量基于干物质
具有部分水解的蛋白质的小麦粉(实施例4)50%
具有部分水解的蛋白质的奶(根据专利US5039532)20%
具有部分水解的蛋白质的蛋(根据专利W02007/144397A1)10%
马铃薯淀粉14%
脂肪混合物2%
酶0. 5%
维生素/矿物预混合物0.4%
缓冲盐0.1%
水3% 实施例20
本发明的谷物产品的组合物的另一个实施例如下(非水成分的重量基于干物质
具有部分水解的蛋白质和淀粉内容物的小麦粉(实施例12) 65% 蔗糖10%
马铃薯淀粉19%
脂肪混合物2%
酶0. 5%
维生素/矿物预混合物0.4%
缓冲盐0.1%
水3%
通过凝胶电泳分析蛋白质/肽
通过SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)、应用NuPAGE12% Bis-Tris凝胶和 Silverstaining检验酶水解对稻米和小麦粉中的蛋白质的作用。结果如图1(稻米)和 2 (小麦)中所示。在图1中，泳道5相应于实施例1的水解产物，泳道6相应于实施例2的 水解产物并且泳道4相应于实施例3的水解产物。在图2中，泳道3相应于实施例4的水解产物并且泳道4相应于实施例5的水解产物。这些图显示在所有情况中，与完整稻米或 小麦粉相比，水解法明显消除了部分水解产物中的蛋白质带。通过Kjeldahl方法测定水解产物中的总氮。通过Adler-Nissen的TNBS方法测 定水解度(J. Agric. Food. Chem. 27 1256-1262，1979)。谷物水解产物的残留过敏原性从致敏大鼠肥大细胞的氚标记的5-羟色胺的释放的功能性体外测定用于测定部 分水解前后来自稻米和小麦的潜在抗原分子的IgE依赖性过敏原性。在稻米的情况中，应 用全蛋白质级分，在小麦的情况中，研究集中于麦醇溶蛋白，即已知涉及小麦过敏发生的小 麦蛋白。简而言之，该方法如下在250mL烧瓶中在RPMI中培养RBL-2H3细胞。为了进行脱 粒测定，除去培养基，在细胞层中加入4mL胰蛋白酶-EDTA并且在37°C温育10分钟。轻度 振摇以分离细胞，加入6mL RPMI并且混合。将9. 5mL分配在15mL蓝顶Falcon试管中；在 310g下离心5分钟(Sorvall，转子75006445)。弃去上清液，在细胞沉淀中加入IOmLRPMI, 混合，以310g离心5分钟。弃去上清液，向细胞沉淀中加入IOmLRPMI,混合，计数细胞并且 再以4 X 105/mL悬浮于RPMI中。将100 μ L该细胞悬浮液分配至96孔Costar板的各孔中。 在37 °C下将板温育过夜。从各孔中取出50 μ L培养基并且用包含IyL 3Η 5_羟色胺的50 μ L大鼠抗-过 敏原(麦醇溶蛋白/稻米蛋白)IgE抗血清代替；在37°C下温育2小时。用250 μ L HBSS 将全部孔轻轻洗涤两次，完全除去上清液并且加入150 μ L用HBSS稀释的过敏原标准品/ 样品/HBSS/TritonX0在37°C下温育45分钟，在140g下离心8分钟(Mistral 2000)并且 将50 μ L上清液转移至Optiplate中。加入200 μ L Microsint 40,混合并且计数放射性 (TopcountPackard β -计数器)。结果如图3和4中所示，从其中可以观察到部分水解的谷物与相应的完整谷蛋白 相比具有大大降低的过敏原性。8-25 μ g稻米蛋白抗原/g蛋白质25-175 μ g麦醇溶蛋白/g蛋白质将结果表示为每克蛋白质能够触发肥大细胞的稻米蛋白/麦醇溶蛋白的量。