专利名称：表现出纤维素水解活性的丝状真菌培养产物的混合物或其干品以及使用其生产葡萄糖的方法
技术领域：
本发明涉及一种糖化纤维素的方法，特别涉及使用表现出纤维素水解活性的丝状 真菌培养产物的混合物糖化纤维素的方法。
背景技术：
近来，为了有效地利用纤维素资源，一直在寻找有效糖化纤维素的方法。在自然界 中，纤维素主要由微生物降解，并且已知多种微生物如细菌和丝状真菌产生纤维素水解酶。这些微生物向真菌体外分泌多种纤维素水解酶，并且纤维素主要通过纤维_寡糖 和纤维二糖经由具有不同作用机制的多种纤维素水解酶的协同作用而降解为葡萄糖。纤维 素水解酶通常称为纤维素酶，作为可以水解纤维素的酶类的总称。木霉属(Trichoderma)是纤维素酶最有希望的酶来源，并且在世界范围内广泛应 用。同时，白曲霉(Aspergillus kawachii)是一种白色曲霉，其是在日本用于制备清酒的 特有曲霉。白曲霉广泛用于谷类原料的糖化。然而，白曲霉不具有特别好的纤维素酶分泌 能力，因此其很少用于纤维素的糖化。非专利文献1记述了由于使用棘孢曲霉(Aspergillus aculeatus)培养物上清液 与商购的纤维素酶降解纤维素，在降解效率中鉴定到协同作用。非专利文献2记述了通过使用来源于木霉属真菌体的纤维素酶与来源于棘孢曲 霉的纤维素酶组合，鉴定到由纤维素纯化单糖能力中的协同作用。然而，棘孢曲霉本质上不同于白曲霉，因为其固有地具有高的生产和分泌纤维素 酶的能力。在这些常规技术领域中，使用酶试剂，导致高成本和不方便的操作。此外，所报 道的降解和糖化效率非常低，低于可以在大规模操作上预测得到利润的效率水平，因此，当 意欲进行实际应用时，所报道的效率仍然是不充分的。[非专利文献1] J. Ferment. Technol.(发酵技术杂志)，卷 57，第 151-159 页，1979[非专利文献 2]Hakkokogaku，卷 60，第 333-341 页，1982发明公开内容本发明要解决的问题本发明意欲解决上述传统问题，并且本发明的目的是提供一种以非常有效、简单 且廉价的方式酶促糖化纤维素质物质的方法。解决问题的方式本发明提供木霉属丝状真菌的培养液或上清液和白曲霉培养产物的混合物、或其 干品，其表现出纤维素水解活性，由此实现上述目的。在实施方案中，白曲霉的培养产物是培养液或上清液。在实施方案中，白曲霉的培养产物是固体培养产物或其提取液。在实施方案中，所述木霉属丝状真菌的培养液或上清液的纤维素酶活性不小于 50U/ml，并且白曲霉培养液、上清液或固体培养产物提取液的半纤维素酶活性不小于50U/ml ο在实施方案中，所述木霉属丝状真菌的培养液或上清液与所述白曲霉培养液、上 清液或固体培养产物提取液的混合比例按体积比在10 90-90 10范围内。在实施方案中，所述木霉属丝状真菌是里氏木霉(Trichoderma reesei)或绿色木 霉(Trichoderma viride)。在实施方案中，所述木霉属丝状真菌是里氏木霉。本发明还提供一种生产葡萄糖的方法，所述方法包括使用所述混合物或其干品糖 化纤维素原料的步骤。在实施方案中，糖化在30_70°C和pH 3-7的条件下进行。发明效果本发明所述的丝状真菌培养产物的混合物具有显著高的纤维素降解和糖化能力。 因此，其可以原样用于纤维素的糖化，并且因此不存在使用酶试剂的需要。因此，纤维素可 以通过简单的操作被廉价地糖化。实施本发明的最佳实施方案已知木霉属丝状真菌是纤维素糖化必需的纤维素酶的酶来源。