癌症的诊断方法和治疗方法

专利名称：癌症的诊断方法和治疗方法
技术领域：
本发明涉及癌症的诊断方法和该方法中使用的诊断剂、癌症的治疗方法和该方法中使用的抗癌剂和癌症疫苗。
背景技术：
人内源性逆转录病毒(Human endogenous retrovirus ；HERV)或其它病毒LTR样序列构成基因组约8%的DNA。在人基因组中，鉴定出了 20种以上的HERV，gag、p0l、env各基因中基本都发生变异，但是也有在胎盘、畸胎癌细胞株、生殖细胞来源的肿瘤、乳腺癌细胞株等中检测到表达的基因。其中，HERV-H基因簇形成最大的群，存在约100拷贝的全长序列、800-900拷贝的具有缺失变异的序列、约1000拷贝的LTR序列。据报道，在HERV-H基因簇中，HERV-H env基因在胎盘、骨骼肌、脾脏、胸腺中的表达高，没有检测到在其它正常组织中有表达。此外，还在广泛的组织来源的肿瘤细胞株中， 广泛地检测到了表达(Yi，J-M, Kim, H-M, and Kim, H-S(2006)Cancer Letters vol.231， pp. 228-239)。

发明内容
发明要解决的问题本发明的目的在于提供利用HERV-H env基因和基因产物的癌症的诊断方法和癌症的治疗方法、尤其是通过检测HERV-H env基因的表达来诊断癌症的方法和该方法中所用的诊断剂、通过抑制HERV-H env基因的功能来治疗癌症的方法和该方法中使用的抗癌剂、 通过给予具有HERV-H env蛋白质的特定序列的肽等来治疗和预防癌症的方法和该方法中使用的癌症疫苗。用于解决问题的方法已知，锌指转录因子Snail是癌症的恶化因子，Snail的表达越高，癌症恶化程度越高(Nature Rev Cancer 7，415-428，2007)。其理由之一是，Snail通过抑制E-钙粘蛋白等细胞间粘着分子的表达，控制在个体发生中原肠陷入或组织和器官的发生过程、正常组织或细胞死亡时的修复过程、 癌细胞转移的转移过程等发生时的上皮-间充质转换(EMT :Epithelial-mesenchymal transition) (Nature Rev Cancer 7，415-428，2007)，因此人们认为癌症中 Snail 的过剩表达会促进癌细胞的转移或浸润，使癌症恶化。因此，本发明人对Snail的过剩表达所导致的癌症中EMT的机理进行了积极研究， 发现Snail的作用由HERV-H env蛋白质介导。由此证实，利用HERV-H env基因及其产物， 能够进行癌症的诊断和治疗，从而完成了本发明。本发明的癌症的诊断剂含有可以检测HERV-H env基因表达的PCR用引物对或抗 HERV-H env抗体。前述PCR用引物对可以具有序列号1和序列号2。此外，所述癌症可以
3是胰腺癌、大肠癌、黑色素瘤、肺癌、白血病、食道癌。本发明的癌症的诊断试剂盒包括上述任一种诊断剂。本发明的药物组合物含有抑制HERV-H erw基因功能的功能抑制物质。所述功能抑制物质可以抑制HERV-H env基因的表达。此外，所述功能抑制物质可以是siRNA。本发明的抗癌剂包括上述任一种药物组合物。本发明的肽具有序列号3-5中的任一序列。本发明的抗原呈递细胞是在细胞表面呈递具有序列号3-5中的任一序列的的肽的细胞。此外，本发明中的T细胞是受到所述抗原呈递细胞诱导、识别表达HERV-H env抗原的癌细胞的细胞毒性T细胞。本发明的癌症疫苗含有选自于序列号3-5中的一个以上的肽、表达前述肽的表达载体、上述任一种抗原呈递细胞、或上述任一种T细胞。也可以是针对表达Snail蛋白质或 HERV-H env抗原的癌细胞的癌症疫苗。此外，还可以是含有选自于序列号3_5中的1个以上的肽、和除前述肽以外的癌抗原肽的癌症疫苗形式。本发明的癌症的治疗和预防方法是对人或人以外的脊椎动物使用上述任一种癌症疫苗的方法。而且，本说明书中，将登录号AD89710中记载的Human endogenous retrovirus H HERV-H/env60 proviral copy clone 734E12 (氨基酸序列序列号1，碱基序列序列号2) 称为HERV-H env基因。并且，本说明书中所谓“癌症”的用语是指，上皮细胞来源的癌、非上皮细胞来源的肉瘤、血液癌症等一般称为恶性肿瘤的肿瘤，对癌细胞的来源没有特别限制。==与相关申请的相互参引==本申请基于2008年9月18日提出申请的日本专利申请第2008-239943主张优先权，通过引用该基础申请将其包含在本说明书中。


[图1]是示出在本发明的一个实施例中，通过RT-PCR研究人的正常组织(A)、肿瘤细胞株(A)、和人进行性大肠癌组织(B)中HERV-Henv基因表达的结果的图。[图2]是总结在本发明的一个实施例中，使snail基因强制表达的Panc-I细胞的表型的表。[图3]是示出在本发明的一个实施例中，使snail基因强制表达的Panc-I细胞中 HERV-H env基因表达抑制的效果的图。[图4]是示出在本发明的一个实施例中，在HLA-AM表达基因改变小鼠中，对用 HERV-H env肽再刺激HERV-H env肽诱导的HERV-H env特异性CTL时的γ干扰素产生量进行测定的结果的图。[图5-1]是示出在本发明的一个实施例中，对使用HLA-AM阳性正常人外周血单核细胞、由HERV-H env肽所诱导的HERV-H env特异性CTL与表达HERV-H env的肿瘤细胞接触时的肿瘤细胞的杀伤率(A和C)进行测定的结果的图。[图5-2]是示出在本发明的一个实施例中，对使用HLA-AM阳性正常人外周血单核细胞、由HERV-H env肽诱导的HERV-H env特异性CTL用HERV-H env肽再刺激时的γ 干扰素产生量(B和D)进行测定的结果的图。
