结合了亲和标记物的融合胶原酶及其制造法的制作方法

专利名称：结合了亲和标记物的融合胶原酶及其制造法的制作方法
技术领域：
本发明涉及在从胰脏等内脏器官中分离胰岛等细胞(块)时使用的胶原酶。
背景技术：
作为糖尿病的根治疗法，已知通过点滴向糖尿病患者的门静脉移植从经蛋白酶处理的胰脏中分离的胰岛(胰岛素产生细胞)的胰岛移植。本移植法由于移植时不需要对患者进行开腹手术，因此作为安全且简便的糖尿病的根治疗法，近年来受到人们关注。从胰脏中分离胰岛，通过用胶原酶和中性金属蛋白酶对胰脏进行处理来实施，作为用于本目的的胶原酶，溶组织梭菌(Clostridium histolyticm)来源的胶原酶特别有效 (非专利文献1、2)。溶组织梭菌来源的胶原酶已知由底物特异性不同的两种酶即胶原酶G和胶原酶H 构成(非专利文献1、2)。编码胶原酶G和胶原酶H的基因已经被分离，已经弄清楚这两种胶原酶都是由氨基末端侧的催化部位和羧基末端侧的胶原结合部位(以下，称为“CBD”)构成的多结构域(7 > ★卜"> 4 > )酶(非专利文献1、2)。然而，溶组织梭菌产生胶原酶时，表达的胶原酶部分被分解(非专利文献幻，用混入了这些被分解的胶原酶的胶原酶处理胰脏时，就存在分离的胰岛的质量下降的问题。因此，从胰岛分离的角度，理想的是获得尽可能除去了分解的胶原酶的胶原酶，用这种胶原酶处理胰脏。然而，由于未被分解的胶原酶与被分解的胶原酶的物理化学性质类似，因此用离子交换层析或疏水层析等方法难以分离这些胶原酶。在这种背景下，所希望的是在溶组织梭菌来源的胶原酶中，选择性回收未被分解的胶原酶的胶原酶制备方法。而且，还未有关于在以大肠杆菌等作为宿主的情况下使溶组织梭菌来源的胶原酶作为重组蛋白质表达时，胶原酶的分解的报道。现有技术文献非专利文献非专利文献1 :Yoshihara，K. et 6489-6496非专利文献 2 :Matsushita，0. et 923-93
发明内容
发明要解决的问题本发明的课题在于从溶组织梭菌来源的胶原酶中除去被分解的胶原酶，选择性回收未被分解的胶原酶。用于解决问题的手段
al. Journal of Bacteriology. (1994)，176, al. Journal of Bacteriology. (1999),181,
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本发明人使溶组织梭菌来源的胶原酶中的羧基末端结合了亲和标记物的融合胶原酶作为重组蛋白质进行表达。使溶组织梭菌来源的胶原酶作为重组蛋白质在以大肠杆菌等作为宿主进行表达时，该重组蛋白质是否会由宿主内的蛋白酶的作用而被分解，而且作为被分解，被如何分解，都是无法预测的。然而，本发明人在用亲和柱纯化在宿主中表达的融合蛋白质时，偶然地发现，分解的胶原酶被除去，具有胶原酶活性的单一的胶原酶被选择性地回收。我们认为这是基于，在宿主内表达的溶组织梭菌来源的胶原酶的分解发生在位于融合的亲和标记物附近的CBD中，因此伴随CBD的分解，亲和标记物从胶原酶上分离，在通过亲和层析进行的纯化阶段，分解胶原酶无法吸附在亲和柱上，只有没有被分解的胶原酶吸附在亲和柱上。也就是说，本发明人发现，通过用特定的配置使胶原酶与亲和标记物结合，可以在亲和纯化的过程中，使在宿主内被分解的胶原酶不被吸附，而具有胶原酶活性的单一的胶原酶被选择性地回收，由此完成了本发明。本发明涉及以下发明。<1>融合胶原酶，其是亲和标记物直接或间接结合在胶原酶上的融合胶原酶，胶原酶和亲和标记物通过以下方式结合以便在宿主内表达的该融合胶原酶在该宿主的作用下被分解时，具有胶原酶活性的片段与亲和标记物分离。<2><1>中所述的融合胶原酶，其中在胶原酶的羧基末端直接或间接结合了亲和标记物。<3><2>中所述的融合胶原酶，其中亲和标记物是2个以上的连续的组氨酸残基。<4><1>中所述的融合胶原酶，其中胶原酶来源于溶组织梭菌。