专利名称：：活性炭工艺出水中炭附细菌的人工培养方法
技术领域：
：本发明涉及一种活性炭工艺出水中炭附细菌的人工培养方法。
背景技术：
：目前应用较广的饮用水活性炭处理工艺多设置在砂滤池之后、消毒之前，以保证饮用水的安全性。活性炭的吸附特性使炭粒附近营养物和溶解氧的浓度较高，且微生物附着于炭粒的多孔表面可避免水力剪切作用。由于活性炭各种表面官能团的存在和炭的还原性对消毒化合物的去除作用，使得炭层中积累大量生物颗粒和非生物颗粒，这些颗粒物会随着炭池的出水一起流出。同时，无论预臭氧存在与否，活性炭滤池中的微生物作用普遍存在，炭池中滋生的大量细菌使得活性炭出水中的细菌总数经常远远高于进水(砂滤池出水)，有时高达数万个/mL，使出水的生物安全性受到威胁。研究发现，活性炭工艺出水中的细菌包括肺炎克雷伯杆菌、假单胞菌属、黄质菌属、产碱杆菌属、不动杆菌属和色杆菌属等。包括大肠杆菌和病原性微生物在内的细菌可被炭池中脱附的细小炭粒(微米级)所吸附并形成炭附细菌。由于受到活性炭颗粒的保护，炭附细菌对各种不利环境有较强的适应性，对消毒有较大的抗性，氯化消毒往往难以杀死这些微生物。未被灭活的炭附细菌进入管网后，可吸附在管壁上，继而形成生物膜，造成二次生物污染，对管网中残留消毒剂的灭活起到一定的抵抗作用，而对饮用水安全产生潜在的威胁。大量的文献调研表明，目前国内外尚缺乏从生物安全角度对活性炭工艺出水中炭附细菌进行控制的系统性研究。由于活性炭工艺出水中炭附细菌的数量相对较少，试验研究需要进行炭附细菌的富集、浓縮等前处理工作，来保证实验研究中样品的需要。以实际的活性炭工艺出水中炭附细菌为对象进行试验，其方法已不能满足全面、系统地开展其科学问题研究中大量样品的需要。更深层次、更大规模地研究炭附细菌的吸附作用机制，分析工艺出水中细菌与其炭粒附着载体的共存关系，探讨两者相互作用的动力学方程等成为当前亟待解决的科学问题。为了更为高效、有序地开展科学研究，鉴于微生物接种技术已广泛高效应用的技术背景，结合活性炭工艺出水的生物安全性问题，研究并提出了炭附细菌实验室的人工培养方法。将某些微生物接种于固体填料技术已经较多应用于水处理领域，而饮用水活性炭工艺出水中炭附细菌的微生物吸附载体为微米级活性炭颗粒，目前尚未出现以微米级活性炭颗粒为载体的微生物人工接种和培养方法研究。
发明内容本发明的目的在于针对现有技术的不足，提供一种微米级炭粒载体的基础上，利用炭粒结构的吸附特性进行微生物的人工接种和固定，得到所需要的炭附细菌样品的培养方法。—种活性炭工艺出水中炭附细菌的人工培养方法有以下步骤组成(a)将活性炭脱水、灭菌；(b)将活性炭搅拌破碎至活性炭粒径为5-50iim;(c)将活性炭粒加入无菌去离子水中，每升无菌去离子水含有2.5-5mg活性炭粒；(d)将菌种接种至装有活性炭粒的无菌去离子水中，活性炭粒上的菌液浓度控制为500-3000cell/粒范围内，200rpm振荡l_2min;(e)将0.lg/ml蛋白胨溶液、0.Olg/mlNaCl溶液与无菌去离子水按照(0.5-0.6):(0.1-0.2):40的体积比，混合均匀；(f)加入磷酸盐缓冲液，调整最终pH在7.0-8.0之间；(g)加热至36-38"，并在恒温下120rpm转速下振荡2-3h，完成培养。所述菌种为大肠杆菌、克雷伯杆菌、假单胞菌属、黄质菌属、产碱杆菌属、不动杆菌属或色杆菌属。本技术的优点在于通过实施有效的接种固定和培养方法，实现了炭附细菌的人工实验室培养；解决了由于活性炭工艺出水中炭附细菌的数量少而不能满足大规模开展实验研究的瓶颈问题。