在光合生物中诱导絮凝的制作方法

专利名称：在光合生物中诱导絮凝的制作方法
在光合生物中诱导絮凝相关申请的交叉引用本申请要求于2008年6月27日提交的美国临时申请号61/076，430的权益，出于 所有目的将其全部内容通过弓I用结合在此。背景藻类是单细胞生物，通过光合作用产生氧气。出于多种原因，一类(微藻)对于生 物技术应用是有用的，这些原因包括它们的高生长速率以及对变化的环境条件的耐受性。 在多种工业过程中用于商业上重要的产品的微藻的用途是已知的和/或已经被提出了。例 如，微藻在生产营养补剂、药物、天然染料、用于鱼和甲壳动物的一种食物来源、生物防治农 业害虫、在污水处理中产生氧以及去除氮、磷以及有毒物质、以及污染控制(如生物降解塑 料或吸收二氧化碳)中具有用途。微藻(像其他生物一样)含有作为膜组分、储藏产物、代谢产物以及能量来源的 脂类和脂肪酸。已经发现一些藻株、硅藻、以及蓝细菌含有成比例地高水平的脂类(超过 30%)。在寻找用于生产生物燃料的一种可持续原料中，具有高油或脂含量的微藻株是特别 感兴趣的。一些野生型藻类适合用于不同的工业应用中。然而，已经认识到通过修饰藻类来 改进对于上述应用有用的具体特征，这些相关的方法更可能是商业上可行的。为此，可以开 发具有超过野生型株的改进特征的藻株。已经通过传统的筛选和突变和选择技术完成了这 样的开发。另外，已经广泛地提出了将重组DNA技术用于藻类。此类方法可以提高生产商 业上有价值的产品的经济有效性。为了生产一些感兴趣的商业产品，可以将生产这些产品的生物生长在液体环境 中。从这些液体环境中去除这些生物有时是有利的。去除生物的一种方法是将这些生物絮 凝或聚集以有助于去除。絮凝剂或絮凝化试剂通过引起液体中的胶体以及其他悬浮的颗粒 物(例如细胞)聚集从而促进了絮凝，形成一种絮状物。将絮凝剂用于水处理过程中以提 高小颗粒的沉淀。例如，可以将一种絮凝剂用于游泳池或饮用水过滤中以帮助去除微观颗 粒，否则这些微观颗粒将引起水浑浊并且这些微观颗粒单独通过过滤将难以去除。许多絮凝剂是多价阳离子，如铝、铁、钙或镁。这些带正电荷的分子与带负电荷的 颗粒和分子相互作用从而减少聚集的障碍。此外，多种这些化学品在适当的PH和其他条件 (如温度和盐度)下，与水反应从而形成不可溶的氢氧化物，当沉淀时这些氢氧化物连接到 一起从而形成长链或网状，物理地将小颗粒俘获到该较大的絮状物中。使用化学絮凝剂使微藻絮凝是已知的。长链聚合物絮凝剂，如修饰的聚丙烯酰胺， 是由絮凝剂生产企业制造并销售的。这些可以以干的或液体的形式提供，用于该絮凝过程 中。例如最常用的液体聚丙烯酰胺是作为一种具有10% -40%的活性物的乳液被提供的， 并且剩余部分是一种载体流体、多种表面活性剂以及胶乳。然而使用化学絮凝剂具有多个缺点。例如，用于水处理和其他过程中要求随后去 除絮凝剂。加入和去除絮凝剂增加了商业生产一种感兴趣的产品的成本，因此降低了生产 的经济可行性。
概述本披露的一个方面提供了多种载体，这些载体包括一个对一个絮凝部分进行编码 的核酸以及一个调节元件，该调节元件被连接为用于在一种光合生物的细胞核中表达该絮 凝部分。在本发明中使用的这些絮凝部分可以包括碳水化合物结合蛋白、结合到莱茵衣藻、 盐生杜氏藻(D. salina)、杜氏盐藻(D. tertiolecta)、或雨生血球藻的一个细胞表面抗原 上的抗体、凝集素、i^huA蛋白、pl35蛋白、或形成一种牢固的蛋白-蛋白对的其他蛋白，其中 该对导致微藻的絮凝。在这些载体中使用的这些调节元件可以包括一种组成型启动子、光 诱导型启动子、群体敏感型启动子、温度敏感型启动子、或氮饥饿响应型启动子。