专利名称：用于抑制cripto/grp78复合物形成和信号的组合物和方法
技术领域：
本发明一般涉及分子生物学和医学领域。更加具体而言，其涉及对Cripto/GSP78 信号破坏所涉及高增生性疾病的治疗。
背景技术：
Cripto (Cripto-1, TDGF1)是在胚胎发生过程中具有基本生理学作用的小的GPI 锚定信号蛋白。其还在人肿瘤中高水平表达，并且与肿瘤引发和进展的数个方面相联系，包括增强的细胞增殖、迁移、侵袭、肿瘤血管发生和上皮间质转化(EMT) (Strizzi等，2005)。认为数个作用机制促成了 Cripto的致癌作用基础(Strizzi等，2005)。例如， 它通过与这些配体中的一些配体以及它们各自的信号受体形成复合体调节TGF-β超家族成员的信号。在该背景下，Cripto在促进某些配体例如Nodal的信号(Schier，2003 ； Shen 和 Schier，2000)而抑制激活蛋白(Adkins 等，2003 ；Gray 等，2003)和 TGF-β 1 (Reddy 等，2003)的信号中具有专一性作用。由于激活蛋白和TGF-β具有肿瘤阻抑制因子作用 (Pardali和Moustakas，2007)，它们的信号被Cripto抑制提供了至少部分解释Cripto促进肿瘤生长的机制(Adkins等，2003 ；Gray等，2003 ；Gray等，2006)。相反地，Cripto依赖的Nodal信号将促成肿瘤生长和转移的晚期阶段，在该条件下细胞变成抵抗TGF- β配体的生长抑制作用(Pardali 和 Moustakas，2007 ；Topczewska 等，2006)。Cripto也可以溶解形式从细胞释放并且以类似于分泌的生长因子的方式起作用 (Strizzi等2005)。在该方面，据报导，Cripto和爪蟾的Cripto直向同源物FRL-I分别引起 erbB-4 (Bianco 等，1999)和 FGFR-I (Kinoshita 等，1995)的磷酸化。然而，Cripto 不直接结合这些蛋白质，并且介导这些磷酸化事件的假定的Cripto受体还没有找到(Bianco等， 1999 ；Kinoshita等，1995)。在该方面，虽然Cripto拥有EGF样结构域并且类似于EGF受体的配体，但它不直接结合EGF受体家族的任何成员(Bianco等，1999)。此外，虽然Cripto 结合细胞外的GPI锚定的蛋白聚糖磷脂酰肌醇蛋白聚糖-1通过c-Src引起MAPK和PI3K 途径的活化，但是仍没有鉴定出介导该作用的跨膜蛋白质(Bianco等，2003)。因此，虽然Cripto具有促进肿瘤生长的多种信号机制，但是已知其细胞表面结合配偶体似乎不能完全解释所报导的其致癌作用。考虑到高增生性疾病的明显的社会和经济影响，因此需要对高增生性疾病的改良治疗，并且对Cripto引起这些效应的机制的了解将得到改良的治疗和筛选方法。
发明内容
本发明通过确定了 Cripto可结合葡萄糖调节蛋白78(GRP78)并引起促进高增生性细胞的生长的下游信号而克服现有技术的局限性。因此，本发明提供可用于治疗疾病如癌症的Cripto/GRP78相互作用抑制剂。在另外的方面中，本发明提供用于筛选Cripto/ GRP78复合物形成的调节剂的方法。本发明至少部分地基于这样一个令人惊奇的发现，即细胞表面的GRP78是Cripto 结合配偶体并且是人肿瘤细胞、人胚胎干细胞和正常人乳腺上皮细胞中Cripto信号所必需的。因此，细胞表面Cripto/GRP78复合体代表着干细胞和肿瘤细胞中可以被治疗性靶向的新的和称心如意的靶标。发明人在下面进一步证明，细胞表面Cripto/GRP78相互作用对于Cripto共受体功能和肿瘤生长因子活性是必需的。结果表明，对细胞表面GRP78的敲低或免疫中和封闭了 Cripto对激活蛋白、Nodal和TGF-β信号的调节并阻止了 Cripto对 c-Src/MAPK/PI3K途径的活化。