Hbv表位反应性外源t细胞受体(tcr)及其用途的制作方法

专利名称：Hbv表位反应性外源t细胞受体(tcr)及其用途的制作方法
技术领域：
本发明主要涉及用于治疗乙型肝炎病毒(HBV)和HBV相关的疾病(如肝硬化和肝 细胞性肝癌(HCC))的免疫介导疗法的领域，并且涉及制定这些疗法的方法。具体而言，所 述免疫介导疗法可为表达至少一种HBV表位反应性外源T细胞受体的细胞和/或编码HBV 表位反应性T细胞受体的多核苷酸、载体和/或多肽的形式。
背景技术：
乙型肝炎病毒(HBV)感染类人动物总科(包括人)的肝脏，并且引起称作肝炎的 炎症。它是一种DNA病毒并且是引起病毒性肝炎的多种独立病毒中的一种。HBV目前感染 全世界至少3. 5亿人。75%的慢性感染HBV的患者生活在亚洲，但是病毒已在世界范围内 扩散。例如，在美国，大约150万美国人或者约0.5%的人口携带HBV。在特定高危人群中， 像与其他男人发生性行为的男人、肾透折患者以及患有血友病的人，感染尤其更加常见。慢 性HBV感染影响了 10 15%的第一代亚裔美国人，并且大约5%的从俄罗斯、亚洲和东欧 收养的儿童有慢性HBV感染。慢性HBV感染可最终导致肝硬化和肝细胞性肝癌(HCC)，而 HCC是一种对目前的化学疗法反应非常差的致命疾病。由于现有的药物抑制而非消除HBV，因此，目前对这种全球性大储源的慢性感染者 的可用治疗方法正在受到挑战。虽然大多数HBV感染患者对目前可用的治疗方法有反应， 表现为肝组织学和血清丙氨酸转氨酶(ALT)水平的改善，但是当停止治疗时，几乎所有患 者都复发。此外，治疗HBV的更常见的方法包括使用如拉米夫定和阿德福韦的药物。然而， 这些药物导致患者体内的抗病毒抗药性的形成，每年大约20%的用拉米夫定治疗的患者和 大约3%的用阿德福韦治疗的患者出现这种情况。最后，大部分患者会形成抗药性，此时，抗 病毒药将几乎没有作用。因此对有效的抗病毒治疗方法存在着全球性的需求，该方法引起HBV特异性免疫 应答从而有效地并成功地消除患者体内的共价闭环形式的HBV。在一些受试对象中发现的 天然产生的HBV表位特异性T细胞使该受试对象能够天生具有对HBV感染的有效控制。过 去的研究已显示，持续/慢性HBV感染患者的HBV表位特异性T细胞缺失或功能改变。因 此，随着人们对在HBV感染期间病毒与宿主相互作用的认识的增加，这些认识促使人们推 测对在慢性感染患者体内存在的缺陷性抗病毒免疫力的治疗性重建可能使疾病症状消退。 这种观念的正确性在进行骨髓移植并接受了对HBV具有天然免疫力的捐献者的骨髓的慢 性HBV感染患者中得到了直接证实。注入健康的HBV致敏的免疫系统导致这些患者体内的 慢性HBV感染症状消退。然而，对HBV慢性感染患者来说，骨髓移植显然不是一种容易的治 疗选择，而在慢性乙型肝炎患者体内使用多种疫苗来增强HBV特异性免疫力的尝试已经是 令人失望的。治疗性疫苗策略失败的可能原因是这样的事实，即HBV慢性携带者的免疫系统不 具有与健康的非HBV感染者相同的效率和特异性谱(i^pertoire of specificities)。此外，慢性HBV感染患者体内的病毒抗原的持续大量产生会删除或耐受抗原特异性T细胞。因此慢性HBV感染患者的特征为HBV特异性⑶4+和⑶8+T细胞应答低下或缺 失。而且，有人已推测，由HBV感染产生的T细胞抗体抗原亲和力低和细胞因子谱(cytokine profile)无效可能促进了慢性HBV感染的发展而不是有利于病毒的清除。显然，为了减少全世界的HBV感染和HBV相关的恶性肿瘤的发病率和死亡率，需要 以HBV感染患者的细胞因子谱涉及的分子为靶向的更加有效的疗法。

发明内容
本发明致力于解决上述问题，并且具体而言，采用外源T细胞受体(TCR)转移通过 重定向慢性HBV感染患者的淋巴细胞的特异性而提供了一种有效且高效的治疗HBV感染的 新方法。根据第一个实施方式，本发明提供了至少一种分离细胞，其包含至少一种HBV表 位反应性外源T细胞受体(TCR)和/或其片段。具体而言，所述HBV表位可以为HLA-A2限制性的。更具体而言，所述HBV表位可 以包含至少一种乙型肝炎核心抗原或一种乙型肝炎包膜抗原或者它们的突变体。甚至更具 体而言，所述HBV表位可以包含HBc 18-27、HBs370-79和/或它们的突变体。所述HBc 18-27 表位可以包含选自SEQ IDNO :25 39中的至少一种序列。具体而言，所述HBcl8_27表位 可以包含序列SEQ ID N0:25。所述HBs370_79表位可以包含选自SEQ ID NO :56 58中 的至少一种序列。具体而言，所述HBs370-79表位可以包含序列SEQ IDNO 56。具体而言，根据本发明的细胞可以进一步包含至少一种第二 HBV表位反应性外源 TCR和/或其片段，其中，第二 HBV表位与第一 HBV表位可以是不同的。具体而言，第一 HBV 表位可为HBc 18-27并且第二 HBV表位可为HBs370_79。所述外源TCR可以包含至少一条α链，该α链包含选自SEQ ID NO :9、SEQ ID NO :10和SEQ ID NO 11或它们的突变体中的至少一种氨基酸序列。具体而言，所述外源TCR 可以包含至少一条α链,该α链包含序列SEQ ID NO :9、SEQ ID NO :10禾口 SEQ ID NO :11。 所述外源TCR可以包含至少一条β链，该β链包含选自SEQ ID N0:21、SEQ ID NO :22和 SEQ ID NO :23或它们的突变体中至少一种氨基酸序列。更具体而言，所述外源TCR可以包 含至少一条β链，该β链包含序列SEQ ID NO :21、SEQ ID NO :22和SEQ ID NO :23。全部 序列示于表1和2中。具体而言，所述外源TCR可以包含至少一条与SEQ ID NO 12或其片段具有至少 80%的氨基酸同一性的α链和/或至少一条与SEQ ID NO 24或其片段具有至少80%的 氨基酸同一性的β链。更具体而言，所述外源TCR可以包含至少一条SEQ ID Ν0:12的α 链和/或至少一条SEQ ID NO :24的β链。所述外源TCR可以包含至少一条α链，该α链包含选自SEQ ID NO :44、SEQ ID Ν0:45和SEQ ID NO :46或它们的突变体中的至少一种氨基酸序列。具体而言，所述外源 TCR包含至少一条α链，该α链包含序列SEQ ID NO 44,SEQ ID NO :45和SEQ ID NO :46。 所述外源TCR可以包含至少一条β链，该β链包含选自SEQ ID NO 52,SEQ ID NO :53和 SEQ ID NO 54或它们的突变体中的至少一种氨基酸序列。更具体而言，所述外源TCR可以 包含至少一条β链，该β链包含序列SEQ ID NO 52,SEQ ID NO :53和SEQ ID NO :54。全 部序列示于表1和2中。
具体而言，所述外源TCR可以包含至少一条与SEQ ID NO :47或其片段具有至少 80%的氨基酸同一性的α链和/或至少一条与SEQ ID NO 55或其片段具有至少80%的 氨基酸同一性的β链。更具体而言，所述外源TCR可包含至少一条SEQ ID Ν0:47的α链 和/或至少一条SEQ ID NO :55的β链。具体而言，根据本发明的细胞可为至少一种造血干细胞。更具体而言，所述细胞可 为至少一种外周血淋巴细胞(PBL)源T细胞。根据另一个实施方式，本发明提供了至少一种分离多核苷酸，其包含至少一种编 码至少一条α链的序列和/或至少一种编码至少一条β链的序列，其中，所述α链和β 链可以是至少一种外源HBV表位反应性TCR的部分。所述HBV表位可为HBcl8_27和/或 HBs370-79。具体而言，所述编码α链的序列包含选自SEQ ID NO :1和SEQ ID Ν0:5中的至 少一种序列、选自SEQ ID NO :2和SEQ ID NO 6中的至少一种序列以及选自SEQ ID NO 3 和SEQ ID NO :7中的至少一种序列，和/或所述编码β链的序列包含选自SEQ ID NO 13 和SEQ ID NO 17中的至少一种序列、选自SEQ ID NO 14和SEQ ID NO 18中的至少一种 序列以及选自SEQ ID NO: 15和SEQ ID NO 19中的至少一种序列。更具体而言，所述编码 α链的序列可以包含SEQ ID NO :5、SEQ ID NO 6和SEQ ID NO :7，和/或所述编码β链 的序列可以包含 SEQ ID NO 17, SEQ ID N0:18 禾口 SEQ ID NO :19。具体而言，所述HBV表位反应性外源TCR的α链可与SEQ ID NO :4或SEQ ID NO: 8具有至少80 %的序列同一性，和/或所述HBV表位反应性外源TCR的β链可与SEQ ID Ν0:16或SEQ ID NO :20具有至少80%的序列同一性。更具体而言，所述编码α链的序列 可选自SEQ ID NO :4和SEQ ID NO :8中，和/或所述编码β链的序列可选自SEQ ID NO 16和SEQ ID NO 20中。更具体而言，所述HBcl8_27表位反应性外源TCR的α链的序列 可选自SEQ ID NO 4和SEQ ID NO :8中，和/或所述HBcl8_27表位反应性外源TCR的β 链的序列可选自SEQ ID NO 16和SEQ ID NO 20中。具体而言，所述编码α链的序列包含SEQ ID NO 40、SEQ ID NO :41和SEQ ID NO :42，禾口 / 或所述编码 β 链的序列包含 SEQ ID NO :48、SEQ ID NO :49 和 SEQ ID NO :50。 更具体而言，所述HBV表位反应性外源TCR的α链可与SEQ ID NO :43具有至少80%的序 列同一性，并且所述HBV表位反应性外源T细胞受体的β链可与SEQ ID NO 51具有至少 80%的序列同一性。甚至更具体而言，所述编码α链的序列包含SEQ ID而43，和/或所 述编码β链的序列包含SEQ ID Ν0:51。更具体而言，所述HBs370_79表位反应性外源TCR 的α链的序列可以包含SEQ ID NO :43，和/或所述HBs370_79表位反应性外源TCR的β 链的序列可以包含SEQ ID NO :51ο根据另一个实施方式，本发明提供了至少一种分离多肽，其由本发明的至少一种 多核苷酸编码。根据又一个实施方式，本发明提供了至少一种分离多肽，其包含选自SEQ ID NO 9, SEQ ID NO :10 禾口 SEQ ID NO 11 中的至少一种序列以及选自 SEQ ID NO :21、SEQ ID NO: 22和SEQ ID NO :23中的至少一种额外序列。具体而言，所述序列可与SEQ ID N0:12具有 至少80%的氨基酸同一性，并且所述额外序列可与SEQ ID NO: M具有至少80%的氨基酸 同一性。