通过与实际活性炭工艺出水中炭附细菌的解析附实验对比，证明该方法培养的炭附细菌与实际的炭附细菌差异性小，能够满足实验研究的要求。由于人工方法实现了大批次培养的条件，为炭附细菌问题的系统研究提供了技术支持，该方法具有广泛的应用前景。为评价人工培养的炭附细菌与实际试验装置出水炭附细菌的差异性，以大肠埃希氏菌(E.coli)为目标微生物开展对比研究。大肠埃希氏菌(E.coli)通常称为大肠杆菌，是Escherich在1885年发现的。大肠杆菌作为外源基因表达的宿主，遗传背景清楚，技术操作简单，培养条件简单，大规模发酵经济，倍受遗传工程专家的重视。目前大肠杆菌是应用最广泛，最成功的表达体系，常做高效表达的首选体系。因此，在实施例中以大肠杆菌作为目标微生物进行了特定菌属的活性炭粒接种固定，通过对人工培养和试验装置出水的炭附细菌解吸附效果对比，证明该方法可行及实用性。为了验证炭附细菌的人工培养效果，将人工培养的炭附细菌(大肠杆菌)和实际活性炭中试工艺出水的炭附细菌(大肠杆菌)进行对比。表l提供了两种炭附细菌解析附试验的对比结果，活性炭粒径选择5-20iim和20-50iim两个梯度范围。结果表明，人工培养的炭附细菌每克炭上吸附细菌数量略高于活性炭工艺实际出水的炭附细菌，二者在数量级上具有较好的一致性；进一步的消毒试验证明(表2)，人工培养的炭附细菌与实际工艺出水炭附细菌的氯消毒效率基本相同，说明人工培养达到了较好的炭附细菌固定效果，活性炭对细菌的吸附和保护作用与实际相吻合，该方法培养的炭附细菌可以替代活性炭实际工艺出水的炭附细菌进行科学研究。表1炭菌接种固定对比实验活性炭粒的粒径范围5_20iim20_50iim人工培养炭附细菌的解析附水平23.13CFU/g活性炭12.97CFU/g活性炭实际活性炭工艺出水炭附细菌解析附水平20.11CFU/g活性炭10.0謂/g活性炭表2氯消毒对比实验(1.Omg/有效氯)4<table>tableseeoriginaldocumentpage5</column></row><table>以铜绿假单胞菌作为目标微生物进行了特定菌属的活性炭粒接种固定，通过对人工培养和试验装置出水的炭附细菌解吸附效果对比，证明该方法的实用性。铜绿假单胞菌(P.aeruginosa)是假单胞菌属的代表菌种，广泛分布于自然界和人体，其在外界环境中存在的重要条件是潮湿环境，为条件致病菌。铜绿假单胞菌为专性需氧菌，部分菌株能在兼性厌氧环境中生长，营养要求不高，在普通培养基上生长良好，可生长温度范围是25t:42°C。验证铜绿假单胞菌为目标微生物的炭附细菌的人工培养效果，表3提供了两种炭附细菌解吸附试验的对比结果，活性炭粒径选择5-25ym和15-40ym两个梯度范围。结果表明，人工培养的炭附细菌每克炭上吸附细菌数量同样略高于活性炭工艺实际出水的炭附细菌，二者在数量级上具有较好的一致性；进一步的氯胺消毒试验证明(表4)，人工培养的炭附细菌与实际工艺出水炭附细菌的氯胺消毒效率基本相同，说明人工培养达到了较好的炭附细菌固定效果，活性炭对细菌的吸附和保护作用与实际相吻合，该方法培养的炭附细菌基本可以替代活性炭实际工艺出水的炭附细菌进行科学研究。表3铜绿假单胞菌接种固定对比实验<table>tableseeoriginaldocumentpage5</column></row><table>表3氯氨消毒对比实验(1.2mg/有效氯，氯氨比例5:1)<table>tableseeoriginaldocumentpage5</column></row><table>具体实施例方式下面通过实施例的方式，对本发明技术方案进行详细说明，但是本发明的保护范围不局限于所述实施例。