专利名称：一种检测传染病病原体的方法及便携式检测装置的制作方法
技术领域：
本发明涉及分子生物学，特别是涉及检测传染病病原体的方法及便携式检测装置。
背景技术：
在传染病流行的初期，准确、快速、便捷地对传染病的病原体进行检测，是控制传 染病流行的关键。虽然国内和国际上已经建立了传染病的监测系统，但是现有的检测手段 各有局限性。血清学检查利用相应的抗体与抗原结合检测到病原体，此方法诊断快速，简单、易 于操作，但必须制备出针对该病原体的抗体后才能够进行检测，尤其是在还没有抗体来源 的情况下不适用于传染病的早期诊断。病原体分离法是通过直接对病原体进行分离培养，检测鉴定病原体。此方法灵敏 度高、特异性强，但操作复杂、费时(至少要花费一周时间)，对实验室生物安全条件要求非 常高，所以很难在疫情发生现场采用，而且不是所有的病原体都能通过病原体分离法获得。核酸检测技术操作简便，反应快速，尤其是近年来发展的实时荧光定量PCR(Real time PCR)，灵敏度高，且能够监控整个反应进程，但一直存在DNA污染造成的假阳性率高的 问题，而且由于其临界值不明显，因此检测结果灰区较宽，无法标准化，而且由于仪器要求 高，投入大，对操作人员要求高，需要进行专业技能培训，还限制了多重检测的应用。同时该 方法对于病原体含量极低的样本仍然无法检测。NASBA(Nucleic acid sequence-based amplification, NASBA,
扩增技术)是一项连续、等温、基于酶反应的核酸扩增技术。该技术的反应体系包括反转录 酶、核糖核酸酶H、噬菌体T7核糖核酸聚合酶和两条特别设计的寡核苷酸引物，其上游引物 3'末端与模板的3'末端互补，5’末端含有噬菌体T7的依赖于DNA的RNA聚合酶的启动 子序列.在扩增起始阶段，上游引物与正义RNA模板结合后，在反转录酶的作用下合成与靶 标RNA互补的反义cDNA，而原来的的RNA模板则被RnaseH降解。接着下游引物与cDNA杂 交，在反转录酶的DNA聚合酶特性的作用下合成双链cDNA，即对应靶标RNA的双链cDNA拷 贝。由于双链cDNA —端包含有T7RNA polymerase的启动子序列，从而诱导了 RNA聚合酶 的活性，合成大量的与靶标序列互补的反义RNA链。如此循环反复，RNA拷贝数被不断放大。利用染料Gelred、EB、Calcein和MgC12的特性检测NASBA特异扩增产物。Gelred 和EB作为核酸染料通过紫外激发观察荧光，NASBA扩增过程中产生的大量焦磷酸盐副产物 与Calcein竞争结合Mn2+而发荧光，MgCl2先直接和焦磷酸盐作用产生絮状沉淀.通过观察 荧光或沉淀来检测NASBA扩增产物，判断病毒模板的感染情况。以此来检测此方法操作简 单，结果表现直观，适用于样品的快速检测。流感病毒A亚型主要通过呼吸道传播，发病急，传染快，致病性高并且难以与普通 感冒区分，极易延误诊断和治疗的最佳时机。目前尚未见报道快速直观能检测及鉴别流感 病毒A亚型传染病病原体的检测方法，也没有相应的便携式检测装置上市。其它可以应用此方法进行的传染病病原体诊断还包括禽流感病毒H5亚型、禽流感病毒H7亚型、SARS冠 状病毒、汉坦病毒，耶氏鼠疫菌和炭疽杆菌等。
发明内容
本发明目的是克服现有技术不方便携带，不能直接观察结果的缺陷，提供一种对 可能存在于生物样品中的传染病病原体进行检测的方法，所述传染病病原体为流感病毒A 亚型，包括(i)扩增生物样品的核酸片段，所述核酸片段为流感病毒A亚型基质蛋白1基因如 SEQ ID NO. 1所示的核酸片段；(ii)用染料 Gelred、EB、Calcein、MgCl2 进行检测.本发明还提供步骤(i)使用的引物，其核苷酸序列如下所示引物用于扩增如SEQ ID NO. 1所示的核酸片段，其上游引物核苷酸序列如SEQ ID NO. 10所示，其下游引物核苷酸 序列如SEQ ID NO. 11所示；本发明还提供所述步骤(ii)使用的染料，包括GelrecUEB.Calcein或MgCl2的一 种。本发明所用仪器如迷你离心机、恒温仪、酶标仪等都可使用普通电源、蓄电池或干 电池作为整套装置所需的能源。上述方法的结果处理可以采取如下方案测试K个阴性对照样品和阳性样品，比 较它们的荧光是否出现或沉淀的多寡，出现荧光或出现浑浊即判断为“阳性”。本发明的术语“引物”指作为合成引物延伸产物的起始位点的单链寡核苷酸序列， 其与待复制的核酸链互补，长度和序列必须适合于延伸产物的合成。本发明还提供一种对可能存在于生物样品中的传染病病原体进行检测的便携式 装置，其包含1组引物，所述引物用于扩增流感病毒A亚型基质蛋白1如SEQ ID NO. 1所 示的核酸片段片段。