[图5-3]是示出在本发明的一个实施例中，对使用HLA-A02阳性正常人外周血单核细胞、由HERV-H env肽所诱导的HERV-H env特异性CTL与表达HERV-H env的肿瘤细胞接触时的肿瘤细胞的杀伤率(E)进行测定的结果的图。[图6]是示出在本发明的一个实施例中，将HERV-Henv肽与其它癌抗原肽混合作为癌症疫苗使用时，免疫活性协同增加的结果的图。[图7]是示出在本发明的一个实施例中，对在使用HLA-AM阳性正常人外周血单核细胞诱导HERV-H env特异性CTL时添加抗HLA抗体的情况下，诱导的HERV-H env特异性CTL对肿瘤细胞的杀伤率(％ )进行测定的结果的图。[图8]是示出在本发明的一个实施例中，对免疫缺陷小鼠中共给予使用HLA-AM 阳性正常人外周血单核细胞由HERV-H env肽诱导的HERV-H env特异性CD8+CTL、HLA-AM 阳性正常人外周血单核细胞和HERV-H env肽时，胰脏和外周血内的CD8+细胞的增殖的流式细胞术的结果。[图9]是示出在本发明的一个实施例中，在表达内源性HERV-Henv和Snail的人大肠癌细胞株C0L0320细胞中，抑制HERV-H env基因表达和Snail基因表达时的上皮-间充质转换控制基因簇的表达量的变化(A)和细胞膜浸润细胞数(B)的图。[图10]是示出在本发明的一个实施例中，在表达内源性HERV-Henv的人大肠癌细胞株SW837细胞中，在抑制HERV-H env基因表达时的上皮-间充质转换控制基因簇的表达量的变化(A)和细胞膜浸润细胞数(B)的图。[图11]是示出在本发明的一个实施例中，在表达内源性HERV-Henv和Snail的人胰腺癌细胞株MIAPaca细胞中，抑制HERV-H env基因表达和Snail基因表达时上皮-间充质转换控制基因簇的表达量变化(A)和细胞膜浸润细胞数(B)的图。
具体实施例方式以下在列举实施例的同时，详细描述本发明的实施方式。在实施方式和实施例中没有特别说明时，使用 J. Sambrook，Ε. F. Fritsch & Τ· Maniatis (Ed.)，Molecular cloning, a laboratory manual (第 3 片反)，Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, M 约(2001) ；F. Μ. Ausubel, R. Brent, R. Ε. Kingston, D. D. Moore, J. G. Seidman, J. A. Smith, K. Struhl(Ed.), Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons Ltd.等标准的实验方案集中的方法，或对其修饰、改变后的方法。而且，在使用市售的试剂盒或测定装置时，在没有特别说明时，使用其中附带的实验方案。而且，通过本说明书的记载，本发明的目的、特征、优点和其构思对于本领域技术人员都是清楚的，根据本说明书的记载，如果是本领域技术人员，就可以容易地再现本发明。以下记载的发明的实施方式和具体的实施例等表示本发明的优选实施方案，用于例示或说明，本发明不受它们的限定。本领域技术人员清楚的是，在本说明书中公开的本发明的意图和范围内，基于本说明书的记载，可以进行各种改变和修饰。==癌症的诊断方法==HERV-H env基因在正常组织中几乎检测不到表达，仅在一部分组织中有弱表达。 但是，在人肿瘤细胞株中在广泛的癌症种和肿瘤株中检测到强表达，实际上，在临床患者的癌症组织中，HERV-H env也高效表达，因此在研究通过活组织检查等采集的组织或细胞中HERV-H env基因的表达，检测到强HERV-H env基因表达时，能够进行癌症的诊断。对能够诊断的癌症的种类没有特别限制，可以是神经瘤、肾癌、肝癌、胰腺癌、肉瘤、大肠癌、黑色素瘤、肺癌、食道癌、子宫癌、睾丸癌、卵巢癌、白血病、淋巴瘤、骨髓瘤等实体癌或者血液癌，但是优选在正常组织中检测不到表达的组织来源的癌——脑肿瘤、神经瘤、肾癌、胸腺瘤、脾脏肿瘤、肝癌、骨肉瘤、淋巴瘤、骨髓瘤等。即使是在正常组织中检测到表达的癌症种类，通过与正常组织比较表达强度、表达增强，也可以诊断为癌症。对诊断方法没有特别限定，如果是能够检测HERV-H env基因表达的方法，不管是检测蛋白质还是检测RNA均可，但从简便角度出发，优选使用抗体的方法(例如ELISA)或使用PCR的方法(例如RT-PCR)等。因此，作为能够简便进行检测的诊断试剂盒，可以制作含有能够检测HERV-H env蛋白质的抗HERV-H env抗体或能够检测HERV-H env基因表达的 PCR用引物对等诊断剂的试剂盒。在该试剂盒中，除了抗体或引物以外，还可以添加ELISA 用试剂或板、PCR用试剂等。==药物组合物和抗癌剂、使用它们的癌症治疗方法==如上所述，人们认为，癌症中Snail的过剩表达使EMT相关基因(例如、E-钙粘蛋白)的表达增强，促进癌细胞的转移或浸润，使癌症恶化。在Snail过剩表达的癌症中， HERV-H env基因表达也增强，但如果在其中抑制HERV-H env蛋白质的功能，则Snail的过剩表达导致的下游基因表达的增强受到抑制。因此，在基因表达控制的进程(流Λ )中， Snail基因位于最上游，其下游有HERV-H env基因，再下游存在EMT相关基因。在Snail过剩表达的癌症中，如果抑制HERV-H env的功能，EMT相关基因的功能就受到抑制，其结果是能够抑制癌症的转移能力和增殖能力。实际上，在Snail过剩表达的癌症中，如果抑制HERV-H env的功能，浸润细胞数就减少，增殖就受到抑制。因此，可以使用含有抑制HERV-H env蛋白质功能的功能抑制物质的药物组合物作为抗癌剂。