本发明中要用的木 霉属丝状真菌没有特别限制，只要其可以产生纤维素酶即可。优选的木霉属丝状真菌是里 氏木霉或绿色木霉。特别优选的是里氏木霉。当木霉属丝状真菌的培养液或上清液与白曲霉培养产物组合使用时，在纤维素水 解活性中鉴定到协同作用。通过利用该协同作用，可以显著提高丝状真菌培养液或上清液 的纤维素降解和糖化能力。丝状真菌里氏木霉和绿色木霉的真菌特性记述在，例如，E. G. Simmons, Abst. 2nd International Mycological Congress (第二届国际真菌学会议)，Tampa, FL,美国，1977 年8月，第618页中。木霉属丝状真菌的培养液或上清液可以通过常规进行的方法制备。即，将通过预 先培养获得的真菌菌株的孢子、菌丝、或预培养液接种到液体培养基中并进行培养。例如， 当培养孢子时，优选将亲本菌株培养在马铃薯葡萄糖琼脂培养基上，以允许孢子提前完全 形成。在上述情形中，培养温度为20-33°C，并且培养时间为4-10天。粉末纤维素、纤维二糖、滤纸、一般的纸材料、锯屑、麸、谷壳、蔗渣、大豆粗粉、咖 啡研磨物、淀粉、乳糖等用作培养基的碳源。无机铵盐如硫酸铵和硝酸铵、有机含氮物 质如尿素、氨基酸、肉提取物、酵母提取物、聚蛋白胨和蛋白降解产物用作氮源。KH2PO4, MgSO4 · 7H20, CaCl2 · 2H20, Fe2Cl3 · 6H20, MnCl2 · 4H20, ZnSO4 · 7H20 等用作无机盐。如果需 要，使用包含有机微量营养素的培养基。使用上述培养基，使用正常的通风-搅拌型培养装置，在20_33°C，优选28_30°C的 培养温度下，在4-6的培养pH下进行液体培养4-10天。如上文所述，获得木霉属丝状真菌 的培养液。然后，通过公知方法如离心或过滤从该培养液中去除真菌体，获得木霉属丝状真 菌的培养物上清液。在木霉属种属丝状真菌的培养液或培养上清液中包含的酶的实例包括纤维素酶、 半纤维素酶、和甘露聚糖酶(marmanase)。这样获得的培养液或培养物上清液的纤维素酶活性不小于10U/ml，优选不小于50U/ml，例如，50-150U/ml，80-120U/ml，更优选约100U/ml。当培养液或培养物上清液的纤 维素酶活性小于10U/ml时，降解纤维素所需要的时间将延长。应该注意到，上述纤维素酶活性可以通过二硝基水杨酸(DNS)法定量由底物水解 产生的还原糖的量而获得，所述底物为羧甲基纤维素(CMC)。更具体地，向Iml 1% CMC底物溶液(通过将Sigma-Aldrich，Inc.(西格玛-奥 德里奇公司)制备的“低粘度”溶解在IOOmM乙酸缓冲液(pH 5)中制备)中加入Iml所述 培养液或培养物上清液，并且允许酶促反应在40°C下进行准确的10分钟。随后，向得到的 混合物中，加入4ml DNS试剂(包含0. 75%二硝基水杨酸，1. 2%氢氧化钠，22. 5%酒石酸钾 钠四水合物，和0. 3%乳糖一水合物)，并且将混合物彻底混合以终止反应。为了定量在该 反应终止液中还原糖的量，将该反应终止液在沸水浴中准确加热15分钟。随后，将混合物 冷却至室温，然后通过测量540nm处的吸光度而定量还原糖的量，所述还原糖对应于葡萄 糖。一单位的纤维素酶活性表示为每分钟能够产生与1 μ mol葡萄糖相当量的还原糖的酶 的量。白曲霉还称为酒曲酶(koji mold)。其是一种从古代就用于酿造和生产发酵食品 的真菌，并且因此是一种安全的微生物。