本发明所述便携式检测装置的引物用于扩增如SEQ ID NO. 1所示的 核酸片段，其上游引物核苷酸序列如SEQ ID NO. 10所示，其下游引物核苷酸序列如SEQ ID NO. 11所示；本发明所述便携式检测装置还可以包含一种或多种下述组分迷你离心机，恒温仪，UV灯。本发明所述对可能存在于生物样品中的传染病病原体进行检测的方法，对比现有 技术的优点在于(1)易于携带，可迅速到达现场检测病原体；(2)检测直观，结果肉眼直接或借助UV可见；(3)特异性强，由于外来双链DNA无T7启动子序列，不能被扩增，这就显著提高了 NASBA反应的特异性，而且NASBA的反应条件温和，且比PCR反应需要的时间短，因此转录更 加忠实于模板，进一步减少了错配率；(4)操作简单，结果稳定，整个检测过程只需要这种常规的仪器；(5)方便携带，借助蓄电池就能开展检测，适用于早期快速诊断；(6)适用范围广，取样简单。样品中DNA、肝素、EDTA、柠檬酸盐、血红蛋白、白蛋白和 脂质等的污染将不会对结果造成影响，因而适用于各种待检样品如咽喉拭子、粪便、血液等。
图1 本发明所述方法检测流感病毒A亚型样本。图2 本发明所述方法检测流感病毒A亚型样本。图3 本发明所述方法检测流感病毒A亚型样本。图4 本发明所述方法检测流感病毒A亚型样本。
具体实施例方式下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。这些实施例仅用于说明本发明而不用 于限制本发明的范围，本领域的技术人员可以对其进行各种改造和修改，这些等价形式同 样落入本发明的保护范围。下面实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，或按照制造厂商 所建议的条件。
实施例1
制备本发明所述便携式检测装置。
1、扩增体系
引物(9组)
/HCl
氯化钾
BSA
二硫苏糖醇
组成为
每组IOuM IO-IOOmM I-IOmM l_5g/ml l-5mM
三磷酸核苷与脱氧三磷酸核苷等浓度混合物200-1000uM 反转录酶5-300U
核糖核酸酶H RNase H5-300U
噬菌体T7核糖核酸聚合酶5-300U
阴性对照为无RNA酶水
阳性对照是5pM人工合成的流感病毒A亚型基质蛋白1序列, 2、检测体系 染料 MgCl2IM
染料GelRed 染料EB 染料 Calcein
Mn:
2+
A亚型基质蛋白1序列^
25 μ M 300 μ M
阴性对照为无RNA酶水； 阳性对照是5ρΜ人工合成的流感病； 3、设备组成 迷你离心机 恒温仪 紫外灯
以上仪器都可使用普通电源、蓄电池或干电池作为整套装置所需 能源[
实施例2 对可能存在于生物样品中的传染病病原体进行检测的方法，同时也是本发明所述 便携式检测装备的使用方法。1、核酸提取取待测痰液样品，离心取上清，加入Iml异硫氰酸胍，混勻后再加入lmlTRIZOL， 振荡混勻，冰浴中放置5分钟.加入350ul氯仿，充分振荡混勻，静止分层后，立即于4°C， 12000r/min离心20分钟.将上清转移至另一离心管，加等体积的异丙醇(4°C预冷)混 勻._20°C放置lh，4°C，12000r/分钟离心20分钟，沉淀即总RNA.加入0. 5ml 75%乙醇洗 涤，4°C，12000r/分钟离心10分钟，小心倒掉乙醇，室温放置10分钟，加适量DEPC处理过的 水溶解沉淀，即得到待测核酸样品，-80°C保存备用。2、NASBA 扩增反应在0. 5ml无RNA酶的灭菌离心管中配制如下所示的20 μ 1 NASBA扩增反应体系， 在41°C温育90分钟，核酸扩增产物用于后续检测。NASBA扩增反应体系(20 μ 1)的终浓度具体为待测核酸样品 200 μ M引物IuMAMVIOURNase HIOUT7RNA 聚合酶 IOUTris/HClIOmM氯化钾ImMBSA100mg/ml二硫苏糖醇 ImM三磷酸核苷与脱氧三磷酸核苷等浓度混合物200uM3、NASBA扩增产物检测取步骤2所得5μ1 NASBA产物，然后加入0. 5μ L GelRed(IOX)溶液。孵育15min， 使用312nm的紫外线进行激发，观察荧光现象。4、结果结果如图1所示5、检测结果分析上述结果处理采取如下方案阳性对照激发后发荧光，阴性对照激发后不发荧 光.激发后发荧光的样本判定为“阳性”，否则为“阴性”。实施例3 对可能存在于生物样品中的传染病病原体进行检测的方法，同时也是本发明所述 便携式检测装置的使用方法。1、核酸提取取待测血液样品，取新鲜全血2ml加Iml 3%柠檬酸钠，混勻后4°C，3000r/分钟离 心，10分钟，取上清，加入Iml异硫氰酸胍，混勻后再加入Iml TRIZ0L,振荡混勻，冰浴中放 置5分钟.加入350ul氯仿，充分振荡混勻，静止分层后，立即于4°C，120001·/分钟离心20