在此披露 的这些载体还可以包含多种核酸，这些核酸能够将该絮凝部分靶向到细胞表面上并且将该 絮凝部分的一部分进行锚定以使该絮凝部分的一部分被牢固地结合到该细胞表面上。使用 这些载体来转化无维管的光合生物(如微藻)用于絮凝。在某些情况下，当将该絮凝部分 分泌到该培养物中时，该锚定部分可以是任选的(取决于一个絮凝部分的特性)，是用于絮 凝的优选的方法。另一个方面提供了使用无维管的光合生物进行絮凝的方法。无维管的光合生物的 实例是莱茵衣藻、盐生杜氏藻、杜氏盐藻、二形栅藻、或雨生血球藻。这些絮凝方法可以包括 通过用不同的絮凝部分进行转化来产生两种明显不同的光合生物并且通过允许这两个絮 凝部分彼此相互作用来引起絮凝。絮凝部分的实例包括ThuA与pl35之间的蛋白-蛋白相 互作用、交配型特异性凝集素之间的相互作用、一个抗体-抗原对、以及能够彼此识别为一 对并且形成一种稳定的蛋白-蛋白复合体的其他蛋白。用于诱导无维管的光合生物絮凝的 方法的实例是，改变光照条件、培养密度、培养温度、或养分有效性；在该培养物中加入凝集 素、蛋白、重金属、阳离子的或化学的絮凝剂；或将上述絮凝剂附连到一种固体支持物上。另一个方面提供了再利用来自一个液体环境的培养物液体的方法。可以将无维管 的光合生物培养在具有本领域中已知的确定成分培养基的一种培养基中，如min-70、M-培 养基、或TAP培养基。在絮凝后，再利用该培养物的液体部分经常是可能的并且经济上有利 的。在此披露的是能够再利用包括对一个絮凝部分进行编码的生长的微生物的液体；将该 生物与絮凝部分进行接触并且由此使该生物絮凝；并且从该液体环境中去除聚集的微生物 的方法。一个具体方面提供了一种用于使一种无维管的光合生物絮凝的方法，该方法包括 在一种无维管的光合生物的外表面上表达一种对一个第一絮凝部分进行编码的外源核酸 并且将该生物与一个第二絮凝部分进行接触。这种生物可以是衣藻属、杜氏藻属、栅藻属或 血球藻属的一个成员，例如莱茵衣藻、盐生杜氏藻、杜氏盐藻、二形栅藻、或雨生血球藻，虽 然可以使用其他属的成员。该第一絮凝部分可以是一种碳水化合物结合蛋白，如一种凝集 素并且具体地一种c型凝集素。碳水化合物结合蛋白的其他非限制性实例包括CD-SIGN、 Dectin-l、Dectin-2、HECL、Langerin、Layilin、Mincle、MMGL、E-选择素、P-选择素、L-选择 素、DEC-205、Endo 180、甘露糖受体、磷脂酶A2受体、唾液酸粘附素(siglec-1)、sigleC-2、 siglec-3、 siglec-4、 siglec-5、 siglec-6、 siglec-7、 siglec-8、 siglec-9、 siglec-10、 siglec-11、以及半乳凝素类。在其他实施方案中，该第一絮凝部分可以是一种单价的、单价 态的或多价的抗体，例如一种scFv抗体，该scFv抗体结合到一种感兴趣的生物的表面上的 一个抗原上。这类生物的实例包括衣藻属、杜氏藻属、栅藻属或血球藻属的成员，如莱茵衣
9藻、盐生杜氏藻、杜氏盐藻、二形栅藻、或雨生血球藻。一些实施方案还可以包括使用一个第 二絮凝部分。该第二絮凝部分可以是在一种固体支持物的表面上或在一个第二生物的表面 上，该第二生物可以是或可以不是一种无维管的光合生物。当该第二絮凝部分被表达于一 个第二生物的表面上时，该第二絮凝部分可以是天然发生的或可以是一种外源核苷酸序列 表达的结果。在一些实施方案中，该第一和第二生物是相同的种，而在其他实施方案中，该 第一和第二生物是不同的品系、不同的属或不同的界。例如，在一个实施方案中，该第一和 第二生物两者都是藻类，而在另一个实施方案中，一个生物是一种藻类而另一个是一种细 菌或酵母。