已知属于曲霉种属的微生物生产α-淀粉酶，并且 用于淀粉的糖化。丝状真菌白曲霉的真菌特性记述在，例如，Koji_gaku，HideyaMURAKAMI编写，1987 年3月25日，第78页中。白曲霉的培养产物可以通过常规进行的方法制备。例如，白曲霉的培养产物可以 是通过固体培养获得的固体培养产物，或可以是通过液体培养获得的培养液或上清液。此 外，白曲霉的培养产物可以是固体培养产物提取液，其通过将固体培养产物浸没在水、盐水 等中以提取其成分，然后通过过滤等去除不溶成分如真菌体而获得。应该注意到，考虑工业规模处理的便利性，白曲霉培养产物优选是培养液或上清 液。当进行白曲霉液体培养时，将通过预先培养获得的真菌菌株的孢子、菌丝、或预培 养液接种到液体培养基中并进行培养。例如，当培养孢子时，优选将亲本菌株培养在马铃薯 葡萄糖琼脂培养基上，以允许孢子提前完全形成。在上述情形中，培养温度为30-40°C，并且 培养时间为3-7天。可用的碳源优选为麦芽糖或淀粉，并且其适当的浓度为约2%。蛋白胨优选作为氮 源，并且其适当的浓度为约0.5%。此外，需要酵母提取物、玉米浸渍液、磷酸二氢钾、硫酸镁 等。尽管上述碳源优选为麦芽糖或淀粉，除上述外，任何正常用于真菌的培养基是适用的。使用上述培养基，使用正常的通风_搅拌型培养装置，在30_40°C，优选35-38°C的 培养温度下，在4-6的培养pH下进行液体培养2-4天。如上所述，可以获得白曲霉的培养 液。然后，通过公知方法如离心或过滤从该培养液中去除真菌体，而获得白曲霉的培养物上 清液。当进行白曲霉固体培养时，将真菌菌株的孢子或菌丝接种到固体培养基上并且进 行培养。例如，当培养孢子时，优选将亲本菌株培养在马铃薯葡萄糖琼脂培养基上，以允许 孢子提前完全形成。在上述情形中，培养温度为30-40°C，并且培养时间为3-7天。除麸之外，可用的固体培养基优选为淀粉原料，其是谷类如大米、大麦、谷子(foxtail millet)和日本谷仓稷(Japanese barnyard millet)和豆类等。特别优选地，使用麸。对于固体培养，与生产用于清酒的酒曲的方法相似，使用在生产酒曲过程中利用 酒曲盘(tray)的方法和机械生产酒曲的装置。将上述培养基蒸过，向其中接种真菌菌株， 并且在30-40°C，优选35-38°C的培养温度下在4_6的培养pH下培养2_4天。如上所述，可 以获得白曲霉的固体培养产物。随后，将该培养产物浸没在水中，以提取其成分，并且通过 过滤去除真菌体，由此获得白曲霉的固体培养物滤过液。在白曲霉培养液、培养物上清液、固体培养产物或其提取液中包含的酶的实例包 括纤维素酶、半纤维素酶、甘露聚糖酶、果胶酶、和蛋白酶。这样获得的培养液、培养物上清液或固体培养物提取液的半纤维素酶活性不小于 10U/ml，优选不小于 50U/ml，例如，50-150U/ml，80-120U/ml，更优选约 100U/ml。当培养液、 培养物上清液或固体培养物提取液的半纤维素酶活性小于10U/ml时，降解纤维素所需要 的时间将延长。应该注意到，上述半纤维素酶活性可以通过用DNS定量由底物的酶促水解产生 的还原糖的量并且观察在540nm处光吸收的增加而获得，所述底物为来源于燕麦(oat spelts)的木聚糖。更具体地，向1.9ml 木聚糖底物溶液(通过将Sigma-Aldrich，Inc.(西格 玛_奥德里奇公司)供应的“来自燕麦的木聚糖”溶解在200mM乙酸缓冲液(pH 4. 