<5><1>中所述的融合胶原酶，其中胶原酶的氨基酸序列选自于以下的(i)、(ii)、 (iii)和(iv)(i)含有序列号1或2中记载的第-110位至第1008位的氨基酸序列的全部或一部分的胶原酶；(ii)含有在序列号1或2中记载的第-110位至第1008位的氨基酸序列中缺失、 置换、插入或添加了1个或多个氨基酸的氨基酸序列的胶原酶；(iii)含有与序列号1或2中记载的第-110位至第1008位的氨基酸序列具有 70%以上的同源性的氨基酸序列的胶原酶；(iv)从⑴至(iii)中所述的胶原酶中除去了序列号1或2中记载的第-1位至第-110位的氨基酸序列的全部或一部分的胶原酶。<6><5>中所述的融合胶原酶，其由序列号3中记载的第-110位至第1021位的氨基酸序列的全部或一部分构成。<7><6>中所述的融合胶原酶，其除去了序列号3中记载的第-1位至第-110位的氨基酸序列的全部或一部分。<8><1>中所述的融合胶原酶，其中胶原酶的氨基酸序列选自于以下的(i)、(ii)、 (iii)和(iv)(i)含有序列号5或6中记载的第-40位至第981位的氨基酸序列的全部或一部分的胶原酶；(ii)含有在序列号5或6中记载的第-40位至第981位的氨基酸序列中缺失、置换、插入或添加了 1个或多个氨基酸的氨基酸序列的胶原酶；(iii)含有与序列号5或6中记载的第-40位至第981位的氨基酸序列具有70% 以上同源性的氨基酸序列的胶原酶；(iv)从⑴至(iii)中所述的胶原酶中除去了序列号5或6中记载的第-1位至第-40位的氨基酸序列的全部或一部分的胶原酶。<9><8>中所述的融合胶原酶，其由序列号7中记载的第-40位至第994位的氨基酸序列的全部或一部分构成。<10><9>中所述的融合胶原酶，其除去了序列号-J中记载的第-1位至第-40位的氨基酸序列的全部或一部分。<11>编码<1>至<10>任一项中所述的融合胶原酶的DNA。<12>由序列号4中记载的第1位至第3396位的碱基序列构成的DNA。<13>由序列号8中记载的第1位至第3105位的碱基序列构成的DNA。<14>含有<11>至<13>任一项中所述的DNA的表达载体。<15>被<11>至<13>任一项中所述的DNA、或<14>中所述的表达载体转化的宿主细胞。<16X15〉中所述的宿主细胞，所述宿主细胞是大肠杆菌。<17>融合胶原酶的制造方法，其特征在于用针对亲和标记物的亲和层析对培养 <15>或<16>中所述的宿主细胞所获得的培养物进行纯化，从而选择性地获取具有胶原结合部位的融合胶原酶。<18>用<17〉中所述的方法制造的融合胶原酶。发明效果本发明提供了胶原酶和亲和标记物结合的融合胶原酶，这是一种在溶组织梭菌来源的胶原酶上结合了亲和标记物的融合胶原酶，以便在宿主内表达的该融合胶原酶在该宿主的作用下被分解时，具有胶原酶活性的片段与亲和标记物分离。而且，还提供了用于高效生产作为重组蛋白质的该融合胶原酶所必需的DNA，和将该融合胶原酶作为重组蛋白质进行表达的宿主细胞。此外还提供了从培养表达该融合胶原酶的宿主细胞而获得的培养液中除去CBD的一部分或全部被分解的胶原酶，能够选择性回收具有CBD的单一的融合胶原酶的方法。通过本发明，可以有效地生产具有CBD的融合胶原酶。


[图1]图1是表示质粒PColG结构的图。图中符号的含义如下(图中的斜体用下划线表示)。胶原酶G基因，PlacZ =IacZ启动子，Ampr 氨苄西林抗性基因。[图2]图2是表示质粒pColG-His结构的图。图中符号的含义如下(图中的斜体用下划线表示)。胶原酶G基因，PlacZ =IacZ启动子，Aim/ 氨苄西林抗性基因，MCS 多克隆位点，6XHis 组氨酸标记物。[图3]图3是表示对表达融合胶原酶G的大肠杆菌的提取液实施活性染色的结果的电泳照片。[图4]图4是表示对供亲和层析的融合胶原酶G溶液实施活性染色的结果的电泳照片。