在图3中，从左到右，第二个棒形图获自实施例3的水解产物，第三个棒形图获自 实施例1的水解产物并且第四个棒形图获自实施例2的水解产物。在图4中，从左到右，第 二个棒形图获自实施例4的水解产物并且第三个棒形图获自实施例5的水解产物。通过喂饲谷蛋白水解产物诱导对谷蛋白的口服耐受应用体内大鼠模型研究部分水解的谷物产品诱导口服耐受的能力。在本试验的第 1、2、3、8、9和10天通过管饲法给予Sprague-Dawley大鼠组(6只动物/组)(用不含谷蛋 白的膳食喂养)不同的试验用液体谷蛋白/谷物水解产物或水(对照组)。在本试验的第 14天通过皮下注射0. Img抗原(麦醇溶蛋白/稻米蛋白)+0. 2mL 3 % Al (OH) 3给全部大鼠 免疫。在第28天时，在全部动物中用完整麦醇溶蛋白/稻米蛋白进行口服攻击2小时，然 后处死。在IgE介导的肠肥大细胞触发后，大鼠肥大细胞蛋白酶(RMCPII)释放入血液。口 服攻击以释放RMCPII是在肠肥大细胞水平测量IgE致敏或耐受(Tolerisation)状态。用商购的 ELISA 试剂盒(Moredun Animal HealthLtd.，Edinburgh, Scotland)、基于“夹心 ELISA”原理测定RMCPII水平，其中用单克隆抗-RMCPII抗体包被板，然后加入试验血清和 偶合辣根过氧化物酶的第二羊抗-RMCPII多克隆抗体。试验1 用部分水解的稻米蛋白的耐受通过管饲法在第1、2、3、8、9、10天施用下列产品A组完整稻米蛋白(稻米粉)B组来自实施例1的部分水解的稻米蛋白C组来自实施例2的部分水解的稻米蛋白D 组H20试验2 用部分水解的小麦蛋白的耐受用管饲法在第1、2、3、8、9、10天施用下列产品A组完整小麦蛋白(小麦粉)B组来自实施例5的广泛水解的小米蛋白C组来自实施例4的部分水解的小麦蛋白D 组H20结果如图5a(完整稻米蛋白、来自实施例1的部分水解的稻米蛋白)、5b (完整稻 米蛋白、来自实施例6的部分水解的稻米蛋白)和6 (完整小麦蛋白、来自实施例5和4的 广泛和部分水解的小麦蛋白)中所示。观察到部分水解的稻米蛋白在攻击前对动物预防性 施用时能够诱导对稻米蛋白的口服耐受，正如RMCPII释放减少所示。用部分水解的小麦蛋 白进行类似观察，它能够诱导对麦醇溶蛋白(即小麦的主要抗原)的口服耐受。相反，广泛 水解的小麦蛋白不能诱导耐受。图7显示如其它图所述的剂量响应口服耐受试验。以75mg、150mg、300mg的小麦 蛋白部分水解产物(图7中2-5栏中的“HA小麦粉”))的剂量诱导口服耐受。作为对照组， 应用完整/天然小麦粉(图7中第一栏中的“小麦粉”)。观察到仍然诱导口服耐受，其中 通过管饲法施用低至75mgHA小麦。对于图7的试验，应用下列产品(HA小麦粉)。将25kg小麦粉、75kg水和用于pH调节的缓冲试剂(Na (OH) 2或K (OH) 2或Ca (OH) 2) 的溶液混合并且通过蒸汽注入加热几秒。加入5%Alcalase 2.4 L AF酶(批号 RBN00013, Novozymes A/S Bagsvaerd, Denmark)并且将混合物在 60°C下保持 2 小时。该水 解步骤后，将混合物加热至90°C达30分钟。然后将混合物滚筒干燥，得到包含部分水解的 小麦蛋白的具有DH 11. 的粉末，将其包装在铝袋中。然后按照如下组成将如上述加工的小麦粉(“HA小麦粉”)混合(非水成分的重