5)中制 备)加入0. Iml所述培养液或培养物上清液，并且允许酶促反应在40°C下进行准确的10分 钟。随后，向得到的混合物中，加入4ml DNS试剂(包含0. 75%二硝基水杨酸，1. 2%氢氧化 钠，22. 5%酒石酸钾钠四水合物，和0. 3%乳糖一水合物)，并且将混合物彻底混合以终止 反应。为了定量在该反应终止液中还原糖的量，将该反应终止液在沸水浴中准确加热15分 钟。随后，将混合物冷却至室温，然后通过测量540nm处的吸光度而定量还原糖的量，所述 还原糖对应于木糖。一单位的半纤维素酶活性表示为在40°C 10分钟的条件下每分钟能够 产生与1 μ mol木糖相当量的还原糖的酶的量。本发明表现出纤维素水解活性的混合物通过将木霉属丝状真菌的培养液或培养 物上清液与白曲霉培养产物混合获得。培养液和培养物上清液均可以相似地用于制备本发 明的混合物。应该注意，制备培养液不需要去除真菌体的操作；因此，其制备方法简单。同 时，在培养物上清液中基本上不存在真菌体；因此，上清液具有极好的储存稳定性。对用于混合木霉属丝状真菌的培养液或上清液和白曲霉培养产物的方法没有特 别限制。例如，当白曲霉培养产物为固体培养产物时，所述固体培养产物可以按原样添加到 木霉属种属丝状真菌的培养液等中并且混合。备选地，所述固体培养产物提取液可以与木 霉属丝状真菌的培养液等混合。此外，例如，当白曲霉的培养产物为液体培养产物或上清液 时，白曲霉的培养产物可以直接和木霉属丝状真菌的培养液或上清液混合。木霉属丝状真 菌的培养液和白曲霉培养产物可以分别在混合之前过滤，或者可以在混合之后过滤。木霉属丝状真菌的培养液或上清液与白曲霉培养液、上清液、或固体培养物提 取液的混合比例按体积为，例如，10 90-90 10，优选为20 80-80 20，更优选为 30 70-70 30,40 60-60 40，甚至更优选为50 50。当混合比例小于10 90或 大于90 10时，纤维素的糖化效率将降低。此外，这样获得的混合物还可以作为干品提供，所述干品可以通过通常所用的方法如冻干制备。可以使用上述混合物降解和糖化纤维素原料。纤维素是指其中葡萄糖通过β_1， 4_糖苷键聚合的分子链或其衍生物(例如，进行衍生化诸如羧甲基化、醛修饰、或酯化的那 些，诸如羧甲基纤维素)，或其中多个上述分子链或其衍生物结合在一起的物质(诸如纤维 素纤维)。纤维素原料优选是包含纤维素的水不溶性纤维物质。纤维素原料可以来源于 植物或动物，产生纤维素原料的植物和动物的实例包括蔗渣(bagasse)、啤酒残渣(beer residue)、木材、竹子、麦禾干(wheat straw)、禾S 草(rice straw)、玉米棒(corn cobs)、棉花 (cotton)、苎麻(ramie)、洋麻(kenaf)、甜菜(beet)、球兰(hoya)、和细菌纤维素等。此外， 在本发明中，除了由上述植物和动物产生的天然纤维素物质之外，还可以使用再生的纤维 素物质和纤维素衍生物物质，再生的纤维素物质通过一次性化学或物理溶解或溶胀天然纤 维素物质，然后使其再生获得，纤维素衍生物物质通过化学修饰纤维素原料获得。对于工业应用，上述纤维素物质可以是任何天然的纤维素原料，诸如浆液、粉末纤 维素，和结晶纤维素，再生纤维素如人造纤维，各种再生的纤维素原料如碱性纤维素和磷酸 溶胀纤维素，和各种类型的纤维素衍生物物质如羧甲基纤维素钠。然而，为了将所获得的葡 萄糖用于药物产品、食品、和化妆品，更优选地使用天然纤维素原料。