专利名称：源自成人肾小球的分离的多潜能间充质干细胞(hGL-MSC)、其制备方法及其在肾脏再生医 ...的制作方法
技术领域：
本发明涉及多潜能的人类间充质干细胞，其源自成人肾脏的脱被膜的肾小球并且显示出分化成多种细胞类型尤其是肾小球细胞类型的能力，同时，其特征在于显著的自我更新和克隆生成能力。此外，本发明涉及制备本发明的多潜能人类间充质干细胞的方法和此类干细胞在再生医学尤其是肾损伤和疾病的治疗性处理中的用途。
背景技术：
已知干细胞移植具有修复和再生受损的或损伤的组织和器官的潜力。因此，近年来已经进行了深入的研究，以便从人类和动物来源鉴定并分离新的多潜能干细胞，并研究干细胞在临床应用尤其是再生医学中的有效性。例如，基于BrdU保留，Oliver等人[3]在成年啮齿类动物的肾乳头中鉴定出缓慢循环的干细胞。使用相同的方法，Maeshima等人[4]在成年大鼠的肾小管中鉴定出BrdU标记的细胞并显示出此类干细胞生成邻近的肾小管的潜力，以及当被移植进入后肾时收集管细胞或纤维母细胞的潜力。Kitamura等人建立并表征了来自成年大鼠肾脏的肾单位的S3 部分的肾祖细胞的独特群体[37]。这些细胞显示为具有自我更新能力并表达肾胚胎标志物，例如Pax2、Wtn4和Wtnl。基于挤出Hoechst染料的能力，在小鼠胚胎和成人肾脏中鉴定出了具有多潜能潜力的所谓的“边缘群体(side population” [38]。最近，Gupta等人证明在成年大鼠肾脏中存在多潜能肾祖细胞的常驻于肾脏中的群体，其表达胚胎干细胞标志物，例如Oct-4和Ι^χ-2[5]。然而，鉴于它们的来源是动物，这些多潜能肾脏干细胞不能用于与人类组织或器官的再生相关的临床应用。在参考文献[39]中已经公开了从胚胎性人类肾脏中鉴定出的多潜能的 CD133+CD24+干细胞群。然而，这些胚胎干细胞不是解决提供用于再生医学的人类干细胞这一问题的最佳方案，尤其是考虑到与胚胎干细胞系以及从人类胚胎来制备它们相关的伦理学问题。本发明人之前公开在成人肾脏中存在CD133+祖细胞/干细胞的常驻群体[1]。 发现这些CD133+细胞是在靠近近侧肾小管和肾小球的间质中或肾小管内的稀少细胞，并且显示它们在体外和体内经历肾上皮和内皮分化。最近，Mgrinati等人从成年肾脏的鲍曼氏囊中分离并表征了多潜能⑶133+⑶M+细胞群[2]。然而，在人类肾脏中鉴定的⑶133+祖细胞/干细胞的特征在于自我更新能力差。此外，没有证明此类干细胞具有分化成存在于肾小球中的多种细胞类型即足细胞、内皮细胞和系膜细胞的能力。Schwab 等人，Human Reproduction (Oxford)，vol. 22，no. 11,2007 年 11 月，第 2903-2911页公开了子宫内膜的⑶146+PDGF-R0 +⑶34+间充质干细胞，其显示出MSC的经典分化能力，即分化为成脂肪、成骨、成软骨和成肌谱系。该论文没有提及进一步的分化能力。然而，这些细胞的子宫内膜来源强烈说明，它们不具有产生肾小球细胞类型例如足细胞、系膜细胞和内皮细胞的能力。
WO 2008/045498公开了源自肾脏的CD;34+CD133-CD105-细胞群，其能够分化成脂肪细胞和成骨细胞。然而，没有公开其分化成肾小球细胞类型。间充质干细胞(MSC)的特征在于它们分化成间充质来源的不同细胞系的能力 [7]。间充质干细胞的主要贮库是骨髓(BM) [8]。然而，最近在鼠模型中获得的数据证明了 MSC区室的更广泛的分布。事实上，已经在几乎所有的鼠成年组织(脾、肌肉、肾、肺、肝、脑、 胸腺)以及血管壁中检测到了 MSCM。在人类中，已经从循环的血液以及从数种组织例如滑膜、脂肪组织、骨小梁、牙髓、真皮和肺中分离了 MSC[9-16]。然而，目前为止尚未研究过人类肾小球中MSC的存在。
发明内容