[图5]图5是表示质粒pColH结构的图。图中符号的含义如下(图中的斜体用下划线表示)。mia:胶原酶H基因，PlacZ =IacZ启动子，Aitoe 氨苄西林抗件基因。[图6]图6是表示质粒pColH-His结构的图。图中符号的含义如下(图中的斜体用下划线表示)。_ 胶原酶H基因，PlacZ IacZ-启动子,Amn1 氨苄西林抗性基因， MCS 多克隆位点，6XHis 组氨酸标记物。[图7]图7是表示对表达融合胶原酶H的大肠杆菌的提取液实施活性染色的结果的电泳照片。[图8]图8是表示对供亲和层析的融合胶原酶H溶液实施活性染色的结果的电泳照片。
具体实施例方式(融合胶原酶)本发明中所谓融合胶原酶，是指胶原酶和亲和标记物结合的融合胶原酶，其是在胶原酶上直接或间接地结合了亲和标记物的蛋白质，以便在宿主内表达的该融合胶原酶在该宿主的作用下被分解时，该融合胶原酶中具有胶原酶活性的片段与亲和标记物分离。这种胶原酶与亲和标记物的结合方式优选是与胶原酶的CBD的结合，最优选是与CBD的羧基末端(即，胶原酶的羧基末端)的结合。本发明中所谓“CBD”，是指胶原酶G中区段3a和北区域(序列号1和2的776位-羧基末端)、和胶原酶H中区段3区域(序列号5的864 位-羧基末端)(非专利文献2)。作为本发明中的胶原酶，如果可以通过与中性金属蛋白酶一起进行处理来从胰脏中分离胰岛，就可以利用任意一种胶原酶，但特别理想的是利用溶组织梭菌来源的胶原酶。 作为溶组织梭菌来源的胶原酶，可以使用任一种胶原酶，但特别理想的是使用序列号1或2 中所述的胶原酶G或序列号5或6中所述的胶原酶H。而且，这些胶原酶也可以由除去了信号序列的全部或一部分的氨基酸序列构成。这里，胶原酶G的氨基酸序列如果保持了胶原酶活性和与胶原的结合性，则也可以是以下任意一种(i)含有序列号1或2中记载的第-110位至第1008位的氨基酸序列的全部或一部分的胶原酶；(ii)含有在序列号1或2中记载的第-110位至第1008位的氨基酸序列中缺失、置换、插入或添加了 1个或多个氨基酸的氨基酸序列的胶原酶；(iii)含有与序列号1或2中记载的第-110位至第1008位的氨基酸序列具有70%以上同源性的氨基酸序列的胶原酶；(iv)从(i)至(iii)中所述的胶原酶中除去了由序列号1或2中记载的第-1位至第-110位的氨基酸序列构成的信号序列的全部或一部分的胶原酶。同样，胶原酶H的氨基酸序列如果保持了胶原酶活性和与胶原的结合性，则也可以是以下任意一种(i)含有序列号5或6中记载的第-40位至第981位的氨基酸序列的全部或一部分的胶原酶；( )含有在序列号5或6中记载的第-40位至第981位的氨基酸序列中缺失、置换、插入或添加了 1个或多个氨基酸的氨基酸序列的胶原酶；(iii)含有与序列号5或6中记载的第-40位至第981位的氨基酸序列具有70%以上同源性的氨基酸序列的胶原酶；(iv)从(i)至(iii)中所述的胶原酶中除去了由序列号5或6中记载的第-1位至第-40位的氨基酸序列构成的信号序列的全部或一部分的胶原酶。这里，所谓“在氨基酸序列中缺失、置换、插入或添加了 1个或多个氨基酸的氨基酸序列”，是指通过定点诱变法等公知方法，或通过进行能够天然发生的程度的多个数目的氨基酸的置换等进行改变。氨基酸改变的个数优选为1-50个、更优选1-30个、进一步优选 1-10个、进一步更优选1-5个、最优选1-2个。对于改变氨基酸序列的例子，优选地，其氨基酸可以是具有1个或多个(优选1至多个或1、2、3或4个)保守置换的氨基酸序列。这里， 所谓“保守置换”，是指用其它化学上类似的氨基酸残基置换1个或多个氨基酸残基。例如， 可以列举将某种疏水性残基用其它疏水性残基置换的情况，将某种极性残基用具有相同电荷的其它极性残基置换的情况等。对于能够进行这种置换的功能上类似的氨基酸，每个氨基酸都是本技术领域公知的。若要举出具体例子，作为非极性(疏水性)氨基酸，可以列举丙氨酸、缬氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、脯氨酸、色氨酸、苯丙氨酸、蛋氨酸等。作为极性(中性) 氨基酸，可以列举甘氨酸、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、半胱氨酸等。作为具有正电荷的(碱性)氨基酸，可以列举精氨酸、组氨酸、赖氨酸等。