本发明还提供了至少一种分离多肽，其包含选自SEQ ID NO 44、SEQ IDNO 45和 SEQ ID NO 46 中的至少一种序列和 / 或选自 SEQ ID NO :52、SEQ IDNO 53 和 SEQ ID NO M中的至少一种额外序列。具体而言，所述序列可与SEQ ID NO :47具有至少80%的氨基 酸同一性，并且所述额外序列与SEQ IDNO 55具有至少80%的氨基酸同一性。根据本发明的多肽可为至少一种HBV表位反应性外源TCR。具体而言，所述HBV表 位可为HBcl8-27、HBs370-79和/或它们的突变体。更具体而言，所述多肽可为至少一种可 溶性TCR或其片段。甚至更具体而言，所述可溶性TCR或其片段可与至少一种抗病毒药连 接。根据一个实施方式，本发明提供了至少一种构建体，其包含与至少一种启动子可 操作地连接的本发明的多核苷酸。根据另一个实施方式，本发明提供了至少一种载体，其包含根据本发明的构建体 或者根据本发明的多核苷酸。根据又一个实施方式，本发明提供了至少一种T细胞，其包含根据本发明的载体 或构建体。根据一个实施方式，本发明提供了制备至少一种T细胞的至少一种方法，所述T细 胞包含至少一种用于递送到至少一种受试对象的HBV表位反应性外源TCR，该方法包括用 本发明的构建体或载体转导至少一种从受试对象中分离的T细胞。根据另一个实施方式，本发明提供了制备至少一种HBV表位反应性外源TCR的至 少一种方法，该方法包括(a)从消退了 HBV感染症状的至少一种HBV感染个体中分离至少一种HBV表位反 应性T细胞；(b)由步骤(a)的HBV表位反应性T细胞克隆编码至少一种TCR细胞受体的至少 一条α链和/或β链的至少一种多核苷酸序列；(c)将步骤(b)的多核苷酸序列递送至至少一种细胞；和(d)在适合所述细胞表达所述HBV表位反应性外源T细胞受体的条件下孵育该细 胞。具体而言，所述制备至少一种HBV表位反应性外源TCR的方法包括步骤(a)，至 少一种T细胞的分离，该T细胞可以是HBC18-27表位反应性的和/或HBs370_79表位反应 性的。根据一个实施方式，本发明提供了至少一种根据本发明的细胞，用于治疗HBV感 染和/或HBV相关的肝细胞性肝癌。根据另一个实施方式，本发明提供了在至少一种受试对象中治疗HBV和/或抑制 HBV复活的至少一种方法，该方法包括向受试对象施用免疫治疗有效量的根据本发明的任 一实施方式的至少一种细胞、至少一种载体和/或至少一种多肽。根据又一个实施方式，本发明提供了在至少一种受试对象中治疗HBV相关的肝细 胞性肝癌的至少一种方法，该方法包括向受试对象施用免疫治疗有效量的根据本发明的任 一实施方式的至少一种细胞、至少一种载体和/或至少一种多肽。根据一个实施方式，本发明提供了诊断能够使HBV感染症状消退的至少一种受试 对象的至少一种体外方法，该方法包括
(a)从至少一种受试对象中采集至少一种样本；(b)检测至少一种多核苷酸的存在，所述多核苷酸包含选自SEQ ID NO :4、SEQ ID NO 8, SEQ ID NO 16, SEQ ID NO 20、SEQ ID NO 43、SEQ ID NO :51、它们的同系物和 / 或 片段中的至少一种核酸序列，或者主要由选自SEQ ID NO 4,SEQ ID N0:8、SEQ ID NO :16、 SEQ ID NO 20, SEQ ID NO 43、SEQ ID NO :51、它们的同系物和/或片段中的至少一种核 酸序列组成，或者由选自 SEQ ID NO :4、SEQ ID NO :8、SEQ ID NO :16、SEQ ID NO :20、SEQ IDNO :43、SEQ ID NO :51、它们的同系物和/或片段中的至少一种核酸序列组成；和/或(c)检测至少一种多肽的存在，所述多肽包含SEQ ID NO :12、SEQ IDNO :24、SEQ ID NO :47,SEQ ID NO :55、它们的同系物和/或片段的氨基酸序列，或者主要由SEQ ID NO :12、 SEQ ID NO 24,SEQ ID NO 47、SEQ IDNO :55、它们的同系物和/或片段的氨基酸序列组成， 或者由 SEQ ID NO 12,SEQ ID NO 24、SEQ ID NO 47、SEQ ID NO :55、其同系物和 / 或片段 的氨基酸序列组成；其中，所述多核苷酸和/或多肽的存在标志着受试对象能够使HBV感染症状消退。根据再一个实施方式，本发明提供了诊断至少一种受试对象患有HBV感染和/或 HBV相关的肝细胞性肝癌或者存在患有HBV感染和/或HBV相关的肝细胞性肝癌的风险的 至少一种体外方法，该方法包括(a)从至少一种受试对象中收集至少一种样本；(b)检测至少一种多核苷酸的存在，所述多核苷酸包含选自SEQ IDNO :4、SEQ ID NO 8,SEQ ID NO 16,SEQ ID NO 20、SEQ ID NO :43、SEQID NO :51、它们的同系物和 / 或片 段中的至少一种核酸序列，或者主要由选自SEQ ID NO 4,SEQ ID NO :8、SEQ ID NO :16、SEQ ID NO :20,SEQ ID NO :43、SEQ ID NO :51、它们的同系物和/或片段中的至少一种核酸序列 组成，或者由选自 SEQ ID NO :4、SEQ ID NO :8、SEQ ID NO :16、SEQ ID NO :20、SEQ IDNO 43、SEQ ID NO :51、它们的同系物和/或片段中的至少一种核酸序列组成；和/或(c)检测至少一种多肽的存在，所述多肽包含SEQ ID NO :12、SEQ IDNO :24、SEQ ID NO :47,SEQ ID NO :55、它们的同系物和/或片段的氨基酸序列，或者主要由SEQ ID NO :12、 SEQ ID NO 24,SEQ ID NO 47、SEQ IDNO :55、它们的同系物和/或片段的氨基酸序列组成， 或者由 SEQ ID NO 12,SEQ ID NO 24、SEQ ID NO 47、SEQ ID NO :55、它们的同系物和 / 或 片段的氨基酸序列组成；其中，所述多核苷酸和/或多肽的缺失与受试对象患有HBV感染和/或HBV相关的 肝细胞性肝癌或者存在患有HBV感染和/或HBV相关的肝细胞性肝癌的风险的可能性相关。根据另一个实施方式，本发明提供了根据本发明的任一实施方式的至少一种细 胞、至少一种载体和/或至少一种多肽在制备用于治疗HBV感染和/或HBV相关的肝细胞 性肝癌的药物中的至少一种用途。根据再一个实施方式，本发明提供了检测和/或治疗HBV感染和/或HBV相关的 肝细胞性肝癌的至少一种试剂盒，该试剂盒包含根据本发明的任一实施方式的至少一种细 胞、至少一种载体和/或至少一种多肽。


图1显示了制备包含至少一种HBV表位反应性外源T细胞受体的细胞所涉及的步骤的示意图。其包括从已经消退了感染症状的HLA-A2阳性HBV患者中分离T细胞克隆，使 用该T细胞克隆形成编码HBV T细胞受体的逆转录病毒载体构建体，并且使用该载体形成 表达HBV表位反应性外源T细胞受体的细胞。图1部分取自文献khumacher et al. ,2002中。图2(A)显示了外周血淋巴细胞(PBL)(其用HBcl8_27肽进行刺激来产生T细胞 系)的FACS分析。使用特异性HBcl8-27-HLA-A201五聚体和磁性分离来分离HBcl8_27特 异性T细胞系。用HBcl8-27-HLA-A201特异性五聚体使分离的HBcl8_27特异性T细胞系 染色以证实克隆形成能力。结果显示，100%的T细胞是⑶8+和HLA-A2五聚体阳性，这表 明其具备克隆形成能力。图2 (B)显示了用TCR V β单克隆抗体(MAbs)板染色的潜在T细胞克隆C183 (其 源于消退了症状的HLA-A201HBV患者)的νβ分型的结果的图。在识别T细胞克隆方面， 与人TCR νβ区反应的MAbs的特异性几乎和私人特异性MAb—样。因此使用这种方法评 价νβ基因家族的表达。已发现，克隆C183对HBV核心18-27(HBcl8-27)表位具有高度特 异性。该结果提示所有T细胞均为νβ 8阳性。图3显示了 HBcl8_27特异性细胞毒性T淋巴细胞(CTL)克隆C183的细胞毒性功 能。将羧基荧光素琥珀酰亚胺基酯(CFSE))标记的H印G2细胞用HBcl8-27(8-10M)表位进 行脉冲标记，然后与未用HBcl8-27脉冲标记过的H印G2细胞混合。以1 1的比例在有或 没有CTL克隆存在下培养H印G2细胞5小时。通过在C183克隆(+C183)存在下CFSE标 记的靶标的消失来测定细胞毒性。5小时共孵育后，结果显示，只剩下CFSE阴性细胞(无 HBcl8-27肽)，而几乎所有HBcl8-27阳性、CFSE阳性的H印G2细胞均被C183杀死了，表明 T细胞克隆能够杀死呈递HBV抗原(如HBcl8-27)的肿瘤细胞。在没有加入CTL时，细胞计 数没有显著差异(无CTL)。图4显示了 C183T细胞克隆识别由肝细胞性肝癌细胞呈递的经内源性处理的病毒 抗原。图4(A)显示了作为对照组的与亲代、仅载体、IfepG2细胞系0fepG2TA2_7) —起孵 育5小时的HBcl8-27特异性细胞毒性T淋巴细胞(CTL)C183的结果。测试对照组的细胞 因子释放和胞毒脱粒(CD107a+染色)，其表明，由于没有激活脱粒(CD107a+)并且没有产生 IFN- γ，因此C183对对照细胞系H印G2TA2-7没有应答。图4(B)显示了在与HBV抗原表达水平不同的H印G2. 105细胞共培养后C183T细 胞克隆的激活刺激了 IFN-Y的产生和脱粒，这表明C183T细胞克隆识别由肝细胞性肝癌细 胞处理且呈递的HBcl8-27表位。在与表达HBV的H印G2细胞共培养5小时后，84%的T细 胞克隆被激活。图5显示了 C183T细胞克隆如何应答天然感染的肝细胞的结果。将从HLA-A2+ 或HLA-A2-外植的慢性HBV肝脏中分离的原代肝细胞与C183共培养。在单独孵育C183、 与HLA-A2+未感染的人原代肝细胞孵育、与HLA错配HBV感染的人原代肝细胞孵育或者与 HLA-A2+HBV感染的人原代肝细胞孵育之后，测量HBcl8_27特异性C183T细胞克隆脱粒和 IFN-Y产生。仅在与HLA-A2+HBV感染的人原代肝细胞孵育以后观察到C183激活(12% ⑶107a+)，表明C183T细胞克隆识别由在其细胞表面表达正确的HLA分子的HBV感染的原 代肝细胞呈递的经内源性处理的病毒抗原。