鉴于以上所述，需要源自成人肾脏的间充质干细胞，其能够分化为存在于肾小球中的多种细胞类型并且能够自我更新，从而成功应用于肾的再生医学，尤其是作为药物用于影响人类肾脏的损伤和/或疾病、更具体而言是影响肾小球的损伤和/或疾病的治疗性处理。通过分离的多潜能人类间充质干细胞实现了这些和其它目标，所述细胞是由本发明人在成人肾脏的脱被膜的肾小球中鉴定并分离的。因此，本发明的第一个方面是源自成人肾脏的分离的多潜能肾小球间充质干细胞 (hGL-MSC)，其特征在于其为CD133 (阴性)、CD146 (阳性)、⑶34 (阴性)和⑶105 (阳性)。有利地，源自成人肾脏的分离的多潜能肾小球间充质干细胞(hGL-MSC)能够分化成肾小球细胞类型，即足细胞、系膜细胞和内皮细胞。在本发明的优选的实施方式中，hGL-MSC的特征还在于，其是⑶对(阳性)和 Ι^χ-2(阳性)。在本发明的优选的实施方式中，hGL-MSC的特征还在于，其是α -SMA(阴性)和 0ct-4(阴性)。本发明的另一个方面是制备本发明的hGL-MSC的方法，其包括以下步骤-在不存在特定生长因子的情况下，在包含含有血清的动物细胞培养基并且在生理PH缓冲的增殖培养基中培养来自成人肾脏的脱被膜的肾小球，从而获得从培养的脱被膜的肾小球中长出的细胞的混合群体，所述细胞的混合群体包含纺锤形的CD133(阴性)、 CD146 (阳性)细胞和CD133 (阳性)、CD146 (阳性)细胞；和-从所述混合群体中分离纺锤形的⑶133(阴性)、⑶146(阳性)细胞，所述纺锤形的⑶133 (阴性)、⑶146 (阳性)细胞即代表本发明的hGL-MSC。根据优选的实施方式，所述增殖培养基在6. 8至7. 4、更优选7. 2至7. 4的pH范围内缓冲。可以使用能够将PH维持在生理范围内的任意缓冲剂，例如H印es、PBS等。在另一个优选的实施方式中，所述代表本发明的hGL-MSC的纺锤形的CD133(阴性)、CD146 (阳性)细胞分离自细胞培养物的至少第3次传代，或分离自细胞培养物的后续传代，例如，第4次传代、第5次传代、第6次传代等。该实施方式是基于以下事实纺锤形的CD133 (阴性)、CD146 (阳性)细胞是在上述培养条件下，细胞培养物第3次传代后发现存活的混合群体中的唯一细胞类型。在本发明的实施方式中，所述纺锤形的⑶133(阴性)、⑶146(阳性)细胞是通过例如FACS的细胞分选方法从混合群体中分离的。或者，可以基于它们的纺锤形状的形态进行分离。有利地，本发明的hGL-MSC的特征在于显著的自我更新和克隆生成能力，以及分化成多种肾小球细胞类型的能力，所述肾小球细胞类型包括但不限于内皮细胞、系膜细胞和足细胞。这些特征使本发明的hGL-MSC特别适合用于肾再生。因此，本发明的另一个方面是本发明的分离的人类肾小球间充质干细胞 (hGL-MSC)作为药物用于肾脏损伤或疾病、尤其是影响肾小球的损伤或疾病的治疗性处理的用途。本发明的另一个方面是包含本发明的分离的人类肾小球间充质干细胞(hGL-MSC) 和药学上可接受的载体、稀释剂和/或介质的药物组合物。包含本发明的人类肾小球间充质干细胞(hGL-MSC)的药物组合物特别适合用于治疗肾脏损伤或疾病、尤其是影响肾小球的损伤或疾病。
本发明的其它优点和特征将通过以下详细描述并参考附图而变得明显，其中图1显示了从肾小球中长出的细胞的形态和生长速率。显示了培养M小时㈧、 7天(B)、2周(C)和3周(D)后以胶原酶I处理而除掉鲍曼氏囊，培养物中的成人肾小球的代表性显微图像(放大200倍)。显示了 5种不同制备物(称作R136、R140、R141、R147 和R148)的生长曲线。图2涉及本发明的hGL-MSC的表征。A)代表性的FACS分析，其显示hGL_MSC对于MSC的特征性表面标志物(⑶四、⑶44、⑶73、⑶90、⑶105、⑶166)是阳性的，对于⑶133 和特异性造血标志物(⑶45和⑶34)是阴性的，并且对于内皮标志物(⑶31)是阴性的。虚线是同种型对照。B)以针对波形蛋白、巢蛋白、Nanog和Musashi的抗体染色的hGL-MSC的代表性的免疫荧光显微图像(放大600倍)。产生的所有的hGL-MSC系都显示出相同的表型。图3显示了 hGL-MSC的免疫调节性质及其克隆效率。A)代表性的FACS分析，其显示hGL-MSC对于II类抗原和粘附分子⑶154以及共刺激分子⑶80、⑶86和⑶40 (黑线) 是阴性的。