而且，作为具有负电荷的(酸性)氨基酸，可以列举天冬氨酸、谷氨酸等。而且，“具有70%以上同源性的氨基酸序列”，可以是具有优选80%以上、更优选 85%以上、进一步优选90%以上、更进一步优选95%以上、特别优选98%以上、最优选99% 以上同一性的氨基酸序列。就碱基序列或氨基酸序列来说的“同源性”，所使用的含义是 在被比较的序列之间，构成各个序列的碱基或氨基酸残基的一致程度。本说明书中所示的 “同源性”的数值任何一个均可以是使用本领域技术人员公知的同源性检索程序计算出的数值，例如，通过使用FASTA、BLAST等中的默认(初期设定)参数，可以容易地计算。本发明中，对于直接或间接与胶原酶融合的亲和标记物，如果能够与某种载体选择性结合，则可以使用任意一种亲和标记物。例如，可以利用特许第沈86090号中记载的由与镍螯合物柱选择性结合的2个以上的连续的组氨酸残基构成的组氨酸标记物、与不溶性纤维素选择性结合的纤维素结合部位、与麦芽糖结合树脂选择性结合的麦芽糖结合部位等，但特别理想的是利用分子量小的组氨酸标记物。本发明中，使亲和标记物与胶原酶直接或间接结合。这里，在使胶原酶与亲和标记物间接结合时，介于二者之间的氨基酸的序列如果不会极大阻碍融合胶原酶的活性和与胶原的结合性，则无论什么样的序列都可以。作为满足上述必要条件的融合胶原酶，可以列举，例如组氨酸标记物与胶原酶G 的羧基末端结合的由序列号3的氨基酸序列的全部构成的融合胶原酶，或组氨酸标记物与胶原酶H的羧基末端结合的由序列号7的氨基酸序列的全部构成的融合胶原酶。此外， 只要保持胶原酶活性、与胶原的结合性和与亲和标记物的结合性，也可以列举由上述融合胶原酶的一部分构成的融合胶原酶。(编码融合胶原酶的氨基酸序列的DNA)本发明中，编码融合胶原酶的DNA如果编码上述融合胶原酶的氨基酸序列，则无论由什么样的碱基序列构成的DNA都可以。编码本发明的融合胶原酶的DNA可以通过人工方法化学合成获得。此外，编码融合胶原酶的DNA还可以通过分别构建编码胶原酶的DNA和编码亲和标记物的DNA，再将它们连接而获得。此时，胶原酶基因可以通过使用基于该基因的序列合成的引物、以基因组DNA、 cDNA、质粒等含该基因的DNA作为模板的PCR扩增而获得。例如，对于溶组织梭菌来源的胶原酶G或胶原酶H的情况，可以通过使用基于非专利文献1中记载的胶原酶G基因或非专利文献2中记载的胶原酶H基因的序列的5’侧末端、3’侧末端的序列设计的引物、以溶组织梭菌来源的基因组DNA作为模板的PCR进行扩增。此外，在编码亲和标记物的DNA中，可以通过将含有编码亲和标记物的基因的基因组DNA、cDNA、质粒等作为模板的PCR进行扩增。 例如，在编码组氨酸标记物的DNA的情况下，可以通过以市售的载体pET-Ma(+)作为模板的PCR进行扩增。作为满足前述必要条件的DNA，可以列举，例如，由编码组氨酸标记物结合在胶原酶G的羧基末端上的融合胶原酶的由序列号4的碱基序列的全部或一部分构成的DNA。此外，可以列举组氨酸标记物结合在胶原酶H的羧基末端上的由序列号8的碱基序列的全部或一部分构成的DNA。(胃汰裁船口赫汰裁冊■針_)本发明中，提供了含有编码前述融合胶原酶的氨基酸序列的DNA的表达载体，所述表达载体处于可以在宿主细胞内复制、且能够表达该DNA序列编码的蛋白质的状态。该表达载体是自我复制载体，即作为染色体外的独立体存在，其复制不依赖于染色体的复制， 例如，可以以质粒作为基础来构建。而且，本表达载体也可以在导入宿主细胞时，整合到该宿主细胞的基因组中，其与所整合的染色体一起复制。本发明的载体构建的程序和方法可以使用基因工程领域中常用的程序和方法。对于本发明的表达载体，为了实际上将其导入宿主细胞中使融合胶原酶表达，除了编码前述融合胶原酶的氨基酸序列的DNA之外，理想的是还含有控制其表达的DNA序列或用于选择所转化的宿主细胞的基因标记等。作为控制表达的DNA序列，其中包括启动子、 终止子和编码信号肽的DNA序列等。