图6显示了 T细胞克隆C183识别HBcl8_27表位的能力，所述HBcl8_27表位来自 由HLA-A2MHC I类家族的不同亚型呈递的HBV基因型B和C (灰条，亚洲病毒；C18-I)与HBV 基因型A和D (黑条，欧洲/美洲病毒；C18-V)。将具有已知的HLA-A2亚型的Epstein-Barr 病毒(EBV)转化的B细胞负载浓度渐增的来自不同HBV基因型的HBcl8-27表位并与C183T 细胞克隆共培养5小时。测量IFN-γ的产生以测定T细胞的激活。数据显示，(A)HLA-A201 ； (B)HLA-A206 ；和(C)HLA-A207MHC I类分子能够呈递来自全部基因型的HBV表位，并被C183 识别，并因此有效地刺激了 T细胞的IFN-Y产生，已发现，C183T细胞克隆能够以高敏感度 (< IpM)识别来自基因型B和C或者基因型A和D的HBcl8-27表位，并且当该表位由三种 最显性的HLA-A2亚型A0201 (A)、A0206 (B)和A0207 (C)呈递时对其识别几乎是相同的。图7显示了对T细胞受体(TCR)转导效率的分析。图7(A)显示了当将外周血淋巴细胞(PBL)进行模拟转导(阴性对照)或用由 V β 8. 2和V α 3链组成的HBc 18-27Α20ITCR转导时，对其的FACS分析。转导后3天对PBL 的8链进行染色以确定引入的HBcl8-27TCR的表达。模拟转导的PBL表达内源性水平 的νβ 8(⑶8+ = 1. 8% ；⑶4+ = 2. 1)。与模拟转导的细胞(仅表达内源性水平的Vβ 8)相 比，用HBcl8-27A201TCR转导后，V β 8的表达大量地增加，表明成功的转导和表达。图7 (B)显示了在用HBcl8-27-A201特异性五聚体染色模拟转导的或HBcl8-27TCR 转导的细胞以确定是否表达V α 3链并在细胞表面上与νβ 8. 2链适当地配对时获得的结 果。五聚体分析显示了只有HBcl8-27TCR转导的T细胞表达了被HBcl8-27-A201特异性五 聚体识别的适合的α链和β链并且α链和β链在细胞表面上适当地配对。在模拟转导 的细胞中没有检测到染色，这是因为PBL来自HLA-A2阴性的健康供体。图7 (C)显示了来自5个健康人、5个HBeAg+的慢性HBV患者(HBV DNA > IO7个 拷贝/ml)和5个HBeAg-的慢性HBV患者(HBV DNA < IO6个拷贝/ml)的νβ 8+T细胞的 平均频率。这说明，转导的V β 8TCR链在慢性HBV患者和健康供体中都表达良好。图7 (D)显示了来自5个健康人、5个HBeAg+的慢性HBV患者(HBV DNA > IO7个 拷贝 /ml)和 5 个 HBeAg-的慢性 HBV 患者(HBV DNA < IO6 个拷贝 /ml)的 HBcl8-27_A201 特异性五聚体+T细胞的平均频率。这说明，适当配对的转导TCR在慢性HBV患者和健康供 体中都表达良好。图8(A)显示了用HBc 18-27 A201 TCR转导的T细胞的FACS分析，以证实引入的 HBcl8-27TCR是有功能的。将HBcl8_27TCR转导的或模拟转导的T细胞与HLA-A2+T2细胞 (其首先用HBcl8-27肽(“肽")进行脉冲标记并孵育5小时)共培养过夜。然后通过对 IFN- y (左列)、TNF- α (中间列)和IL_2 (右列)的细胞内细胞因子染色来评价T细胞的 功能。在没有肽的情况下，HBcl8-27TCR转导的细胞没有被激活(首行)。经肽脉冲标记 的T2细胞没有激活模拟转导的细胞(中间行)。在与经肽脉冲标记的T2细胞共培养后， HBcl8-27TCR 转导的细胞被刺激产生 IFN-γ、TNF-a 和 IL_2(底行)。CD8+和 CD8_(CD4+T 细胞)都能够产生全部三种细胞因子，这证明了在⑶4+T细胞中引入的TCR的功能和TCR 重定向的细胞的多功能能力。图8(B)显示了来自慢性HBV患者的HBcl8_27TCR转导的T细胞具有与健康供体同 样的功能。显示了来自5个健康人、5个HBeAg+的慢性HBV患者(HBV DNA > IO7个拷贝/ ml)和 5 个 HBeAg-的慢性 HBV 患者(HBV DNA < IO6 个拷贝 /ml)的 IFN- y ,TNF- α 和 IL-2阳性细胞的平均频率。结果显示，用HBcl8-27-A201TCR转导的T细胞变成了多功能的。图9显示了与原始C183T细胞克隆相比，来自健康人和慢性HBV患者的 HBcl8-27TCR转导的T细胞的亲和性。图9 (A)显示了在将正^^+0)8+冊(；18-27110 转导的11细胞和(18311细胞克隆与 用浓度渐增的HBcl8-27肽脉冲标记过的T2细胞共培养5小时后，对IFN- γ染色时的结 果。所示的数据为得自5个健康供体、5个HBeAg+的慢性HBV患者(HBV DNA > IO7个拷贝 /ml)和5个HBeAg-的慢性HBV患者(HBV DNA < IO6个拷贝/ml)的HBcl8_27TCR转导的 T细胞的最大应答的平均百分比，其中当TCR转导的细胞频率变化时C183是100%特异性 的。结果显示，当与原始C183T细胞克隆相比并且识别浓度低至0. 1 lpg/ml的所述表位 时，来源于患者T细胞的CD8+HBcl8-27TCR转导的T细胞的病毒表位的亲和性是相同的。图9 (B)显示了在将正^^+0)4+冊(；18-27110 转导的11细胞和和(18311细胞克隆 与用浓度渐增的HBcl8-27肽脉冲标记过的T2细胞共培养5小时后对IFN- γ染色时的结 果。所示的数据为得自5个健康供体、5个HBeAg+的慢性HBV患者(HBV DNA > IO7个拷 贝/ml)和5个HBeAg-的慢性HBV患者(HBV DNA < IO6个拷贝/ml)的HBcl8_27TCR转导 的T细胞的最大应答的平均百分比，其中当TCR转导的细胞频率变化时C183是100%特异 性的。来源于患者T细胞的⑶4+HBcl8-27TCR转导的T细胞与C183相比敏感度低，但是在 100pg/ml时50%的HBcl8-27特异性T细胞被激活，这表明即使在没有⑶8共同受体的情 况下，引入的HBcl8-27TCR也是高度敏感的。图10显示了与野生型HBcl8-WT_TCR相比，最优化的HBcl8-0pt_TCR的表达。图10(A)为显示来源于模拟转导、HBcl8-WT-TCR转导和HBcl8-0pt_TCR转导的 PBL细胞的νβ 8+T细胞的百分比的直方图。在最优化的HBcl8-TCR转导的细胞与野生型 HBcl8-TCR转导的细胞之间νβ 8+细胞的频率相当。图10(B)显示了对模拟转导、HBcl8-WT-TCR转导和HBcl8-0pt_TCR转导的T细胞 的表达水平的比较。为了比较表达水平，使用V β 8+细胞的平均荧光强度(MFI)。结果显 示，在最优化的TCR转导的细胞与野生型TCR转导的细胞之间V β 8+的表达水平没有显著差异。图10(C)显示了从HBcl8-27HLA_A2特异性五聚体染色获得的结果。来自上述各 组的细胞用抗⑶8和HBcl8-27HLA-A2特异性五聚体染色。结果显示，与野生型TCR相比， 在用HBclS-Opt-TCR构建体转导的T细胞中的五聚体阳性细胞的频率增加了将近两倍，这 说明与野生型序列相比，密码子最优化的构建体可以更加有效地表达Va 3链。图11显示了与HBcl8-WT_TCR构建体相比，在用HBcl8-0pt_TCR转导的T细胞 中IFN-Y阳性细胞的频率增加了。在2yg/ml布雷菲德菌素A存在下，用HLA-A2阳性 T2细胞(用HBcl8-27肽先脉冲标记过的或未脉冲标记过的)刺激模拟转导的T细胞、 HBcl8-WT-TCR转导的T细胞和HBcl8-0pt-TCR转导的T细胞过夜。然后将T细胞用抗 ⑶8PE-Cy7标记并通过细胞内细胞因子染色对IFN- γ染色。结果证明，与用HBcl8-WT_TCR 转导的T细胞相比，用HBclS-Opt-TCR转导的IFN-γ阳性T细胞的频率增加了将近两倍。 五聚体阳性细胞的增加与能够应答肽装载的靶T细胞的功能细胞的增加相关。图 12 (A)将表达 HLA-A0201、HLA-A0206 或 HLA-A0207 亚型的 EBV 转化 B 细胞负载 浓度渐增的HBV基因型A/D HBcl8-27表位(所述序列在表1中提供)，并且与HBc-18_27TCR转导的T细胞共培养5小时。通过对IFN-γ进行细胞内细胞因子染色来测量T细胞的激 活。结果显示，HBc-18-27TCR转导的T细胞识别由多种HLA-A2亚型呈递的HBcl8_27表位。图 12 (B)将表达 HLA-A0201、HLA-A0206 或 HLA-A0207 亚型的 EBV 转化 B 细胞负载 浓度渐增的HBV基因型B/C HBcl8-27表位(所述序列在表1中提供)，并且与HBc-18_27TCR 转导的T细胞共培养5小时。通过对IFN-γ进行细胞内细胞因子染色来测量T细胞的激 活。结果显示，HBc-18-27TCR转导的T细胞识别由多种HLA-A2亚型呈递的HBcl8_27表位。图12(C)显示了在将HLA-A2+T2细胞负载HBcl8_27表位的各种突变肽并且与 HBc-18-27TCR转导的T细胞共培养5小时时的结果。通过对IFN-γ进行细胞内细胞因 子染色来测定突变肽的T细胞识别。所述突变肽的序列在表1中提供。从结果可以看出， HBc-18-27TCR转导的T细胞识别HBcl8_27表位的各种突变体。Unstim 1和Unstim 2指 其中HLA-A2+T2细胞未负载任何突变肽的对照组。图13 (A)在碘化丙锭(PI)存在下以1 1的效应子标靶比值将来源于各患者组 (健康人、HBeAg㈠、HBeAg⑴)的TCR转导的T细胞与DiOC标记的表达完整HBV基因组的 H印G2细胞(HBV-H印G2)或者对照亲代细胞系(Ctrl-Η印G2)共培养6小时。濒死的靶细 胞为DiOC+/PI+。结果是3次实验的代表。在用肽脉冲标记过的T2细胞刺激后，通过细胞 内细胞因子染色确定，效应T细胞被认为是IFN- γ +/⑶8+细胞。该结果显示，HBcl8-27TCR 转导的T细胞能够杀死内源性表达HBV蛋白的HCC细胞系或者载有HBV 18-27肽的HCC细 胞系。图13 (B)将DiOC标记的HCC细胞系0fepG2、SNU-387、SNU-368)负载浓度渐增的 HBcl8-27肽，并且在碘化丙锭(PI)存在下以1 1的效应子标靶比值与HBc-18_27TCR转 导的T细胞共培养6小时。濒死的靶细胞为DiOC+/PI+。结果是3次实验的代表。在用肽脉 冲标记过的T2细胞刺激后，通过细胞内细胞因子染色确定，效应T细胞被认为是IFN-Y+/ ⑶8+细胞。该结果显示，HBcl8-27TCR转导的T细胞能够杀死多种HLA-A2+HCC细胞系。图14(A)显示了 E10-1D T细胞克隆或者HBs370_79TCR转导的T细胞识别载有 HBs370-79表位的HLA-A2+T2细胞。根据实施例10提供的方法制备E10-1D T细胞克隆。 将T2细胞负载浓度渐增的HBs370-79肽，并将其与E10-1D或HBs370_79TCR转导的T细胞 共培养5小时并对IFN-Y染色。数据显示为最大应答的百分比以将各细胞系的不同频率 标准化的。该结果显示，HBs370-79特异性TCR是功能性的。图14(B)显示了 HBs370-79TCR转导的T细胞识别HBs370_79表位的基因型变体 (所述基因型变体的序列在表2中提供)。将HBs370-79TCR转导的T细胞与载有1 μ g/ ml各种基因型的肽的HLA-A2+T2细胞共培养5小时，并且通过⑶107a标记和对IFN- γ染 色来评价激活作用。基因型A&D序列是相同的。该结果显示，HBs370-79特异性TCR识别 HBs370-79表位的基因型变体。