当该第二絮凝部分是在一个第二生物或固体支持物的表面上时，该方法进一步 包括将该第一生物与该第二生物、与该固体支持物或两者结合。另一个方面提供了一种无维管的光合生物，该光合生物包括在该生物的外部细胞 表面(如一个细胞膜或细胞壁)上的一种外源蛋白；该外源蛋白包括一个结合对的一个成 员。该外源蛋白可以是一种抗体，如一种单链可变区片段(scFv)抗体，或一种碳水化合物 结合蛋白，如一种凝集素(例如一种c型凝集素)。在其他实施方案中，该外源蛋白是一 种抗原，该抗原是一种抗体的目标，并且在一个实施方案中，一种抗体对于那种抗原是特异 的。在一些实施方案中，该外源蛋白是一种融合或嵌合蛋白，其中部分的该蛋白发挥作用将 该蛋白锚定到该细胞表面上。该无维管的光合生物可以是一种藻类，例如一种绿藻，更具体 地衣藻属、杜氏藻属、栅藻属或血球藻属的一个成员，并且更具体地莱茵衣藻、盐生杜氏藻、 杜氏盐藻、二形栅藻、或雨生血球藻中的一种。在一个实施方案中，该无维管的光合生物是 一种适盐生物，如盐生杜氏藻或杜氏盐藻。在又其他实施方案中，该碳水化合物结合蛋白是 以下各项中的至少一个CD-SIGN、Dectin-l、Dectin-2、HECL、Langerin、Layilin、Mincle、 MMGL、E-选择素、P-选择素、L-选择素、DEC-205、Endo 180、甘露糖受体、磷脂酶A2受体、唾 液酸粘附素(siglec-1)、siglec-2、siglec-3、siglec-4、siglec-5、siglec-6、siglec-7、 siglec-8、siglec-9、siglec-10、siglec-11、或半乳凝素类。又另一个方面提供了一种絮凝方法，该方法包括用一种对一个第一絮凝部分进行 编码的核酸转化一个第一无维管性光合生物，用一种对一个第二絮凝部分或一种用于生产 一个第二絮凝部分所必要的蛋白(该第二絮凝部分与该第一絮凝部分相互作用)进行编码 的核酸转化一个第二生物，该第二生物可以是或可以不是一种无维管的光合生物，表达该 第一和第二絮凝部分并且使这两部分进行接触从而使得絮凝发生。这两个生物可以是相同 的或不同的属、相同的或不同的种或相同的或不同的界。例如，这些生物可以是相同种的藻 类、不同种的藻类、或一种藻类和一种细菌或酵母。该第一生物、该第二生物或两者可以是 衣藻属、杜氏藻属、栅藻属或血球藻属的成员，从而这些生物中的一个或两者可以是莱茵衣 藻、盐生杜氏藻、杜氏盐藻、二形栅藻、或雨生血球藻。该第一或第二絮凝部分可以是抗体、 碳水化合物结合蛋白或交配型特异性凝集素。又另一个方面提供了一种载体，该载体包括一个对一个絮凝部分进行编码的分 离的核酸、一个用于在该光合生物中(例如在细胞核中)表达该絮凝部分的调节元件、以及 一个允许该絮凝部分导向到该生物的表面上或被该生物分泌的靶向元件。该絮凝部分可以 是一种抗体或在此所述的碳水化合物结合蛋白的任何一种。絮凝部分的具体实例包括抗 体、凝集素、i^huA蛋白以及pb5蛋白。当该核酸编码一种抗体时，它可以是对于衣藻属、杜 氏藻属、栅藻属或血球藻属的一个成员例如莱茵衣藻、盐生杜氏藻、杜氏盐藻、二形栅藻、或雨生血球藻的表面的抗原的。在某些实施方案中，该载体进一步包括一种对一个锚定元件 进行编码的核酸，该锚定元件将该絮凝部分锚定到该生物的表面上。又另一个方面提供了一种宿主细胞，该宿主细胞包括这些前述载体中的任何一 个。该宿主细胞可以是或可以不是一种无维管的光合生物。在一些实施方案中，该宿主细 胞是衣藻属、杜氏藻属、栅藻属或血球藻属的一个成员，例如莱茵衣藻、盐生杜氏藻、杜氏盐 藻、二形栅藻、或雨生血球藻。在另一个实施方案中，该宿主细胞是一种细菌或一种酵母。