虚线是同种型对照。B)加入骨髓间充质干细胞(BM-MSC)或本发明的人类肾小球间充质干细胞(hGL-MSC)抑制了 PHA诱导的PBMC增殖。在存在2. 5 μ g/m PHA的情况下， 在含有或不含^dO3AilBM-MSC或hGL-MSC的情况下，培养PBMC (5xl04/ml) 48小时。数据表示为平均值士一式三份的4次独立实验的SD。*p < 0. 05 (Student t检验)。C)克隆生成效率表示为在每次培养传代中获得的克隆的百分率(％ )。图4是代表性的共聚焦显微图像，其显示了 A)⑶146和⑶对在肾小球中的共表达(箭头)；B)CD133在鲍曼氏囊的壁细胞中的表达(箭头)以及在近侧肾小管的上皮细胞中的表达(星号)；(C)在肾小球⑶146(阳性)和⑶M (阳性)细胞中不存在⑶133的表达(箭头)。原始放大630倍。
具体实施例方式本发明人进行的研究旨在探究在成人脱被膜的肾小球中是否存在间充质干细胞，以及此类干细胞是否是常驻群体。此外，本发明人评估了源自肾小球的MSC的分化潜力，尤其是分化为肾小球细胞类型例如足细胞、内皮细胞和系膜细胞的潜力。如在说明书的实验部分更详细地公开的那样，本发明的间充质干细胞(hGL-MSC) 获自通过手术方式切除的人类肾脏的皮层的正常部分。分离皮层并通过分级的连续网孔之后，收集肾小球悬浮液，洗涤并通过机械和酶处理除掉鲍曼氏囊。将脱被膜的肾小球(图 1A)在含有血清的缓冲的增殖培养基中在非分化条件下培养，也就是说，在不存在能够引导干细胞分化的特定生长因子的条件下培养。在7天内，观察到肾小球中长出粘附细胞(图1B)。到第12-14天时达到汇合时，通过胰蛋白酶-EDTA处理剥离细胞单层。通过低速离心除掉肾小球残留物，将细胞在相同的增殖培养基中增殖。在最初的培养阶段，细胞培养物中具有形态上的异质性(图1C)，但是在大约3周(即大约第4次传代)后，培养物变成单一形态的具有纺锤形的细胞(图1D)。 图IE显示了 5种不同的细胞制备物的生长曲线。在前5次传代过程中，生长速率低，但是随着连续的亚培养而增加，直至第20次传代(培养大约100天)，此时细胞不能再增殖。传代之间的间隔是大约3至7天，直至第4次传代，在第4次传代之后，传代之间的间隔设定为大约7天。从脱被膜的肾小球中长出的纺锤形的细胞是本发明的人类肾小球间充质干细胞 (hGL-MSC)。因此，可以基于它们的形态学特征从细胞培养物中分离这些干细胞，优选从细胞培养物的至少第3次传代或细胞培养物的后续传代，例如，第4次传代、第5次传代、第6 次传代分离。本发明人还观察到，从脱被膜的肾小球中长出的细胞是混合的群体，其在早期细胞传代(1-3)时包含31 士 11% CD133(阳性)和74 士洸％ CD133 (阴性)细胞(n = 15个制备物)，如通过流式细胞术所检测。两种细胞群体都表达CD146。因此，作为形态学方法的替代，可以通过细胞分选方法，例如荧光激活的细胞分选 (FACS)来分离本发明的人类肾小球间充质干细胞(hGL-MSC)。优选地，通过FACS从第2次、 第3次或第4次传代分离⑶133 (阳性)、⑶146 (阳性)细胞和⑶133 (阴性)、⑶146 (阳性)细胞；然而，也可以从任意细胞传代甚至在亚传代之前分离它们。表征并克隆FACS分选的群体。发现⑶133+⑶146+细胞共表达标志物⑶31和vWF，这表明其为内皮细胞表型。这种 ⑶133+群体不共表达巢蛋白(数据未显示)，也不共表达MSC标志物，例如波形蛋白、⑶73、 CD29或CD166(数据未显示)。当从经消化的脱被膜的肾小球的细胞悬浮液中通过免疫磁性分选CD133+细胞群体时，观察到相同的表型(数据未显示)。当在存在增殖培养基的条件下在第4次传代后表征从肾小球中长出的细胞时，无法再检测到CD133+细胞。分选的⑶133XD146+细胞对于MSC的特征性表面标志物(包括⑶四、⑶44、⑶73、 ⑶90、⑶105和⑶166) [25]是阳性的，并且对于⑶133和特定的造血标志物(⑶45和⑶34) 以及对于内皮标志物(CD31)是阴性的(图2A)。