具体实施例方式为了方便起见，在本说明书中提到的参考文献以文献参考表的形式列出并且添加 到实施例结尾处。所述参考文献的全部内容在此通过引用的方式并入。定义为了方便起见，将说明书、实施例和所附权利要求书中采用的特定术语集中于此。
术语“包含/包括”在本文中被定义为在实施本发明的过程中可以结合使用各种 组分、成分或步骤的情况。因此，术语“包含/包括”涵盖了限制性更强的术语“主要由…组 成”和“由…组成”。当采用术语“主要由…组成”时，应理解为，根据本发明的外源TCR多肽和/或多 核苷酸“主要”包含指明的序列作为“主要”成分。在5'端和/或在3'端可以包含其它 序列。因此，相对于偶然包含序列X的已知多肽，“主要由序列X组成”的多肽将是新型的。当采用术语“由…组成”时，应理解为，根据本发明的多肽和/或多核苷酸与至少 一种指明的序列(例如用SEQ ID号表示的特定序列或者其同源序列或片段)相对应。术语“外源T细胞受体”(TCR)在本文中被定义为通过引入外源TCR编码序列在细 胞中表达的重组TCR。具体而言，HBV表位反应性TCR可以在其中没有天然表达TCR或者表 达TCR的水平不足以诱导细胞应答的细胞中表达，或者当TCR配体结合时在应答细胞中表 达。术语“片段”在本文中被定义为HBV表位反应性外源TCR的完整序列的不完全部 分或分离部分，其包含使所述序列具有HBV表位反应性外源TCR的特性和功能的活性部位。 具体而言，其可比完整序列短至少一个核苷酸或氨基酸。更具体而言，所述片段包含使HBV 表位反应性外源TCR能够识别HBc 18-27表位和/或HBs370_79表位的活性部位。术语“HBV表位反应性T细胞受体(TCR) ”在本文中被定义为这样的TCR，其在主要 组织相容性复合体(MHC)分子环境下与HBV表位结合从而在表达重组TCR的细胞中诱导产 生辅助子或细胞毒性应答。具体而言，所述HBV表位可为HBcl8-27。更具体而言，所述HBV 表位可包含SEQ ID N0:25的序列。所述HBV表位可为HBs370_79。更具体而言，所述HBV 表位可包含 SEQ ID NO 56, SEQ ID NO 57 或 SEQ ID NO 58 的序列。术语“HBcl8-27表位”在本文中被定义为能够刺激HLA I类限制性T细胞的表位。 其可在本发明中以HBc 18、HBc 18-27、HBc 18-27肽和所述肽互换使用。所述表位的序列可 为“FLPSDFFPSV”(SEQ ID NO :25)。在本发明中，除非另作说明，术语HBcl8_27用来指SEQ ID N0:25序列在白种人中普遍的基因型A/D的HBcl8-27表位。与该表位结合的T细胞受 体的区域被称为HBcl8-27TCR或HBcl8TCR。术语“HBs370_79表位”在本文中被定义为能够刺激HLA I类限制性T细胞的表 位。所述表位的序列可为“SIVSPFIPLL”(SEQ ID NO :56)。在本发明中，除非另作说明，术 语HBs370-79用来指SEQ ID NO 56序列在白种人中普遍的基因型A/D的HBcl8_27表位。 与表位结合的T细胞受体的区域被称为HBs370-79TCR。术语“免疫治疗有效量”在本文中被定义为在受试对象体内带来免疫介导的预防 或治疗效果的量，即，与治疗前的症状相比或者与适合的对照相比，将防止或减少至少50%
症状的量。术语“分离的”在本文中被定义为一种生物学成分(如核酸、肽或蛋白质)，其实质 上已经从在天然产生所述成分的生物体的细胞中的其它生物学成分(即其它的染色体和 染色体外的DNA和RNA以及蛋白质)中分离出来、单独制备或者纯化出来。已被分离的核 酸、肽和蛋白质因此包括用标准纯化方法纯化的核酸和蛋白质。该术语还涵盖通过在宿主 细胞中重组表达而制备的核酸、肽和蛋白质以及化学合成的核酸。术语“可操作地连接”在本文中被定义为在调节序列(如启动子和/或转录因子结合位点的排列)与第二核酸序列之间的功能连接，其中，所述调节序列控制与第二序列 对应的核酸的转录。术语TCR表位的“突变体”或“突变型”在本文中被定义为这样一种“突变体”或 “突变型”，其具有至少一个氨基酸序列，该氨基酸序列通过置换、缺失或添加至少一个氨基 酸而与至少一个参照病毒编码序列不同，但保留了结合和激活由非突变表位结合并激活的 TCR的能力。具体而言，所述突变体可天然产生或者可以重组或合成的方式产生。术语“可溶性TCR”在本文中被定义为膜结合TCR(其为负责T细胞识别对其具有 特异性抗原的分子)的可溶(分泌)型。在其可溶性型中，除了它识别与MHC分子有关的 肽片段而抗体识别在整个蛋白上的决定簇外，它类似于单克隆抗体。具体而言，本发明的分 离多肽可用于使用本领域中任何已知的方法制备可溶性TCR。更具体而言，所述可溶性TCR 可与HBV的HBc 18-27和/或HBs370_79表位结合。术语“受试对象”在本文中被定义为脊椎动物，尤其是哺乳动物，更尤其是人。为 了研究的目的，所述受试对象具体可为至少一种动物模型，例如，小鼠、大鼠等。具体而言， 对于动物模型，可以基于物种选择TCRa链和β链的序列。在一些情况下，也可以使用表 达人MHC分子的转基因动物来评价本发明的特定实施方式。本领域技术人员将理解，根据本文给出的方法，在没有进行过度实验的情况下就 可以实施本发明。方法、技术和化学药品记载在给出的参考文献中或者来自标准生物技术 和分子生物学教科书中的方案。在本发明的一个实施方式中，提供了至少一种分离细胞，其包含至少一种HBV表 位反应性外源T细胞受体(TCR)和/或其片段。这种细胞可适用于过继转移方案从而提供 特别有效的治疗模式。本发明的分离细胞可以克服HBV特异性CD8+和CD4+细胞(可在慢 性HBV感染的患者体内存在)的缺失和功能欠佳的问题。具体而言，来源于HBV感染症状 消退的患者的TCR可用于重定向慢性HBV患者的淋巴细胞对TCR转移的特异性。具体而言，HBV反应性TCR可以通过用一种或多种编码功能性α链和/或β链 的多核苷酸和/或功能性α链和/或β链的多肽(其可以组装形成至少一种功能性HBV 表位反应性TCR)转化或转导至少一种分离细胞而制备。具体而言，所述分离细胞可以使用 本领域中已知的任何技术分离。更具体而言，可以使用至少一种细胞分离试剂盒、菲可帕克 (Ficoll-Paque)密度梯度离心、BD FACSAria细胞分选系统等分离细胞。所述分离细胞可为至少一种自身细胞，S卩，它们可来源于至少一种可接受所制得 的转导或转化细胞的受试对象。具体而言，所述分离细胞可来源于受试对象的外周血淋巴 细胞和/或造血干细胞。更具体而言，所述分离细胞可为至少一种T细胞，该T细胞天然地表达至少一种 ⑶4+细胞表面标记，表达至少一种⑶8+细胞表面标记，同时表达⑶4+和⑶8+标记，或者 既不表达CD4+细胞表面标记又不表达CD8+细胞表面标记。具体而言，根据本发明的细胞 可为至少一种还天然地表达至少一种TCR的T细胞。所述HBV反应性外源TCR可以与天然 表达的TCR相同的表位结合，和/或可以结合不同的表位。具体而言，所述HBV反应性外源 TCR可以在至少一种细胞中被表达，在该细胞中，TCR可以没有被天然表达或者当与TCR配 体结合时，表达TCR的水平可能不足以诱导该细胞的应答或应答细胞的应答。具体而言，根 据本发明的分离细胞可以用两种或更多种不同的HBV反应性外源TCR(即与两种或更多种不同的HBV表位结合的TCR)来转导。已经清除了他们的病毒感染的HBV感染患者可以提供表达高亲和性TCR的HBV反 应性T细胞的优异来源。具体而言，所述HBV表位反应性TCR可以通过从至少一个HBV感染 的无病毒血症个体(aviremic individual)中分离至少一种HBV反应性T细胞并且从HBV 反应性T细胞克隆编码TCR的α链和β链的多核苷酸序列而制备。一旦使用本领域中已 知的标准方法克隆了这些序列，就可以将所述序列递送到至少一种分离细胞并且在适合分 离细胞表达TCR的条件下孵育所述分离细胞。更具体而言，所述适合条件可以包括标准细 胞培养条件。当在体外或离体表达TCR时，如本领域中已知的和如下举例说明的，除了其它 的目的参数以外，还可以针对与HBV表位的反应性评价表达TCR的细胞。在一些方案(即 其中可以向至少一种受试对象施用载体的那些方案)中，还可以在体内表达TCR从而向至 少一种需要治疗的受试对象(即患有急性或慢性HBV感染或者HBV并发症的至少一种受试 对象)提供治疗作用。根据本发明的HBV反应性TCR在它们可被表达的分离细胞中可以是有功能的。具 体而言，它们可为与在至少一种I类或II类MHC分子背景下识别至少一种HBV表位的⑶3 复合物有关的α和β TCR链的功能性异源二聚体。在人类中，至少一种表位的MHC限制可 取决于由至少一种抗原呈递细胞表达的至少一种特定的人白细胞抗原(HLA)。在本发明中 可以使用可识别受任何 HLA 型(即 HLA-A、HLA-B, HLA-C, HLA-DPAU HLA-DPBU HLA-DQAU HLA-DQBU HLA-DRA和HLA-DRB1)限制的HBV表位的HBV反应性TCR。为了研究的目的，所 述HBV反应性TCR在除了人类以外的至少一种物种(例如，Η-2Κ小鼠)的至少一种MHC分 子背景下可以识别至少一种HBV表位。具体而言，所述HBV反应性TCR识别的HBV表位可为HLA-A2限制性的。总人口的 大约50%表达MHC I类分子HLA-A2，即一种HLA-A血清型。因此，HLA-A2-限制性TCR可 具有普遍的治疗用途。