用于产生己二酸和其他化合物的微生物的制作方法

专利名称：用于产生己二酸和其他化合物的微生物的制作方法
用于产生己二酸和其他化合物的微生物本申请要求于2008年3月27日申请的美国临时系列号61/040，059的优先权权 益，该申请的全部内容通过引用合并于此。
背景技术：
本发明总体上涉及生物合成方法，且更具体地涉及具有己二酸、6-氨基己酸和己 内酰胺生物合成能力的生物体。己二酸，一种分子量为146. 14的二羧酸，是一种具有商业意义的化合物。其主要 用途是制备尼龙6，6，一种通过将己二酸与环己二胺缩合制备的线性聚酰胺，其主要用于制 造不同种类的纤维。己二酸的其他用途包括其在增塑剂、不饱和聚酯和聚酯多元醇中的用 途。其他用途包括用于制备聚氨酯、润滑剂组分，和作为调味剂和胶凝助剂用作食品成分。过去，己二酸使用氧化作用由各种脂肪制备。目前用于己二酸合成的商业方法依 靠使用过量的浓硝酸氧化KA油——一种环己酮(酮或K组分)和环己醇(醇或A组分) 的混合物，或氧化纯环己醇。此方案有几种变型，其区别在于产生KA或环己醇的途径。例 如，苯酚是KA油制备中的替代原料，并且已经描述了用于从苯酚合成己二酸的方法。此方 法的其他方式倾向于使用除硝酸以外的氧化剂，诸如过氧化氢、空气或氧。己内酰胺是一种有机化合物，其是6-氨基己酸(ε -氨基己酸、氨基己酸)的内酰 胺。或者其可以被认为是己酸的环酰胺。己内酰胺的主要工业应用是作为制备尼龙-6的 单体。大多数己内酰胺使用硫酸羟铵经肟化方法然后使用Beckmarm重排工艺步骤通过催 化重排合成自环己酮。因此，存在着用于有效地制备商业数量的化合物诸如己二酸和己内酰胺的可替代 方法的需求。本发明满足了这种需求并还提供了相关的优势。发明概述本发明提供了具有己二酸、6-氨基己酸或己内酰胺途径的非天然存在的微生物生 物体。该微生物生物体含有至少一种编码己二酸、6-氨基己酸或己内酰胺途径中各自的酶 的外源性核酸。本发明还提供了一种产生己二酸、6-氨基己酸或己内酰胺的方法。该方法 可以包括在产生己二酸、6-氨基己酸或己内酰胺的条件下和足以产生己二酸、6-氨基己酸 或己内酰胺的时间内培养产生己二酸、6-氨基己酸或己内酰胺的微生物生物体，其中所述 微生物生物体以足以产生各自产物的量表达至少一种编码己二酸、6-氨基己酸或己内酰胺 途径酶的外源性核酸。附图简要说明

图1显示在产黄青霉菌(Penicillium chrysogenum)的过氧化酶体中降解己二酸 的示例性途径。图2显示经逆降解途径形成己二酸的示例性途径。对于己二酰-CoA至己二酸的 最终转变提供了几种选择。图3显示经3-氧代己二酸途径形成己二酸的示例性途径。图4显示己二酸合成和还原性TCA循环的3-氧代己二酸途径的最后三个步骤的 类似酶化学。
图5显示经顺，顺-己二烯二酸从葡萄糖合成己二酸的示例性途径。生物合成中间 体(缩写)D-赤藓糖4-磷酸(E4P)、磷酸烯醇式丙酮酸(PEP)、3_脱氧-D-阿拉伯庚酮糖 酸7-磷酸(DAHP)、3-脱氢奎尼酸(DHQ)、3_脱氢莽草酸(DHS)、原儿茶酸(PCA)。酶(编码 基因)或反应条件(a) DAHP合成酶(aroFFBR)、(b) 3-脱氢奎尼酸合成酶(aroB)、(c) 3-脱 氢奎尼酸脱水酶(aroD)、(d) DHS脱水酶(aroZ), (e)原儿茶酸脱羧酶(aroY), (f)儿茶酚 1，2-双加氧酶(catA)、(g) 10% Pt/C, H2，3400kPa，25°C。附图取自 Niu 等，Biotechnol. Prog. 18 :201-211(2002)) ο图6显示使用α -酮戊二酸作为起点经α -酮己二酸合成己二酸的示例性途径。图7显示使用赖氨酸作为起点合成己二酸的示例性途径。图8显示使用己二酰-CoA作为起点的示例性己内酰胺合成途径。图9显示使用α -酮己二酸作为起点的示例性己二酸合成途径。发明详述本发明涉及具有己二酸、6-氨基己酸或己内酰胺的生物合成性制备能力的细胞和 生物体的设计和产生。本文所述的结果表明代谢途径可以被设计和重组改造，从而在大肠 杆菌(Escherichia coli)和其他细胞或生物体中实现己二酸、6_氨基己酸或己内酰胺的 生物合成。通过构建具有设计的代谢基因型的菌株可以确认己二酸、6-氨基己酸和己内酰 胺的生物合成性制备。这些代谢改造的细胞或生物体还可以进行适应进化以进一步增加己 二酸、6-氨基己酸或己内酰胺的生物合成，包括在接近理论最大生长的条件下。如本文所公开的，描述了许多用于产生己二酸、6-氨基己酸和己内酰胺的代谢途 径。发现两种途径——逆向己二酸降解途径和3-氧代己二酸途径——在下列方面是有益 的(i)己二酸产率(以葡萄糖计，92%摩尔产率)，(ii)对于己二酸合成不需要氧，(iii) 相关的能量学，和(iv)产生作为单一发酵产物的己二酸的理论能力。还描述了通过α-酮 己二酸或赖氨酸产生己二酸的代谢途径，但其产率较低，并且需要通气以达到最大产量。 本文还公开了用于从己二酰-CoA产生6-氨基己酸或己内酰胺或两者的途径，所述己二 酰-CoA是逆降解途径中的前体。如本文所公开的，描述了许多生物合成己二酸的示例性途径。一种示例性途径包 括经依赖于己二酸降解的可逆性的途径的己二酸合成，如在生物体诸如产黄青霉菌中所描 述(参见实施例I和II)。第二种示例性途径需要形成3-氧代己二酸，然后使其还原、脱 水和再次还原以形成己二酸(参见实施例HI和IV)。使用这两种途径的任一种的己二酸 产率为0. 92摩尔/摩尔消耗的葡萄糖。为了达到这些理论最大产率，不需要摄取氧，并且 在厌氧条件下的能量学有利于生长和产物分泌。从葡萄糖来源的顺，顺-己二烯二酸产生 己二酸的方法以前有所描述(Frost等，美国专利号5，487，987，于1996年1月30日授权) (参见实施例V)。对本文公开的实施方案相对于此先前描述的方法的优势进行了讨论。通 过α -酮己二酸(实施例VI)或赖氨酸(实施例VII)前体产生己二酸的代谢途径的产率 较低，并且需要通气以达到最大产量。描述了从己二酰-CoA产生6-氨基己酸或己内酰胺 或两者的途径，所述己二酰-CoA是逆降解途径中的前体(参见实施例VIII和IX)。用于产 生己二酸的其他途径描述在实施例X和XI中。描述了构建具有这些能力的微生物所需的 示例性基因和酶以及克隆和转化、监测产物形成和使用改造的微生物用于生产的方法。如本文所公开的，描述了使用葡萄糖/蔗糖作为碳底物的己二酸合成的6种不同的途径。对于所有最大产率计算，在给定途径中缺少的反应加入至SimPheny中的大肠杆菌 化学计算网络中，其类似于以前所述的一种网络(Reed等，Genome Biol. 4 :R54(2003)) 0己 二酸在生理条件下是一种带电分子，并且其被假设需要以基于质子的同向转运系统形式的 能量以被分泌出网络。如果在中性或接近中性PH下进行发酵，则此转运系统在热力学上是 可行的。低PH己二酸形成将需要ATP-依赖性输出机制，例如，与质子同向转运相反的ABC 系统。这些途径中的反应和实现这些途径的方法描述在实施例I-XI中。如本文所使用，术语“非天然存在的”当用来说明本发明的微生物生物体或微生物 时意在指微生物生物体具有至少一个在参照物种的天然存在株中正常情况下不存在的遗 传改变，所述天然存在株包括参照物种的野生株。遗传改变包括，例如，引入可表达的编码 代谢多肽的核酸的修饰，其他核酸添加，核酸缺失和/或微生物遗传材料的其他功能性破 坏。此类修饰包括，例如，参照物种的异源多肽、同源多肽或异源多肽和同源多肽两者的编 码区和其功能片段。其他的修饰包括，例如，非编码调控区，其中所述修饰改变基因或操纵 子的表达。示例性的代谢多肽包括己二酸、6-氨基己酸或己内酰胺生物合成途径内的酶。代谢修饰指从其天然存在状态改变的生化反应。因此，非天然存在的微生物可以 具有对编码代谢多肽的核酸或其功能片段的遗传修饰。