启动子如果是在宿主细胞中呈现出转录活性的启动子，则没有特别限定，可以作为控制编码与宿主细胞同种或异种的任何蛋白质的基因的表达的DNA序列来获得。此外，信号肽如果是在宿主细胞中有助于蛋白质分泌的信号肽，则没有特别限定，可以通过由编码与宿主细胞同种或异种的任何蛋白质的基因所来源的DNA序列获得。而且，本发明中的基因标记，尽管可以根据转化体的选择方法适当选择，但也可以利用例如编码耐药性的基因或互补营养需求性的基因。而且，本发明还提供了由该表达载体转化的宿主细胞。对该宿主-载体系统没有特别限定，可以使用例如，采用大肠杆菌、放线菌、酵母、丝状真菌、动物细胞等的系统等，但特别理想的是使用大肠杆菌作为宿主。此外，由这些表达载体进行的宿主细胞的转化也可以按照本领域中常用的方法实施。(表达融合I^iCi!的宿t细朐, 似吝养禾nil丄寸亲禾ΠHl析讲行的对H有CBD的融合月$ 原酶的选择性回收)本发明中，可以用适当的培养基培养表达融合胶原酶的宿主细胞，从其培养物中获得融合胶原酶。表达融合胶原酶的宿主细胞的培养和其条件可以与使用的宿主细胞的培养和其条件基本相同。表达融合胶原酶的宿主细胞中或培养液中分泌的融合胶原酶的回收可以采用本领域中常用的方法。用前述方法回收的融合胶原酶可以通过提供给亲和层析除去分解胶原酶，来选择性地回收具有CBD的融合胶原酶。此时利用的亲和层析必须是与胶原酶结合的亲和标记物所针对的方法，例如、结合组氨酸标记物时，就用选择性结合组氨酸标记物的镍螯合物柱等纯化。通过亲和层析进行的分解胶原酶的除去程度可以通过以下方式评价，即用添加了明胶的凝胶对融合胶原酶溶液进行电泳，然后进行活性染色。(其它方式)本发明人认为使重组胶原酶在大肠杆菌等中表达时，其CBD的一部分或全部被分解，根据这种认识，可以利用与重组胶原酶中的CBD结合的抗体，排除被分解的胶原酶，特异性亲和纯化未分解的重组胶原酶。此时，在不需要亲和标记物与重组胶原酶融合这方面来说是有利的。即，本发明还提供了胶原酶的制造方法，其特征在于通过用与重组胶原酶的CBD结合的抗体来纯化通过培养表达该重组胶原酶的宿主细胞而获得的培养物，从而选择性收集具有CBD的胶原酶。而且，由于CBD与胶原具有亲和性，因此利用胶原代替上述抗体，可以特异性亲和纯化重组胶原酶。即，本发明还提供了胶原酶的制造方法，其特征在于通过用胶原纯化通过培养表达重组胶原酶的宿主细胞而获得的培养物，从而选择性收集具有CBD的胶原酶。
实施例通过实施例更具体地说明本发明，但本发明只要不超越其要旨，则不限于以下的实施例。「实施例11组氨酸标记物连接在溶组织梭菌来源的胶原酶G的羧基末端上的融合胶原酶(融合胶原酶G)的表达(1-1)胶原酶G基因片段的制备通过以溶组织梭菌来源的基因组DNA作为模板的PCR扩增溶组织梭菌来源的胶原酶G基因的5’侧末端至3’侧末端。此时，设计在扩增的胶原酶G基因的3’侧末端形成 XbaI识别序列、并添加与该基因的终止密码子连接的M HI识别序列的引物。其结果是，在非专利文献1中所述的天然胶原酶G的羧基末端氨基酸序列的2个位置(序列号1的第 1007位和第1008位的氨基酸)导入变异，改变成为序列号2中所述的氨基酸序列。该PCR中使用的引物如下。colG-F ATGAAAAAAAATATTTTAAAGATTC (序列号9)colG-R CCGGATCCTATCTAGATACCCTTAACT (序列号10)被扩增的胶原酶G基因片段被MmHI消化。(1-2)含有编码组氨酸标记物的区域的DNA片段的制备为了制备编码由6个连续的组氨酸残基构成的组氨酸标记物的DNA，以市售的载体pET-2^ (+)作为模板，实施PCR，扩增编码组氨酸标记物的DNA。而且，还使得在该DNA 片段中，除了编码组氨酸标记物的DNA之外，还含有该载体来源的多克隆位点、T7终止子所对应的基因片段。以该扩增DNA片段的5’侧末端上含有SmI和在3’侧末端上含有_1 识别序列的形式设计引物。该PCR中使用的引物如下。