在上述纤维素原料中， 其一种类型或其两种或多种类型的混合物可以用作原料。可以利用公知的方法作为糖化纤维素的方法。尽管对方法没有特别限制，但是其 一个实例是这样的方法，所述方法包括将作为底物的纤维素原料混悬在水性介质中；向 其中加入上述混合物；并且在搅拌或摇动的条件下加热所得到的混合物，以允许糖化反应 进行。除了上述表现出纤维素水解活性的混合物之外，可以使用其干品或包含分散或溶解 在其中的干品的溶液。纤维素原料优选地预先进行去木质作用。适当调整反应条件，如混悬方法、搅拌方 法、添加上述混合物的方法、添加的顺序、和进行上述操作的浓度，从而以更高产率获得葡 萄糖。在纤维素糖化中，反应液的pH和温度可以设定在酶不失活这样的范围内。通常， 当在正常的压力下进行反应时，温度可以在30-70°C范围内，pH可以在3-7的范围内。此 外，与上述相似，压力、温度和PH也可以适当调整，从而以更高产率获得葡萄糖。在乙酸或 磷酸缓冲液中在正常压力下，糖化优选在50-60°C的温度下和pH 4-6进行。反应时间通常 为6-147小时，优选为24-72小时。含葡萄糖的水溶液通过糖化葡萄糖获得。需要时，这样获得的水溶液可以进行纯 化处理，诸如脱色、脱盐、和酶去除。尽管对纯化方法没有特别限制，只要其是公知的方法， 例如，可以使用过滤处理，诸如活性炭处理，离子交换树脂处理，色谱处理，显微过滤，超滤， 或反渗透性过滤，和结晶处理。上述处理可以单独使用，或者其两种以上可以组合使用。主要由通过上述方法纯化的葡萄糖组成的水溶液可以按原样使用，或者需要时， 通过干燥固化。尽管对干燥方法没有特别限制，只要其是公知的方法，例如，可以使用喷雾 干燥、冷冻干燥、转鼓式干燥、薄膜干燥、盘式干燥、气流干燥(flash drying)、和真空干燥。 上述方法可以单独使用，或者其两种以上可以组合使用。实施例
7
本发明将参考下述实施例进行更具体地描述；然而，本发明并不限于这些实施例。实施例1里氏木霉QM9414(NBRC 31329)在马铃薯葡萄糖琼脂培养基上在28°C培养7天， 以允许孢子完全形成。将1接种环的孢子接种在带有挡板的500ml-ErIenmeyer培养 M Φ, ^ Φ # W π HH ^ ( S AsahikaseiChemicals Corporation (Asahikasei it ψ 公司)制备，商业名:Ceolus) :lg, KH2PO4 :0· 2g，(NH4)2SO4 :0· 14g，CaCl2 · 2H20 :0· 03g， MgSO4 · 7H20 :0. 03g，聚蛋白胨:0. 2g，酵母提取物:0· 05g,吐温80 :0· 1ml，痕量的基本液体 (trace element liquid)(通过将 6mg H3BO4, 26mg (NH4) 6Mo7024 · 4H20，IOOmg FeCl3 · 6H20， 40mg CuSO4 · 5H20，8mg MnCl2 · 4H20，禾口 200mgZnS04 · 7H20 溶解并混悬在 100ml 水中获得的 液体)0. Iml和水100ml，然后通过在28°C摇动培养7天。在第7天，过滤培养液，以获得 上清液。这样获得的上清液的纤维素酶活性为50U/ml，其是通过上述方法测量的。同时，白曲霉(NBRC4308)在马铃薯葡萄糖琼脂培养基上在37°C培养4天，以允许 孢子完全形成。将1接种环的孢子接种在带有挡板的500ml-Erlenmeyer培养瓶中，其中包 含麦麸3g，K2HPO4 0. 