实施例1将活性炭脱水、灭菌；然后将活性炭搅拌破碎至活性炭粒径为5m;将活性炭粒加入无菌去离子水中，每升无菌去离子水含有2.5mg活性炭粒；4。C保存备用。将市售的并经过预处理的大肠杆菌的菌种接种至装有活性炭粒的无菌去离子水中，活性炭粒上的菌液浓度控制为500cell/粒范围内，于涡旋振荡器上200rpm振荡lmin;再加入0.lg/ml蛋白胨溶液、0.01g/mlNaCl溶液与无菌去离子水按照0.5:0.1:40的体积比，保障菌群生长的理化环境，混合均匀；通过加入磷酸盐缓冲液，调整最终pH在7.0;置于36t:水浴中人工培养，并在恒温水浴振荡器中120rpm转速下振荡2h，完成培养。实施例2将活性炭脱水、灭菌；然后将活性炭搅拌破碎至活性炭粒径为10i！m;将活性炭粒加入无菌去离子水中，每升无菌去离子水含有5mg活性炭粒；4t:保存备用。将市售的并经过预处理的克雷伯杆菌的菌种接种至装有活性炭粒的无菌去离子水中，活性炭粒上的菌液浓度控制为3000cel1/粒范围内，于涡旋振荡器上200rpm振荡2min;再加入0.lg/ml蛋白胨溶液、0.01g/mlNaCl溶液与无菌去离子水按照0.6:0.2:40的体积比，保障菌群生长的理化环境，混合均匀；通过加入磷酸盐缓冲液，调整最终pH在8.0;置于38t:水浴中人工培养，并在恒温水浴振荡器中120rpm转速下振荡3h，完成培养。实施例3将活性炭脱水、灭菌；然后将活性炭搅拌破碎至活性炭粒径为15i！m;将活性炭粒加入无菌去离子水中，每升无菌去离子水含有4.5mg活性炭粒；4。C保存备用。将市售的并经过预处理的假单胞菌属的菌种接种至装有活性炭粒的无菌去离子水中，活性炭粒上的菌液浓度控制为1750cel1/粒范围内，于涡旋振荡器上200rpm振荡2min;再加入0.lg/ml蛋白胨溶液、0.01g/mlNaCl溶液与无菌去离子水按照0.55:0.15:40的体积比，保障菌群生长的理化环境，混合均匀；通过加入磷酸盐缓冲液，调整最终pH在8;置于37t:水浴中人工培养，并在恒温水浴振荡器中120rpm转速下振荡2.5h，完成培养。实施例4将活性炭脱水、灭菌；然后将活性炭搅拌破碎至活性炭粒径为25iim;将活性炭粒加入无菌去离子水中，每升无菌去离子水含有2.5mg活性炭粒；4t:保存备用。将市售的并经过预处理的黄质菌属的菌种接种至装有活性炭粒的无菌去离子水中，活性炭粒上的菌液浓度控制为2500cel1/粒范围内，于涡旋振荡器上200rpm振荡1.5min;再加入0.lg/ml蛋白胨溶液、0.01g/mlNaCl溶液与无菌去离子水按照0.15:40的体积比，保障菌群生长的理化环境，混合均匀；通过加入磷酸盐缓冲液，调整最终pH在7.5;置于37t:水浴中人工培养，并在恒温水浴振荡器中120rpm转速下振荡2.5h，完成实施例5将活性炭脱水、灭菌；然后将活性炭搅拌破碎至活性炭粒径为30iim;将活性炭粒加入无菌去离子水中，每升无菌去离子水含有4mg活性炭粒；4t:保存o.5:培养。备用。