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His-F GCTCTAGAAAGCTTGCGGCCGCACTCGA (序列号11)His-R CGGGATCCGGATATAGTTCCTCCT (序列号12)扩增的含有编码编码组氨酸标记物的区域的DNA片段用-I和进行双重消化。(l-3)lacZ启动子片段的制备作为用于使融合胶原酶表达的启动子，制备kZ启动子。该DNA片段用以pUC19 作为模板的PCR进行扩增。此时，以在扩增DNA片段的5’侧末端上含有HindIII识别序列的形式设计引物。该PCR中使用的引物如下。Iac-F CCGGCAAGCTTGCCCAATACGCAAACCG (序列号13)Iac-R AGCTGTTTCCTGTGTGAA (序列号14)扩增的kz启动子片段用HindIII消化。(1-4)连接了组氨酸标记物的融合胶原酶G的表达载体的构建将用前述方法制备的3种DNA片段，从5’侧末端开始，以含有IacZ启动子、胶原酶G基因、组氨酸标记物的DNA片段的顺序连接的方式插入市售的载体pBR322中。首先， 将IacZ启动子、胶原酶G基因插入PBR322中。也就是说，对如前述那样制备的IacZ启动子区域和胶原酶G基因片段进行磷酸化后，插入用HindIII和M HI双重消化的pBR322， 构建PColG (图1)。而且，因启动子区域(PlacZ)与colG基因的连接通过平滑末端而进行。接着，在用XMI和M HI进行了的双重消化的pColG中插入用前述的方法制备的编码组氨酸标记物的DNA，构建出pCdG-His (图幻。最后，插入pBR322的DNA形成具有序列表4中记载的第1位至第3396位的碱基序列的DNA。(1-5)融合胶原酶G表达大肠杆菌的构建按照常规方法用pCoKi-His转化大肠杆菌大肠埃希氏菌(Escherichia coli) X 1776 株，用添加了 20 μ g/ml 的二氨基庚二酸(diaminopimelic acid)、100 μ g/ml 胸腺啼啶脱氧核苷、50μ g/ml氨苄西林的LB琼脂培养基，于37°C培养一昼夜，构建出融合胶原酶 G表达大肠杆菌。Γ实施例21融合胶原酶G表达大肠杆菌的培养和对具有CBD的胶原酶G的选择性回收(2-1)融合胶原酶G表达大肠杆菌的培养将实施例1中获得的融合胶原酶G表达大肠杆菌接种于添加了 100ml培养基的 250ml的三角烧瓶中，以200rpm在搅拌培养16小时。本培养中使用的培养基为添加了 100 μ g/ml的二氨基庚二酸、20 μ g/ml胸腺嘧啶脱氧核苷、50 μ g/ml氨苄西林、0. ImM的 IPTG的TB培养基(1. 2%胰蛋白胨、2. 4%酵母提取物、0. 94%磷酸氢二钾、0. 22%磷酸二氢钾、0.8%甘油)。(2-2)融合胶原酶G表达大肠杆菌的提取液的制备
通过离心分离中获得的培养终止液，回收菌体，用IOml的POPculture Regent ( ^ ^ ”社制)使回收的菌体溶菌，提取菌体内的蛋白质。为了从通过离心分离溶菌液获得的上清中除去基因重组体，用0. 2 μ m的膜过滤，形成融合胶原酶G表达大肠杆菌的提取液。(2-3)通过亲和层析进行的具有CBD的融合胶原酶G的选择性回收为了从0-2)中获得的融合胶原酶G表达大肠杆菌的提取液中除去分解胶原酶， 通过针对组氨酸标记物的亲和层析镍螯合物柱进行分级分离。在IOml用前述方法制备的融合胶原酶G表达大肠杆菌的提取液中添加60ml镍螯合物柱结合用缓冲液(加入了 0. 5M 的NaCl、20mM咪唑的20mM的磷酸钠缓冲液(pH7. 5))，通入经镍螯合物柱结合用缓冲液平衡化了的IOOml的镍螯合物柱中。然后，用适当量的镍螯合物柱结合用缓冲液清洗柱，除去无法吸附在镍螯合物柱上的分解胶原酶，之后通入添加了 500mM咪唑的镍螯合物柱结合用缓冲液100ml，回收具有CBD的融合胶原酶G。(2-4)分解胶原酶除去的确认为了确认从融合胶原酶G提取液除去了分解胶原酶，对融合胶原酶G表达大肠杆菌的提取液和供亲和层析的融合胶原酶G溶液实施活性染色。