具体而言，该亚型可以识别许多HLA-A*02等位基因的基因产物，包 括HLA-A*0201、*0202、*0203、*0206和*0207的基因产物。在白种人群和亚洲人群间的亚 型可存在明显的差异。然而，超过95%的HLA-A2阳性白种人群是HLA-A0201，HLA_A2阳性 中国人群可划分为23% HLA-A0201 ；45% HLA-A0207 ；8% HLA-A0206 ；23% HLA-A0203。本发明的TCR可为HBV表位反应性的。可以在In immunodominance :The choice of the Immune System, J. A. Frelinger, ed(ffeinheim :ffiley-VCH)的书中第 11 章(病原 体对免疫系统的影响病毒性肝炎)第233页中找到已知的免疫反应性HBV表位和它们的 序列的列表，该书通过引用的方式将其并入本文。所述HBV表位可以包含至少一种核心抗 原、包膜抗原、表面抗原和/或它们的突变体。具体而言，所述HBV表位可以包含至少一种乙型肝炎核心抗原和/或其突变体。更 具体而言，所述HBV表位可以包含HBc 18-27和/或其突变体。所述HBc 18-27表位可以包 含“FLPSDFFPSV”(SEQ ID NO 25)或其突变体。此外，存在于可以包含“FLPSDFFPSV”(SEQ ID NO 25)的基因型A和D(它们在欧洲是最普遍的)中的HBcl8_27表位不同于可以包含 “FLPSDFFPSI”(SEQ ID NO 26)的基因型B和C (它们在亚洲是最普遍的)的HBcl8_27表 位。具体而言，所述HBV表位可以包含至少一种乙型肝炎包膜抗原和/或其突变体。更 具体而言，所述HBV表位可以包含HBs370-79和/或其突变体。所述HBs370_79表位可以包含“SIVSPFIPLL”(SEQ ID NO 56)或其突变体。此夕卜，存在于可以包含“SIVSPFIPLL”(SEQ ID NO 56)的基因型A和D (它们在欧洲是最普遍的)中的HBs370_79表位不同于可以包含 “NILSPFMPLL”(SEQ ID NO 57)的基因型 B 的 HBs370_79 表位和可以包含“NILNPFLPLL”(SEQ ID NO 58)的基因型C(它们在亚洲是最普遍的)的HBs370-79表位。具体而言，根据本发明的细胞可以进一步包含至少一种第二 HBV表位反应性外源 TCR和/或其片段，其中，所述第二 HBV反应性外源TCR可为与第一表位相同的表位，或者为 与第一 HBV表位不同的表位。具体而言，第二 HBV表位可为HBs370-79，并且第一表位可为 HBc 18-27。所述外源TCR可以包含至少一条α链，该α链包含选自序列SEQ ID NO :9、SEQ ID Ν0:10和SEQ ID NO :11和/或它们的突变体中的至少一种氨基酸序列。具体而言，所 述外源TCR包含至少一条α链，该α链包含序列SEQ ID NO :9、SEQ ID NO 10和SEQ ID NO =Il0更具体而言，所述α链包含全部三种序列SEQ ID NO :9、SEQ ID N0:10和SEQ ID NO :llo所述α链可以连续地包含SEQ ID NO :9、SEQ ID N0:10禾口 SEQ ID N0:11的序列。 具体而言，所述α链可以主要由序列SEQ ID N0:9、SEQ ID N0:10和SEQ ID N0:11组成。 在表1和2中给出本发明所用的全部序列。所述外源TCR可以进一步包含至少一条β链，该β链包含选自序列SEQ ID NO 21、SEQ ID Ν0:22和SEQ ID NO :23和/或它们的突变体中的至少一种氨基酸序列。具体 而言，所述β链可以包含全部三种序列:SEQ ID NO :21、SEQ ID NO :22和SEQ ID NO :23。 具体而言，所述β链可以连续地包含SEQ ID NO :2USEQ ID N0:22和SEQ ID NO :23的序 列。更具体而言，所述β链可以主要由序列SEQ ID NO :21、SEQ ID NO 22和SEQ ID NO 23组成。具体而言，所述外源TCR可以包含至少一条与SEQ ID NO 12或其片段具有至少 80%的氨基酸同一性的α链和/或至少一条与SEQ ID NO 24或其片段具有至少80%的 氨基酸同一性的β链。具体而言，所述α链和β链与SEQ ID Ν0:12和SEQ ID NO :24的 同一性可分别为至少约85%、至少约90%或者至少约95%。更具体而言，所述α链可以包 含全部SEQ ID NO :9、SEQ ID NO 10和SEQ ID NO 11序列，并且所述β链可以包含全部 SEQ ID N0:21、SEQ ID NO 22 禾口 SEQ ID N0:23 序列。所述外源TCR可以包含至少一条α链，该α链包含选自序列SEQ ID NO :44、SEQ ID N0:45和SEQ ID NO :46和/或它们的突变体中的至少一种氨基酸序列。具体而言，所 述外源TCR包含至少一条α链，该α链包含序列SEQ ID NO 44、SEQ ID NO 45和SEQ ID NO :46ο更具体而言，所述α链可以包含全部三种序列SEQ ID NO 44、SEQ ID NO :45和 SEQ ID NO :46。所述 α 链可以连续地包含 SEQ ID NO :44、SEQ ID NO 45 和 SEQ ID NO 46的序列。具体而言，所述α链可以主要由序列SEQ ID NO 44、SEQ ID NO 45和SEQ ID NO 46组成。在表1和2中给出本发明所用的全部序列。所述外源TCR可以进一步包含至少一条β链，该β链包含选自序列SEQ ID NO 52、SEQ ID Ν0:53和SEQ ID NO :54和/或它们的突变体中的至少一种氨基酸序列。具体 而言，所述β链可以包含全部三种序列SEQ ID NO :52、SEQ ID NO 53和SEQ ID NO :54。 具体而言，所述β链可以连续地包含SEQ ID NO 52,SEQ ID Ν0:53和SEQ ID NO 54的序 列。更具体而言，所述β链可以主要由序列SEQ ID NO :52、SEQ ID NO 53和SEQ ID NO 54组成。具体而言，所述外源TCR可以包含至少一条与SEQ ID NO :47或其片段具有至少 80%的氨基酸同一性的α链和/或至少一条与SEQ ID NO 55或其片段具有至少80%的 氨基酸同一性的β链。具体而言，所述α链和β链与SEQ ID Ν0:47和SEQ ID NO :55的 同一性可分别为至少约85%、至少约90%或者至少约95%。更具体而言，所述α链可以包 含全部SEQ ID NO 44,SEQ ID NO 45和SEQ ID NO :46序列，并且所述β链可以包含全部 SEQ ID NO :52、SEQ ID NO 53 和 SFQ ID NO 54 序列。编码α链和β链的序列已经分别被确定为用于针对HBV表位HBcl8_27和/或 HBs370-79反应的TCR的至少一个高效重排的α链和β链的氨基酸序列。更具体而言，所述针对HBV表位HBcl8_27反应的外源TCR可以包含至少一条SEQ ID Ν0:12的α链和/或至少一条SEQ ID NO :24的β链。甚至更具体而言，所述针对HBV 表位HBcl8-27反应的外源TCR可以主要由至少一条SEQ ID Ν0:12的α链和至少一条SEQ ID Ν0:24的β链组成。所述针对HBV表位HBcl8-27反应的外源TCR可以由至少一条SEQ ID Ν0:12的α链和至少一条SEQ ID NO :24的β链组成。具体而言，所述针对HBV表位 HBcl8_27反应的外源TCR可以由两条α链和两条β链组成。更具体而言，所述针对HBV表位HBS370-79反应的外源TCR可以包含至少一条SEQ ID Ν0:47的α链和/或至少一条SEQ ID NO :55的β链。甚至更具体而言，所述针对HBV 表位HBs370-79反应的外源TCR可以主要由至少一条SEQ ID NO :47的α链和至少一条 SEQ ID Ν0:55的β链组成。所述针对HBV表位HBs370_79反应的外源TCR可以由至少一 条SEQ ID N0:47的α链和至少一条SEQ ID NO :55的β链组成。具体而言，所述针对HBV 表位HBs370-79反应的外源TCR可以由两条α链和两条β链组成。可以使用Karlin 和 Altschul 的运算法则(Proc. Natl. Acad. Sci. 87 2264-68(1990)，modified Proc. Natl. Acad. Sci. 90 :5873_77 (1993))确定同一性百分比。 这种运算法则被加入到BLASTx程序中，其可以用于获得与参照多肽同源的氨基酸序列。本 发明还可以涵盖具有包括保守氨基酸置换的氨基酸序列的TCRa链和β链。这种置换在 本领域中是众所周知的。根据另一个实施方式，本发明提供了至少一种分离多核苷酸，其包含至少一种编 码至少一条α链的序列和/或至少一种编码至少一条β链的序列，其中，所述被编码的α 链和β链可以是至少一种HBV表位反应性TCR的一部分。具体而言，所述编码α链的序列包含选自SEQ ID NO :1和SEQ ID NO :5中的至少 一种序列、选自SEQ ID NO :2和SEQ ID NO 6中的至少一种序列以及选自SEQ ID NO :3和 SEQ ID NO :7中的至少一种序列，和/或所述编码β链的序列包含选自SEQ ID Ν0:13和 SEQ ID NO :17中的至少一种序列、SEQ ID Ν0:14禾口 SEQ ID NO :18中的至少一种序列以及 选自SEQ ID Ν0:15和SEQ ID NO :19中的至少一种序列。更具体而言，所述编码α链的序 列可包含SEQ ID N0:5、SEQ ID NO :6和SEQ ID N0:7，和/或所述编码β链的序列可包含 SEQ ID NO: 17、SEQ ID NO: 18 禾口 SEQ ID NO: 19。具体而言，所述编码HBc-18-27表位反应性TCR的α链的序列可以与SEQ ID NO 4或SEQ ID NO :8具有至少80%的序列同一性，和/或所述编码HB c_18_27表位反应性 外源TCR的β链的序列可以与SEQ ID Ν0:16或SEQ ID NO :20具有至少80%的序列同一性。具体而言，所述编码α链和β链的序列与SEQ ID NO :4或SEQ ID NO 8以及SEQ ID NO 16或SEQ ID NO 20的同一性可分别为至少约85%、至少约90%或者至少约95%。