通过免疫荧光发现，这些细胞表达MSC特异性标志物波形蛋白和神经及肝脏常驻干细胞标志物巢蛋白[沈，27，观]，显示出细胞质丝状模式(图2B)。该细胞群体不表达上皮标志物细胞角蛋白和E-钙粘附蛋白。它也不表达通常由特化的肾小球细胞表达的其它标志物，例如α SMA(但是系膜细胞表达α SMA)或 Mphrin (但是足细胞表达η印hrin)(数据未显示)。这些特征表明不存在污染性的肾小球细胞。还评估了标志物NanOg、0ct-4和Musashi的表达。这些分子是已知的参与胚胎和成体干细胞的自我更新和多能性的转录因子[29-33]。本发明的干细胞群显示出Nanog和 Musashi 二者的细胞核-细胞质表达(图2B)，而它不表达0ct_4 (未显示)。还显示hGL-MSC组成型表达I类MHC抗原(图2A)，但是它们对于II类抗原、对于粘附分子⑶154以及对于共刺激分子⑶80、⑶86和⑶40是阴性的(图3A)，如对于BM-MSC 所描述的那样[34]。此外，类似于BM-MSC (已知其抑制PHA诱导的PBMC增殖)，hGL-MSC使 PHA诱导的PBMC增殖显著减少(图:3B)。然而，不同于BM-MSC的是，hGL-MSC是⑶对(阳性)和Pax-2(阳性)的。此外发现，本发明的hGL-MSC对于α -SMA和Oct-4都是阴性的， 这不同于分离自小鼠肾脏的肾干细胞。为了证明从肾小球获得的hGL-MSC群体的自我更新能力，本发明人在分选的 ⑶133+CD146+和⑶133TD146+细胞上进行了克隆生成测定。将单细胞悬浮液接种于96孔板中，分选在增殖培养基中的培养物的第3次传代时从肾小球中长出的细胞。CD133—CD146+ 细胞的克隆生成效率是25.3士5.1%，而^133+00146+细胞不是克隆生成性的(图3C)。从 CD133XD146+细胞的原代克隆产生的单细胞悬浮液的接种提供了次级克隆，从次级克隆产生的单细胞的接种产生三级克隆(图3C)。这些数据表明肾小球的⑶133TD146+细胞是克隆生成性的并且在体外显示出自我更新能力，而⑶133+CD146+细胞在这些培养条件下不能产生克隆。通过流式细胞术和免疫组化方法分析了⑶133TD146+克隆，其显示出与源自未克隆的群体的hGL-MSC相同的间充质表型(数据未显示)。当在存在增殖培养基的条件下在第4次传代后表征从肾小球长出的未分选的细胞时，它们都显示出间充质表型，这表明所用的培养条件对于hGL-MSC的增殖是选择性的。本发明人还进行了旨在研究本发明的GL-MSC是否是常驻于肾的群体而非定位于肾小球的源自BM的MSC群体的实验。为此目的，首先检测了由常驻干细胞和源自BM的干细胞差别化表达的标志物的存在。hGL-MSC表达⑶M，但是⑶对在源自BM的MSC中是阴性的并且被认为是常驻于肾的干细胞的标志物[2，35]。器官特异性胚胎1^皿-2蛋白和基因的表达也说明hGL-MSC的起源是肾。BM-MSC不表达I^ax-2。Pax-2是由后肾间充质的干细胞表达的转录因子[36]，是由分离自成年大鼠和人类肾脏的干细胞表达的转录因子[1，5]。 此外，本发明人从由男性供体移植进入女性接受者的移植的肾脏的肾小球分离了 hGL-MSC。 源自移植的肾脏的hGL-MSC显示出与源自正常肾脏的hGL-MSC相同的表型(数据未显示)。 为了测定hGL-MSC是源自接受者骨髓还是源自移植的肾脏，在第2次和第6次传代时分析了 hGL-MSC中的Y染色体的存在情况。在第2次传代078个细胞核；23个中期)和第6 次传代G36个细胞核；25个中期)时分析了总共914个细胞核和48个中期。双色X(绿色)/Y(红色)着丝粒探针的杂交模式的FISH分析显示90%的细胞核具有男性红色/绿色模式，10%的细胞核仅具有1个绿色斑点。具有1个绿色斑点的细胞核可能源自丢失了 Y染色体的男性细胞核，Y染色体的丢失是培养中经常发生的事件。没有观察到女性细胞核 O个绿色斑点)。hGL-MSC的所有48个中期中检测到的核型都是男性的。以用于FISH负染的DAPI观察到的中期染色体显示为正常的。