量基于干物质给出)。对于对照组，在下列组成中应用天然小麦粉(代替加工的HA小麦粉)如上述具 有部分水解的蛋白质内容物的小麦粉(或天然小麦粉)79. 7%糖4.3%脂肪混合物4.3%天然淀粉10%水1.7%
1权利要求
谷蛋白的部分水解产物，其中水解产物具有9至18％之间的水解度。
2.权利要求1的水解产物，其中水解度是11至16%之间。
3.权利要求1或2的水解产物，其中谷物是稻米、小麦、黑麦、玉米、燕麦或它们的混合物。
4.制备谷蛋白的部分水解产物的方法，该方法包括将谷物粉与水混合，进行初步加热 处理，加入纯化的蛋白酶以及在40至70°C之间的温度下将混合物水解30分钟至240分钟， 得到具有9至18%之间的水解度的部分水解产物。
5.权利要求4的方法，其中初步加热处理是直接蒸汽注入。
6.权利要求4或5的方法，其中纯化的蛋白酶是AlcalaseAF 。
7.权利要求4至6中任意一项的方法，其中水解在50至60°C之间的温度下进行。
8.权利要求4至7中任意一项的方法，其中水解进行60至180分钟。
9.权利要求4至8中任意一项的方法，其中部分水解产物具有11至16%之间的水解度。
10.权利要求4至9中任意一项的方法，其中所述方法包括挤出所述谷蛋白的部分水解 产物的步骤。
11.谷物粉，其中蛋白质是部分水解的并且具有9至18%之间的水解度。
12.权利要求11的谷物粉，其中水解度是11至16%之间。
13.谷物产品，该谷物产品包含，按干物质重量百分比计算，15至100%的权利要求11 或12的谷物粉、0至40%的糖、0至30%的淀粉和0至30%的脂肪以及1至85%的水。
14.权利要求13的谷物产品，其在60°C/50rpm下具有2000至3000mPa · s之间的粘度。
15.权利要求13至14中任意一项的谷物产品，其中所述谷物产品包含低过敏原卵蛋白。
16.权利要求13至15中任意一项的谷物产品，该谷物产品包含，按干物质重量百分 比计算，5至10%的权利要求11或12的谷物粉、2至7%的乳固体、至多15%的脂肪、至多 30%的糖和至多5%的淀粉以及75至90%的水。
17.权利要求16的谷物产品，其中乳固体由低过敏原婴儿配方提供。
18.权利要求13至17中任意一项的谷物产品，其中谷物是稻米、小麦、黑麦或它们的混 合物。
19.一级预防年轻哺乳动物对谷蛋白的过敏反应的方法，该方法包括给年轻哺乳动物 喂饲治疗量的谷蛋白的部分水解产物，所述的谷蛋白的部分水解产物具有9至18%之间的 水解度。
20.权利要求19的方法，其中年轻哺乳动物是人婴儿。
21.权利要求20的方法，其中人婴儿处于对膳食蛋白质发生过敏反应的风险中。
22.权利要求19至21中任意一项的方法，其中水解度是11至16%之间。
23.增强处于对膳食蛋白质发生过敏反应的风险中的婴儿的谷蛋白口服耐受的方法， 该方法包括给年轻哺乳动物喂饲治疗量的权利要求1至3中任意一项的谷物的部分水解产 物。
全文摘要
本发明公开了谷蛋白的部分水解产物，其中该水解产物具有9-18％之间的水解度，本发明还公开了包含此类部分水解产物的产品以及应用此类部分水解产物一级预防年轻哺乳动物对谷蛋白过敏反应的方法。
文档编号A23L1/305GK101896078SQ200880120473
公开日2010年11月24日 申请日期2008年12月12日 优先权日2007年12月14日
发明者A·韦尔梅勒, G·奥尔特加, R·夏勒, R·弗里切 申请人:雀巢产品技术援助有限公司