更 具体而言，所述编码α链的序列可选自SEQ ID NO :4和SEQ ID NO 8中，和/或所述编码 β链的序列可选自SEQ ID Ν0:16和SEQ ID Ν0:20中。所述HBc-18-27表位反应性外源 TCR可以包含两条由SEQ ID NO :8序列编码的α链和两条由SEQ ID Ν0:20序列编码的β 链。更具体而言，所述α链和β链可以由包含分别在SEQ ID NO :4或SEQ ID NO 8以及 SEQ ID NO :16或SEQ ID NO 20中所示的连续序列的核苷酸序列编码。甚至更具体而言，所述外源TCR可以主要由至少一条由SEQ ID NO :4或SEQ ID Ν0:8编码的α链和至少一条由SEQ ID Ν0:16或SEQ ID NO :20编码的β链组成。所述 外源TCR可以由至少一条由SEQ ID NO :4或SEQ ID NO :8编码的α链和至少一条由SEQ ID Ν0:16或SEQ ID NO :20编码的β链组成。具体而言，所述外源TCR可以由两条由SEQ ID NO :4或SEQ ID Ν0:8编码的α链和两条由SEQ ID Ν0:16或SEQ ID Ν0:20编码的β 链组成。具体而言，所述编码的α链的序列包含SEQ ID NO :40、SEQ ID NO 41和SEQ ID NO :42，和 / 或所述编码 β 链的序列包含 SEQ ID NO 48、SEQ ID NO 49 禾口 SEQ ID NO :50。更具体而言，所述编码HBs370_79表位反应性外源TCR的α链的序列可与SEQ ID NO 43具有至少80%的序列同一性，并且编码HBs370-79表位反应性外源T细胞受体的β 链的序列与SEQ ID NO :51具有至少80%的序列同一性。具体而言，所述编码α链和β链 的序列与SEQ ID NO 43和/或SEQID NO 51的同一性可分别为至少约85%、至少约90% 或者至少约95%。更具体而言，所述编码α链的序列可为SEQ ID NO 43和SEQ ID NO: 51，和/或所述编码β链的序列可为SEQ ID Ν0:51。所述HBs370_79表位反应性外源TCR 可以包含两条由序列SEQ ID N0:43编码的α链和两条由SEQ IDNO :51编码的β链。更 具体而言，所述α链和β链可以由包含分别在SEQ IDN0:43和SEQ ID NO :51中所示的连 续序列的核苷酸序列编码。根据另一个实施方式，本发明提供了至少一种由本发明的多核苷酸编码的分离多 肽。根据还一个实施方式，本发明提供了至少一种分离多肽，其包含选自SEQ ID NO 9,SEQ ID N0:10和SEQ ID NO :11中的至少一种氨基酸序列。具体而言，所述多肽可与SEQ ID NO :12具有至少80%的氨基酸同一性。更具体而言，所述多肽与SEQ ID N0:12的同一 性可为至少约85%、至少约90%或者至少约95%。本发明还提供了至少一种分离多肽，其包含选自SEQ ID NO 44,SEQ ID NO 45和 SEQ ID NO :46中的至少一种序列。具体而言，所述多肽可与SEQ ID N0:47具有至少80% 的氨基酸同一性。更具体而言，所述多肽与SEQ ID NO :47的同一性可为至少约85%、至少 约90%或者至少约95%。所述多肽可以进一步包含选自SEQ ID NO :21、SEQ ID NO :22禾口 SEQ ID NO 23中 的至少一种序列。具体而言，所述额外序列可与SEQ ID NO :24具有至少80%的氨基酸同一 性。更具体而言，所述其它序列与SEQ ID NO :24的同一性可为至少约85%、至少约90%或 者至少约95%。甚至更具体而言，所述多肽可以包含分别在SEQ ID N0:12和SEQ ID NO: 24中所示的氨基酸的连续序列。
所述多肽可以进一步包含选自SEQ ID NO 52,SEQ ID NO :53禾口 SEQ ID NO 54中 的至少一种其它序列。具体而言，所述额外序列可与SEQ ID NO :55具有至少80%的氨基 酸同一性。更具体而言，所述其它序列与SEQ ID NO :55的同一性可为至少约85%、至少约 90%或者至少约95%。甚至更具体而言，所述多肽可以包含分别在SEQ ID NO 47和SEQ ID NO 55中所示的氨基酸的连续序列。根据本发明的多肽可为至少一种HBV表位反应性外源TCR。具体而言，所述多肽的 功能可以等同于特定的示例性TCR序列的功能，该TCR序列可以通过单个或多个氨基酸置 换、通过氨基酸的添加和/或缺失而被修饰或者其中一个或多个氨基酸已被化学修饰，但 是无论怎样修饰其仍然保留了本发明的TCR蛋白对HBV表位的结合特异性和高亲和性结合 活性。具体而言，所述HBV表位可为HBcl8-27、HBs370-79和/或它们的突变体。更具体而 言，所述多肽可为至少一种可溶性TCR。甚至更具体而言，所述可溶性TCR蛋白可以缺少天 然细胞结合的TCR的部分并且在溶液中可以是稳定的(也就是，当如本文所述进行处理时 以及在用于蛋白质溶液的标准条件下其在溶液中通常不聚集)。所述可溶性TCR可以通过本领域中已知的任何方法制备。可用于制备可溶性TCR 的方法的实例可以包括但不限于构建聚合受体链，其中，可以用TCRa和β可变区置换来 自至少一种磷酸胆碱特异性抗体的免疫球蛋白重链可变区；在TCR跨膜区域的上游引入翻 译终止密码子或者用用于来自GPI连接蛋白Thy-I的羧基末端的糖基磷脂酰肌醇(GPI)连 接的信号替代TCRa和β链cDNA的跨膜区。所述可溶性TCR可与至少一种抗病毒药连接。所述抗病毒药可为HBV靶向性药 物。例如，抗病毒药可以包括但不限于，阿德福韦二匹伏酯、干扰素α _2b、聚乙二醇干扰素 α-2a、拉米夫定、恩替卡韦、替比夫定(telbivudine)等等。具体而言，所述可溶性TCR可通过本领域中已知的任何方法与抗病毒药连接 以形成可溶性TCR-药物偶联物。所述连接可为将可溶性TCR共价结合到药物部分的 含有共价键或原子链的化学部分。连接体可包括二价基团，例如，亚烷基、亚芳基、杂 亚芳基、如下部分-(CR2)n0(CR2)n-;烷氧基的重复单元(如聚氧化乙烯、PEG、聚甲 醚(polymethyleneoxy))和烷基氨基的重复单元(如聚乙烯胺(polyethyleneamino)， Jeffamine )；以及包括琥珀酸酯、琥珀酰胺、二甘醇酸酯、丙二酸酯、己酰胺等的二酸酯和 酰胺。根据一个实施方式，本发明提供了至少一种构建体，其包含与至少一种启动子可 操作地连接的本发明的多核苷酸。TCR的α链和β链的编码序列可与至少一种在分离细 胞中有功能的启动子可操作地连接。适合的启动子可为组成型和诱导型启动子，并且本领 域技术人员可很好地选择合适的启动子。例如，适合的启动子可包括但不限于，逆转录病毒 的LTR、SV40启动子、CMV启动子和细胞启动子(例如，β -肌动蛋白启动子)。根据另一个实施方式，本发明提供了至少一种载体，其包含根据本发明的构建体 或者根据本发明的多核苷酸。具体而言，所述载体可包括但不限于，慢病毒载体、逆转录病 毒载体、腺病毒载体、腺伴随病毒载体和单纯疱疹病毒载体。更具体而言，如实施例中所述， 可以使用逆转录病毒载体来在体外、离体或体内递送所述构建体。根据又一个实施方式，本发明提供了至少一种T细胞，其包含根据本发明的载体、 构建体或多肽。
根据一个实施方式，本发明提供了制备至少一种T细胞的至少一种方法，所述T 细胞包含至少一种HBV表位反应性外源TCR，用于递送到至少一种受试对象，该方法包括用 本发明的构建体和/或载体转导至少一种从受试对象中分离的T细胞。可以使用本领域 技术人员已知的多种方法将根据本发明的构建体或载体递送到体外、离体或体内细胞中。 例如，如果所述细胞为体外或离体细胞，可根据标准方案(例如在Molecular Cloning =A Laboratory Manual, 3d ed.，Sambrook and Russell, CSHL Press (2001)中所述的那些方 案，该书通过引用的方式并入本文)对其转化或转导。方法的实例可包括但不限于，CaCl2 化学法、电穿孔法等。具体而言，根据本发明构建体可被递送到体内细胞中。适合的递送 多核苷酸构建体的方法是本领域中已知的，并且可包括但不限于，病毒载体、纳米颗粒、脂 质“核酸复合物(Iipoplex)和/或多聚物-核酸复合物(polyplex)。根据另一个实施方式，本发明提供了制备至少一种HBV表位反应性外源TCR的至 少一种方法，该方法包括(a)从至少一种消退了 HBV感染症状的HBV感染个体中分离至少一种HBV表位反 应性T细胞；(b)由步骤(a)的HBV表位反应性T细胞克隆编码至少一种TCR的至少一条α链 和/或β链的至少一种多核苷酸序列；(c)将步骤(b)的多核苷酸序列递送至至少一种细胞；和(d)在适合由所述细胞表达所述HBV表位反应性外源T细胞受体的条件下孵育该 细胞。具体而言，上述步骤(a)的HBV表位反应性T细胞可为HBcl8_27表位反应性的和 /或HBs370-79表位反应性的。根据一个实施方式，本发明提供了根据本发明的所有实施方式的至少一种细胞、 至少一种载体和/或至少一种多肽，用于治疗HBV感染和/或HBV相关的肝细胞性肝癌的 用途。根据另一个实施方式，本发明提供了在至少一种受试对象中治疗HBV和/或抑制 HBV复活的至少一种方法，该方法包括向受试对象施用至少一种免疫治疗有效量的根据本 发明的任何实施方式的细胞、至少一种载体和/或至少一种多肽。另外，所述HBV-TCR重定向方法可以应用在患有肝细胞性肝癌(HCC)的患者中。 HBV慢性感染对发展成这种肝肿瘤来说是最重要的危险因子，并且在肿瘤转化细胞中频繁 地发生HBV-DNA整合到肝细胞中。采用传统化学疗法、放射或手术切除治疗HCC具有极大 的局限性。HBV特异性T细胞可以识别并杀死表达HBV抗原的HCC细胞，并且HBV-TCR-重 定向T细胞的过继转移可以使HCC退化。在鼻咽癌、表达Epstein-Barr病毒(EBV)蛋白的 肿瘤中得到了这种结果，其中灌输EBV特异性CD8+细胞显示了有价值的结果。因此包含编 码TCR的多核苷酸的载体和/或包含至少一种HBV表位反应性TCR的细胞可用于治疗HCC。因此，本发明提供了在至少一种受试对象中治疗HBV相关的肝细胞性肝癌的至少 一种方法，该方法包括向受试对象施用至少一种免疫治疗有效量的根据本发明的任何实施 方式的细胞、至少一种载体和/或至少一种多肽。可以向受试对象适当地施用如上所述制备的包含编码TCR的多核苷酸的载体和/ 或包含至少一种HBV表位反应性TCR的细胞以治疗受试对象体内的急性或慢性HBV感染或并发症(包括，例如，肝细胞性肝癌)。