这些数据说明hGL-MSC不是来源于接受者的骨髓。相反，它们是供体肾脏的肾小球中的常驻群体。由于间充质干细胞的最主要的特征之一是它们的分化成多种间充质谱系的能力，本发明人测评了本发明的hGL-MSC分化成特定的结缔组织细胞的能力。在确定的培养条件下，显示了在第2个或第3个传代分选的CD133+CD146+群体不能分化为成脂肪、成骨和成软骨谱系(数据未显示)。相反，显示了获自15位患者的最初的⑶133TD146+hGL-MSC系(在第4-10次传代)和随后获得的4个克隆具有多谱系分化能力。在成骨培养基中培养14天后，hGL-MSC有效地进行成骨分化，如钙沉淀物的 Alizarin Red染色所显示。当在脂肪细胞培养基中培养21天时，hGL-MSC产生含有脂滴的细胞。在未分化的对照中，未观察到矿化或脂滴的迹象。使用软骨细胞选择性培养基[7]获得了 hGL-MSC向软骨细胞的分化。在处理的第 28天收获的分化的沉淀物被Mfranin 0和Alcian蓝染色，这是软骨细胞分化的典型特征 [7]。综上所述，这些结果证明了本发明的hGL-MSC的多谱系分化能力。值得注意的是， 以最初分离的15个hGL-MSC系和随后获自最初的细胞系的4个克隆获得了非常相似的结^ ο还评估了 hGL-MSC在合适的培养条件下分化为特定的肾小球细胞群体例如内皮细胞、足细胞和系膜细胞的能力。为了获得内皮的分化，将hGL-MSC在EBM中在存在VEGF的情况下培养3周。流式细胞术分析显示出特定的内皮标志物例如⑶105、KDR、⑶34和⑶31 的表达。此外，当在Matrigel中培养时，内皮分化的hGL-MSC和非分化的细胞形成特征性的毛细管样结构(数据未显示)。在存在PDGFlA和TGF β 1的情况下，hGL-MSC获得了系膜样表型。特别地，它们获得了 α-SMA和血管紧张素2受体I(ATl)的表达。当在存在20 μ M/ L ATRA的情况下培养3周时，hGL-MSC获得了特定的上皮标志物的表达，所述上皮标志物是足细胞表达的标志物例如细胞角蛋白、podocin、nephrin和突触极蛋白。通过实时PCR确认了 Mphrin的表达，其显示在分化成足细胞后的hGL-MSC中存在η印hrin转录物，但在维持在阻止分化的增殖培养基中的hGL-MSC中不存在。测试的3个克隆的细胞系获得了相似的结果。在所有的实验条件下，分化的细胞丧失了干细胞性质相关的标志物，例如Nanog、 Musashi、波形蛋白、巢蛋白、⑶90、⑶146、⑶73，系膜和内皮分化的细胞除外，它们保持了通常由成熟细胞表达的CD90和CD146(数据未显示)。所有的hGL-MSC细胞系和克隆都显示出相同的分化能力。源自BM的MSC在相同培养条件下能够分化成内皮细胞和肌肉样细胞， 但是不分化成足细胞样细胞(数据未显示)。总之，本发明人研究了预先脱被膜的人类肾小球中干细胞的存在，脱被膜是为了避免与鲍曼氏囊相关的干细胞的存在。发现在早期传代时从脱被膜的肾小球长出的细胞由 2个不同群体组成⑶133+CD146+群体和⑶133XD146+群体。⑶133+细胞很可能是内皮定向的细胞群体，因为它们共表达内皮标志物。此外，CD133+CD146+细胞在第3次传代后不存活。另外，当分选CD133+CD146+群体时，其不能够自我更新并且不是克隆生成性的。相反，发现从脱被膜的人类肾小球分离和克隆的⑶133TD146+群体是能够产生长期培养物的间充质干细胞的多潜能群体。有趣的是，它们是从肾小球中长出的在第4次细胞传代培养后唯一存活的细胞。这些细胞被称作hGL-MSC。hGL-MSC与源自BM的MSC以及源自其它成体组织的MSC[9-16，26-28]共有下列特征表达Q^9、CD44、CD166、CD73、CD90、⑶105、⑶146、波形蛋白和巢蛋白；无⑶34和⑶45 ；进行中胚层分化的能力(骨细胞、软骨细胞和脂肪细胞)。此外，hGL-MSC表达参与细胞维持的Nanog和Musashi胚胎标志物。类似于源自BM的MSC，hGL-MSC能够抑制PHA诱导的PBMC的增殖。