5g，和水100ml，然后在37°C摇动培养3天。在第3天，过滤培养液， 以获得上清液。这样获得的上清液的半纤维素酶活性为50U/ml，其是通过上述方法测量的。将要进行糖化的纤维素原料按照下述方法进行去木质作用。将啤酒残渣、稻草、麦 秆、和蔗渣分别精细地研磨成粉，并且混悬在0. 3N NaOH中，在120°C处理15分钟。然后，将 这样得到的产物用水彻底洗涤，并且干燥。粉状纤维素(由Nippon Paper Chemicals Co., Ltd.(日本造纸化学有限公司)制备，商品名KC flock ff-50)按原样进行糖化。通过在50°C pH 4. 8摇动液体(3 %的纤维素原料液)24_48小时糖化纤维素原 料，所述液体由下列各项组成纤维素原料0. 3g，里氏木霉培养物上清液4. 75ml，白曲霉 培养物上清液4. 75ml，和IM乙酸缓冲液(pH 4. 8) 0. 2ml。然后，通过葡萄糖CII-检测 Wako (ffako Pure Chemicalslndustries, Ltd. (Wako纯化学工业有限公司))测量这样生产 的葡萄糖。分别单独使用里氏木霉培养物上清液9. 5ml和白曲霉培养物上清液9. 5ml替 换培养物上清液混合物作为对照。这样得到的结果分别显示在
图1-5中。实施例2随着改变里氏木霉培养物上清液与白曲霉培养物上清液的混合比例，比较糖化效 率。对于这些培养物上清液，使用以与实施例1相似的方式制备的那些。糖化通过在50°C pH 4. 8摇动这样的液体(10%的蔗渣液)24小时进行，所述液 体由下列各项组成蔗渣lg，培养物上清液混合物8. 8ml，和IM乙酸缓冲液(pH 4.8) 0.2ml。然后，测量这样生产的葡萄糖。这样得到的结果显示在图6中。图中水平轴显示的 混合比例为体积比例。实施例3里氏木霉培养液和白曲霉培养液以与实施例1相似的方式获得，不同的是不进行 过滤。然后，制备具有不同的培养液混合比例的各种混合物，并且比较糖化效率。糖化通过在50°CpH 4.8摇动这样的液体(10%粉状纤维素液体)24小时进行，所 述液体由粉状纤维素(商品名KC flock) :lg，培养液混合物8.8ml，和IM乙酸缓冲液(pH4.8) :0.2ml组成。然后，测量这样生产的葡萄糖。这样得到的结果显示在图7中。图中水 平轴显示的混合比例为体积比例。实施例4随着改变里氏木霉培养物上清液与白曲霉培养物上清液的混合比例，比较糖化效 率。对于这些培养物上清液，使用以与实施例1相似的方式制备的那些。糖化通过在50°C pH 4. 8摇动这样的液体(3%的啤酒残渣液体)24小时进行，所 述液体由啤酒残渣0. 3g，培养物上清液混合物9. 5ml，和IM乙酸缓冲液(pH 4. 8) 0. 2ml 组成。然后，测量这样生产的葡萄糖。这样得到的结果显示在图8中。图中水平轴显示的 混合比例为体积比例。实施例5利用各种曲霉属丝状真菌的培养物上清液与里氏木霉培养物上清液组合，比较对 糖化效率的协同作用。对于里氏木霉培养物上清液，使用以与实施例1相似的方式制备的 那种。^^ (Aspergillus awamori), NBRC4388, M^M (Aspergillusniger), NBRC31125，佐氏曲霉(Aspergillus saitoi)，ATCC11363，米曲霉(Aspergillus oryzae), RIB40，和棘孢曲霉(Aspergillus aculeatus)，NBRC5330，分别在马铃薯葡萄糖琼脂培养 基上在37°C培养4天，以允许孢子完全形成。