可以向至少一种受试对象预防性地施用表达HBV表位反应性TCR的细胞、包含编 码HBV表位反应性TCR的多核苷酸的载体和/或编码HBV表位反应性TCR的多肽以抑制HBV 感染的再激活。具体而言，可以将本发明的载体施用到来自至少一种受试对象的离体细胞 中。更具体而言，多核苷酸和/或病毒载体的施用方式将是特定地和/或主要地将TCR编 码序列递送到T细胞和/或造血干细胞中的那些方式。当为逆转录病毒载体时，可以预见， 适合的剂量将在约0. 1 μ g/106个细胞至约10 μ g/106个细胞的范围内，例如，在约1 μ g/106 个细胞至约5 μ g/106个细胞的范围内。更具体而言，与治疗前的症状相比或者与适合的对 照相比，这种剂量可以防止或减少至少50%的HBV相关症状。即使没有治愈，用根据本发明 的至少一种逆转录病毒载体进行治疗也可以减轻或减缓HBV感染和/或至少一种并发症， 和/或可以降低发展成慢性HBV并发症的发生率。具体而言，可以使用该治疗来治愈或预 防急性或慢性HBV感染或包括肝细胞性肝癌的并发症。具体而言，构成要被施用的免疫治疗有效量的细胞的细胞数量取决于要被治疗的 受试对象。其可以取决于但不限于，个体的免疫系统承载TCR介导的免疫反应的能力、患者 的年龄、性别和重量以及被治疗病症的严重性。对于至少一种个体的预防或治疗方法，变量 的数目可以很大，并且可用的剂量范围相当大。具体而言，可以按至少5X IO5个细胞/kg体 重至IX IOltl个细胞/kg体重来施用细胞。更具体而言，可以施用5 X IO6个细胞/kg体重 至IX IO8个细胞/kg体重。要向受试对象施用的细胞和/或病毒载体的最大剂量可为不 会引起不希望和/或不能耐受的副作用的最高剂量。还可以预期并且可以根据常规方案确 定适合的初始施用和附加治疗的方法。根据另一个实施方式，本发明提供了根据本发明的任一实施方式的至少一种细 胞、至少一种载体和/或至少一种多肽在制备用于治疗HBV感染和/或HBV相关的肝细胞 性肝癌的药物中的至少一种用途。适合的固体或液体药物制剂形式可为，例如，颗粒剂、粉剂、片剂、包衣片剂、(微) 胶囊、栓剂、糖浆剂、乳剂、混悬剂、霜剂、气雾剂、滴剂或安瓿剂形式的可注射溶液，并且还 可以是使活性化合物缓释的制剂，如上所述，在所述制剂中常规使用赋形剂和添加剂和/ 或助剂，如崩解剂、粘合剂、包衣衣料、溶胀剂、润滑剂、调味料、增甜剂或增溶剂。所述药物 可适合用于多种药物递送系统。根据一个实施方式，本发明提供了诊断能够使HBV感染症状消退的至少一种受试 对象的至少一种体外方法，该方法包括(a)从至少一种受试对象中采集至少一种样本；(b)检测至少一种多核苷酸的存在，所述多核苷酸包含选自SEQ ID NO :4、SEQ ID NO :8、SEQ ID NO 16 和 SEQ ID NO :20、SEQ ID NO :43、SEQ ID NO :51、它们的同系物和 / 或片段中的至少一种核酸序列，或者主要由选自SEQ ID N0:4、SEQ ID NO :8、SEQ ID NO 16 和SEQ ID N0:20、SEQ ID NO :43、SEQ ID NO :51、它们的同系物和/或片段中的至少一种 核酸序列组成，或者由选自 SEQ ID NO :4、SEQ ID NO :8、SEQ ID NO 16 和 SEQ ID NO :20、 SEQ ID NO 43, SEQ ID NO :51、它们的同系物和/或片段中的至少一种核酸序列组成；和/ 或(c)检测至少一种多肽的存在，所述多肽包含SEQ ID NO :12、SEQ ID NO :24、SEQID NO 47, SEQ ID NO :55、它们的同系物和/或片段的氨基酸序列，或者主要由SEQ ID NO: 12、SEQ ID NO 24, SEQ ID NO 47, SEQ ID NO :55、它们的同系物和/或片段的氨基酸序列 组成，或者由 SEQ ID N0:12、SEQ ID NO 24、SEQ ID NO 47、SEQ ID NO :55、它们的同系物 和/或片段的氨基酸序列组成；其中，所述多核苷酸和/或多肽的存在表示受试对象能够使HBV感染症状消退。根据还一个实施方式，本发明提供了诊断至少一种受试对象患有HBV感染和/或 HBV相关的肝细胞性肝癌或者存在患有HBV感染和/或HBV相关的肝细胞性肝癌的风险的 至少一种体外方法，该方法包括(a)从至少一种受试对象中采集至少一种样本；(b)检测至少一种多核苷酸的存在，所述多核苷酸包含选自SEQ ID NO :4、SEQ ID NO :8、SEQ ID NO 16 和 SEQ ID NO :20、SEQ ID NO :43、SEQ ID NO :51、它们的同系物和 / 或片段中的至少一种核酸序列，或者主要由选自SEQ ID N0:4、SEQ ID NO :8、SEQ ID NO 16 和SEQ ID N0:20、SEQ ID NO :43、SEQ ID NO :51、它们的同系物和/或片段中的至少一种 核酸序列组成，或者由选自 SEQ ID NO :4、SEQ ID NO :8、SEQ ID NO 16 和 SEQ ID NO :20、 SEQ ID N043, SEQ ID NO :51、它们的同系物和/或片段中的至少一种核酸序列组成；和/ 或(c)检测至少一种多肽的存在，所述多肽包含SEQ ID NO :12、SEQ ID NO :24、SEQ ID N047,SEQ ID NO :55、它们的同系物和/或片段的氨基酸序列，或者主要由SEQ ID N0: 12、SEQ ID NO 24, SEQ ID NO 47, SEQ ID NO :55、它们的同系物和/或片段的氨基酸序列 组成，或者由 SEQ ID N0:12、SEQ ID NO 24、SEQ ID NO 47、SEQ ID NO :55、它们的同系物 和/或片段的氨基酸序列组成；其中，所述多核苷酸和/或多肽的缺失与受试对象患有HBV感染和/或HBV相关 的肝细胞性肝癌或者存在患有HBV感染和/或HBV相关的肝细胞性肝癌的风险的可能性相关。具体而言，测试样本可为尿、血、血清、汗液和/或口腔液体样本。更具体而言，可 以使用本领域中已知的几种方法确定本发明的至少一种多核苷酸和/或多肽的存在。所述 方法中的一些可以包括但不限于，实时PCR、流式细胞计量术、PCR和/或几何平均荧光强度 (MFI)。根据又一个实施方式，本发明提供了用于检测和/或治疗HBV感染和/或HBV相 关的肝细胞性肝癌的至少一种试剂盒，该试剂盒包含根据本发明的任何实施方式的至少一 种细胞、至少一种载体和/或至少一种多肽。具体而言，所述试剂盒可以包含至少一个提供 了关于如何使用该试剂盒的说明的手册。表1 :HBV表位反应性外源TCR α 3和β 8链以及天然产生的HBcl8-27表位突变肽的序列。
权利要求
1.一种分离细胞，其包含至少一种HBV表位反应性外源T细胞受体和/或其片段。
2.根据权利要求1所述的细胞，其中，所述HBV表位为HLA-A2限制性的。
3.根据前述权利要求中任一项所述的细胞，其中，所述HBV表位包含至少一种乙型肝 炎核心抗原、至少一种肝炎包膜抗原和/或它们的突变体。
4.根据前述权利要求中任一项所述的细胞，其中，所述HBV表位包含HBc18-27、 HBs370-79和/或它们的突变体。
5.根据权利要求4所述的细胞，其中，所述HBcl8-27表位包含SEQIDNO :25和/或SEQ ID NO 26,并且所述HBs370-79表位包含选自SEQ IDNO 56至58中的任一序列。
6.根据前述权利要求中任一项所述的细胞，其进一步包含至少一种第二HBV表位反应 性外源T细胞受体和/或其片段，其中，所述第二 HBV表位与第一 HBV表位不同。
7.根据前述权利要求中任一项所述的细胞，其中，所述外源T细胞受体包含至少一条 α链，该α链包含(a)选自SEQID N0:9、SEQ ID N0:10和SEQ ID NO :11和/或它们的突变体中的至少 一种序列；和/或(b)选自SEQID NO :44、SEQ ID NO 45和SEQ ID NO 46和/或它们的突变体中的至 少一种序列。
8.根据前述权利要求中任一项所述的细胞，其中，所述外源T细胞受体包含至少一条 α链，该α链包含序列(a)SEQ ID N0:9、SEQ ID NO :10 禾口 SEQ ID NO :11，或者它们的突变体；和 / 或(b)SEQID NO :44, SEQ ID NO :45 禾口 SEQ ID NO :46，或者它们的突变体。
9.根据前述权利要求中任一项所述的细胞，其中，所述外源T细胞受体包含至少一条 β链，该β链包含选自下列序列中至少一种序列(a)SEQ ID NO :21、SEQ ID NO 22 和 SEQ ID NO 23 和 / 或它们的突变体；禾口 / 或(b)SEQID NO :52, SEQ ID NO :53 禾口 SEQ ID NO :54 和 / 或它们的突变体。
10.根据前述权利要求中任一项所述的细胞，其中，所述外源T细胞受体包含至少一条 β链，该β链包含序列(a)SEQ ID NO :21、SEQ ID NO :22 和 SEQ ID NO 23 或者它们的突变体；和 / 或(b)SEQID NO :52、SEQ ID NO 53 和 SEQ ID NO 54 或者它们的突变体。
11.根据前述权利要求中任一项所述的细胞，其中，所述外源T细胞受体包含(a)至少一条与SEQID NO :12或其片段具有至少80%氨基酸同一性的α链和/或至 少一条与SEQ ID NO 24或其片段具有至少80%氨基酸同一性的β链；和/或(b)至少一条与SEQID NO :47或其片段具有至少80%氨基酸同一性的α链和/或至 少一条与SEQ ID NO :55或其片段具有至少80%氨基酸同一性的β链。
12.根据前述权利要求中任一项所述的细胞，其中，所述外源T细胞受体包含(a)至少一条SEQID NO :12的α链和/或至少一条SEQ ID NO 24的β链和/或(b)至少一条SEQID NO 47的α链和/或至少一条SEQ ID NO 55的β链。
13.根据前述权利要求中任一项所述的细胞，其中，所述细胞为至少一种造血干细胞。
14.根据前述权利要求中任一项所述的细胞，其中，所述细胞为至少一种外周血淋巴细 胞(PBL)源T细胞。
15.一种分离多核苷酸，其包含至少一种编码至少一条α链的序列和/或至少一种编 码至少一条β链的序列，其中，所述α链和β链为至少一种HBV表位反应性外源T细胞 受体。