这里，对抑制HERV-H env蛋白质功能的功能抑制物质没有特别限制，可以是抗 HERV-H env抗体、siRNA、反义RNA等，作为其机制，既可以在转录水平抑制HERV-H env基因表达，也可以在翻译水平抑制HERV-H env基因表达，还可以抑制蛋白质功能。治疗对象癌症如果是表达Snail蛋白质或HERV-H env抗原的癌症，就没有特别限制，可以是神经瘤、肾癌、肝癌、胰腺癌、肉瘤、大肠癌、黑色素瘤、肺癌、食道癌、子宫癌、睾丸癌、卵巢癌、白血病、淋巴瘤、骨髓瘤等等实体癌或者血液癌，但优选胰腺癌、大肠癌、黑色素瘤、肺癌、白血病、食道癌，最优选大肠癌或胰腺癌。抗癌剂的使用方法可以适当确定，但优选在患者中全身给药或者在肿瘤部位或其附近直接给药。==癌症疫苗和使用所述癌症疫苗的癌症的治疗和预防方法==在作为抗原呈递细胞的树突细胞中添加具有作为HERV-H env蛋白质所具有的氨基酸序列的一部分的序列号3-5的肽时，通过与HLA I类分子结合，所述肽被呈递到细胞表面，被细胞毒性T细胞识别，从而能够诱导HERV-H env特异性细胞毒性T细胞。而且，通过各肽的刺激建立的细胞毒性T细胞会更有效地识别表达HERV-H env蛋白质的癌细胞，因此选自于序列号3-5中的一个以上的肽、在细胞表面上呈递该肽的抗原呈递细胞、受到抗原呈递细胞诱导识别表达HERV-H env抗原的癌细胞的细胞毒性T细胞可以作为癌症疫苗用于癌症的治疗和预防。
现在，作为癌症疫苗，开发了对肿瘤患者给予肿瘤特异性癌抗原、癌抗原呈递细胞、或癌抗原反应性细胞毒性T细胞的方法。本发明中，由于使用HERV-H env的部分肽，因此作为治疗或预防对象的肿瘤如果是表达HERV-H env的癌症，则没有特别限制，可以是神经瘤、肾癌、肝癌、胰腺癌、肉瘤、大肠癌、黑色素瘤、肺癌、食道癌、子宫癌、睾丸癌、卵巢癌、 白血病、淋巴瘤、骨髓瘤等实体癌或者血液癌症。主要的治疗对象是具有这种肿瘤的人类患者，但也可以是具有肿瘤的人以外的脊椎动物。==癌症疫苗的使用方法==首先，本发明的癌症疫苗可以含有具有序列号3-5的肽。此时，在对具有作为治疗对象的肿瘤的患者给予癌症疫苗时，优选预先研究患者的HLA I类的类型。这里，在患者的 HLA I类的类型为AM或A02时，给予序列号3-5的肽。给予的肽既可以是一种，也可以是多种。对于给药部位，考虑皮内给药、皮下给药、静脉内给药、腹腔内给药等，但没有特别限定。此外，在给药时，还可以将肽和提高免疫诱导能力的佐剂等一起给药。此外，还可以对所给予的肽实施使得难以在生物体内被分解的修饰。此外，还可以不给予肽本身，而给予作为使用整合了编码所述肽的基因的表达载体等的基因疫苗。此外，上述癌症疫苗还可以含有呈递具有序列号3-5的肽的抗原呈递细胞。这里， 细胞表面上呈递的肽可以是具有序列号3-5的肽本身，也可以是用糖或磷酸等进行修饰的肽。此外，在其制作中，既可以是化学合成，也可以使用整合了编码所述肽的基因的载体等使之表达。作为抗原呈递细胞，除了树突细胞之外，还考虑巨噬细胞、B细胞，和通过基因导入而强制表达B7或4-1BBL等T细胞刺激因子的肿瘤细胞(伪抗原呈递细胞)等，但由于抗原呈递能力高等原因，优选树突细胞。以下，描述树突细胞的分离方法的例子。首先，从脊椎动物个体的外周血中分离单核细胞。该单核细胞优选从作为治疗对象的个体自身分离，但也可以从其他个体分离。此外，该单核细胞优选是CD14阳性或CDllc 阳性。如果用GM-CSF和IL-4培养分离的单核细胞7天左右，就可以诱导分化(分化誘導) 成未成熟的树突细胞。这样诱导分化的树突细胞高度表达作为抗原呈递分子的MHC分子。 研究该未成熟的树突细胞的HLA I类的类型，在为AM或A02时，添加序列号3-5的下述肽。HERV-H#1 :SYLHHTINL (序列号 3)HERV-H#2 :FYSLLLYSL (序列号 4)HERV-H#3 =NYAEPPffPL (序列号 5)添加的物质不限于人工合成肽，也可以是使肽表达的细胞的提取物(提取物或溶胞产物)或纯化物等。向具有肿瘤的个体给予这样获得的抗原呈递树突细胞。对于给药部位，考虑皮内给药、皮下给药、静脉内给药、淋巴结内给药等，没有特别限定，但如果考虑到包括树突细胞的抗原呈递在内的生理性抗肿瘤免疫反应会在肿瘤组织内和所属淋巴结等肿瘤附近进行，则优选向肿瘤组织内或淋巴结内直接给药。此外，癌症疫苗可以含有通过呈递序列号3-5来源的肽的抗原呈递细胞的刺激而建立的T细胞。将呈递序列号3-5来源的肽的抗原呈递细胞和T细胞一起培养，用抗原呈递细胞刺激。还可以给具有肿瘤的个体给予这样建立的T细胞。这里的T细胞优选是细胞毒性T细胞，也可以是辅助性T细胞等。对于给药部位，考虑到皮内给药、皮下给药、静脉内给药、肿瘤内给药等，没有特别限定，但当为细胞毒性T细胞时，由于能够直接攻击表达抗原的细胞，因此优选肿瘤内给药。
而且，这些癌症疫苗还可以与其它癌症疫苗一起给药。尤其是，在将序列号3-5来源的肽作为癌症疫苗使用时，由于这些肽是病毒来源的抗原，因此在与能够起癌症疫苗作用的其它癌抗原肽等一起给药时，还同时具有作为增强其抗原性的佐剂的作用效果，因此能够发挥协同效果。实施例以下，通过实施例具体说明本发明，这些实施例用于说明本发明，但不限定本发明的技术范围。[实施例1]人的正常组织和肿瘤细胞中HERV-Henv基因的表达本实施例表明，内源性逆转录病毒HERV-H env基因在人正常组织中基本不表达， 但在肿瘤细胞株和肿瘤组织中高度表达。==通过RT-PCR进行的基因表达分析法==用RNeasykit (Qiagen公司)，从人正常组织、各种人肿瘤细胞株、和人大肠癌(参照图1)中提取RNA，用AMV逆转录，获得了 cDNA。然后，使用下述引物，用iCycler (Biorad 公司)扩增基因，通过电泳检测基因表达。