来自成年小鼠的非肾小管 ka-1+lin-多潜能干细胞/祖细胞WO]和源自心脏、脾和外周脂肪的人类MSC[41]显示出类似的免疫调节效应。成体器官中的MSC的起源是有争议的。在本研究中，本发明人发现分离的 hGL-MSC具有常驻于肾的干细胞的表型特征。事实上，与BM-MSC不同的是，hGL-MSC表达 ⑶24，⑶对被认为是常驻于肾的祖细胞的标志物[2，35]，还表达1^拟-2胚胎器官特异性转录因子[1，5，36]。以前已经证明，Pax-2的表达是常驻于肾的干细胞群体的标志物[1，5， 36]。此外，具有供体的性别特征的hGL-MSC在肾同种移植物中的存在提供了证据证明了局部常驻于成人肾小球中的MSC群体的存在。该结果与之前来自于肺移植研究的关于在人类肺中提供的常驻于组织的MSC的证据是一致的[16]。hGL-MSC在合适的培养条件下分化成内皮细胞和分化成特定的肾小球谱系例如足细胞和系膜样细胞的能力显示出它的肾定向。事实上，当在存在ATRA和IV型胶原的情况下培养时，hGL-MSC能够分化成表达特异于足细胞的裂孔隔膜的标志物例如η印hrin、突触极蛋白和podocin的上皮细胞。这与BM-MSC不同。通过在存在TGF β 1和PDGF-bb (已经报道TGF β 1和PDGF_bb诱导源自BM的多潜能成年祖细胞中的平滑肌细胞分化[20])的混合物的情况下培养细胞，获得了 hGL-MSC 向肾小球系膜细胞的分化。此外，hGL-MSC显示出免疫调节性质，因为它们抑制PHA刺激的 PBMC的增殖，类似于BM-MSC[23-25]。hGL-MSC的免疫调节活性与炎性肾小球疾病相关。总之，本研究的结果证明在成人脱被膜的肾小球中存在常驻的多潜能干细胞的群体，其表达间充质表型，具有促成不同的肾小球特异性细胞类型的转变的潜力。在以下的实验部分更详细地描述了从成人肾小球中分离本发明的人类肾小球间充质干细胞以及它们的特征性特征，其仅是通过解释的方式提供，不是意在限制如随附的权利要求定义的本发明的范围。实验部分材料和方法 i Kmn^mmmmmifM^mm^Mmim来自肾小球的人类间充质干细胞(hGL-MSC)获自通过手术切除的肾脏(15例不同的制备物)的皮质的正常部分。分离皮质并通过分级的连续网孔(60和120孔)之后，收集肾小球悬浮液，以Hans Balanced Salt Solution(GIBCO,Grand Island，NY)洗涤并通过机械方式和酶学方式除掉鲍曼氏囊，所述机械方式为使用IOml的吸液管进行数轮的吸液/ 排液，所述酶学方式为以胶原酶I (Sigma，St. Louis, MO)消化2分钟。将脱被膜的肾小球转移至纤连蛋白包被的 T25 培养瓶(Falcon, BD Bioscience, Two Oak Park, Bedford, MA) 中。比较了数种培养基。在存在IX ITS(Sigma)和H印es (游离的酸，IOmM) (Sigma) 的情况下，含有 10% FCS(Euroclone, ffetherby, UK)的 RPMI (Sigma)(增殖培养基)允许 hGL-MSC的最佳扩增，因此其被用于以下的实验。按照以前的描述从BM中分离人类MSC并进行培养[7]。
牛长动力学按照之前的描述生成描述培养物动力学的生长曲线W]。为了简化起见，将原代 hGL-MSC培养物占据的生长面积(对应于25cm2)假设为1。当发生第2次传代时，将第1 次传代时的分传比(1 幻乘以该数值，也就是说，在第1次传代结束时，累积生长面积是 3(即，原代培养物的占据的生长的3倍)。在第2次传代结束时，第2次传代时的分传比 (1 3)乘以第1次传代时的累积生长面积(3x3 = 9)。对于每次传代都重复该程序，从而提供与细胞数目成正比的理论生长曲线。在5例不同的肾小球制备物中评测生长情况。