将(2-2)中获得的融合胶原酶G表达大肠杆菌的提取液0.25μ1和0-3)中获得的供亲和层析的融合胶原酶G溶液 2. 5 μ 1提供给Zymogram-PAGE mini ( f 7 二社制)，实施活性染色。其结果是在融合胶原酶G表达大肠杆菌的提取液中观察到呈现蛋白酶活性的5个条带(图幻。另一方面，还观察到，对于供亲和层析的融合胶原酶G溶液，在前述5个条带中，呈现最大分子量的1个条带作为主要的条带(图4)。根据这些条带的比较和分析，弄清了在大肠杆菌中表达融合胶原酶G时，CBD的部分或全部被分解。以上结果表明，通过亲和层析纯化融合胶原酶G表达大肠杆菌的提取液，能够除去CBD的部分或全部被分解的胶原酶，选择性地回收具有CBD的融合胶原酶。「实施例31溶组织梭菌来源的胶原酶H的羧基末端上连接了组氨酸标记物的融合胶原酶的表达(3-1)胶原酶H基因片段的制备通过以溶组织梭菌来源的基因组DNA作为模板的PCR扩增溶组织梭菌来源的胶原酶H基因的5’侧末端至3’侧末端。此时，设计在扩增的胶原酶H基因的3’侧末端形成 XbaI识别序列、并添加与该基因的终止密码子连接的M HI识别序列的引物。其结果是，在非专利文献2中所述的天然胶原酶H的氨基酸序列的羧基末端氨基酸序列的1个位置(序列号5的第980位的氨基酸)导入变异，改变成序列号6中所述的氨基酸序列。该PCR中使用的引物如下。colH-F ATGAAAAGGAAATGTTTATC (序列号15)colH-R CCGGATCCTATCTAGATACTGAACCTT (序列号16)被扩增的胶原酶H基因片段被MmHI消化。(3-2)含有编码组氨酸标记物的区域的DNA片段的制备含有编码组氨酸标记物的区域的DNA片段通过与实施例1同样的方法制备。
(3-3)M启动子片段的制备M启动子片段通过与实施例1同样的方法制备。(3-4)连接了组氨酸标记物的融合胶原酶H的表达载体的构建将用前述方法制备的3种DNA片段，从5’侧末端开始，以含有M启动子、胶原酶H基因、组氨酸标记物的DNA片段的顺序连接的方式插入市售的载体pBR322中。首先， 为了将M启动子、胶原酶H基因插入PBR322中，对如前述那样制备的M启动子区域和胶原酶H基因片段进行磷酸化，之后插入用HindIII和双重消化的pBR322中，构建出pColH(图5)。而且，IacZ基因启动子区域与胶原酶H基因的连接通过平滑末端而讲行。接着，在用和进行了的双重消化的pColH中插入用前述的方法制备的包含编码组氨酸标记物的DNA的DNA片段，构建出pColH-His (图6)。最后，插入pBR322的DNA 形成具有序列表8中记载的第1位至第3105位的碱基序列的DNA。(3-5)融合胶原酶H表达大肠杆菌的构建融合胶原酶H表达大肠杆菌用与实施例1同样的方法制造。Γ实施例41融合胶原酶H表达大肠杆菌的培养和具有CBD的融合胶原酶H的选择性回收(4-1)融合胶原酶H表达大肠杆菌的培养用实施例2中所述的方法培养实施例3中获得的融合胶原酶H表达大肠杆菌，获得培养液。(4-2)融合胶原酶H表达大肠杆菌的提取液的制备用实施例2中所述的方法从中获得的培养终止液中获得融合胶原酶H表达大肠杆菌的提取液。(4-3)通过亲和层析进行的具有CBD的融合胶原酶H的选择性回收用实施例2中所述的方法将(4- 获得的融合胶原酶H表达大肠杆菌的提取液提供给亲和层析，回收具有CBD的融合胶原酶H。(4-4)分解胶原酶的除去的确认为了确认从融合胶原酶H中除去分解胶原酶的程度，用实施例2中所述的方法在电泳后实施活性染色。其结果是，在融合胶原酶H表达大肠杆菌的提取液中观察到显示蛋白酶活性的4个条带(图7)。另一方面还观察到，对于供亲和层析的融合胶原酶H溶液，在前述4个条带中呈现最大分子量的1个条带为主要条带(图8)。根据这些条带的比较和分析，弄清了在大肠杆菌中表达的融合胶原酶H中，CBD的部分或全部被分解。以上结果表明，通过用亲和层析纯化融合胶原酶H表达大肠杆菌的提取液，能够除去CBD的部分或全部被分解的胶原酶，选择性地回收具有CBD的融合胶原酶H。工业上利用的可能性根据本发明，可以以高纯度生产不含有由于宿主作用而产生的分解产物的作为重组蛋白质的胶原酶。如果使用利用本发明的方法生产的胶原酶，则由于例如不会使胰岛质量降低地从胰脏中分离胰岛，因此能够大大有助于向糖尿病患者移植胰岛。