示例性的代谢修饰公开在本文中。如本文所使用，术语“分离的”当用来说明微生物生物体时意在指生物体基本上不 含有当参照微生物生物体在自然界中被发现时的至少一种成分。该术语包括微生物生物体 与当其在自然环境中被发现时的一些或所有成分分开。该术语还包括微生物生物体与当微 生物生物体在非天然存在的环境中被发现时的一些或所有成分分开。因此，分离的微生物 生物体与当其在自然界中发现时或当其在非天然存在的环境中生长、保存或生存时的其他 物质部分或全部地分离。分离的微生物生物体的具体实例包括部分纯的微生物、基本上纯 的微生物和在非天然存在的在培养基中培养的微生物。如本文中所使用，术语“微生物”、“微生物生物体”或“微生物体”意在指包括在古 细菌域、真细菌域或真核生物域的范围内的作为微型细胞存在的任何生物体。因此，该术语 意在包括具有微型尺寸的原核或真核细胞或生物体，并且包括所有物种的细菌、古细菌和 真细菌以及真核微生物诸如酵母和真菌。该术语还包括可被培养以产生生物化学物质的任 何物种的细胞培养物。如本文所使用，术语“CoA”或“辅酶A”意在指有机辅因子或辅基(酶的非蛋白部 分)，其存在是许多酶(脱辅基酶)的活性形成活性酶体系所必需的。辅酶A在某些缩合酶 中起作用，在乙酰基或其他酰基转移和在脂肪酸合成和氧化、丙酮酸氧化和在其他乙酰化 中发挥作用。如本文所使用，具有化学式-00C-(CH2) 4-C00_(参见图2)的“己二酸盐 (adipate)”(IUPAC 名称hexanedioate)是己二酸(IUPAC 名称:hexanedioic acid)的离 子化形式，并且要理解己二酸盐和己二酸通篇可以互换使用以指采取其中性或离子形式的 任一种形式的化合物，包括其任何盐形式。技术人员要理解的是，具体形式将取决于PH。
如本文所使用，具有化学式-00C- (CH2) 5-NH2 (参见图8)的“ 6-氨基己酸盐 (6-aminocaproate) ”是 6-氨基己酸(IUPAC 名称6_aminohexanoic acid)的离子形式，并 且要理解6-氨基己酸盐和6-氨基己酸通篇可以互换使用以指采取其中性或离子形式的任 一种形式的化合物，包括其任何盐形式。技术人员要理解的是，具体形式将取决于PH。
如本文所使用，“己内酰胺”(IUPAC名称az印an-2-one (氮杂环庚烷-2-酮))是 6-氨基己酸的内酰胺(参见图8)。如本文所使用，术语“基本上厌氧的”当用来描述培养或生长条件时意在指氧量小 于液体培养基中溶解氧饱和度的约10%。该术语还意在包括液体或固体培养基的密闭室保 持以小于约氧的气氛。如本文所使用，“外源性”意在指参照分子或参照活性被引入指宿主微生物生物体 中。该分子可以通过如下方法被引入，例如，通过将编码核酸引入宿主遗传物质中诸如通过 整合至宿主染色体中或作为非染色体遗传物质诸如质粒引入。因此，该术语当用来说明编 码核酸的表达时指编码核酸以可表达形式引入至微生物生物体中。当用来说明生物合成活 性时，该术语指引入至宿主参照生物体申的活性。来源可以是，例如，同源或异源的编码核 酸，其在引入至宿主微生物生物体中后表达参照活性。因此，术语“内源性”指参照分子或 活性存在于宿主中。类似地，该术语当用来说明编码核酸的表达时指包含在微生物生物体 内的编码核酸的表达。术语“异源的”指分子或活性来源于参照物种以外的来源，而“同源 的”指分子或活性来源于宿主微生物生物体的。因此，本发明的编码核酸的外源性表达可以 利用异源的编码核酸或同源的编码核酸或两者。本发明的非天然存在的微生物生物体可以含有稳定的遗传改变，其指微生物可以 培养5代以上而没有丢失所述改变。通常，稳定的遗传改变包括持续10代以上的修饰，特 别稳定的修饰将持续约25代以上，并且更特别地，稳定的遗传修饰将为50代以上，包括无 限期。本领域技术人员将会理解，遗传改变，包括本文所例举的代谢修饰，参照适当的宿 主生物体诸如大肠杆菌和它们相应的代谢反应或适合于所需的遗传物质诸如所需代谢途 径的基因的来源生物体进行描述。然而，鉴于多种多样的生物体的全基因组测序和基因组 学领域中的高技术水平，本领域技术人员将能够容易地将本文提供的教导和指导应用于基 本上所有其他生物体。例如，本文例举的大肠杆菌代谢改变可以通过掺入来自参照物种以 外的物种的相同的或类似的编码核酸而容易地应用于其他物种。此类遗传改变包括，例如， 物种同源物的遗传改变，通常和特别地，直向同源物(ortholog)、旁系同源物(paralog)或 非直向同源(nonorthologous)基因置换。直向同源物是通过垂直遗传而相关并且在不同的生物体中负责基本上相同或同 一功能的一种基因或多种基因。例如，小鼠环氧化物水解酶和人环氧化物水解酶可以被认 为是环氧化物水解的生物学功能的直向同源物。例如，当基因共享足以表明它们是同源的 量的序列相似性时，它们是通过垂直遗传而相关的，或由共同祖先进化而相关。如果基因共 享足以表明它们已从共同祖先进化至一级序列相似性不可鉴定的程度的量的三维结构但 不必然具有这样的量的序列相似性，它们也可被认为是直向同源物。直向同源的基因可以 编码具有约25% -100%氨基酸序列同一性的序列相似性的蛋白质。如果其三维结构也显 示相似性，则编码共享小于25%的氨基酸相似性的蛋白质的基因也可以被认为由垂直遗传 而产生。丝氨酸蛋白酶家族的成员，包括组织纤溶酶原激活物和弹性蛋白酶，被认为从共同 祖先通过垂直遗传而产生。直向同源物包括基因或它们编码的基因产物，它们通过，例如，进化，已经在结构 上或总体活性上发生了趋异。例如，在一个物种编码显示两种功能的基因产物的情况下以及在此类功能已经在第二物种中分离入不同基因的情况下，这三种基因和它们相应的产物 被认为是直向同源物。对于生物化学产物的产生，本领域技术人员将理解具有待引入或待 破坏的代谢活性的直向同源基因被选择用于构建非天然存在的微生物。显示可分离的活性 的直向同源物的实例是在两个或多个物种之间或单个物种内不同的活性已经分离入不同 的基因产物的情况。具体的实例是弹性蛋白酶蛋白水解和纤溶酶原蛋白水解(两种类型的 丝氨酸蛋白酶活性)作为纤溶酶原激活物和弹性蛋白酶分离入不同分子。第二个实例是支 原体5’ -3’外切核酸酶和果蝇(DrOSOphila)DNA聚合酶III活性的分离。来自第一物种 的DNA聚合酶可以被认为是来自第二物种的外切核酸酶或聚合酶或两者的直向同源物，且 反之亦然。相反，旁系同源物是通过例如，复制然后通过进化趋异而相关的同源物，并且具有 相似的或共有的、但不相同的功能。旁系同源物可以源自或来自，例如，相同的物种或不同 的物种。例如，微粒体环氧化物水解酶(环氧化物水解酶I)和可溶性环氧化物水解酶(环 氧化物水解酶II)可以被认为是旁系同源物，因为它们代表从共同祖先共同进化的两种不 同的酶，它们在相同的物种中催化不同的反应并且具有不同的功能。旁系同源物是来自相 同物种的彼此具有显著的序列相似性的蛋白质，表明它们是同源的，或通过从共同祖先共 同进化而相关。旁系同源蛋白家族的组包括HipA同源物、萤光素酶基因、肽酶等。非直向同源基因置换是来自一个物种的非直向同源基因可以替代不同物种中的 参照基因功能。置换包括，例如，能够在来源物种中执行与不同物种中的参照功能相比基本 上相同或相似的功能。尽管通常非直向同源置换将可被鉴定为与编码参照功能的已知基因 结构上相关，然而结构上不太相关但功能上相似的基因和它们相应的基因产物将仍然落在 该术语的范围内，如其在本文中所使用的那样。与编码寻求替代的功能的基因相比，功能相 似性需要，例如，非直向同源基因产物的活性位点或结合区中的至少一些结构相似性。因 此，非直向同源基因包括，例如，旁系同源物或不相关基因。因此，在鉴定和构建本发明的具有己二酸、6-氨基己酸或己内酰胺生物合成能力 的非天然存在的微生物生物体时，本领域技术人员将理解，将本文提供的教导和指导应用 于具体物种，使得代谢修饰的鉴定可以包括直系同源物的鉴定和包含或失活。