源自肾小球的间充质干细胞的表征按照之前的描述进行细胞荧光测定分析[1]，使用下列抗体，其全部是藻红蛋白(PE)或荧光素异硫氰酸盐(FITC)缀合的抗-⑶105、抗-⑶四、抗-⑶31、抗-⑶146、 抗-CD44> 抗-CD24> 抗-CD90(Dakocytomation, Copenhagen, Denmark)；抗-CD73> 抗-CD34、抗-CD45、抗-CD80、抗-CD86、抗-CD166、抗-HLA-I(Becton Dickinson Biosciences Pharmingen, San Jose, CA)； 抗-CD133(Miltenyi Biotec, Auburn)； KDR(R&D Systems, Abington, U. K.)；抗-HLA-II(Chemicon International Temecula, CA)，抗-CD40(Immunotech，Beckman Coulter)，抗-CD154 (Serotec，Raleigh, NC USA)单克隆抗体。小鼠IgG同种型对照来自Dakocytomation。所有的温育在含有0. 牛血清白蛋白和0.1%叠氮化钠的ΙΟΟμΙ磷酸盐缓冲液(PBS)中在4°C进行。对于每个样品，在 FACSCalibur细胞仪(BD Biosciences Pharmingen)上分析10，000个细胞。基于阴性对照构建闸门，在所进行的所有分析中都包括补偿对照。使用Cell Quest软件(BD Biosciences Pharmingen)对来自每次实验的设闸门的群体产生群体百分率和数目。在未分化的或分化的hGL-MSC上进行间接免疫荧光分析，所述hGL_MS培养于腔室玻片(Nalgen Nunc International, Rochester, NY, USA)上，以含有 2%蔗糖的 4%多聚甲醛固定，如果需要，以ifepes-Triton X 100缓冲液(Sigma)进行通透化处理。使用下列单克隆抗体抗-波形蛋白(Sigma)、抗-细胞角蛋白(Biomeda，Foster City CA)、 抗-E-钙粘附蛋白(Dakocytomation)，α-平滑肌肌动蛋白(α SMA) (Dakocytomation)、 抗-突角虫极蛋白(Progen Biotechnik, Heidelberg)。使用了抗-von Willebrand 因子 (vffF) (Dakocytomation) > Jfl - M ^ [=| (Chemicon International)、Jfi -Pax~2 (Covance, Princeton, NJ)、抗-Nanog> 抗-0ct_4、抗-Musashi (AbCam, Cambridge, Science Park Cambridge UK)、抗-podocin、抗-血管紧张素 II 受体 1 (ATI) (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz，CA)兔多克隆抗体和猪多克隆抗-N印hrin (Progen Biotechnik)。视需要使用下列对照不加初级抗体；或将初级抗体替换为非免疫兔、大鼠或小鼠IgG。Alexa Fluor 488 抗-兔子或抗-猪 IgG 和 Texas Red 抗-小鼠 IgG (Molecular Probes, Leiden, The Netherlands)用作次级抗体。使用 Zeiss LSM 5 Paseal Model Confocal Microscope (Carl Zeiss hternational，Germany)进行共聚焦显微镜分析。加入Hoechst 33258染料 (Sigma)进行细胞核染色。标志物表达特征谱的总结下面的表1提供了本发明的人类肾小球间充质干细胞(hGL-MSC)的标志物表达特征谱的总结
权利要求
1.源自成人肾脏的分离的多潜能肾小球间充质干细胞(hGL-MSC)，其特征在于标志物 CD133 (阴性)、CD146 (阳性)、CD34 (阴性)和CD105 (阳性)，其特征还在于分化成至少下列细胞类型的能力足细胞、内皮细胞和系膜细胞。
2.根据权利要求1的源自成人肾脏的多潜能肾小球间充质干细胞(hGL-MSC)，其还能够进行成骨、成脂肪和成软骨分化。