因此资料支持这样一种想法，即GRP78是对于Cripto信号必需的Cripto受体/共因子。重要的是，发明人首次证明GRP78存在于人ES细胞表面，其中它与Cripto共定位并且介导Cripto对激活蛋白和Nodal信号的相反作用。Cripto与细胞表面GRP78的结合对于Cripto增加细胞增殖和降低E-钙黏着蛋白表达和细胞粘附的能力也是必需的，表明这些蛋白质会一起作用促进肿瘤生长和转移。发明人发现，激活蛋白-A 和Nodal在Cripto/GRP78复合体存在下是促有丝分裂的而在Cripto/GRP78复合体缺乏时激活蛋白-A具有细胞抑制作用并且Nodal对增殖无作用。不希望被任何理论所束缚，该结果支持这样一个想法，即细胞表面Cripto/GRP78复合体通过协调MAPK/PI3K和Smad2/3途径之间的通讯调节细胞增殖。本发明的一个方面涉及用于抑制细胞中Cripto信号的方法，包括抑制CriptO和 GRP78之间复合体形成的形成。方法将包括将至少所述细胞表面与选择性的GRP78靶向性化合物接触，其中所述抑制包括抑制Cripto/GRP78复合体在细胞表面上的形成。所述复合体的形成将被抗GRP78抗体抑制，并且抗GRP78抗体将结合GRP78的N-20表位。在某些实施方案中，抗GRP78抗体是人源化单克隆抗体。抗体可与报告分子，例如放射性配体或荧光标签缀合。所述复合体的形成将被抗GRP78F(ab)或F(ab)2，或GRP78靶向性shRNA、siRNA 或siNA(例如包括SEQ ID N0:5的GRP78靶向性shRNA)抑制。施用可以是全身性的、局部的、部位性的、肠胃外的、静脉内的、腹膜内的、通过吸入或者瘤内的。在某些实施方案中，方法进一步定义为降低细胞增殖的方法，包括细胞与有效量的优先结合GRP-78并抑制GRP-78结合Cripto并引起Nodal信号的能力的GRP-78靶向性化合物接触。方法可包括将至少所述细胞表面与Cripto靶向性化合物接触，其中Cripto 靶向性化合物选择性地结合Cripto的CFC结构域或GRP78-结合结构域中的表位并抑制 Cripto与GRP78之间复合物的形成。Cripto靶向性化合物可以是结合Cripto的GRP78-结合结构域或CFC结构域中表位的抗体。方法可包括将至少所述细胞的表面与shRNA接触，其中shRNA包括SEQID NO :4。靶向性化合物可以是不结合或基本不结合Cripto的GRP78突变体。GRP78突变体可以是缺乏天然GRP78的氨基酸19-68位的GRP78突变体，例如Δ 19-68 GRP78。在另外的实施方案中，GRP78可以通过在GRP78的19-68位氨基酸区的一个或更多个替代或插入突变进行突变以产生不结合或者基本不结合Cripto的GRP78突变体。所述细胞可以衍生自选自下列的器官乳腺、结肠、胃、胰脏、肺、卵巢、子宫内膜、睾丸、膀胱、前
5列腺、头、颈、子宫颈、胃、胆囊和肾上腺皮质。细胞可以是癌性细胞、癌前细胞或恶性细胞， 并且其中方法进一步定义为治疗高增生性疾病例如癌症的方法。癌症可以选自乳腺癌、结肠癌、胃癌、胰腺癌、肺癌、卵巢癌、子宫内膜癌、睾丸癌、膀胱癌、前列腺癌、头颈癌、宫颈癌、 胆囊癌或肾上腺皮质癌。在某些实施方案中，方法进一步定义为降低细胞增殖的方法。方法可包括降低细胞中由Cripto引起的Nodal信号、激活蛋白/TGF-β信号或c_Src/MAPK/PI3K信号的方法。 方法可包括向受试者施用第二治疗，例如化学治疗(例如紫杉醇、顺钼或碳钼)、放射治疗、 基因治疗、免疫治疗或外科手术。方法可进一步定义为促进干细胞向神经元细胞分化的方法，其中细胞是干细胞， 并且其中抑制Cripto与GRP78之间复合体的形成促进细胞向神经元细胞分化。细胞可以是人胚胎干细胞(例如H9或BG02)或者诱导的多能干细胞(iPSC)。