就编码催化 相似或基本上相似的代谢反应的酶的旁系同源物和/或非直向同源基因置换存在于参照 微生物中这一程度而言，本领域技术人员还可以利用这些进化上相关的基因。直系同源物、旁系同源物和非直向同源基因置换可以通过本领域技术人员所熟知 的方法来确定。例如，对于两种多肽，核酸或氨基酸序列的检查将揭示比较的序列之间的 序列同一性和相似性。基于这些相似性，本领域技术人员可以确定是否相似性足够高从而 表明这些蛋白质通过从共同祖先进化而相关。本领域技术人员所熟知的算法，诸如Align、 BLAST、Clustal W和其他算法比较和确定原始序列相似性或同一性，并且还确定序列中空 位的存在或显著性，其可以被赋予权重或分值。此类算法在本领域中也是已知的，并且类似 地可应用于确定核苷酸序列相似性或同一性。基于用于计算统计学相似性的公知方法、或 在随机多肽中找到相似匹配的机会以及确定的匹配的显著性来计算足以确定关联性的相 似性参数。如果需要，两条或多条序列的计算机比较也可以由本领域技术人员通过肉眼观 察来优化。相关的基因产物或蛋白质可被预期具有高相似性，例如，25% -100%序列同一 性。如果扫描具有足够大小的数据库，不相关的蛋白质可以具有与如预期将偶然发生的那样基本上相同的同一性(约5% )。5% 之间的序列可以代表或不代表足以得出比较 的序列是相关的结论的同源性。对于给定的数据库大小，可以进行用于确定此类匹配的显 著性的其他统计学分析以确定这些序列的相关性。例如，使用BLAST算法确定两条或多条序列的关联性的示例性参数可如下所示。 简言之，使用BLASTP 2. 0. 8版(1999年1月5日)和下列参数执行氨基酸序列比对矩阵 0BL0SUM62 ；空位开放11 ；空位延伸1 ；x_dropoff :50 ；期望值:10.0 ；字长3 ；过滤器 开。可以使用BLASTN 2. 0. 6版(1998年9月16日)和下列参数执行核酸序列比对匹配 1 ；错配-2 ；空位开放5 ；空位延伸2 ；x_dropoff :50 ；期望值10. 0 ；字长11 ；过滤器 关。本领域技术人员将知道可以对上述参数作出何种修改来例如，增加或降低比较的严格 性，和确定两条或多条序列的关联性。本发明提供了能够产生己二酸、6-氨基己酸或己内酰胺的非天然存在的微生物 生物体。例如，己二酸途径可以是逆向己二酸降解途径(参见实施例I和II)。在一个实 施方案中，本发明提供了具有己二酸途径的非天然存在的微生物生物体，其包含以足以产 生己二酸的量表达的至少一种编码己二酸途径酶的外源性核酸，所述己二酸途径包括琥珀 酰-CoA 乙酰-CoA酰基转移酶、3-羟酰-CoA脱氢酶、3-羟基己二酰-CoA脱水酶、5-羧 基-2-戊烯酰-CoA还原酶和己二酰-CoA合成酶或磷酸己二酰转移酶/己二酸激酶或己二 酰-CoA 乙酰-CoA转移酶或己二酰-CoA水解酶。另外，己二酸途径可以经由3-氧代己二 酸途径(参见实施例III和IV)。在另一个实施方案中，本发明提供了具有己二酸途径的 非天然存在的微生物生物体，其包含以足以产生己二酸的量表达的至少一种编码己二酸途 径酶的外源性核酸，所述己二酸途径包括琥珀酰-CoA 乙酰-CoA酰基转移酶、3-氧代己二 酰-CoA转移酶、3-氧代己二酸还原酶、3-羟基己二酸脱水酶和2-烯酸还原酶。还在另一个实施方案中，本发明提供了具有6-氨基己酸途径的非天然存在的微 生物生物体，其包含以足以产生6-氨基己酸的量表达的至少一种编码6-氨基己酸途径 酶的外源性核酸，所述6-氨基己酸途径包括CoA-依赖性醛脱氢酶和转氨酶(参见实施例 VIII和IX)。备选地，6-氨基己酸脱氢酶可以用来转变己二酸半醛以形成6-氨基己酸(参 见图8)。在进一步的实施方案中，本发明提供了具有己内酰胺途径的非天然存在的微生物 生物体，其包含以足以产生己内酰胺的量表达的至少一种编码己内酰胺途径酶的外源性核 酸，所述己内酰胺途径包括CoA-依赖性醛脱氢酶、转氨酶或6-氨基己酸脱氢酶和酰胺水解 酶(参见实施例VIII和IX)。如本文所公开，本发明的产生6-氨基己酸或己内酰胺的微生物生物体可以从己 二酰-CoA前体产生6-氨基己酸和/或己内酰胺(参见图8和实施例VIII和IX)。因此，要 理解，产生6-氨基己酸或己内酰胺的微生物生物体可以进一步包括产生己二酰-CoA的途 径。例如，己二酰-CoA途径可以包括图2的酶，其通过己二酰-CoA的产生利用琥珀酰-CoA 和乙酰-CoA作为前体，即，缺少用于将己二酰-CoA转变为己二酸的最终步骤的酶。因此， 一个示例性的己二酰-CoA途径可以包括琥珀酰-CoA 乙酰-CoA酰基转移酶、3-羟酰-CoA 脱氢酶、3-羟基己二酰-CoA脱水酶和5-羧基-2-戊烯酰-CoA还原酶。另外，如图1中所示，己二酸降解途径包括通过己二酸CoA连接酶将己二酸转变为 己二酰-CoA的步骤。因此，己二酰-CoA途径可以是进一步包括将己二酸转变为己二酰-CoA 的酶活性的己二酸途径，包括，例如，如图1的第一步骤中的己二酸-CoA连接酶活性和以逆向进行的图2的最终步骤中的任一种酶，例如，己二酰-CoA合成酶(也称为己二酸Co-A连 接酶)、磷酸己二酰转移酶/己二酸激酶、己二酰-CoA 乙酰-CoA转移酶或己二酰-CoA水解 酶的任一种。具有己二酸转变为己二酰-CoA活性的酶可以是内源性活性或可以作为编码 该酶的外源性核酸而提供，如本文所公开的。因此，要理解，利用己二酸转变为己二酰-CoA 的酶活性，任何己二酸途径可以用来产生己二酰-CoA途径。这样的途径可以包含在产生 6-氨基己酸或己内酰胺的微生物生物体中，从而为6-氨基己酸和/或己内酰胺的产生提供 己二酰-CoA前体。其他示例性的己二酸途径利用α -酮己二酸作为前体(参见图6和实施例VI)。 在又一个实施方案中，本发明提供了具有己二酸途径的非天然存在的微生物生物体，其包 含以足以产生己二酸的量表达的至少一种编码己二酸途径酶的外源性核酸，所述己二酸途 径包括高柠檬酸合成酶、高乌头酸酶、同分异构柠檬酸脱氢酶、2-酮己二酸还原酶、α -羟 基己二酸脱水酶和氧化还原酶。进一步示例性的己二酸途径利用赖氨酸降解途径(参见图 7和实施例VII)。本发明的另一实施方案提供了具有己二酸途径的非天然存在的微生物生 物体，其包含以足以产生己二酸的量表达的至少一种编码己二酸途径酶的外源性核酸，所 述己二酸途径包括碳氮裂合酶、氧化还原酶、转氨酶和氧化还原酶。还有另一个示例性的己二酸途径利用α -酮己二酸作为前体(参见图9和实施 例X和XI)。因此，本发明另外提供了具有己二酸途径的非天然存在的微生物生物体，其包 含以足以产生己二酸的量表达的至少一种编码己二酸途径酶的外源性核酸，所述己二酸途 径包括α-酮己二酰-CoA合成酶、磷酸酮己二酰转移酶(phosphotransketoadipylase)/ α -酮己二酸激酶或α -酮己二酰-CoA 乙酰-CoA转移酶；2_羟基己二酰-CoA脱氢酶； 2-羟基己二酰-CoA脱水酶；5-羧基-2-戊烯酰-CoA还原酶；和己二酰-CoA合成酶、磷酸 己二酰转移酶(phosphotransadipylase) /己二酸激酶、己二酰-CoA 乙酰-CoA转移酶或 己二酰-CoA水解酶。还在另一个实施方案中，本发明提供了具有己二酸途径的非天然存在 的微生物生物体，其包含以足以产生己二酸的量表达的至少一种编码己二酸途径酶的外源 性核酸，所述己二酸途径包括2-羟基己二酸脱氢酶；2-羟基己二酰-CoA合成酶、磷酸羟基 己二酰转移酶/2-羟基己二酸激酶或2-羟基己二酰-CoA 乙酰-CoA转移酶；2-羟基己二 酰-CoA脱水酶；5-羧基-2-戊烯酰-CoA还原酶；和己二酰-CoA合成酶、磷酸己二酰转移 酶/己二酸激酶、己二酰-CoA 乙酰-CoA转移酶或己二酰-CoA水解酶。