16.根据权利要求15所述的分离多核苷酸，其中，所述编码α链的序列包含选自SEQ ID NO 1和SEQ ID NO 5中的至少一种序列、选自SEQ ID NO 2和SEQ ID NO 6中的至少 一种序列以及选自SEQ ID NO :3和SEQ ID NO :7中的至少一种序列，和/或所述编码β链 的序列包含选自SEQ ID Ν0:13和SEQ ID NO :17中的至少一种序列、选自SEQ ID Ν0:14和 SEQ ID NO 18中的至少一种序列以及选自SEQ ID NO 15和SEQ ID NO 19中的至少一种 序列。
17.根据权利要求15或16所述的分离多核苷酸，其中，所述编码α链的序列包含SEQ ID NO 5,SEQ ID NO 6 和 SEQ ID NO :7，禾口 / 或所述编码 β 链的序列包含 SEQ ID NO :17、 SEQ ID NO 18 和 SEQ ID NO :19。
18.根据权利要求15 17中任一项所述的分离多核苷酸，其中，所述HBV表位反应性 外源T细胞受体的α链与SEQ ID NO 4或SEQ ID NO 8具有至少80%的序列同一性，并 且所述HBV表位反应性外源T细胞受体的β链与SEQ ID NO: 16或SEQ ID NO 20具有至 少80%的序列同一性。
19.根据权利要求15 18中任一项所述的分离多核苷酸，其中，所述编码α链的序列 选自SEQ ID NO 4和SEQ ID NO :8中，和/或所述编码β链的序列选自SEQ ID NO 16和 SEQ ID NO 20 中。
20.根据权利要求15所述的分离多核苷酸，其中，所述述编码α链的序列包含SEQID NO 40,SEQ ID NO 41 和 SEQ ID NO :42，禾口 / 或所述编码 β 链的序列包含 SEQ ID NO :48、 SEQ ID NO 49 和 SEQ ID NO :50。
21.根据权利要求15或20所述的分离多核苷酸，其中，所述HBV表位反应性外源T细 胞受体的α链与SEQ ID NO :43具有至少80%的序列同一性，并且所述HBV表位反应性外 源T细胞受体的β链与SEQ ID NO :51具有至少80%的序列同一性。
22.根据权利要求15、20和21中任一项所述的分离多核苷酸，其中，所述编码α链的 序列包含SEQ ID NO :43，和/或所述编码β链的序列包含SEQ ID NO :51。
23.一种分离多肽，其由根据权利要求15 22中任一项所述的至少一种多核苷酸编码。
24.一种分离多肽，其包含(a)选自SEQID NO :9、SEQ ID NO :10禾口 SEQ ID NO 11中的至少一种氨基酸序列和/ 或选自SEQ ID NO :21、SEQ ID NO 22和SEQ ID NO 23中的至少一种额外氨基酸序列；和 /或(b)选自SEQID NO :44、SEQ ID NO 45和SEQ ID NO 46中至少一种氨基酸序列和/ 或选自SEQ ID NO 52, SEQ ID NO 53和SEQ ID NO 54中的至少一种额外氨基酸序列。
25.根据权利要求M所述的分离多肽，其中(a)所述氨基酸序列与SEQID NO :12具有至少80%的氨基酸同一性，并且所述额外氨 基酸序列与SEQ ID NO 24具有至少80%的氨基酸同一性；和/或(b)所述氨基酸序列与SEQID NO :47具有至少80%的氨基酸同一性，并且所述额外氨基酸序列与SEQ ID NO :55具有至少80%的氨基酸同一性。
26.根据权利要求23 25中任一项所述的多肽，其中，所述多肽为至少一种HBV表位 反应性外源T细胞受体。
27.根据权利要求沈所述的多肽，其中，所述HBV表位为HBcl8-27、HBs370-79和/或 它们的突变体。
28.根据权利要求23 27中任一项所述的多肽，其中，所述多肽为至少一种可溶性 TCR或其片段。
29.根据权利要求观所述的多肽，其中，所述可溶性TCR或其片段与至少一种抗病毒药 连接。
30.一种构建体，其包含与至少一种启动子可操作地连接的根据权利要求15 22中任 一项所述的多核苷酸。
31.一种逆转录病毒载体，其包含权利要求30所述的构建体或者根据权利要求15 22中任一项所述的多核苷酸。
32.—种T细胞，其包含权利要求31所述的载体。
33.一种制备至少一种T细胞的方法，所述T细胞包含用于递送到至少一种受试对象的 至少一种HBV表位反应性外源T细胞受体，该方法包括用根据权利要求30所述的构建体或 根据权利要求31所述的载体转导至少一种从所述受试对象中分离的T细胞。
34.一种制备至少一种HBV表位反应性外源T细胞受体的方法，该方法包括(a)从至少一种消退了HBV感染症状的HBV感染个体中分离至少一种HBV表位反应性 T细胞；(b)由步骤(a)的HBV表位反应性T细胞克隆编码至少一种T细胞受体的至少一条α 链和/或β链的至少一种多核苷酸序列；(c)将步骤(b)的多核苷酸序列递送至至少一种细胞；和(d)在适合所述细胞表达所述HBV表位反应性外源T细胞受体的条件下孵育该细胞。
35.根据权利要求34所述的方法，其中，在步骤(a)中分离的所述T细胞是HBcl8-27 表位反应性的和/或HBs370-79表位反应性的。
36.根据权利要求1 14和32中任一项所述的细胞用于治疗HBV感染和/或HBV相 关的肝细胞性肝癌的用途。
37.一种在至少一种受试对象中治疗HBV和/或抑制HBV复活的方法，该方法包括向受 试对象施用至少一种免疫治疗有效量的根据权利要求1 14和32中任一项所述的细胞、 至少一种根据权利要求31所述的载体和/或至少一种根据权利要求23 四中任一项所 述的多肽。
38.一种在至少一种受试对象中治疗HBV相关的肝细胞性肝癌的方法，该方法包括向 受试对象施用至少一种免疫治疗有效量的根据权利要求1 14和32中任一项所述的细 胞、至少一种根据权利要求31所述的载体和/或至少一种根据权利要求23 四中任一项 所述的多肽。
39.一种诊断能够使HBV感染症状消退的至少一种受试对象的体外方法，该方法包括(a)从至少一种受试对象中采集至少一种样本；(b)检测至少一种多核苷酸的存在，所述多核苷酸包含选自SEQID NO 4, SEQ ID NO.8、SEQ ID NO :16、SEQ ID NO :20、SEQ ID NO :43、SEQID NO :51、它们的同系物和 / 或片段 中的至少一种核酸序列，或者主要由选自SEQ ID NO :4、SEQ ID NO :8、SEQ ID NO :16、SEQ ID NO 20,SEQ ID NO 43、SEQ ID NO :51、它们的同系物和/或片段中的至少一种核酸序列 组成，或者由选自 SEQ ID NO 4, SEQ ID N0:8、SEQ ID NO: 16、SEQ ID NO 20, SEQ ID NO: 43、SEQ ID NO :51、它们的同系物和/或片段中的至少一种核酸序列组成；和/或(c)检测至少一种多肽的存在，所述多肽包含SEQ ID NO 12, SEQ ID NO 24、SEQ ID NO 47,SEQ ID NO :55、它们的同系物和/或片段的氨基酸序列，或者主要由SEQ ID N0:12、 SEQ ID NO :24, SEQ ID NO :47、SEQ ID NO :55、它们的同系物和/或片段的氨基酸序列组 成，或者由 SEQ ID NO 12, SEQ ID NO 24、SEQ ID NO 47、SEQ ID NO :55、它们的同系物禾口 /或片段的氨基酸序列组成；其中，所述多核苷酸和/或多肽的存在标志着受试对象能够使HBV感染症状消退。
40.一种诊断至少一种受试对象患有HBV感染和/或HBV相关的肝细胞性肝癌或者存 在患有HBV感染和/或HBV相关的肝细胞性肝癌的风险的体外方法，该方法包括(a)从至少一种受试对象中采集至少一种样本；(b)检测至少一种多核苷酸的存在，所述多核苷酸包含选自SEQID NO 4, SEQ ID NO: 8,SEQ ID NO :16,SEQ ID NO 20,SEQ ID NO 43,SEQ ID NO :51、它们的同系物和 / 或片段 中的至少一种核酸序列，或者主要由选自SEQ ID NO :4、SEQ ID NO :8、SEQ ID NO :16、SEQ ID NO 20,SEQ ID NO 43、SEQ ID NO :51、它们的同系物和/或片段中的至少一种核酸序列 组成，或者由选自 SEQ ID NO 4, SEQ ID N0:8、SEQ ID NO: 16、SEQ ID NO 20, SEQ ID NO: 43、SEQ ID NO :51、它们的同系物和/或片段中的至少一种核酸序列组成；和/或(c)检测至少一种多肽的存在，所述多肽包含SEQID NO 12, SEQ ID NO 24、SEQ ID NO 47,SEQ ID NO :55、它们的同系物和/或片段的氨基酸序列，或者主要由SEQ ID NO :12、 SEQ ID NO 24,SEQ ID NO 47、SEQ IDNO :55、它们的同系物和/或片段的氨基酸序列组成， 或者由 SEQ ID NO 12,SEQ ID NO 24、SEQ ID NO 47、SEQ ID NO :55、它们的同系物和 / 或 片段的氨基酸序列组成；其中，所述多核苷酸和/或多肽的缺失与受试对象患有HBV感染和/或HBV相关的肝 细胞性肝癌或者存在患有HBV感染和/或HBV相关的肝细胞性肝癌的风险的可能性相关。
41.至少一种根据权利要求1 14和32中任一项所述的细胞、至少一种根据权利要 求31所述的载体和/或至少一种根据权利要求23 四中任一项所述的多肽在制备用于 治疗HBV感染和/或HBV相关的肝细胞性肝癌的药物中的用途。
42.一种检测和/或治疗HBV感染和/或HBV相关的肝细胞性肝癌的试剂盒，该试剂盒 包含至少一种根据权利要求1 14和32中任一项所述的细胞、至少一种根据权利要求31 所述的载体和/或至少一种根据权利要求23 四中任一项所述的多肽。
全文摘要
本发明提供了至少一种分离细胞以及制备它们的方法，所述分离细胞包含至少一种HBV表位反应性外源T细胞受体和/或其片段。具体而言，本发明提供了编码至少一种用于治疗乙型肝炎病毒(HBV)和肝细胞性肝癌(HCC)的HBV表位反应性外源T细胞受体的多核苷酸、构建体和载体。本发明进一步提供了检测HBV和HCC的试剂盒和方法。
文档编号C12N5/10GK102083979SQ200980126398
公开日2011年6月1日 申请日期2009年5月7日 优先权日2008年5月9日
发明者亚当·格林, 安东尼奥·贝尔托莱蒂 申请人:新加坡科技研究局