将1接种环的每种孢子接种在带有挡板的 500ml-Erlenmeyer培养瓶中，其中包含麦麸3g，K2HPO4 0. 5g，和水100ml，然后在37°C摇 动培养3天。在第3天，过滤每种培养液，以获得上清液。通过在50°C pH 4. 8摇动液体(5%的粉状纤维素液)24小时进行糖化，所述液体 由粉状纤维素0. 5g，曲霉属丝状真菌的培养物上清液和里氏木霉培养物上清液的混合物 (混合比例为50 50) 9. 3ml，和IM乙酸缓冲液(pH 4.8) :0. 2ml组成。然后，测量这 样生产的葡萄糖。分别单独使用里氏木霉培养物上清液9. 3ml和曲霉属的培养物上清液 9. 3ml替换培养物上清液混合物作为对照。这样得到的结果显示在图9中。参照实施例1检验木霉属来源的纤维素酶和白曲霉来源的纤维素酶的协同作用。分别将里氏木 霉来源的纤维素酶制剂(Sigma-Aldrich，Inc.(西格玛-奥德里奇公司))和绿色木霉来源 的纤维素酶制剂(Sigma-Aldrich，Inc.(西格玛-奥德里奇公司))溶解在水中，制成的 纤维素酶液体。通过在50°C pH 4. 8摇动由脱木素处理的蔗渣0. 5g，的纤维素酶液体 4. 65ml,白曲霉培养物上清液4. 65ml和IM乙酸缓冲液(pH 4. 8) 0. 2ml组成的液体(5% 的蔗渣液体)24小时进行糖化。然后，测量这样生产的葡萄糖。对于白曲霉培养物上清液， 使用以与实施例1相似的方式制备的那种。分别单独使用纤维素酶液体9. 3ml和白曲霉培养物上清液9. 3ml替换培养 物上清液混合物作为对照。这样得到的结果显示在图10中。由上述获得的实施例和参照实施例的结果可知，当木霉属丝状真菌的培养液或上 清液与白曲霉培养液或上清液组合使用时，鉴定到纤维素水解活性的协同作用，并且丝状 真菌培养液或上清液的纤维素降解和糖化能力显著提高。实施例6里氏木霉培养物上清液以与实施例1相似的方式获得。
白曲霉(NBRC4308)在马铃薯葡萄糖琼脂培养基上在37°C培养4天，以允许孢子 完全形成。将1接种环的孢子接种在培养基中，所述培养基通过将包含50g麸调整至含水 量为50%的培养皿在121°C高压灭菌15分钟获得。然后，将孢子在36°C培养3天，以产生 固体培养产物。对于所述固体培养产物，以固体培养产物重量5倍的量加入0. 5%的盐水。 在将所述固体培养产物静置过夜后，过滤去除真菌体，由此获得固体培养物滤过液。这样获得的固体培养物滤过液的半纤维素酶活性为90U/ml，这是通过上述方法测 量的。使要被糖化的纤维素原料按照下述方法进行去木质处理。将蔗渣块分别精细研磨 成粉，并且混悬在0.3N NaOH中，并且在120°C处理15分钟。随后，将这样得到的产物用水 彻底洗涤，并且干燥。粉状纤维素(由NipponPaper Chemicals Co.，Ltd.(日本造纸化学 有限公司)制备，商品名KC flockff-50)按其原样进行糖化。纤维素原料通过在50°C pH 4. 8摇动这样的液体(6. 5%的纤维素原料液)24小时 进行糖化，所述液体由纤维素原料0. 65g，里氏木霉培养物上清液4. 6ml，白曲霉固体培 养物滤过液4. 6ml，和IM乙酸缓冲液(pH4. 8) 0. 2ml组成(培养物上清液与固体培养物滤 过液的体积比例为50%:50%)。