在其他的实施方案中，本发明提供了具有己二酸、6-氨基己酸或己内酰胺途径的 非天然存在的微生物生物体，其中所述非天然存在的微生物生物体包含至少一种编码将底 物转变为产物的多肽的外源性核酸，如本文所公开的那样。因此，本发明提供了含有至少 一种编码多肽的外源性核酸的非天然存在的微生物生物体，其中所述多肽是转变己二酸、 6-氨基己酸或己内酰胺途径的底物和产物的酶或蛋白质，诸如图2、3、8和9中所示的那些。在一个实施方案中，本发明提供了具有己二酸途径的非天然存在的微生物生物 体，其中所述微生物生物体含有至少一种编码将底物转变为产物的多肽的外源性核酸，所 述的底物转变为产物选自琥珀酰-CoA和乙酰-CoA转变为3-氧代己二酰-CoA ；3-氧代己二 酰-CoA转变为3-羟基己二酰-CoA ；3-羟基己二酰-CoA转变为5-羧基-2-戊烯酰-CoA ； 5-羧基-2-戊烯酰-CoA转变为己二酰-CoA ；己二酰-CoA转变为己二酸(参见图2)。在 另一个实施方案中，本发明提供了具有己二酸途径的非天然存在的微生物生物体，其中所述微生物生物体含有至少一种编码将底物转变为产物的多肽的外源性核酸，所述的底物转 变为产物选自琥珀酰-CoA和乙酰-CoA转变为3-氧代己二酰-CoA ；3-氧代己二酰-CoA转 变为3-氧代己二酸；3-氧代己二酸转变为3-羟基己二酸；3-羟基己二酸转变为己-2-烯 二酸盐(hexa-2-enedioate)；己_2_烯二酸盐转变为己二酸(参见图3)。在其他的实施方案中，本发明提供了具有6-氨基己酸途径的非天然存在的微生 物生物体，其中所述微生物生物体含有至少一种编码将底物转变为产物的多肽的外源性核 酸，所述的底物转变为产物选自己二酰-CoA转变为己二酸半醛；和己二酸半醛转变为6-氨 基己酸(参见图8)。还在另一个实施方案中，本发明提供了具有己内酰胺途径的非天然存 在的微生物生物体，其中所述微生物生物体含有至少一种编码将底物转变为产物的多肽的 外源性核酸，所述的底物转变为产物选自己二酰-CoA转变为己二酸半醛；己二酸半醛转变 为6-氨基己酸；和6-氨基己酸转变为己内酰胺。还在另一个实施方案中，本发明提供了具有己二酸途径的非天然存在的微生物生 物体，其中所述微生物生物体含有至少一种编码将底物转变为产物的多肽的外源性核酸， 所述的底物转变为产物选自α-酮己二酸转变为α-酮己二酰-CoA; α-酮己二酰-CoA 转变为2-羟基己二酰-CoA ；2-羟基己二酰-CoA转变为5-羧基-2-戊烯酰-CoA ；5-羧 基-2-戊烯酰-CoA转变为己二酰-CoA ；和己二酰-CoA转变为己二酸(参见图9)。另外， 本发明提供了具有己二酸途径的非天然存在的微生物生物体，其中所述微生物生物体含有 至少一种编码将底物转变为产物的多肽的外源性核酸，所述的底物转变为产物选自α -酮 己二酸转变为2-羟基己二酸；2-羟基己二酸转变为2-羟基己二酰-CoA ；2-羟基己二 酰-CoA转变为5-羧基-2-戊烯酰-CoA ；5-羧基-2-戊烯酰-CoA转变为己二酰-CoA ；和 己二酰-CoA转变为己二酸(图9)。在本文中一般地提及代谢反应、其反应物或产物、或具体提及编码与提及的代谢 反应、反应物或产物相关的或催化提及的代谢反应、反应物或产物的酶的一种或多种核酸 或基因来本发明进行描述。除非在本文中另外明确地指明，本领域技术人员将理解，对反应 的提及还构成对该反应的反应物和产物的提及。类似地，除非在本文中另外明确地指明，对 反应物或产物的提及也提及该反应，并且对这些代谢组分的任一种的提及也提及编码催化 该提及的反应、反应物或产物的酶的一种基因或多种基因。同样，就代谢生物化学、酶学和 基因组学的公知领域而言，本文对基因或编码核酸的提及也构成对相应编码的酶和其催化 的反应以及该反应的反应物和产物的提及。本发明的非天然存在的微生物生物体可以通过引入可表达的编码一种或多种参 与一个或多个己二酸、6-氨基己酸或己内酰胺生物合成途径的酶的核酸来产生。取决于选 择用于生物合成的宿主微生物生物体，可以表达用于一些或所有特定的己二酸、6-氨基己 酸或己内酰胺生物合成途径的核酸。例如，如果选择的宿主缺乏一种或多种用于所需生物 合成途径的酶，则将可表达的用于一种或多种缺乏的酶的核酸引入至宿主中用于随后的外 源表达。备选地，如果选择的宿主显示一些途径基因的内源性表达，但缺乏其他的基因表 达，则需要编码一种或多种缺乏的酶的编码核酸以实现己二酸、6-氨基己酸或己内酰胺生 物合成。因此，本发明的非天然存在的微生物生物体可以通过引入外源酶活性以获得所需 的生物合成途径来产生，或所需的生物合成途径可以通过引入一种或多种外源酶活性来获 得，所述一种或多种外源酶活性与一种或多种内源酶一起产生所需产物诸如己二酸、6-氨基己酸或己内酰胺。取决于所选择的宿主微生物生物体的己二酸、6-氨基己酸或己内酰胺生物合成 途径组分，本发明的非天然存在的微生物生物体包括至少一种外源性表达的编码己二酸、 6-氨基己酸或己内酰胺途径的核酸并且至多达一个或多个己二酸、6-氨基己酸或己内酰 胺生物合成途径的所有编码核酸。例如，己二酸、6-氨基己酸或己内酰胺生物合成可以在缺 乏途径酶的宿主中通过外源表达相应的编码核酸来建立。在缺乏己二酸、6-氨基己酸或己 内酰胺途径的所有酶的宿主中，可以包括外源表达途径中的所有酶，尽管要理解的是，即使 宿主含有至少一种途径酶，也可以表达途径的所有酶。例如，在用于产生己二酸的途径中所有酶的外源表达可以包含在宿主生物体中， 诸如琥珀酰-CoA 乙酰-CoA酰基转移酶、3-羟酰-CoA脱氢酶、3-羟基己二酰-CoA脱水酶、 5-羧基-2-戊烯酰-CoA还原酶和己二酰-CoA合成酶或磷酸己二酰转移酶/己二酸激酶或 己二酰-CoA 乙酰-CoA转移酶或己二酰-CoA水解酶。特别地，宿主生物体可以含有己二 酸途径酶琥珀酰-CoA 乙酰-CoA酰基转移酶、3-羟酰-CoA脱氢酶、3-羟基己二酰-CoA 脱水酶、5-羧基-2-戊烯酰-CoA还原酶和己二酰-CoA合成酶。备选地，宿主生物体可以 含有己二酸途径酶琥珀酰-CoA 乙酰-CoA酰基转移酶、3-羟酰-CoA脱氢酶、3-羟基己二 酰-CoA脱水酶、5-羧基-2-戊烯酰-CoA还原酶和磷酸己二酰转移酶/己二酸激酶。另外， 宿主生物体可以含有己二酸途径酶琥珀酰-CoA 乙酰-CoA酰基转移酶、3-羟酰-CoA脱氢 酶、3-羟基己二酰-CoA脱水酶、5-羧基-2-戊烯酰-CoA还原酶和己二酰-CoA 乙酰-CoA 转移酶。此外，宿主生物体可以含有己二酸途径酶琥珀酰-CoA 乙酰-CoA酰基转移酶、 3-羟酰-CoA脱氢酶、3-羟基己二酰-CoA脱水酶、5-羧基-2-戊烯酰-CoA还原酶和己二 酰-CoA水解酶。在产生6-氨基己酸的微生物生物体情况下，在用于产生6-氨基己酸的途径中所 有酶的外源表达可以包含在宿主生物体中，诸如CoA-依赖性醛脱氢酶和转氨酶或CoA-依 赖性醛脱氢酶和6-氨基己酸脱氢酶。对于产生己内酰胺的微生物生物体，在用于产生己内 酰胺的途径中所有酶的外源表达可以包含在宿主生物体中，诸如CoA-依赖性醛脱氢酶、转 氨酶或6-氨基己酸脱氢酶和酰胺水解酶。鉴于本文提供的教导和指导，本领域普通技术人员将理解，以可表达形式引入的 编码核酸的数目将至少与所选择的宿主微生物生物体的己二酸、6-氨基己酸或己内酰胺途 径缺陷相配。因此，本发明的非天然存在的微生物生物体可以具有一种、两种、三种、四种或 五种，至多所有编码构成己二酸、6-氨基己酸或己内酰胺生物合成途径的上述酶的核酸。在 一些实施方案中，非天然存在的微生物生物体还可以包括促进或优化己二酸、6-氨基己酸 或己内酰胺生物合成或赋予宿主微生物生物体以其他有用功能的其他遗传修饰。一种这样 的其他功能性可以包括，例如，增加一种或多种己二酸、6-氨基己酸或己内酰胺途径前体的 合成，所述前体诸如在己二酸合成时的琥珀酰-CoA和/或乙酰-CoA，或在6-氨基己酸或己 内酰胺合成时的己二酰-CoA，包括本文中公开的己二酸途径酶。