图1的上半部分示出HERV-H env基因的表达、下半部分示出作为表达水平对照的 GAPDH基因的表达。HERV-H env 用引物正向5' -GGATCCTCTACCTACATGTGTC-3‘(序列号 6)反向5' -TCAAGGGAATTAGTGGAATAAC-3‘(序列号 7)GAPDH 用引物正向5' -GTCAACGGATTTGGTCGTATT-3‘(序列号 8)反向5 ‘ -ATCACTGCCACCCAGAAGACT-3 ‘(序列号 9)如图IA所示，在人正常组织中，在心脏(Heart)、脾脏(Spleen)、胰脏(Pancreas)、 睾丸CTestis)、胎盘(Placenta)中能够检测到弱HERV-H env基因表达，但无法在脑 (Brain)、肾脏(Kidney)、肝脏(Liver)、胸腺(Thymus)、骨骼肌(Muscle)、骨髓(BM)中检测到表达。人肿瘤细胞株中，在广泛的癌症种类(胰腺癌、大肠癌、黑色素瘤、肺癌、白血病、食道癌)和各个肿瘤株中检测到了强HERV-H env表达。此外，如图IB所示，确认在大肠癌的癌组织(Tu)中，表达水平高于正常组织(N)。这样，在HERV-H env基因的表达能够用于癌症诊断的同时，以HERV-H env为目标 (作为癌抗原)的治疗法对各种脏器的副作用少，能够适用于广泛的癌症种类的患者。[实施例2]肿瘤细胞中表达的HERV-Henv的功能及对其的抑制本实施例表明HERV-H env与癌细胞的浸润相关，通过HERV-H env基因的表达抑制能够抑制癌细胞的浸润。(I)Panc-I细胞中snail基因的强制表达首先，通过PCR从用已知为EMT诱导剂中的一种的TGF-beta刺激的Panc-Ι细胞扩增snail cDNA (CDS 71-865，795bp)，插入具有G418耐性基因的pcDNA3. 1 (+)质粒载体 anvitrogen公司)的限制性酶EcoR I-Xho I位点中。通过电穿孔将其导入于肿瘤细胞株中，培养2周后，用G418(aiig/mL)选出药物耐性细胞，克隆细胞。图2中，将snail基因导入细胞株的表型汇集在表中。
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在作为亲代细胞株的Panc-I细胞中观察到Snail蛋白质的固有表达，但通过导入snail基因的强制表达载体，克隆D6、D10、F3、F5中Snail蛋白质的表达水平增强。其结果是，在每一个克隆中，细胞形状由球状(round)变化为扁平的纺锤形 (spindle/spreading)，在体内和体外的细胞增殖能力(proliferation)降低，E-钙粘蛋白 (E-cadherin)的蛋白质水平和细胞粘着能力(Adhesion)降低，细胞迁移能力(Migration) 和细胞浸润能力(Invasion)增强。尤其是，在克隆F3中，观察到与上皮-间充质转换(EMT) 相关的显著效果，因此在以下实施例中使用F3。(2)克隆F3中HERV-H env基因表达抑制的效果本试验中，在克隆F3中，抑制HERV-H env基因表达，测定细胞浸润能力和增殖能力。首先，对5X IO4个F3细胞、和通过PEI complex法(Polyplus公司)导入了下述 4种HERV-H env基因特异性siRNA的2-3天后的F3细胞(#1_#4、Invitrogen公司)计数。 将此时的细胞数制图成图3A，作为增殖能力的指标。==细胞浸润能力的测定法==然后，将回收的细胞加入到用matrigel涂覆了膜的hvasion Chamber(孔径 8ym,BD Bioscience公司)的上层，培养4小时(37 °C, 5% CO2) 0完全除去膜上的细胞后， 用结晶紫溶液对向下层浸润的细胞进行固定并染色，显微镜下计数，从而测定细胞浸润能力。另外，使用导入了 ^witrogen公司制的对照寡核苷酸的F3细胞(对照)作为对照和导入了下述snail基因特异性siRNA(SiRNA_snail#l)的F3细胞(siRNA-snail)和 Panc-I细胞株(亲代)。siRNA-HERVH#l 正义CCAAUCUUAUGCCACCCUUdTdT(序列号 10)反义AAGG⑶GGCAUAAGAUUGGdTdT(序列号 11)siRNA-HERVH#2 正义CCAAUUCUUA⑶CCUUUAAdTdT(序列号 1 反义UUAAAGGACUAAGAAUUGGdTdT(序列号 I3)siRNA-HERVH#3 正义CCAGGCCAUCACCGAUCAUdTdT(序列号 14)反义AUGAUCG⑶GAUGGCCUGGdTdT(序列号siRNA-HERVH#4 正义GGAGGACUCUGUAUAUUCUdTdT(序列号 I6)反义AGAAUAUACAGAGUCCUCCdTdT(序列号 1了)siRNA_snail#l 正义GCGAGCUGCAGGACUCUAAdTdT(序列号 I8)反义UUAGA⑶CCUGCAGCUCGCdTdT(序列号 19)对照寡核苷酸正义GGAUCAGUCUAUUAG⑶CUdTdT(序列号 20)反义AGACCUAAUAGACUGAUCCdTdT(序列号 21)