又另一个方法提供了一种用于再利用液体(如水或一种基于水的生长培养基)的 方法，该方法包括使一种无维管的光合生物生长在一个液体环境中(该无维管的光合生物 包括一种对一个絮凝部分进行编码的外源核酸)，将该生物与一个第二絮凝部分进行接触 (该第二絮凝部分直接地或间接地结合到该第一絮凝部分上，导致该生物的絮凝)，并且将 该液体环境中至少一部分液体与该生物分离。该第一和第二絮凝部分可以是在此所述的多 个部分中的任何一种，包括但不限于，抗体、碳水化合物结合蛋白、碳水化合物、重金属絮凝 剂、化学絮凝剂、阳离子絮凝剂、以及交配型凝集素。该第二絮凝部分可以被附连到一个第 二生物的表面上，该第二生物可以是或可以不是一种无维管的光合生物，或可以被附连到 一种固体支持物上。又另一个方面提供了一种使一种无维管的光合生物絮凝的方法，包括将该无维管 的光合生物与一个第二生物进行接触，该第二生物包括一种对一种抗体进行编码的外源核 酸，该抗体结合到该无维管的光合生物的表面上的一个抗原上，由此引起絮凝。在一个实施 方案中，该抗体被表达在该第二生物的表面上。在另一个实施方案中，该抗体是一种单链可 变区片段(scFv)抗体。在又另一个实施方案中，该外源核酸编码了一种融合或嵌合蛋白， 该融合或嵌合蛋白包括该抗体以及一个锚定组分，该锚定组分将该抗体锚定到该第二生物 的细胞膜或细胞壁的外表面上。在一个实施方案中，该第二生物是一种细菌，而在另一个实 施方案中，该第二生物是一种酵母。该无维管的光合生物可以是一种绿藻，例如衣藻属、杜 氏藻属、栅藻属或血球藻属的一个成员，并且更具体地莱茵衣藻、盐生杜氏藻、杜氏盐藻、二 形栅藻、或雨生血球藻。另一个方面提供了一种将一种无维管的光合生物絮凝的方法，该方法包括将该无 维管的光合生物与一个第二生物进行接触，该第二生物包括一种对一个絮凝部分进行编码 的外源核酸，该絮凝部分结合到该无维管的光合生物的一个表面组分上，由此引起该无维 管的光合生物的絮凝。该絮凝部分可以被该第二生物分泌、被表达在该第二生物的表面上、 或两者。该第二生物可以是一种酵母、一种细菌、一种非光合藻类或一种光合藻类。在一些 实施方案中，该第二生物是大肠杆菌或巴斯德毕赤酵母。该碳水化合物部分可以是下组中 的多个成员中的至少一个成员，该组选自CD_SIGN、Dectin-I、Dectin-2、HECL, Langerin、 Layilin、Mincle、MMGL, E-选择素、P-选择素、L-选择素、DEC-205、Endo 180、甘露糖受 体、磷脂酶 A2 受体、唾液酸粘附素(siglec-1)、siglec-2、siglec-3、siglec-4、siglec-5、 siglec-6、siglec-7、siglec-8、siglec-9、siglec-10、siglec-11、以及半乳凝素类。在具 体实施方案中，该碳水化合物结合蛋白是一种凝集素，例如一种c型凝集素。在在此说明的实施方案中的任何一个中，一种对一个絮凝部分(如一种抗体或一 种碳水化合物结合蛋白)进行编码的外源核酸可以进一步包括一个或多个调节元件(如一 个启动子)。启动子可以是组成型的或诱导型的。诱导型启动子包括但不限于，光诱导型启动子、群体敏感型启动子、温度敏感型启动子或氮敏感型启动子。应当理解的是，除非另外说明，当提及一个絮凝部分在一种生物或固体支持物的 表面上表达或存在时，这种提及是指该生物或固体支持物的外表面，即该表面面对该有待 絮凝的生物存在其中的环境。通过引用进行结合在本说明书中提到的所有公开物、专利、以及专利申请都通过引用以相同程度结 合在此，如同各个单独的公开物、专利或专利申请都专门地并且个别地表明要通过引用进