本发明的另一个方面涉及筛选Cripto/GRP78复合物形成的抑制剂的方法，包括 得到候选调节剂，将候选调节剂与Cripto和GRP78接触，并测量Cripto/GRP78复合体的形成，其中在候选调节剂存在下Cripto/GRP78复合体形成的减少或者Cripto/GRP78复合体信号的降低表明候选调节剂是Cripto/GRP78复合物形成的抑制剂。Cripto和GRP78可以由细胞表达。在某些实施方案中，Cripto和GRP78由细胞转基因性过表达。细胞可以是癌性细胞或癌前细胞。方法可包括测量Cripto/GRP78信号，其中Cripto/GRP78信号包括激活蛋白/TGF-β信号、c-Src/MAPK/PI3K信号或PI3K/Akt/GSK3i3信号。方法可包括测量 Cripto和GRP78之间的结合，其中在候选调节剂存在下Cripto/GRP78结合的降低表明候选调节剂抑制Cripto/GRP78复合物形成。所述的测量结合可包括细胞表面生物素化作用 /Co-IP测定(例如如在Shani等2008中所述的那样)、125I_Cripto结合测定(例如在完整细胞中)、包括测量Cripto与固定化GRP78结合的测定(例如在多孔板中)、或者测量可溶性Cripto结合的ELISA测定。在许多实施方案中，包括将Cripto和GRP78用荧光团或猝灭剂标记并例如使用FACS测量荧光的荧光测定可以在本发明中使用。本发明的又一方面涉及人源化单克隆抗GRP78抗体，其中抗体结合GRP78中的 N-20表位，并且其中所述结合抑制Cripto/GRP78复合体形成。抗体可以包含在药物组合物中，并且药物组合物可以配制成用于肠胃外、静脉内或瘤内施用。术语“抑制”、“降低”或“阻止”或者这些术语的任何变形，当在权利要求书和/或说明书中使用时包括任何可测量的降低或者完全抑制以达到预期结果。如在说明书和/或权利要求书中使用的术语“有效的”意思是指足以达到想要的、 期望的或预期的结果。当词语“a”或“an”在权利要求书和/或说明书中与术语“包括(包含)”结合使用时意思是指“一”，但是其还有“一或更多”、“至少一”和“一或一以上”的含义。考虑了就本发明的任何方法或组合物而言，在本说明书中讨论的任何实施方案可以实施，并且反之亦然。此外，本发明组合物可以用于实现本发明的方法。在本申请通篇中，术语“大约”用于指数值包括对于所采用测定数值的设备、方法所固有的误差变化，或者在研究受试者当中存在的变异。虽然本公开支持术语“或”的定义指仅仅备选方案和“和/或”，但是除非明确地指出是仅指备选方案或者备选方案相互排斥，否则术语“或”在权利要求书的使用意思是指“和/或”。如在本说明书和权利要求书中所使用，词语“包含”(和包含的任何形式，例如复数和单数形式的“包含”)、“具有”(和具有的任何形式，例如复数和单数形式的“具有”)、“包括”(和包括的任何形式，例如复数和单数形式的“包括”)或“含有”(和含有的任何形式， 例如复数和单数形式的“含有”)是包含在内的或开放式的并且不排除另外的、非描述的元素或方法步骤。根据下列详细的描述，本发明的其他目的、特征和优势将变得显而易见。然而，应当理解，详细的描述和表明本发明特定实施方案的特定实施例仅通过例证方式给出，因为根据该详细的描述，处于本发明精神和范围内的许多改变和修改对本领域技术人员而言将变得显而易见。
下列图构成本说明书的一部分，并且旨在进一步证明本发明的某些方面。通过参考一个或更多个这些附图并结合本文呈现的特定实施方案的详细描述可更好的理解本发明。图1A-C.新的Cripto结合蛋白的鉴定.293T细胞以空载体或Cripto-Flag转染， 免疫沉淀在抗Flag珠上，然后以Flag肽洗脱。通过SDS-PAGE分离Cripto相关蛋白然后或者进行银染色(A)或者印迹在硝酸纤维素上并用抗GRP78或抗Cripto抗体探测(C)，如在下面材料和方法中所述。将在(A)中指定为a和b的条带切下并进行质谱分析，如在下面材料和方法中所述。对应于条带a的鉴定为GRP78的质量指纹数据示于(B)中。