权利要求
1.融合胶原酶，其是亲和标记物直接或间接结合在胶原酶上的融合胶原酶，胶原酶和亲和标记物通过以下方式结合在宿主内表达的该融合胶原酶在由于该宿主的作用而被分解时，具有胶原酶活性的片段与亲和标记物分离。
2.根据权利要求1中所述的融合胶原酶，其中在胶原酶的羧基末端直接或间接结合了亲和标记物。
3.根据权利要求2中所述的融合胶原酶，其中亲和标记物是2个以上的连续的组氨酸残基。
4.根据权利要求1中所述的融合胶原酶，其中胶原酶来源于溶组织梭菌(Clostridium histolyticm)。
5.根据权利要求1中所述的融合胶原酶，其中胶原酶的氨基酸序列选自于以下的(i)、 (ii)、(ill)和(iv)(i)含有序列号1或2中记载的第-110位至第1008位的氨基酸序列的全部或一部分的胶原酶；( )含有在序列号1或2中记载的第-110位至第1008位的氨基酸序列中缺失、置换、插入或添加了 1个或多个氨基酸的氨基酸序列的胶原酶；(iii)含有与序列号1或2中记载的第-110位至第1008位的氨基酸序列具有70% 以上的同源性的氨基酸序列的胶原酶；(iv)从(i)至(iii)中所述的胶原酶中除去了序列号1或2中记载的第-1位至第-110位的氨基酸序列的全部或一部分的胶原酶。
6.根据权利要求5中所述的融合胶原酶，其由序列号3中记载的第-110位至第1021 位的氨基酸序列的全部或一部分构成。
7.根据权利要求6中所述的融合胶原酶，其除去了序列号3中记载的第-1位至第-110位的氨基酸序列的全部或一部分。
8.根据权利要求1中所述的融合胶原酶，其中胶原酶的氨基酸序列选自于以下的(i)、 (ii)、(iii)和(iv)(i)含有序列号5或6中记载的第-40位至第981位的氨基酸序列的全部或一部分的胶原酶；(ii)含有在序列号5或6中记载的第-40位至第981位的氨基酸序列中缺失、置换、 插入或添加了1个或多个氨基酸的氨基酸序列的胶原酶；(iii)含有与序列号5或6中记载的第-40位至第981位的氨基酸序列具有70%以上同源性的氨基酸序列的胶原酶；(iv)从⑴至(iii)中所述的胶原酶中除去了序列号5或6中记载的第-1位至第-40 位的氨基酸序列的全部或一部分的胶原酶。
9.根据权利要求8中所述的融合胶原酶，其由序列号7中记载的第-40位至第994位的氨基酸序列的全部或一部分构成。
10.根据权利要求9中所述的融合胶原酶，其除去了序列号-J中记载的第-1位至第-40位的氨基酸序列的全部或一部分。
11.编码权利要求1至10任一项中所述的融合胶原酶的DNA。
12.由序列号4中记载的第1位至第3396位的碱基序列构成的DNA。
13.由序列号8中记载的第1位至第3105位的碱基序列构成的DNA。
14.含有权利要求11至13任一项中所述的DNA的表达载体。
15.被权利要求11至13任一项中所述的DNA或权利要求14中所述的表达载体转化的宿主细胞。
16.根据权利要求15中所述的宿主细胞，所述宿主细胞是大肠杆菌。
17.融合胶原酶的制造方法，其特征在于用针对亲和标记物的亲和层析对培养权利要求15或16中所述的宿主细胞所获得的培养物进行纯化，从而选择性地获取具有胶原结合部位的融合胶原酶。
18.用权利要求17中所述的方法制造的融合胶原酶。
全文摘要
使在胶原酶的羧基末端添加了亲和标记物的融合胶原酶作为重组蛋白质表达。发现通过用亲和层析纯化获得的融合胶原酶，可以选择性地回收具有胶原结合部位的胶原酶。
文档编号C12N15/00GK102216454SQ20098014572
公开日2011年10月12日 申请日期2009年11月6日 优先权日2008年11月19日
发明者后藤昌史, 山形洋平, 村岛弘一郎, 横山健吾, 福岛崇惠 申请人:国立大学法人东北大学, 明治制果药业株式会社