如图3A所示，与无处理的情况(图中为“无”)和导入了对照SiRNA的情况(图中为“对照”)相比，抑制F3时(图中为#1-#4)，与导入Snail特异性siRNA的情况(图中为 "siRNA-snail") 一样，细胞增殖受到强烈抑制。此外，如图;3B所示，与Panc-I亲代株系(图中为“亲代”)相比，F3细胞株中浸润能力增强，而通过导入HERV-H env基因特异性siRNA，与导入Snail特异性siRNA的情况一样，F3细胞株的细胞浸润能力显著降低。这样，对于细胞增殖能力和细胞浸润能力这样的细胞功能，由于HERV-H env蛋白质在snail蛋白质的下游行使功能，因此通过抑制HERV-H env蛋白质的功能，就能够消除 snail基因的强制表达的效果。也就是说，在snail基因过剩表达的癌细胞中，通过抑制 HERV-H env的功能，能够使细胞增殖能力和细胞浸润能力降低，因此能够抑制HERV-H env 功能的功能抑制物质作为抗癌剂(增殖抑制剂或抗转移剂)是有用的。[实施例3]使用HLA-AM表达基因改变小鼠的HERV-Henv特异性CTL的诱导本实施例表明，用HLA-AM限制性HERV-H env肽免疫表达HLA-AM的基因改变小鼠(A24-Tg)(从 SLC 公司购入，参考文献 international J. Cancer 100:5565-5570， 2002)，HERV-H env具有免疫原性，即可以诱导HERV-H env特异性CTL。I 5fe， ffl LineagePanel Streptavidin Plus Magnetic Particles-DM(BD Biosciences公司)，从A24-Tg小鼠的骨髓细胞中分离树突细胞前体细胞，在GM-CSF (lOng/ mL、Peprotech公司)存在下培养6天，使之分化。在具有下述序列的肽(10 μ g/mL、由 Invitrogen公司合成)的存在下，将该树突细胞培养6小时，之后，在HLA-AM表达基因改变小鼠皮下，以每只5X IO6个接种小鼠，进行免疫。而且，使用已经被鉴定为癌睾丸抗原并会建立 HLA-AM 限制性肽的 SAGE 作为阳性对照(Cancer Research 60 :3848-3855,2000), 以使用不用肽刺激的树突细胞的情况作为阴性对照。HERV-H#1 :SYLHHTINL (序列号 3)HERV-H#2 :FYSLLLYSL (序列号 4)HERV-H#3 =NYAEPPffPL (序列号 5)SAGE :LYKPDSNEF(序列号 2 从用肽免疫一周后的小鼠中收集脾脏细胞，用10 μ g/mL的相同肽刺激培养6天后，用Miltenyi公司的抗体结合MACS磁珠法分离CD8+细胞。为了获得更强的细胞因子产生，在APC (用丝裂霉素C使从HLA-AM表达基因改变小鼠中收集的新鲜的脾脏细胞失活的细胞、1 X IO7个)的存在下，用0. 08-10 μ g/mL的相同的肽再刺激CD8+细胞(1 X IO6个)24 小时。用小鼠用Cytometric Bead Array试剂盒(BDBiosciences公司)，测定其培养上清中所含的Y干扰素值。图4A中示出10 μ g/mL的肽刺激⑶8+细胞时的、干扰素产生量。经免疫的A24_Tg 小鼠中，所使用的3种HERV-H env肽每一种均与HERV-H env抗原反应，能够诱导大量产生 Y干扰素的⑶8+细胞，而且其活性也比SAGE肽更好。图4B中示出用0. 08-10 μ g/mL浓度的各肽刺激⑶8+细胞时、干扰素的产生量。 而且，在该图中的左上方示出了以通过10 μ g/mL的肽刺激产生的γ干扰素量作为100%， 换算各个肽浓度刺激而产生的、干扰素量(标准化)的图。将各HERV-H env肽之间进行比较，HERV-H#2的活性最高，然而HERV-H#2和HERV_H#3如果达到2 μ g/mL以下的低浓度，
10其活性就极度降低，而HERV-H#1即使变成低浓度，其活性也保持一定。由此表明，HERV-H#1 的TCR结合亲和性显著(P < 0. 001，t-test检验)高于其它肽。[实施例4]使用正常人外周血单核细胞的HERV-Henv特异性CTL的诱导具有序列号3-5中的任一个的HERV-H env肽不仅在HLA-AM表达基因改变小鼠中、也在人类中显示出能够诱导HERV-H env特异性CTL。首先，从两个HLA-AM阳性正常人中，加入1/10量的4%柠檬酸钠进行采血，用 Ficoll-Paque (Amersham公司)形成多层，进行离心(1500rpm、20分钟、室温)，用10 μ g/mL 的各肽刺激培养在其中间层中分离的单核细胞级分(PBMC)6天，通过Miltenyi公司的抗体结合MACS磁珠法分离⑶8+细胞。为了评价细胞伤害活性，按⑶8+细胞C0L0320肿瘤细胞 =50 1的比例，混合培养作为目标细胞的人大肠癌细胞株C0L0320 (HLA-A24+SAGE+HERV-H env+)和分离的 CD8+细胞 6 小时，用 Immunocyto Cytotoxity Detection Kit(MBL 公司) 检测被杀伤的肿瘤细胞。按照附带的实验方案计算肿瘤特异性伤害率，其结果绘成图5A。如图5A所示，在两个正常人来源的PBMC中，HERV-H env肽可以与SAGE肽同等或以上程度地诱导能够充分杀伤C0L0320肿瘤细胞的CD8+细胞。而且，在其肿瘤细胞伤害活性中，HERV-H#1诱导CTL最高。另一方面，还评价了 γ干扰素产生能力，在IL_2(100U/mL、Peprotech公司)和 APC (用丝裂霉素C使从正常人中采集的新鲜的PBMC失活的细胞、5X IO6个)的存在下，用 1或10 μ g/mL的各肽刺激1 X IO6个CD8+细胞M小时，用人Cytometric Bead Array试剂盒(BD Biosciences公司)测定其培养上清中所含的Y干扰素值，将其结果制图成图5B。如图5B所示，在低浓度(1 μ g/mL)刺激下，没有观察到各肽间有本质差异，但如果用高浓度(10yg/mL)刺激，则HERV_H#1与其它肽相比，出现极高的Y干扰素产生。而且，基于与上述完全相同的方法，在使用从两名HLA-A02阳性正常人中采集的 PBMC的情况下，如图5E所示，确认了用序列号3-5的HERV-H env肽刺激能够诱导可以充分杀伤人胰腺癌细胞株Panc-I (HLA-A24_HLA-A02+SAGE+HERV-H env+)的CD8+细胞，此时的肿瘤细胞伤害活性也还是在HERV-H#1诱导CTL中最高。