3.根据权利要求1或2的源自成人肾脏的多潜能肾小球间充质干细胞(hGL-MSC)，其对于标志物⑶对和Pax-2是阳性的。
4.根据权利要求1-3的任意项的源自成人肾脏的多潜能肾小球间充质干细胞 (hGL-MSC)，其对于标志物α -SMA和0ct_4是阴性的。
5.根据权利要求1-4的任意项的源自成人肾脏的多潜能肾小球间充质干细胞 (hGL-MSC)，其对于标志物CD45是阴性的。
6.根据权利要求1-5的任意项的源自成人肾脏的多潜能肾小球间充质干细胞 (hGL-MSC)，其对于标志物CD31是阴性的。
7.根据权利要求1-6的任意项的源自成人肾脏的多潜能肾小球间充质干细胞 (hGL-MSC)，其对于选自下列的间充质干细胞特征性的表面标志物是阳性的CD29、CD44、 ⑶73、⑶90、⑶166或其任意组合。
8.根据权利要求1-7的任意项的源自成人肾脏的多潜能肾小球间充质干细胞 (hGL-MSC)，其对于标志物Nanog和Musashi是阳性的。
9.根据权利要求1-8的任意项的源自成人肾脏的多潜能肾小球间充质干细胞 (hGL-MSC)，其对于波形蛋白和巢蛋白是阳性的，并且对于细胞角蛋白是阴性的。
10.根据权利要求1-9的任意项的源自成人肾脏的多潜能肾小球间充质干细胞 (hGL-MSC)，其组成型表达I类MHC抗原并且对于II类MHC抗原是阴性的。
11.根据权利要求10的源自成人肾脏的多潜能肾小球间充质干细胞(hGL-MSC)，其对于共刺激分子⑶80、⑶86和⑶40是阴性的。
12.制备根据权利要求1-11的任意项的源自成人肾脏的分离的多潜能肾小球间充质干细胞(hGL-MSC)的方法，其包括下列步骤-在不存在特定生长因子的情况下，在包含含有血清的动物细胞培养基并且在生理 PH缓冲的增殖培养基中培养来自成人肾脏的脱被膜的肾小球，从而获得从培养的脱被膜的肾小球中长出的细胞的混合群体，所述细胞的混合群体包含纺锤形的CD133(阴性)、 CD146 (阳性)细胞和CD133 (阳性)、CD146 (阳性)细胞；和-从所述混合群体中分离纺锤形的CD133(阴性)、CD146(阳性)细胞，所述纺锤形的 CD133(阴性)、CD146(阳性)细胞即代表所需的源自成人肾脏的人类多潜能肾小球间充质干细胞(hGL-MSC)。
13.权利要求12的方法，其中所述纺锤形CD133(阴性)、CD146(阳性)细胞分离自细胞培养物的至少第3次传代。
14.权利要求12或13的方法，其中所述CD133(阴性)、CD146(阳性)细胞是根据它们的纺锤形状的形态分离的。
15.权利要求12或13的方法，其中所述⑶133(阴性)、⑶146 (阳性)细胞是通过细胞分选方法分离的。
16.用作药物的根据权利要求1-11的任意项的源自成人肾脏的分离的多潜能肾小球间充质干细胞(hGL-MSC)。
17.用作再生医学的药物的根据权利要求16的源自成人肾脏的分离的多潜能肾小球间充质干细胞(hGL-MSC)。
18.用作肾损伤或疾病的治疗性处理的药物的根据权利要求17的源自成人肾脏的分离的多潜能肾小球间充质干细胞(hGL-MSC)。
19.用作肾小球损伤或疾病的治疗性处理的药物的根据权利要求18的源自成人肾脏的分离的多潜能肾小球间充质干细胞(hGL-MSC)。
20.药物组合物，其包含根据权利要求1-11的任意项的分离的人类肾小球间充质干细胞(hGL-MSC)和药学上可接受的载体、稀释剂和/或介质。
全文摘要
本发明涉及源自成人肾脏的分离的多潜能肾小球间充质干细胞(hGL-MSC)，其特征在于标志物特征谱CD133-、CD146+、CD34-和CD105+。还公开了从脱被膜的肾小球制备本发明的hGL-MSC的方法，以及本发明的hGL-MSC用于肾脏的再生性治疗，尤其是用于治疗影响肾小球的损伤或疾病的用途。
文档编号C12N5/074GK102292434SQ200980154241
公开日2011年12月21日 申请日期2009年11月2日 优先权日2008年11月4日
发明者B·布索拉蒂, G·卡姆西, S·布鲁诺 申请人:弗雷森纽斯医疗护理德国有限责任公司