然后，通过葡萄糖CII-检测Wako (Wako Pure Chemicals Industries, Ltd. (Wako纯化学工业有限公司))测量这样生产的葡萄糖。分别单独使用 里氏木霉培养物上清液9. 2ml和白曲霉固体培养物滤过液9. 2ml替换上述混合物作为对 照。这样得到的结果显示在图11中。图中水平轴显示的混合比例为体积比例。附图简述[图1]图1是生产的葡萄糖浓度相对于啤酒残渣糖化反应时间绘制的图。[图2]图2是生产的葡萄糖浓度相对于稻草糖化反应时间绘制的图。[图3]图3是生产的葡萄糖浓度相对于麦秆糖化反应时间绘制的图。[图4]图4是生产的葡萄糖浓度相对于蔗渣糖化反应时间绘制的图。[图5]图5是生产的葡萄糖浓度相对于粉状纤维素糖化反应时间绘制的图。[图6]图6是比较改变里氏木霉培养物上清液和白曲霉培养物上清液的混合比例 对蔗渣进行糖化产生的葡萄糖浓度的图。[图7]图7是比较改变里氏木霉培养液和白曲霉培养液的混合比例对粉状纤维素 进行糖化产生的葡萄糖浓度的图。[图8]图8是比较改变里氏木霉培养物上清液和白曲霉培养物上清液的混合比例 对啤酒残渣进行糖化产生的葡萄糖浓度的图。[图9]图9是比较使用各种类型的曲霉属丝状真菌的培养物上清液与里氏木霉培 养物上清液组合对粉状纤维素进行糖化产生的葡萄糖浓度的图。[图10]图10是比较使用包含来源于两种木霉属丝状真菌的纤维素酶的液体与白 曲霉培养物上清液组合对粉状纤维素进行糖化产生的葡萄糖浓度的图。[图11]图11是显示使用里氏木霉培养物上清液与白曲霉固体培养物滤过液组合 对纤维素原料进行糖化产生的葡萄糖浓度的图。
权利要求
木霉属(Trichoderma)丝状真菌的培养液或上清液和白曲霉(Aspergillus kawachii)培养产物的混合物、或其干品，其表现出纤维素水解活性。
2.根据权利要求1所述的混合物或其干品，其中白曲霉培养产物是培养液或上清液。
3.根据权利要求1所述的混合物或其干品，其中白曲霉培养产物是固体培养产物或其 提取液。
4.根据权利要求1-3中任一项所述的混合物或其干品，其中所述木霉属丝状真菌的培 养液或上清液的纤维素酶活性不小于50U/ml，并且白曲霉培养液、上清液或固体培养产物 提取液的半纤维素酶活性不小于50U/ml。
5.根据权利要求1-4中任一项所述的混合物或其干品，其中所述木霉属丝状真菌的培 养液或上清液与所述白曲霉培养液、上清液或固体培养产物提取液的混合比例按体积比在 10 90-90 10 范围内。
6.根据权利要求1-5中任一项所述的混合物或其干品，其中所述木霉属丝状真菌是里 氏木霉(Trichoderma reesei)或绿色木霉(Trichodermaviride)。
7.根据权利要求1-5中任一项所述的混合物或其干品，其中所述木霉属丝状真菌是里 氏木霉。
8.—种生产葡萄糖的方法，其包括使用根据权利要求1-7中任一项所述的混合物或其 干品糖化纤维素原料的步骤。
9.根据权利要求8所述的方法，其中所述糖化在30-70°C和pH3_7的条件下进行。
全文摘要
本发明的目的是提供一种以非常有效、简单且廉价的方式酶促糖化纤维素质物质的方法。该目的的溶液是表现出纤维素水解活性的混合物或其干品，其包含木霉属丝状真菌的培养液或上清液和白曲霉的培养产物。
文档编号C12P19/02GK101981178SQ200980110856
公开日2011年2月23日 申请日期2009年2月27日 优先权日2008年3月28日
发明者福田和郎 申请人:朝日啤酒株式会社