6分钟.将上清转移至另一离心管，加等体积的异丙醇(4°C预冷)混勻.-20°C放置lh，4°C， 12000r/min离心20分钟，沉淀即总RNA.加入0. 5ml 75%醇洗涤，4°C，12000r/min离心10 分钟，小心倒掉乙醇，室温放置10分钟，加适量DEPC处理过的水溶解沉淀，即得到待测核酸 样品，-80°C保存备用。2、NASBA 扩增在0. 5ml无RNA酶的灭菌离心管中配制如下所示的20 μ 1 NASBA扩增反应体系， 在41°C温育90分钟，核酸扩增产物用于后续检测。NASBA扩增反应体系(20 μ 1)的终浓度具体为待测核酸样品600uM引物2uMAMV150URNase H150UT7RNA 聚合酶150UTris/HClIOmM氯化钾ImMBSA200mg/ml二硫苏糖醇3mM三磷酸核苷与脱氧三磷酸核苷等浓度混合物600uM3、NASBA扩增产物检测取步骤2所得5μ1 NASBA产物，加入IM MgCl2溶液，振荡混勻，3000rpm离心lmin， 观察沉淀现象。4、结果结果如图2所示。5、检测结果分析上述结果处理采取如下方案阳性对照有沉淀产生，阴性对照无沉淀.离心后发 有沉淀的样本判定为“阳性”，否则为“阴性”。实施例4 检测流感病毒A亚型的染料EB实验1、核酸提取取Iml流感病毒A亚型标准品加入Iml异硫氰酸胍，混勻后再加入lmlTRIZOL， 振荡混勻，冰浴中放置5分钟.加入350ul氯仿，充分振荡混勻，静止分层后，立即于4°C， 12000r/min离心20分钟.将上清转移至另一离心管，加等体积的异丙醇(4°C预冷)混 勻· _20°C放置lh,4°C,12000r/min离心20分钟，沉淀即总RNA.加0. 5ml 75%乙醇洗涤， 4°C，12000r/min离心10分钟，小心倒掉乙醇，室温放置10分钟，加适量DEPC处理过的水溶 解沉淀，即得到待测核酸样品，测定其浓度。2、NASBA 扩增在0. 5ml无RNA酶的灭菌离心管中配制如下所示的20 μ 1 NASBA扩增反应体系， 在41°C温育90分钟，核酸扩增产物用于后续检测。NASBA扩增反应体系(20 μ 1)的终浓度具体为待测核酸样品600uM
引物2uM
AMV150U
RNase H150U
T7RNA聚合酶150U
Tris/HClIOmM
氯化钾ImM
BSA200mg/ml
二硫苏糖醇3mM 三磷酸核苷与脱氧三磷酸核苷等浓度混合物600uM3、NASBA扩增产物检测取步骤2所得5μ1 NASBA产物，加入0. 5yL EB溶液，振荡混勻，3000rpm离心 Imin，观察沉淀现象。4、结果结果如图3所示。5、检测结果分析上述结果处理采取如下方案阳性对照激发后发荧光，阴性对照激发后不发荧 光·激发后发荧光的样本判定为“阳性”，否则为“阴性”。实施例5 检测流感病毒A亚型的染料Calcein实验1、核酸提取取Iml流感病毒A亚型标准品加入Iml异硫氰酸胍，混勻后再加入lmlTRIZOL， 振荡混勻，冰浴中放置5分钟.加入350ul氯仿，充分振荡混勻，静止分层后，立即于4°C， 12000r/min离心20分钟.将上清转移至另一离心管，加等体积的异丙醇(4°C预冷)混 勻· _20°C放置lh,4°C,12000r/min离心20分钟，沉淀即总RNA.加入0. 5ml 75%醇洗涤， 4°C，12000r/min离心10分钟，小心倒掉乙醇，室温放置10分钟，加适量DEPC处理过的水溶 解沉淀，即得到待测核酸样品，测定其浓度。2、NASBA扩增及产物分析在0. 5ml无RNA酶的灭菌离心管中配制如下所示的20 μ 1 NASBA扩增反应体系， 加入Calcein与Mn2+混合液。在41°C温育90分钟，观察荧光变化。NASBA扩增反应体系(20 μ 1)的终浓度具体为
待测核酸样品600uM
引物2uM
AMV150U
RNase H150U
T7RNA聚合酶150U
Tris/HClIOmM
氯化钾ImM
BSA200mg/ml
二硫苏糖醇3mM
8
三磷酸核苷与脱氧三磷酸核苷等浓度混合物600uM3、结果结果如图4所示。5、检测结果分析上述结果处理采取如下方案阳性对照扩增后发荧光，阴性对照不发荧光扩增后 发荧光的样本判定为“阳性”，否则为“阴性”。以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人 员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应 视为本发明的保护范围。