在一些实施方案中，本发明的非天然存在的微生物生物体产生自含有酶促合成己 二酸、6-氨基己酸或己内酰胺的能力的宿主。在此具体的实施方案中，其可以用来增加己 二酸、6-氨基己酸或己内酰胺途径产物的合成或积累，从而例如，驱使己二酸、6-氨基己酸 或己内酰胺途径反应朝向产生己二酸、6-氨基己酸或己内酰胺。增加的合成或积累可以通过，例如，编码一种或多种上述己二酸、6-氨基己酸或己内酰胺途径酶的核酸的过度表达来 实现。一种或多种己二酸、6-氨基己酸或己内酰胺途径酶的过度表达可以，例如，通过一种 或多种内源基因的外源表达，或通过一种或多种异源基因的外源表达来发生。因此，天然存 在的生物体可以容易地生成为本发明的非天然存在的微生物生物体，例如，通过过度表达 一种、两种、三种、四种、五种，即，所有编码己二酸、6-氨基己酸或己内酰胺生物合成途径酶 的核酸来产生己二酸、6-氨基己酸或己内酰胺。另外，非天然存在的生物体可以通过诱变导 致己二酸、6-氨基己酸或己内酰胺生物合成途径中的酶活性增加的内源基因来生成。在特别有用的实施方案中，采用编码核酸的外源表达。外源表达赋予对宿主和应 用定制调节表达和/或调控元件以达到由用户控制的所需表达水平的能力。然而，在其他 实施方案中，也可以利用内源表达，诸如通过去除负调控效应器或当与诱导型启动子或其 他调控元件连接时诱导基因的启动子。因此，具有天然存在的诱导型启动子的内源基因可 以通过提供适当的诱导剂而上调，或内源基因的调控区可以被改造以结合诱导型调控元 件，从而允许在所需的时间调控内源基因的增加表达。类似地，诱导型启动子可以被包含作 为内源基因的调控元件引入至非天然存在的微生物生物体中。要理解，在本发明的方法中，一种或多种外源性核酸的任一种可以被引入至微生 物生物体中以产生本发明的非天然存在的微生物生物体。核酸可以被引入以便将，例如，己 二酸、6-氨基己酸或己内酰胺生物合成途径赋予微生物生物体。备选地，编码核酸可以被 引入以产生具有催化一些所需反应的生物合成能力的中间微生物生物体，以赋予己二酸、 6-氨基己酸或己内酰胺生物合成能力。例如，具有己二酸、6-氨基己酸或己内酰胺生物合 成途径的非天然存在的微生物生物体可以包含至少两种编码所需酶的外源性核酸。在产 生己二酸的情况下，至少两种外源性核酸可以编码酶诸如琥珀酰-CoA 乙酰-CoA酰基转移 酶和3-羟酰-CoA脱氢酶，或琥珀酰-CoA 乙酰-CoA酰基转移酶和3-羟基己二酰-CoA脱 水酶，或3-羟基己二酰-CoA和5-羧基-2-戊烯酰-CoA还原酶，或3-羟酰-CoA和己二 酰-CoA合成酶的组合，等等。在产生己内酰胺的情况下，至少两种外源性核酸可以编码酶 诸如CoA-依赖性醛脱氢酶和转氨酶，或CoA-依赖性醛脱氢酶和酰胺水解酶，或转氨酶和酰 胺水解酶的组合。因此，要理解生物合成途径的两种或多种酶的任何组合可以包含在本发 明的非天然存在的微生物生物体中。类似地，要理解，生物合成途径的三种以上的酶的任何组合可以包含在本发明的 非天然存在的微生物生物体中，例如，在产生己二酸的情况下，如果需要，酶琥珀酰-CoA 乙酰-CoA酰基转移酶、3-羟酰-CoA脱氢酶和3-羟基己二酰-CoA脱水酶；或琥珀酰-CoA 乙酰-CoA酰基转移酶、3-羟酰-CoA脱氢酶和5-羧基-2-戊烯酰-CoA还原酶；或琥珀 酰-CoA 乙酰-CoA酰基转移酶、3-羟酰-CoA脱氢酶和己二酰-CoA合成酶；或3-羟酰-CoA 脱氢酶、3-羟基己二酰-CoA脱水酶和己二酰-CoA 乙酰-CoA转移酶的组合，等等，只要所 需生物合成途径的酶的组合导致产生相应的所需产物。类似地，如果需要，如本文所公开的 生物合成途径的四种以上的酶的任意组合可以包含在本发明的非天然存在的微生物生物 体中，只要所需生物合成途径的酶的组合导致产生相应的所需产物。除了如本文所描述的生物合己二酸、6-氨基己酸或己内酰胺以外，本发明的非天 然存在的微生物生物体和方法也可以以彼此以及与本领域中公知的其他微生物微生物体 和方法的各种组合来使用，从而通过其他途径实现产物合成。例如，除了使用己二酸、6-氨基己酸或己内酰胺生产体以外，产生己二酸、6-氨基己酸或己内酰胺的一个替代方法是通 过加入能够将己二酸、6-氨基己酸或己内酰胺途径中间体转变为己二酸、6-氨基己酸或己 内酰胺的另一微生物生物体。一种这样的步骤包括，例如，产生己二酸、6-氨基己酸或己内 酰胺途径中间体的微生物生物体的发酵。然后，己二酸、6-氨基己酸或己内酰胺途径中间体 可以用作第二微生物生物体的底物，所述第二微生物生物体将己二酸、6-氨基己酸或己内 酰胺途径中间体转变为己二酸、6-氨基己酸或己内酰胺。己二酸、6-氨基己酸或己内酰胺 途径中间体可以直接加入至第二生物体的另一培养物中或己二酸、6-氨基己酸或己内酰胺 途径中间体生产体的初始培养物可以例如，通过细胞分离而去除这些微生物生物体，然后 将第二生物体加入至发酵液中，从而可以用来产生最终产物而无需中间体纯化步骤。在其他实施方案中，本发明的非天然存在的微生物生物体和方法可以以大量的亚 途径组装，从而实现，例如，己二酸、6-氨基己酸或己内酰胺的生物合成。在这些实施方案 中，用于本发明的所需产物的生物合成途径可以分离至不同的微生物生物体中，并且所述 不同的微生物生物体可以共培养以产生最终产物。在这样的生物合成路线中，一种微生物 生物体的产物是第二种微生物生物体的底物，直至合成最终产物。例如，己二酸、6-氨基己 酸或己内酰胺的生物合成可以通过构建含有用于将一种途径中间体转变为另一途径中间 体或产物的生物合成途径的微生物生物体来实现。备选地，己二酸、6-氨基己酸或己内酰胺 还可以使用在同一容器中的两种微生物通过共培养或共发酵从微生物生物体中生物合成 地产生，其中第一种微生物生物体产生己二酸、6-氨基己酸或己内酰胺中间体，且第二种微 生物生物体将该中间体转变为己二酸、6-氨基己酸或己内酰胺。鉴于本文提供的教导和指导，本领域技术人员将理解，对于本发明的非天然存在 的微生物生物体和方法与其他微生物生物体，与具有亚途径的其他非天然存在的微生物生 物体的共培养，以及与本领域中公知的产生己二酸、6-氨基己酸或己内酰胺的其他化学和 /或生物化学方法的组合，存在有大量的组合和排列。己二酸、6-氨基己酸或己内酰胺途径酶的编码核酸的来源可以包括，例如，其中编 码基因产物能够催化所参照的反应的任何物种。此类物种包括原核生物体和真核生物体， 包括，但不限于，细菌，包括古细菌和真细菌，和真核生物，包括酵母、植物、昆虫、动物和哺 乳动物，包括人。此类来源的示例性物种包括，例如，大肠杆菌、Pseudomonas knackmussii、 恶臭假单胞菌(Pseudomonas putida)、焚光假单胞菌(Pseudomonas. fluorescens)、月市 炎克雷伯菌(Klebsiella pneumoniae)、变形斑沙雷菌(Serratia proteamaculans)、 链霉菌属 2065 (Streptomyces sp. 2065)、铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)、 富养产碱菌(Ralstonia eutropha)、丙酮 丁酉享梭菌(Clostridium acetobutylicum)、 小眼虫(Euglenagracilis)、齿垢密螺旋体(TMponema denticola、克氏梭状芽孢杆菌 (Clostridiumkluyveri)、智人(Homo sapiens)、褐家鼠(Rattus norvegicus)、不动杆菌 M ADPl (Acinetobacter sp. ADP1) > ^Μ^Ι^β · (Streptomyces coelicolor)、El