行结合。附图简要说明在所附权利要求中具体提出了本发明的新颖的特征。通过参考以下详细描述以及 以下附图将获得对本发明特征和优点的更好的理解，这些详细描述提出了说明性实施方案 (在这些说明性实施方案中使用了本发明的原理)

图1展示了本披露中使用的多个构建体图2是一个通过凝集素进行絮凝的流程图。执行Q. C.；执行大规模生长的质量控 制，包括生长速率、培养基PH，以及对于菌株污染进行筛选。N ；对于条件令人不满意来前进 到下一个步骤的替代的工作流程。图3是一个由一种抗-Fusl抗体诱导的絮凝的流程图。图4是一个由!^huA和pb5的表达诱导的絮凝的流程图。图5是一个在基因修饰的莱茵衣藻中由基因诱导的絮凝的流程图，这些基因是由 氮饥饿来调节的。图6显示了在大肠杆菌中生产的重组凝集素的活性。A-D是莱茵衣藻，其中A和C 是阴性对照并且B和D是对应地存在来自盖罩大蜗牛(H. pomatia)和滑北螈(T. vulgaris) 的FITC-结合的凝集素。E-H是二形栅藻，其中E和G是阴性对照并且F和H是对应地存在 来自盖罩大蜗牛OLpomatia)和滑北螈(T. vulgaris)的FITC-结合的凝集素。图7显示将一种LppOmpA-凝集素融合蛋白插入大肠杆菌的细胞膜中。图8显示了 β -自转运蛋白扁豆(L. culinaris)凝集素融合蛋白对二形栅藻的沉 淀的影响。图9显示了一种蛋白质印迹，该蛋白质印迹显示了将一种Lpp0mpA-SCFv5融合物 正确地插入大肠杆菌的质膜中。图10显示了在巴斯德毕赤酵母中分泌的凝集素的蛋白质印迹。标记1 (盖罩大蜗 牛凝集素)和2(扁豆凝集素)的代表性实例显示了蛋白分泌到该生长培养基中。图11显示了在巴斯德毕赤酵母中表达这些支架凝集素融合蛋白=(I)Pirlb-盖罩 大蜗牛凝集素，(^Pirlb-扁豆凝集素，以及C3)Pirla-滑北螈凝集素。图12显示了将一种Pirla-凝集素融合蛋白插入巴斯德毕赤酵母的膜中。图13显示了 Fasl-凝集素融合物的表达。条带1 :Fasl-扁豆凝集素；条带2 Fasl-截短的扁豆凝集素；条带3 :Fasl-鸡冠刺桐(E. cristagalli)凝集素。图14显示了一种蛋白质印迹，该蛋白质印迹描述了 !^asl-凝集素融合蛋白的亚细 胞定位。WT :21gr ；对照细胞质酶；1 :Fasl-扁豆凝集素融合物；2 :Fasl-截短的扁豆凝集 素融合物；3 =Fasl-T.鸡冠刺桐凝集素融合物。
图15显示了 Fasl-滑北螈凝集素融合蛋白构建体的存在对沉降的影响。图16显示了在莱茵衣藻中全细胞表达GPl-凝集素蛋白。1 :GP1_盖罩大蜗牛凝 集素融合物；2 :GP1-截短的扁豆凝集素融合物。图17显示了一种蛋白质印迹，该蛋白质印迹显示了 GPl-凝集素融合蛋白的亚细 胞定位。WT :21gr ；对照细胞质酶；GPl-盖罩大蜗牛凝集素。图18显示了 GPl-盖罩大蜗牛凝集素构建体的存在对沉降的影响。图19显示了 一种蛋白质印迹，该蛋白质印迹显示了在莱茵衣藻中表达一种 SCFV5-FaSl融合蛋白。1:该融合蛋白在此显示。较高的条带是残留的与争光霉素蛋白的 完整融合物。图20显示了一种蛋白质印迹，该蛋白质印迹描述了 i^asl融合蛋白的亚细胞定位。 WT :21gr ；对照细胞质酶；scFV5-Fasl融合物。存在定位于该膜部分上的scFv5-Fasl蛋 白。(箭头)。图21显示了在莱茵衣藻中N03_诱导表达盖罩大蜗牛凝集素。泳道1 时间0，ΤΑΡ ； 泳道2 时间12小时，TAP ；泳道3 时间M小时，TAP ；泳道4 时间12小时，TAP-NH4C1+7. 4mM KNO3 ；泳道 5 时间 24 小时，TAP-NH4Cl+7. 4mM KNO3 泳道 6 对照。