这样，具有序列号3-5中的任一个的HERV-H env肽在HLA-AM阳性、HLA-A02阳性的两种类型的人中都能够诱导HERV-H env特异性CTL，但在肿瘤细胞伤害活性中和γ干扰素产生能力中，序列号3的肽HERV-H#1的效果最高。于是，就肿瘤细胞伤害活性和Y干扰素产生能力，将序列号3的肽HERV_H#1与下述的HLA-AM限制性癌抗原肽进行比较。它们是在临床中最新的肽疫苗疗法中所使用的肽。NY-ES0-1 LLMWITQCF (序列号 23)CEA TYACFffSNL (序列号 24)WTl :CMTWNQMNL(序列号 25)对于肿瘤细胞伤害活性，按照⑶8+细胞C0L0320肿瘤细胞的比例为6. 25 1、 12.5 1、25 1、50 1进行，其结果制图为图5C。如图5C所示，在比CD8+细胞:C0L0320 肿瘤细胞=25 1的比率更低时，其活性与SAGE或WTl等同等，但在25 1以上的E T 比时，则肽HERV-H#1诱导CTL呈现出最高活性。此外，对于Y干扰素产生能力，在IL-2和APC存在下，用0.1、1或10 μ g/mL的各肽刺激CD8+细胞，将其结果制图为图5D。如图5D所示，在lyg/mL以上的高浓度下， NY-ES0-1诱导CTL呈现出最高的γ干扰素产生，但如果达到低浓度(0. lyg/mL)，则 NY-ES0-1诱导CTL的活性极度降低。另一方面，在1 μ g/mL以上的高浓度下，HERV_H#1诱导CTL的活性次于NY-ES0-1，但即使在低浓度(0. lyg/mL)下还是能够充分诱导Y干扰素产生。这样，相对于现在临床上使用的肽，序列号3的肽HERV_H#1也呈现优异的效果。[实施例5]HERV-Henv肽作为佐剂的有用性本实施例表明，在HERV-H env肽与其它癌抗原肽混合作为癌症疫苗使用时，会发挥出协同增强的免疫活性。以与实施例4 一样的方式从正常人中采集PBMC，将用HERV_H#1、NY-ESO-U CEA、 WTl各肽(最终浓度10 μ g/mL)刺激6天后分离的⑶8+细胞(1 X IO6个)，在IL-2和 APC的存在下，在HERV-H#1、NY-ESO-U CEA、WTl各肽(最终浓度1. 0 μ g/mL)中再添加 HERV-H#1 (最终浓度0. 5 μ g/mL)，刺激24小时，用人用Cytometric Bead Array试剂盒测定其培养上清中所含的Y干扰素值(即，在HERV-H env组中单独用HERV-H#1刺激，包括其它组在内的作为肽浓度的最终浓度为1.5yg/mL)。其结果制图为图6。此外，作为对照， 使用只添加HERV-H#1使其浓度为0. 5 μ g/mL的样品。如图6所示，与用各肽单独刺激时相比，由于在它们中加入了 HERV-H env肽，γ干扰素的产生能力协同性地增强了。这样就表明，HERV-H env肽在现存的肽疫苗疗法中补充性追加时，作为佐剂是有用的。[实施例6]抗HLA抗体产生的HERV-Henv特异性CTL诱导的抑制本实施例表明，HERV-H env肽产生的特异性CTL诱导受到抗HLA抗体的抑制。使用添加了抗HLA抗体(最终浓度10yg/mL)的培养基，用HERV_H#1 (最终浓度 10 μ g/mL)将以与实施例4 一样的方式从正常人中采集的PBMC刺激培养6天。然后，用 Miltenyi公司的抗体结合MACS珠法分离⑶8+细胞。为了评价该⑶8+细胞的细胞毒性，以 CD8+细胞C0L0320肿瘤细胞=6. 25 1,12. 5 1、25 1、50 1的比例将作为目标细胞的人大肠癌细胞株C0L0320与CD8+细胞混合培养6小时，用Immunocyto Cytotoxity Detection Kit(MBL公司)检测被杀伤的肿瘤细胞，按照附带的实验方案计算肿瘤特异性抑制率(障害率)。此外，以除了用未添加抗HLA抗体的培养基刺激培养以外、其余同样方式处理的未添加抗HLA抗体组作为对照。如图7所示，在刺激培养时添加了抗HLA抗体的组中，与未添加组(对照)相比， 被杀伤的肿瘤细胞率显著降低。通过添加抗HLA抗体抑制HERV-H env抗原肽与PBMC上的HLA抗原的结合，被杀伤的肿瘤细胞率显著减少，表明HERV-H env肽所诱导的CD8+细胞大都特异性识别肿瘤细胞上的HLA和呈递的HERV-H env抗原，是杀伤肿瘤细胞的⑶8+阳性细胞毒性T细胞。[实施例7]HERV_Henv肽导致的CD8+细胞的体内增殖本实施例表明，由于HERV-H env肽的刺激，在免疫缺陷小鼠体内，⑶8+细胞会自我增殖。首先，按照实施例4中记载的方法，通过用HERV_H#1 (最终浓度10 μ g/mL)刺激培养PBMC，获得⑶8+细胞。对照组的⑶8+细胞用NY-ES0-1肽(序列号2 代替相同浓度的HERV-H#1来刺激培养而获得。将该CD8+细胞与荧光色素PKH67 (Sigma公司)混合，通过孵育10分钟，进行荧光标记。从免疫缺陷小鼠(SCID小鼠、日本夕> 7公司)的尾静脉中给予2X10ef&PKH67 标记CD8+细胞、从同一正常人中采集的PBMCQX IO7个)和肽(HERV-H env或NY-ES0-1 (对照组)、总共每只lOOyg)。给药5天后，收集小鼠的脾脏细胞和外周血细胞，用流式细胞仪 (BD公司)测定PKH67标记⑶8+细胞的比例。此外，将除了不给予肽以外，其余进行同样处理的小鼠作为对照。如图8所示，在HERV-H env肽或NY_ES0_1肽任一情况下，在给予了肽的小鼠组中，与未给予肽的小鼠组相比，体内的CD8+细胞的比例高，肽的给药促进了 CD8+细胞的增殖。