If |if (Eubacterium barkeri) > ^· I H ffl Iillif (Peptostreptococcusasaccharolyti cus)、肉毒梭菌(Clostridium botulinum)、酪丁酸梭菌(Clostridiumtyrobutyricum) > 热乙酸梭菌(Clostridium thermoaceticum) (Moorellathermoaceticum(热乙酸禾裹尔 氏菌))、乙酸 丐不动杆菌(Acinetobactercalcoaceticus)、小家鼠(Mus musculus)、 野猪(Sus scrofa)、黄杆菌属(Flavobacterium sp)、金黄节杆菌(Arthrobacteraurescens)、产黄青霉菌(Penicillium chrysogenum)、黑曲霉菌(Aspergillus niger)、 构巢曲霉菌(Aspergillus nidulans)，枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)、酿酒酵母 (Saccharomyces cerevisiae)、运动发酵单胞菌(Zymomonas mobilis)、曼海姆产琥拍酸菌 (Mannheimia succiniciproducens)、杨氏梭菌(Clostridium 1 jungdahlii) ^Clostridium carboxydivorans、嗜热月旨肪土芽抱杆菌(Geobacillus stearothermophiIus)、根癌农杆 菌(Agrobacterium tumefaciens)、反石宵化无色！flif (Achromobacterdenitrificans) 南芥(Arabidopsis thaliana)、流感嗜血杆菌(Haemophilus influenzae)、发酵氨基酸球 菌(Acidaminococcus. fermentans)、梭菌属 M62/1 (Clostridium sp. M62/1)、具核梭杆菌 (Fusobacterium nucleatum)，以及本文公开的或作为相应基因的来源生物体可获得的其 他示例性物种(参见实施例)。然而，在现在可以获得的550个以上的物种的全基因组序 列(这些中超过一半可在公共数据库诸如NCBI上获得)，包括395个微生物基因组和大量 的酵母、真菌、植物、和哺乳动物基因组的情况下，对于相关或关系较远的物种中的一种或 多种基因，鉴定编码必要的己二酸、6-氨基己酸或己内酰胺生物合成活性的基因，包括例如 已知基因的同源、直向同源物、旁系同源物和非直向同源基因置换，和生物体之间遗传改变 的互换，是本领域中常规的和公知的。因此，能够实现本文关于特定生物体诸如大肠杆菌所 描述的己二酸、6-氨基己酸或己内酰胺的生物合成的代谢改变可以容易地应用于其他微生 物，同样地包括原核和真核生物。鉴于本文提供的教导和指导，本领域技术人员将知晓在一 个生物体中举例说明的代谢改变可以同样地应用于其他生物体。在一些情况下，诸如当可替代的己二酸、6-氨基己酸或己内酰胺生物合成途径存 在于不相关物种中时，己二酸、6-氨基己酸或己内酰胺生物合成可以通过，例如，来自不相 关物种的催化类似的但不相同的代谢反应以代替参照反应的一种或多种旁系同源物的外 源表达而赋予宿主物种。因为在不同的生物体之间存在有代谢网络间的某些差异，因此本 领域技术人员将理解不同生物体之间的实际基因利用可以发生变化。然而，鉴于本文提供 的教导和指导，本领域技术人员还将理解本发明的教导和方法可以使用本文例举的那些的 同类代谢改变应用于所有微生物生物体以构建将合成己二酸、6-氨基己酸或己内酰胺的目 标物种的微生物生物体。宿主微生物生物体可以选自，并且非天然存在的微生物生物体可以产生自，例 如，细菌、酵母、真菌或可应用于发酵方法的多种其他微生物中的任一种。示例性的细 菌包括选自大肠杆菌、奥克西托克雷白杆菌(Klebsiella oxytoca)、产琥珀酸厌氧螺旋 菌(Anaerobiospirillum succiniciproducens)、产玻拍酸放线杆菌(Actinobacillus succinogenes)、曼海姆产琥珀酸菌、埃特里根瘤菌(lihizobium etli)、枯草芽孢杆菌、谷氨 酸棒状杆菌(Corynebacterium glutamicum)、氧化葡萄酸杆菌(Gluconobacter oxydans)、 运动发酵单胞菌、乳酸乳球菌、植物乳杆菌(LactcAacillus plantarum)、天蓝色链霉菌、丙 酮丁醇梭菌、荧光假单胞菌、和恶臭假单胞菌的物种。示例性的酵母或真菌包括选自酿酒酵 母、裂殖酵母、克鲁维酵母、马克斯克鲁维酵母(Kluyveromyces marxianus)、土曲霉菌、黑 曲霉菌和毕赤酵母的物种。例如，大肠杆菌是特别有用的宿主生物体，因为它是一种适合于 遗传工程改造的受到充分表征的微生物生物体。其他特别有用的宿主生物体包括酵母诸如 酿酒酵母。用于构建和测试非天然存在的产生己二酸、6-氨基己酸或己内酰胺的宿主的表达水平的方法可以通过，例如，本领域中公知的重组和检测方法来进行。这些方法可参 见,例如，Sambrook 等，Molecular Cloning :A Laboratory Manual (分子克隆实验室指 南)，第三版，Cold Spring Harbor Laboratory, New York (2001)；禾口 Ausubel 等，Current Protocols in Molecular Biology (现代分子生物学技术)，John Wiley and Sons, Baltimore, MD (1999)。参与产生己二酸、6-氨基己酸或己内酰胺的途径中的外源核酸序列可以使用本 领域中公知的技术而稳定地或瞬时地引入至宿主细胞中，所述技术包括，但不限于，接合、 电穿孔、化学转化、转导、转染、和超声转化。对于在大肠杆菌或其他原核细胞中的外源表 达，真核生物核酸的基因或cDNA中的一些核酸序列可以编码靶向信号诸如N-端线粒体 或其他靶向信号，如果需要它们可以在转化至原核生物宿主细胞中之前被去除。例如，线 粒体前导序列的去除导致大肠杆菌中的增加表达(Hoffmeister等，T. Biol. Chem. 280 4329-4338 (2005))。对于在酵母或其他真核细胞中的外源表达，基因可以在胞液中表达，无 需加入前导序列，或可以通过加入适合于宿主细胞的适当的靶向序列诸如线粒体靶向或分 泌信号而靶向至线粒体或其他细胞器，或靶向分泌。因此，要理解，对核酸序列的去除或包 含靶向序列的适合修饰可以结合至外源核酸序列中以赋予其所需的特性。此外，基因可以 使用本领域中公知的技术进行密码子优化以实现蛋白质的最佳表达。可以构建一种或多种表达载体以包含与宿主生物体中有功能的表达控制序列可 操作地连接的如本文所例举的一个或多个编码己二酸、6-氨基己酸或己内酰胺生物合成途 径的核酸。可应用于本发明的微生物宿主生物体的表达载体包括，例如，质粒、噬菌体载体、 病毒载体、附加体和人工染色体，包括可操作用于稳定的整合入宿主染色体中的载体和选 择序列或标记。另外，表达载体包括一个或多个选择性标记基因和适当的表达控制序列。例 如，还可以包括提供对抗生素或毒素的抗性、补充营养缺陷性缺乏、或供应培养基中不包含 的关键营养素的选择性标记基因。表达控制序列可以包括本领域中公知的组成型和诱导型 启动子、转录增强子、转录终止子等。当两种或多种外源编码核酸要共表达时，两种核酸可 以插入至，例如单一表达载体中或独立的表达载体中。对于单一载体表达，编码核酸可以可 操作性地连接至一条共有表达控制序列或连接至不同的表达控制序列，诸如一个诱导型启 动子和一个组成型启动子。参与代谢或合成途径的外源核酸序列的转化可以使用本领域中 公知的方法来确认。