将市售的并经过预处理的产碱杆菌属的菌种接种至装有活性炭粒的无菌去离子水中，活性炭粒上的菌液浓度控制为1000cell/粒范围内，于涡旋振荡器上200rpm振荡lmin;再加入0.lg/ml蛋白胨溶液、0.01g/mlNaCl溶液与无菌去离子水按照0.55:0.2:40的体积比，保障菌群生长的理化环境，混合均匀；通过加入磷酸盐缓冲液，调整最终pH在7;置于38t:水浴中人工培养，并在恒温水浴振荡器中120rpm转速下振荡2h，完成培实施例6将活性炭脱水、灭菌；然后将活性炭搅拌破碎至活性炭粒径为40iim;将活性炭粒加入无菌去离子水中，每升无菌去离子水含有5mg活性炭粒；4t:保存备用。将市售的并经过预处理的不动杆菌属的菌种接种至装有活性炭粒的无菌去离子水中，活性炭粒上的菌液浓度控制为1200cel1/粒范围内，于涡旋振荡器上200rpm振荡2min;再加入0.lg/ml蛋白胨溶液、0.01g/mlNaCl溶液与无菌去离子水按照06:0.15:40的体积比，保障菌群生长的理化环境，混合均匀；通过加入磷酸盐缓冲液，调整最终pH在7.5;置于36t:水浴中人工培养，并在恒温水浴振荡器中120rpm转速下振荡3h，完成培实施例7将活性炭脱水、灭菌；然后将活性炭搅拌破碎至活性炭粒径为50iim;将活性炭粒加入无菌去离子水中，每升无菌去离子水含有3.5mg活性炭粒；4t:保养。存备用。将市售的并经过预处理的色杆菌属的菌种接种至装有活性炭粒的无菌去离子水中，活性炭粒上的菌液浓度控制为1750cell/粒范围内，于涡旋振荡器上200rpm振荡1.5min;再加入0.lg/ml蛋白胨溶液、0.01g/mlNaCl溶液与无菌去离子水按照70.55:0.15:40的体积比，保障菌群生长的理化环境，混合均匀；通过加入磷酸盐缓冲液，调整最终pH在8;置于37t:水浴中人工培养，并在恒温水浴振荡器中120rpm转速下振荡2.5h，完成培养。权利要求一种活性炭工艺出水中炭附细菌的人工培养方法，其特征在于该方法包括以下步骤(a)将活性炭脱水、灭菌；(b)将活性炭搅拌破碎至活性炭粒径为5-50μm；(c)将活性炭粒加入无菌去离子水中，每升无菌去离子水含有2.5-5mg活性炭粒；(d)将菌种接种至装有活性炭粒的无菌去离子水中，活性炭粒上的菌液浓度控制为500-3000cell/粒范围内，200rpm振荡1-2min；(e)将0.1g/mL蛋白胨溶液、0.01g/mLNaCl溶液与无菌去离子水按照(0.5-0.6)∶(0.1-0.2)∶40的体积比，混合均匀；(f)加入磷酸盐缓冲液，调整最终pH在7.0-8.0之间；(g)加热至36-38℃，并在恒温下120rpm转速下振荡2-3h，完成培养。2.根据权利要求1所述一种活性炭工艺出水中炭附细菌的人工培养方法，其特征在于所述菌种为大肠杆菌、克雷伯杆菌、假单胞菌属、黄质菌属、产碱杆菌属、不动杆菌属或色杆菌属。全文摘要本发明涉及一种活性炭工艺出水中炭附细菌的人工培养方法。提供一种微米级炭粒载体的基础上，利用炭粒结构的吸附特性进行微生物的人工接种和固定，得到所需要的炭附细菌样品的培养方法。通过实施有效的接种固定和培养方法，实现了炭附细菌的人工实验室培养；解决了由于活性炭工艺出水中炭附细菌的数量少而不能满足大规模开展实验研究的瓶颈问题。该方法培养的炭附细菌与实际的炭附细菌差异性小，能够满足实验研究的要求。由于人工方法实现了大批次培养的条件，为炭附细菌问题的系统研究提供了技术支持，该方法具有广泛的应用前景。文档编号C12R1/385GK101717768SQ200910264438公开日2010年6月2日申请日期2009年12月22日优先权日2009年12月22日发明者林涛,王磊磊,谢成塔,赵金辉,陈卫申请人:河海大学