而且，在不给予小鼠肽时，经HERV-H env肽诱导的⑶8+细胞，与经NY-ES0-1肽诱导的 ⑶8+细胞相比，细胞的自我增殖低，而且，通过给予肽，经HERV-H env肽诱导的⑶8+细胞比经NY-ES0-1肽诱导的⑶8+细胞的增殖活性更强。也就是说，我们认为，经HERV-H env肽诱导的⑶8+细胞，与经NY-ES0-1肽诱导的⑶8+细胞相比，以更强的抗原特异性增殖。而且，还同样在脾脏内、外周血内观察到了该倾向。以上结果表明，经HERV-H env肽诱导的⑶8+细胞在生物体内增殖，而且其增殖中 HERV-H env肽抗原特异性高。因此，HERV-H env肽在生物体内的疫苗疗法中更为有效。[实施例8]表达内源性HERV-H env和Snail的肿瘤细胞中的HERV-H env和Snail 的功能及对其的抑制本实施例表明，在表达内源性HERV-H env和Snail的肿瘤细胞中，HERV-H env和 Snail与细胞浸润相关，HERV-H env基因或Snail基因的表达抑制能够抑制大肠癌细胞的浸润。首先，用PEI complex法(Polyplus公司)，在人大肠癌细胞株C0L0320细胞中导入特异性抑制HERV-H env或snail的siRNA(序列号10-19)或hvitrogen公司制的对照寡核苷酸(序列号20、21)，培养2-3天。而且，C0L0320细胞是表达内源性HERV-H env和 Snail的细胞株。按照实施例1的“通过RT-PCR进行的基因表达分析法”，用下述引物进行RT-PCR， 检测HERV-H env、Snail、Slug、Twist、E-钙粘蛋白、纤连蛋白、GAPDH(内部标准)的各基因表达。HERV-H env 用引物正向5，-GGATCCTCTACCTACATGTGTC-3反向5，-TCAAGGGAATTAGTGGAATAAC-3Snail 用引物正向5，-CAGATGAGGACAGTGGGAAAGG-3反向5，-ACTCTTGGTGCTTGTGGAGCAG-3Slug 用引物正向5，-AGCGAACTGGACACACATAC-3，(序列号 28)反向5，-TCTAGACTGGGCATCGCAG-3，(序列号 29)Twist 用引物正向5，-GCAAGCTTAGAGATGATGCAGGACG-3，(序列号 30)
，(序列号6) ，(序列号7)
，(序列号26) ，(序列号27)
13
反向5，-GACTCGAGGTGGGACGCGGACATGGA-3，(序列号 31)E-钙粘蛋白用引物正向5，-TTCCTCCCAATACATCTCCCTTCACAGCAG-3，(序列号 32)反向5，-CGAAGAAACAGCAAGAGCAGCAGAATCAGA-3，(序列号 33)纤连蛋白用引物正向5，-CCGTGGGCAACTCTGTC-3，(序列号 34)反向5，-TGCGGCAGTTGTCACAG-3，(序列号 35)GAPDH 用引物正向5，-GTCAACGGATTTGGTCGTATT-3，(序列号 8)反向5，-ATCACTGCCACCCAGAAGACT-3，(序列号 9)此外，回收各SiRNA导入后培养2-3天的人大肠癌细胞株C0L0320细胞，按照实施例1的“细胞浸润能力的测定法”，对细胞膜浸润在下层的细胞数(膜浸润细胞数)进行计数。如图9A所示，在未导入SiRNA组(无)中，检测到HERV-H env的表达，确认了 C0L0320细胞会表达内源性的HERV-H env。此外，在通过siRNA抑制HERV-H env表达时 (HERV# 1-4)，HERV-H env的基因表达量减少，同时，Snail、Slug、Twist、纤连蛋白的表达量降低，E-钙粘蛋白的表达量增加。它们是已知会控制上皮-间充质转换的基因簇，通过抑制HERV-H env表达，显示出肿瘤的恶化程度减少。此外，如图9B所示，在导入抑制HERV-H env或Snail的表达的siRNA的情况下，膜浸润细胞数减少。这样，在表达HERV-H env和Snail的癌细胞中，通过抑制HERV-H env或Snail的表达，癌细胞的细胞浸润能力显著降低。因此，能够抑制HERV-H env功能的功能抑制物质作为抗癌剂是有用的。[实施例9]表达内源性HERV-Henv的肿瘤细胞中的HERV-H env的功能及对其的抑制本实施例表明在高度表达内源性HERV-H env而不表达Snail的肿瘤细胞中， HERV-H env与细胞浸润相关，HERV-H env基因的表达抑制能够抑制大肠癌细胞的浸润。首先，用PEI complex法(Polyplus公司)，在人大肠癌细胞株SW837细胞中导入特异性抑制HERV-H env的siRNA(序列号10-19)或hvitrogen公司制的对照寡核苷酸 (序列号20、21)，培养2-3天。而且，SW837细胞是不表达Snail而表达HERV-H env的细胞株。按照实施例1的“通过RT-PCR进行的基因表达分析法”，用实施例8中记载的序列号 6-9,26-35 的引物，进行 RT-PCR，检测 HERV-H env、Snail、Slug、Twist、E-钙粘蛋白、纤连蛋白、GAPDH(内部标准)的各基因表达。此外，以上述方式回收各siRNA导入后培养2-3天的人大肠癌细胞株SW837细胞， 按照实施例1的“细胞浸润能力的测定法”，对细胞膜浸润在下层的细胞数(膜浸润细胞数) 进行计数。如图IOA所示，在未导入siRNA组(无)中，检测到HERV-H env的表达，确认了 SW837 细胞表达 HERV-H。此外，在通过 siRNA 抑制 HERV-H 表达时(HERV#1_4)，HERV-H env 的基因表达量减少，同时，Slug、TWist、纤连蛋白的表达量降低，E-钙粘蛋白的表达量增加。