此类方法包括，例如，核酸分析诸如mRNA的Northern印迹或聚合酶链 式反应(PCR)扩增，或用于基因产物表达的免疫印迹，或用于测试引入的核酸序列或其相 应的基因产物的表达的其他合适的分析方法。本领域技术人员要理解，外源核酸以足以产 生所需产物的量表达，并且进一步要理解，表达水平可以使用本领域中公知的和如本文中 所公开的方法进行优化以获得充分的表达。本发明另外提供了用于产生所需产物诸如己二酸、6-氨基己酸或己内酰胺的方 法。在一个实施方案中，本发明提供了一种用于产生己二酸的方法，包括在产生己二酸的条 件下和足以产生己二酸的时间内培养具有己二酸途径的非天然存在的微生物生物体，所述 途径包含以足以产生己二酸的量表达的至少一种编码己二酸途径酶的外源性核酸，所述己 二酸途径包括琥珀酰-CoA 乙酰-CoA酰基转移酶、3-羟酰-CoA脱氢酶、3-羟基己二酰-CoA 脱水酶、5-羧基-2-戊烯酰-CoA还原酶和己二酰-CoA合成酶或磷酸己二酰转移酶/己二 酸激酶或己二酰-CoA 乙酰-CoA转移酶或己二酰-CoA水解酶。在另一个实施方案中，本发明提供了一种用于产生己二酸的方法，包括在产生己二酸的条件下和足以产生己二酸的时 间内培养具有己二酸途径的非天然存在的微生物生物体，所述途径包含以足以产生己二酸 的量表达的至少一种编码己二酸途径酶的外源性核酸，所述己二酸途径包括琥珀酰-CoA 乙酰-CoA酰基转移酶、3-氧代己二酰-CoA转移酶、3-氧代己二酸还原酶、3-羟基己二酸脱 水酶和2-烯酸还原酶。还在另一个实施方案中，本发明提供了一种用于产生6-氨基己酸的方法，包括在 产生6-氨基己酸的条件下和足以产生6-氨基己酸的时间内培养具有6-氨基己酸途径的 非天然存在的微生物生物体，所述途径包含以足以产生6-氨基己酸的量表达的至少一种 编码6-氨基己酸途径酶的外源性核酸，所述6-氨基己酸途径包括CoA-依赖性醛脱氢酶和 转氨酶或6-氨基己酸脱氢酶。在进一步的实施方案中，本发明提供了一种用于产生己内酰 胺的方法，包括在产生己内酰胺的条件下和足以产生己内酰胺的时间内培养具有己内酰胺 途径的非天然存在的微生物生物体，所述途径包含以足以产生己内酰胺的量表达的至少一 种编码己内酰胺途径酶的外源性核酸，所述己内酰胺途径包括CoA-依赖性醛脱氢酶、转氨 酶或6-氨基己酸脱氢酶和酰胺水解酶。本发明另外提供了一种用于产生己二酸的方法，包括在产生己二酸的条件下和足 以产生己二酸的时间内培养具有己二酸途径的非天然存在的微生物生物体，所述途径包含 以足以产生己二酸的量表达的至少一种编码己二酸途径酶的外源性核酸，所述己二酸途径 包括α-酮己二酰-CoA合成酶、磷酸酮己二酰转移酶/α-酮己二酸激酶或α-酮己二 酰-CoA 乙酰-CoA转移酶；2-羟基己二酰-CoA脱氢酶；2-羟基己二酰-CoA脱水酶；5-羧 基-2-戊烯酰-CoA还原酶；和己二酰-CoA合成酶、磷酸己二酰转移酶/己二酸激酶、己二 酰-CoA 乙酰-CoA转移酶或己二酰-CoA水解酶。还在另一个实施方案中，本发明提供了一种用于产生己二酸的方法，包括在产生 己二酸的条件下和足以产生己二酸的时间内培养具有己二酸途径的非天然存在的微生物 生物体，所述途径包含以足以产生己二酸的量表达的至少一种编码己二酸途径酶的外源性 核酸，所述己二酸途径包括2-羟基己二酸脱氢酶；2-羟基己二酰-CoA合成酶、磷酸羟基 己二酰转移酶/2-羟基己二酸激酶或2-羟基己二酰-CoA 乙酰-CoA转移酶；2-羟基己二 酰-CoA脱水酶；5-羧基-2-戊烯酰-CoA还原酶；和已二酰-CoA合成酶、磷酸己二酰转移 酶/己二酸激酶、己二酰-CoA 乙酰-CoA转移酶或己二酰-CoA水解酶。可以使用公知的方法进行适当的纯化和/或检测己二酸、6-氨基己酸或己内酰胺 的产生的测定。对于待检测的每种工程菌株可以生长适当的复制物诸如一式三份培养物。 例如，可以监测被改造的生产宿主中的产物和副产物形成。终产物和中间体，和其他有机化 合物可以通过诸如HPLC(高效液相色谱)、GC-MS(气相色谱-质谱)和LC-MS(液相色谱-质 谱)的方法使用本领域中公知的常规操作来分析。产物在发酵液中的释放还可以使用培养 上清液来检测。副产物和残余的葡萄糖可以使用，例如，用于葡萄糖和醇的折射率检测器， 和用于有机酸的 UV 检测器通过 HPLC (Lin 等，Biotechnol. Bioeng. 90 :775-779 (2005))，或 本领域中公知的其他适当的测定法和检测方法来定量。来自外源DNA序列的各酶的活性还 可以使用本领域中公知的方法来测定。己二酸、6-氨基己酸或己内酰胺可以使用本领域中公知的多种方法与培养物中的 其他组分分离。所述分离方法包括，例如，萃取方法以及包括连续液-液萃取、渗透蒸发、膜
23过滤、膜分离、反渗透、电渗析、蒸馏、结晶、离心、萃取过滤、离子交换色谱、尺寸排阻色谱、 吸附色谱和超滤的方法。所有上述的方法在本领域中均是公知的。本文所述的任何非天然存在的微生物生物体可以被培养以产生和/或分泌本发 明的生物合成产物。例如，己二酸、6-氨基己酸或己内酰胺生产体可以被培养用于生物合成 产生己二酸、6-氨基己酸或己内酰胺。对于己二酸、6-氨基己酸或己内酰胺的产生，重组株培养在含有碳源和其他必需 营养素的培养基中。非常需要在发酵罐中保持厌氧条件以减少总工艺的成本。所述条件可 以例如，通过首先用氮气喷射培养基，然后用隔膜和压线帽(crimp-cap)密封烧瓶来获得。 对于在厌氧条件下未观察到生长的菌株，可以通过将隔膜穿以小孔用于限量通气来施加微 氧条件。示例性的厌氧条件先前已有描述并且在本领域中是公知的。示例性的需氧和厌氧 条件描述在，例如，于2007年8月10日申请的美国专利申请系列号11/891,602中。发酵 可以如本文公开的那样，以分批、分批补料或连续的方式进行。如果需要，培养基的pH可以根据需要通过加入碱，诸如NaOH或其他碱，或酸保持 在所需的PH，尤其是中性pH，诸如约7的pH，从而将培养基保持在所需的pH。生长速率可 以通过使用分光光度计(600nm)测量光密度来测定，葡萄糖摄取速率可以通过监测碳源随 时间的消耗来确定。生长培养基可以是，例如，任何碳水化合物来源。其可以向非天然存在的微生物供 应碳源。所述来源包括，例如，糖类诸如葡萄糖、木糖、阿拉伯糖、半乳糖、甘露糖、果糖和淀 粉。碳水化合物的其他来源包括，例如，可再生的原料和生物质。可以用作本发明的方法中 的原料的示例类型的生物质包括纤维质生物质、半纤维质生物质和木质素原料或原料的部 分。此类生物质原料含有，例如，用作碳源的碳水化合物底物诸如葡萄糖、木糖、阿拉伯糖、 半乳糖、甘露糖、果糖和淀粉。鉴于本文提供的教导和指导，本领域技术人员会理解，除了上 面例举的那些以外的可再生的原料和生物质也可以用于培养本发明的微生物生物体以产 生己二酸、6-氨基己酸或己内酰胺。除了诸如上面所例举的那些可再生的原料以外，本发明的己二酸、6-氨基己酸或 己内酰胺微生物生物体还可以被修饰用于靠合成气作为其碳源而生长。在此具体实施方案 中，一种或多种蛋白质或酶在产生己二酸、6-氨基己酸或己内酰胺的生物体中表达以提供 用于利用合成气或其他气态碳源的代谢途径。合成气体，也称为合成气或发生炉煤气，是煤和含碳物质诸如生物质材料包括农 作物和残渣的气化的主要产物。合成气是主要含有H2和CO的混合物，并且可以获自任何 有机原料的气化，所述有机原料包括但不限于煤、煤油、天然气、生物质和有机废料。气化通 常在高燃料/氧比率下进行。尽管主要含H2和C0，但合成气还可以包括较小量的(X)2和其 他气体。因此，合成气体提供气态碳诸如CO和另外地(X)2的廉价来源。Wood-Ljungdahl途径催化CO和H2转变为乙酰-CoA和其他的产物诸如乙酸。能 够利用CO和合成气的生物体还通常具有通过Wood-Ljimgdahl途径所包含的相同的一组基 本的酶和转变作用来利用(X)2和C02/H2混合物的能力。