图22显示了在氮缺乏后两个莱茵衣藻株的絮凝。图23显示了在将氮减少到最小后两个莱茵衣藻株的絮凝。详细说明本披露在此提供了在光合生物中并且具体地在无维管的光合生物(NVPO)中引发 絮凝的新颖的方法。出于工业或农业的目的，光合生物、具体地单细胞的生物如微藻或蓝细 菌的生长经常涉及从液体环境中收获这些生物的细胞。当前，许多这种收获是通过离心、压 带机处理、向液体环境中加入化学絮凝剂、或多种方法的一些组合来完成的。传统的絮凝方 法可能导致额外的成本(例如，絮凝剂的成本、从该液体和/或生物中去除絮凝剂的成本、 等)以及其他问题(例如，污染，产品纯化、等)。本披露提供了用于使光合生物絮凝的新颖 的组合物、宿主细胞以及方法，这些新颖的组合物、宿主细胞以及方法能够克服传统的絮凝 方法的缺点。本披露利用了不同分子之间的强的分子相互作用(例如，抗体与抗原、蛋白和碳 水化合物、蛋白-蛋白结合对、等)。可以使用絮凝对(两个组分的复合体)或絮凝复合体 (多于两个组分的复合体)。在一些实例中，一个絮凝对或复合体的一个成员将被自然地表 达在将被絮凝的一个生物上，但是生产的水平可以从基因方面被提高。在其他实例中，一个 絮凝对或复合体的一个成员将被重组地表达于有待絮凝的一个生物上。然后将该生物与该 第二(和/或随后的)絮凝部分进行接触以诱导絮凝。附带地可以将该第二或随后的絮凝 部分加入(例如，到一种固相如一种珠粒或筛上)，在一个分离的生物上进行表达(该生物 与该第一生物可以是相同的或不同的种)然后将该分离的生物与该第一生物进行接触、或 在相同的生物上进行表达(例如，在一个可诱导型调节元件的控制下)。所使用的一种方法涉及基因操作一种光合生物(例如一种NVP0)以表达一个或多 个絮凝部分。基因操作可以涉及用一种对一个絮凝部分进行编码的核酸瞬时地或整合地转 化一种光合生物(例如，莱茵衣藻、盐生杜氏藻、杜氏盐藻、二形栅藻、雨生血球藻)或一种 非光合生物(例如大肠杆菌)。在一些实例中，该絮凝部分是一种能够结合到另一种蛋白、一种碳水化合物或另一种感兴趣的分子上的蛋白。例如，可以用一个对融合到一个抗体上 的一个莱茵衣藻细胞表面蛋白进行编码的基因转化莱茵衣藻，从而在该细胞的表面上抗体 的表达将引起这些转化的细胞的或任何其他目标生物的絮凝。已经在莱茵衣藻的叶绿体 中生产了抗体，但是这样的表达没有在该细胞的表面上产生抗体。参见，例如Mayfield et al. , PNAS 100(2) :438-42 (2003)。可替代地，该抗体可以被表达于一种非光合生物的表面 上。在一个实施方案中，该非光合生物是一种原核生物如一种细菌。在另一个实施方案中， 该非光合生物是一种真核生物，例如一种真菌，并且更具体地一种酵母。然后该非光合生物 的表面上的细胞表面抗体结合到多个光合生物上，导致了絮凝。宿主细胞本披露还考虑了用在此所述的一个或多个核酸转化的一种宿主细胞。在某些实施 方案中，该宿主细胞是光合的。在一些情况下，该宿主细胞是光合的并且无维管的。在其他 情况下，该宿主细胞是光合的并且有维管的。在又其他情况下，该宿主细胞是非光合的。该 宿主细胞可以是真核的或原核的。可以用对一个或多个絮凝部分进行编码的多个基因转化 一些宿主细胞。例如，一个单个的转化的细胞可以包含对一个、两个、三个或更多个蛋白或 其亚基进行编码的外源核酸。例如，可以用对一种抗体进行编码的一个基因转化一种藻类 如莱茵衣藻、一种细菌如大肠杆菌或一种蓝细菌、或一种酵母如巴斯德毕赤酵母，该抗体识 别该有待絮凝的生物的一种细胞表面蛋白，其中将该抗体作为一种融合蛋白或以两个或更 多个内部组装的亚基进行生产。该有待絮凝的生物可以是与表达该表面蛋白的生物相同或 不同。