它们是已知会控制上皮-间充质转换的基因簇，通过抑制HERV-H env表达，显示出肿瘤的恶化程度减少。此外，如图IOB所示，在导入抑制HERV-H env表达的siRNA的情况下，与对照相比，膜浸润细胞数减少。这样，在表达HERV-H env的癌细胞中，通过抑制HERV-H env的表达，癌细胞的细胞浸润能力显著降低。因此，能够抑制HERV-H env功能的功能抑制物质作为抗癌剂是有用的。[实施例10]表达内源性HERV-H env和Snail的肿瘤细胞中的HERV-H env和 Snail的功能及对其的抑制本实施例表明在表达内源性HERV-H env和Snail的肿瘤细胞中，HERV-H env和 Snail与细胞浸润相关，HERV-H env基因或Snail基因的表达抑制能够抑制胰腺癌细胞的浸润。首先，用PEI complex法(Polyplus公司)，在人胰腺癌细胞株MIAPaca细胞中导入特异性抑制HERV-H env的siRNA (序列号10-19)或特异性抑制snail的 siRNA (SiRNA-snail#2)(序列号36、37)或hvitrogen公司制的对照寡核苷酸(序列号20、 21)，培养2-3天。而且，MIAPaca细胞是表达内源性的HERV-H env和Snail的细胞株。siRNA_snail#2 正义CCCACUCAGAU⑶CAAGAAdTdT(序列号 36)反义UUCUUGACAUCUGAGUGGGdTdT(序列号 3了)按照实施例1的“通过RT-PCR进行的基因表达分析法”，用实施例8中记载的序列号 6-9、26-35 的引物，进行 RT-PCR，检测 HERV-Henv、Snai 1、Slug、Twist、E-钙粘蛋白、纤连蛋白、GAPDH(内部标准)的各基因表达。此外，以上述方式回收各siRNA导入后培养2-3天的人胰腺癌细胞株MIAPaca细胞，按照实施例1的“细胞浸润能力的测定法”，对细胞膜浸润在下层的细胞数(膜浸润细胞数)进行计数。如图IlA所示，在未导入siRNA组(无)中，检测到HERV-H env和Snail的表达，确认了 MIAPaca细胞会表达内源性的HERV-H env和Snail。此外，在通过siRNA抑制 HERV-H env或Snail的表达时(HERV#1_4) ,HERV-H env的基因表达量减少，同时已知会控制上皮-间充质转换的基因簇(Snail、Slug、Twist、纤连蛋白)的表达量降低，E-钙粘蛋白的表达量增加。它们是已知会控制上皮-间充质转换的基因簇，通过抑制HERV-H env表达，显示出肿瘤的恶化程度减少。此外，如图IlB所示，在导入抑制HERV-H env或Snail表达的siRNA的情况下，与对照相比，膜浸润细胞数减少。这样，在表达HERV-H env和Snail的癌细胞中，通过抑制HERV-H env或Snail的表达，癌细胞的细胞浸润能力显著降低。因此，能够抑制HERV-H env功能的功能抑制物质作为抗癌剂是有用的。工业上利用的可能性本发明能够提供利用HERV-H env基因和蛋白质的癌症的诊断方法和治疗方法，尤其是通过检测HERV-H env基因的表达来诊断癌症的方法及该方法中使用的诊断剂、通过抑制HERV-H env基因的功能来治疗癌症的方法以及该方法中使用的抗癌剂、通过给予具有 HERV-H env蛋白质的特定序列的肽等来治疗癌症的方法及该方法中使用的癌症疫苗。
权利要求
1.药物组合物，其特征在于含有抑制HERV-Herw基因的功能的功能抑制物质。
2.根据权利要求1所述的药物组合物，其特征在于所述功能抑制物质抑制HERV-Henv 基因的表达。
3.根据权利要求2所述的药物组合物，其特征在于所述功能抑制物质是siRNA。
4.含有权利要求1-3任一项的药物组合物的抗癌剂。
5.具有序列号3-5中的任一序列的肽。
6.抗原呈递细胞，其在细胞表面呈递具有序列号3-5中的任一序列的肽。
7.T细胞，其被权利要求6所述的抗原呈递细胞诱导，并识别表达HERV-H env抗原的癌细胞。
8.根据权利要求7所述的T细胞，其特征在于其是细胞毒性T细胞。
9.癌症疫苗，其含有选自于序列号3-5中的一个以上的肽、表达所述肽的表达载体、权利要求6所述的抗原呈递细胞、或权利要求7或8所述的T细胞。
10.根据权利要求9所述的癌症疫苗，其特征在于其是针对表达Snail蛋白质或HERV-H env抗原的癌细胞的癌症疫苗。
11.癌症疫苗，其含有选自于序列号3-5中的一个以上的肽和除所述肽以外的癌抗原肽。
12.癌症的治疗和预防方法，其对人以外的脊椎动物使用权利要求9-11任一项所述的癌症疫苗。
13.癌症的诊断剂，其含有能够检测HERV-Henv基因的表达的PCR用引物对或抗 HERV-H env 抗体。
14.根据权利要求13所述的诊断剂，其特征在于所述PCR用引物对具有序列号6和序列号7。
15.根据权利要求13或14所述的诊断剂，其特征在于所述癌症是胰腺癌、大肠癌、黑色素瘤、肺癌、白血病、食道癌。
16.含有权利要求13-15任一项所述的诊断剂的癌症的诊断试剂盒。
全文摘要
本发明的目的是提供利用HERV-H env基因和蛋白质的癌症的诊断方法和治疗方法。尤其是，通过检测HERV-H env基因的表达来诊断癌症，将表达检测中使用的试剂制成诊断剂。此外，通过抑制HERV-H env基因的功能来治疗癌症，将功能抑制中使用的试剂制成抗癌剂。而且，通过给予具有HERV-H env蛋白质的特定序列的肽等来治疗癌症，将该肽等制成癌症疫苗。
文档编号C12N15/09GK102215870SQ20098014590
公开日2011年10月12日 申请日期2009年9月11日 优先权日2008年9月18日
发明者工藤千惠, 河上裕 申请人:学校法人庆应义塾