在揭示CO也可以由同一微生物利 用和相同的途径被包括在内之前很长一段时间以来，认为微生物将(X)2转变为乙酸是H2-依 赖性的。许多产乙酸菌已经显示在⑶2的存在下生长，并且产生诸如乙酸的化合物，只要存 在氢以供应必需的还原当量(参见，例如，Drake，Acetogenesis，3-60页，Chapman和Hall，New York, (1994))。这可以通过下列的等式来概括2C02+4H2+nADP+nPi — CH3C00H+2H20+n ATP因此，具有Wood-Ljungdahl途径的非天然存在的微生物可以同样地利用(X)2和H2 混合物以产生乙酰-CoA和其他所需的产物。Wood-Ljungdahl途径在本领域中是公知的，并且由12个反应组成，这些反应可以 分成两个支路(1)甲基支路和( 羰基支路。甲基支路将合成气转变为甲基四氢叶酸酯 (甲基-THF)，而羰基支路将甲基-THF转变为乙酰-CoA。甲基支路中的反应由以下酶按次 序催化铁氧还蛋白氧化还原酶、甲酸脱氢酶、甲酰四氢叶酸合成酶、次甲基四氢叶酸环化 脱水酶、亚甲基四氢叶酸脱氢酶和亚甲基四氢叶酸还原酶。羧基支路中的反应由下列酶按 次序催化钴胺素类咕啉(cobalamide corrinoid)/铁-硫蛋白、甲基转移酶、一氧化碳脱 氢酶、乙酰-CoA合成酶、乙酰-CoA合成酶二硫化物还原酶和氢化酶。根据本文提供的用于 引入足够数量的编码核酸以产生己二酸、6-氨基己酸或己内酰胺途径的教导和指导，本领 域技术人员将理解，对于至少引入宿主生物体中缺少的编码Wood-Ljungdahl酶的核酸，也 可以进行相同的改造设计。因此，将一种或多种编码核酸引入至本发明的微生物生物体中 使得被修饰的生物体含有完整的Wood-Ljungdahl途径，将赋予合成气利用能力。鉴于本文提供的教导和指导，本领域技术人员将理解可以产生这样的非天然存在 的微生物生物体，当其靠碳源诸如碳水化合物生长时其分泌本发明的生物合成化合物。此 类化合物包括，例如，己二酸、6-氨基己酸或己内酰胺和己二酸、6-氨基己酸或己内酰胺途 径中的任一种中间代谢物。所有必需的工作是改造一种或多种必需的酶活性以实现所需化 合物或中间体的生物合成，包括，例如，包含己二酸、6-氨基己酸或己内酰胺生物合成途径 的一些或全部。因此，本发明提供了一种非天然存在的微生物生物体，当其靠碳水化合物生 长时产生和/或分泌己二酸、6-氨基己酸或己内酰胺，并且当其靠碳水化合物生长时其产 生和/或分泌己二酸、6-氨基己酸或己内酰胺途径中显示的任一种中间代谢物。例如，本发 明的产生己二酸的微生物生物体可以根据需要从中间体启动合成，所述中间体例如3-氧 代己二酰-CoA、3-羟基己二酰-CoA、5-羧基-2-戊烯酰-CoA或己二酰-CoA (参见图幻。另 外，产生己二酸的微生物生物体可以从中间体，例如，3-氧代己二酰-CoA、3-氧代己二酸、 3-羟基己二酸或己-2-烯二酸盐启动合成(参见图幻。本发明的产生6-氨基己酸的微生 物生物体可以从中间体启动合成，所述中间体例如，己二酸半醛(参见图8)。本发明的产生 己内酰胺的微生物生物体可以根据需要从中间体启动合成，所述中间体例如己二酸半醛或 6-氨基己酸(参见图8)。本发明的非天然存在的微生物生物体使用如本文所例举的本领域中公知的方法 来构建，从而外源性地以足以产生己二酸、6-氨基己酸或己内酰胺的量表达至少一种编码 己二酸、6-氨基己酸或己内酰胺途径酶的核酸。要理解，本发明的微生物生物体在足以产生 己二酸、6-氨基己酸或己内酰胺的条件下培养。根据本文提供的教导和指导，本发明的非 天然存在的微生物生物体可以实现产生约0. l_200mM之间或以上的细胞内浓度的己二酸、 6-氨基己酸或己内酰胺的生物合成。通常，己二酸、6-氨基己酸或己内酰胺的细胞内浓度 在约3-150mM之间，尤其是约5-125mM之间，和更优选约8_100mM之间，包括约10mM、20mM、 50mM、80mM或更大。这些示例性范围中的每一个之间和以上的细胞内浓度也可以由本发明 的非天然存在的微生物生物体来实现。
在一些实施方案中，培养条件包括厌氧的或基本上厌氧的生长或维持条件。示例 性的厌氧条件先前已有描述并且在本领域中是公知的。示例性的用于发酵工艺的厌氧条件 描述在本文中，且描述在例如，于2007年8月10日申请的美国专利申请系列号11/891，602 中。这些条件中的任一种条件以及本领域中公知的其他厌氧条件可以用于所述非天然存 在的微生物生物体。在这些厌氧条件下，己二酸、6-氨基己酸或己内酰胺生产株可以以 5-10mM或更高的细胞内浓度以及本文中例举的其他浓度合成己二酸、6-氨基己酸或己内 酰胺。要理解，即使上面的描述提到了细胞内浓度，产生己二酸、6-氨基己酸或己内酰胺的 微生物生物体可以在细胞内产生己二酸、6-氨基己酸或己内酰胺和/或将产物分泌至培养 基中。培养条件可以包括，例如，液体培养方法以及发酵和其他大规模培养方法。如本文 所述，在厌氧或基本上厌氧的培养条件下可以获得特别有用的产量的本发明的生物合成产 物。如本文所述，用于实现己二酸、6-氨基己酸或己内酰胺的生物合成的一种示例性 生长条件包括厌氧培养或发酵条件。在某些实施方案中，本发明的非天然存在的微生物生 物体可以在厌氧或基本上厌氧的条件下维持、培养或发酵。简言之，厌氧条件指缺少氧的环 境。基本上厌氧的条件包括，例如，培养基中的溶解氧浓度保持在0和10%之间的饱和度的 培养、分批发酵或发酵。基本上厌氧的条件还包括使细胞在保持以小于氧的气氛的密封 室内在液体培养基中或固体琼脂上生长或休眠。氧的百分比可以通过，例如，用队/0)2混合 物或其他合适的一种或多种非氧气体喷射培养物来保持。本文所述的培养条件可以按比例放大和连续生长用于制造己二酸、6-氨基己酸或 己内酰胺。示例性的生长方法包括，例如，分批补料发酵和分批分离；分批补料发酵和连续 分离，或连续发酵和连续分离。所有这些方法在本领域中是公知的。发酵方法对于生物合 成商用量的己二酸、6-氨基己酸或己内酰胺是特别有用的。通常，并且当采用非连续的培养 方法，连续和/或接近连续的产生己二酸、6-氨基己酸或己内酰胺将包括在充足的营养素 和培养基中培养本发明的非天然存在的产生己二酸、6-氨基己酸或己内酰胺的生物体，从 而将生长保持和/或几乎保持在指数生长期。在此类条件下的连续培养可以包括，例如，1 天、2、3、4、5、6或7天或更多天。另外，连续培养可以包括1周、2、3、4或5或更多周，并且 可达几个月。备选地，如果对于具体应用是合适的，本发明的生物体可以培养几小时。要理 解，连续和/或接近连续的培养条件也可以包括这些示例性期间之间的所有时间间隔。要 进一步理解，培养本发明的微生物生物体的时间持续足够的时间段以产生足量的产物用于 所期望的目的。发酵方法在本领域中是公知的。简言之，用于生物合成产生己二酸、6-氨基己酸或 己内酰胺的发酵可以被利用，例如，分批补料发酵和分批分离；分批补料发酵和连续分离， 或连续发酵和连续分离。分批和连续发酵方法的实例在本领域中是公知的。除了上面使用本发明的己二酸、6-氨基己酸或己内酰胺生产株用于连续生产大量 己二酸、6-氨基己酸或己内酰胺的发酵方法以外，己二酸、6-氨基己酸或己内酰胺生产株 还可以，例如，同时地进行化学合成方法，从而将产物转变为其他化合物，或产物可以从发 酵培养物中分离并且连续地进行化学转变作用，从而将产物转变为其他化合物，如果需要 的话。如本文所述，利用3-氧代己二酸、己-2-烯二酸盐的己二酸途径中的中间体，可以通过在钼催化剂上的化学氢化作用转变为己二酸(参见实施例III)。为了生成较好的生产株，可以利用代谢建模来优化生长条件。还可以使用建 模来设计基因敲除，从而额外地优化该途径的利用(参见，例如，美国专利
发明者A·P·博加德, 普里蒂·法克雅, 罗宾·E·奥斯特豪特 申请人:基因组股份公司