0150]序列表0151]<110>北京海康基因芯片开发有限公司0152]<120> 一种检测传染病病原体的方法及便携式检测装置0153]<130>0154]<160>0155]<170>0156]<210>10157]<211>2420158]<212>DNA0159]<213>流感病毒A亚型基质蛋白1基因32-2740160]<400>10161]tctaacgagg tcgaaacgta cgttctctct atcgtcccatcaggccccctcaaagccgag600162]atcgcgcaga gacttgagga tgtttttgca gggaagaacacagatcttga ggctctcatg1200163]gaatggctaa agacaagacc aatcctgtca cctctgactaagggaattttagggtttgtg1800164]ttcacgctca ccgtgcccag tgagcgagga ctgcagcgtagacgatttgtccaaaatgcc2400165]Ct2420166]<210>100167]<211>430168]<212>DNA0169]<213> 引物 InfA-F0170]<400>100171]gatgcaaggt cgcatatgag cttctaaccg aggtcgaaacgta430172]<210>110173]<211>550174]<212>DNA0175]<213> 引物 InfA-R0176]<400>110177]aattctaata cgactcacta tagggagaag tggacaaagcgtcta5权利要求
一种对可能存在于生物样品中的传染病病原体进行检测的方法，包括(i)扩增生物样品的核酸片段，(ii)扩增后利用染料进行当场检测。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤(i)利用NASBA技术扩增样品的核 酸片段，NASBA运行条件为41°C 45°C温育90 150分钟。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(ii)中所述染料检测可用肉眼直接 观察或借助UV观察结果。
4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述步骤(ii)使用染料为Gelred、EB、 Calcein或MgCl2中的一种进行扩增产物分析。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述传染病病原体为流感病毒A亚型。
6.如权利要求5所述的方法，其特征在于，所述流感病毒A亚型使用以下寡核苷酸序列 作为引物进行扩增引物用于扩增如SEQ IDNO. 1所示的核酸片段，其上游引物核苷酸序列 如SEQ ID NO. 10所示，其下游引物核苷酸序列如SEQ ID NO. 11所示。
7.一种对可能存在于生物样品中的传染病病原体进行检测的便携式装置，其包含可用 作核酸片段扩增用的试剂，引物和染料。
8.如权利要求7所述的便携式检测装置，所述引物其上游引物核苷酸序列如SEQID NO. 10所示，其下游引物核苷酸序列如SEQ IDNO. 11所示。
9.根据权利要求7所述的便携式检测装置，其特征在于，所述染料还包含Gelred、EB、 Calcein或MgCl2染料其中的一种。
10.根据权利要求7至9任一项所述的便携式检测装置，其特征在于，所用仪器如迷你 离心机、恒温仪、酶标仪等使用普通动力电源、蓄电池或干电池作为整套装置所需的能源。
全文摘要
本发明公开一种对可能存在于生物样品中的传染病病原体进行检测的方法，包括扩增生物样品的核酸片段、使用染料试剂进行检测、检测结果为裸眼可见或借助紫外光检测。本发明还提供用于扩增的引物及检测的一整套装置。本发明所述方法通过肉眼或利用UV直接观察结果，操作简单，样本范围广，方便携带，可以在疫情发生的第一现场进行检测，适用于多种病原体包括呼吸道传染病的早期诊断。
文档编号C12R1/93GK101886118SQ20091014162
公开日2010年11月17日 申请日期2009年5月14日 优先权日2009年5月14日
发明者于常海, 冯晓燕, 刘乐庭 申请人:北京海康基因芯片开发有限公司