这些构建体可以包含相同基因的多个拷贝、和/或对相同蛋白进行编码的多个基因、 和/或在该编码序列的一个或多个部分中具有突变的多个基因。可以用一种在此所述的载体(例如包括一个或多个絮凝部分编码基因的一种载 体)转化该宿主细胞。该载体可以包含用于转化该宿主细胞的细胞核或一个叶绿体或其他 质体的一个质体启动子或一个核启动子。该载体还可以编码一种融合蛋白或试剂，该融合 蛋白或试剂选择性地将该载体产物靶向到细胞核或该叶绿体或其他质体中。使用本领域中 已知的任何方法，可以发生一种宿主细胞的转化。一个宿主生物是包括一种宿主细胞的一个生物。在某些实施方案中，该宿主生物 是光合的。一种光合生物是一种生物，该生物是自然地光合的(具有一种质体)或该生物 是被基因设计为或另外地被修饰为是光合的。在一些实例中，可以用一种构建体转化一种 光合生物，该构建体使得该光合装置的全部或部分不可操作。在一些实例中，它是无维管的 并且光合的。该宿主细胞可以是原核的。本发明的一些光合原核生物的实例包括但不限于 蓝细菌(例如蓝藻、集胞藻、节旋藻(Athrospira))。该宿主生物可以是单细胞的或多细胞 的。在几个实施方案中，该宿主生物是真核的(例如绿藻)。在此考虑的生物的实例包括但 不限于，红藻门、绿藻门、不等鞭毛门、tribophyta、灰藻门、chlorarachniophytes、裸藻、定 鞭藻门、隐藻、腰鞭毛类、以及浮游植物。在其他实施方案中，该宿主生物是非光合的。非光 合宿主生物包括细菌和酵母。适合的细菌宿主生物的实例可以在变形菌门中找到，并且包 括但不限于大肠杆菌。适合的酵母生物的实例可以在子囊菌门中找到，并且包括但不限于 巴斯德毕赤酵母以及酿酒酵母。一个宿主生物可以在允许光合作用的条件下进行生长，然而，这不是一个必要条 件(例如，一个宿主生物可以在无光下进行生长)。在一些实例中，该宿主生物可以以这样一种方式被基因修饰，即减少和/或破坏光合作用的能力。在生长条件下当一个宿主生物 不能光合作用时(例如由于无光和/或基因修饰)，典型地，将向该生物提供必需的营养物 以支持在无光合作用下的生长。例如，可以用任何需要的营养物补充一个生物在其中(或 其上)生长的一种培养基，这些营养物包括一种有机碳源、氮源、磷源、维生素、金属、脂类、 核酸、微量营养物、或一种生物特异的需要物。有机碳源包括该宿主生物能够代谢的任何碳 源，包括但不限于，乙酸盐、简单的碳水化合物(例如葡萄糖、蔗糖、乳糖)、复杂的碳水化合 物(例如淀粉、糖原)、蛋白、以及脂类。本领域的普通技术人员应当认识到不是所有的生物 都将能够充分地代谢一种特定的营养物并且应当意识到营养物混合物可能需要从一种生 物到另一种生物进行修饰，从而提供适当的营养物混合物。可以将一个宿主生物生长在陆地上，例如在池塘、水渠、垃圾中，或生长在封闭的 或部分封闭的生物反应器系统中。也可以将这些宿主生物直接生长在水中(例如洋、海、 湖、河、水库、等)。在藻类被大量培养的实施方案中，可以将该藻类生长在高密度光生物反 应器中。大量培养藻类的方法在本领域中是已知的。例如可以将藻类生长在高密度光生物 反应器中(参见，例如 Lee et al, Biotech. Bioengineering 44 :1161-1167,1994)以及其 他生物反应器(例如用于污水和废水处理的那些)中(例如Sawayama et al,Appl. Micro. Biotech. ,41 :729-731,1994)。此外，可以将藻类大量培养以去除重金属(例如Wilkinson， Biotech. Letters, 11 :861-864,1989)、氢(例如美国专利申请
发明者C·贝恩克, M·门德斯, P·李, Y·潘 申请人:蓝宝石能源公司