图2A-D. Cripto结合细胞表面上的GRP78. 293T细胞根据指示以的构建体转染 (A-D)并且P19细胞(D)以细胞不渗透性NHS-LC-生物素标记。使用所标明的抗体对细胞裂解液进行免疫沉淀，然后用Flag肽(肽洗脱液)或者通过在样品缓冲液中加热珠洗脱。 样品通过SDS-PAGE分离并且用抗生物素蛋白-HRP或者标明的抗体进行印迹，如下面材料和方法中所述。在一些情况中(B和C)，对过表达GRP78的293T细胞进行细胞表面生物素化作用，然后将所得到的细胞裂解液与载体或Cripto-Flag珠孵育。图3A-C.使用RNA干扰对GRP78表达的靶向性降低.HeLa细胞以包含 GRP78shRNA(Gl)或空载体的慢病毒感染，并用如所标明的毒胡萝卜内酯处理或者不处理。 (A)通过使用抗GRP78或抗肌动蛋白的抗体的Western印迹分析细胞裂解液，如在材料和方法中所描述。(B)柱表示每100个GFP阳性细胞中凋亡细胞的数量，如在材料和方法中所述。(C)以载体或GlshRNA病毒感染的细胞以包含Cripto-Flag的病毒再次感染。使用抗Flag珠对来自这些细胞的裂解液进行免疫沉淀，然后用Flag肽洗脱。使用抗生物素蛋白-HRP、抗GRP78和抗Cripto抗体对洗脱蛋白质进行Western印迹分析，如下面材料和方法中所述。图4A-D.内源GRP78表达的抑制增强TGF-β诱导的Smad2磷酸化.HeLa细胞以包含靶向GRP78的ShRNA(Gl)或空载体的慢病毒感染，然后用如所标明的5 μ M毒胡萝卜内酯处理或者不处理。在毒胡萝卜内酯过夜处理之后，细胞根据指示以剂量的TGF-βΙ处理 (Α和B)，然后通过Western印迹确定磷酸化Smad2和总的Smad2水平，如在下面材料和方法中所述。备选地，按照所标明处理的相同的细胞以细胞不渗透性生物素标记，所得到的裂解液用抗GRP78抗体(抗KDEL)免疫沉淀，接着使用抗生物素蛋白-HRP进行Western印迹 (C)，或者使用抗T β RI、抗T β RII或抗肌动蛋白抗体将裂解液直接进行Western印迹(D)， 如在材料和方法中所述。图5. GRP78不直接结合TGF-β类型I和类型II受体.293T细胞以p26_Flag、 Cripto-Flag、T β RI-HA或T β RII-His转染，然后使用如所标明的抗Flag、抗HA或抗His 抗体进行免疫沉淀。使用抗生物素蛋白-HRP或标明的抗体对沉淀的蛋白质进行Western 印迹分析，如在下面材料和方法中所述。图6A-D. Cripto 和 GRP78 协同抑制 TGF- β 信号.(A)以空载体、GRP78、Cripto 或者GRP78和Cripto两者转染的PC3细胞根据指示以的TGF-β I(IOpM)处理或者不处理。磷酸化Smad2 (pSmad2)和总Smad2 (Smad2)水平通过Western印迹测定，如下面材料和方法中所述。(B)来自(A)的磷酸化Smad2条带使用光密度测定法定量并且相对于对应的Smad2 条带标准化，如下面材料和方法中所述。(C)使用如所标明和如在材料和方法中所述的抗 T β RII、抗T β RI和抗肌动蛋白抗体对PC3细胞裂解液进行Western印迹。(D)将细胞铺于 96孔板上，然后8天后测量细胞增殖，如下面材料和方法中所述。图7A-D. GRP78和Cripto协同抑制TGF- β对前列腺癌细胞贴壁不依赖性生长的抗增殖作用.如下面材料和方法中所述，在媒介物或者增加剂量的TGF-β 1存在下，以载体、GRP78、Cripto或者GRP78和Cripto两者转染的PC3细胞在贴壁不依赖性条件下于软琼脂中生长15天。数据表示为在缺乏或存在所标明剂量TGF-β 1下单一视野中计数的集落数(A)或者表示为在存在所标明TGF-β 1浓度下计数的集落数除以在缺乏TGF-β 1处理时所计数的集落数(％基础)(B)。(C)来自IOOpM TGF-β 1存在或缺乏情况下所标明视野的照片。(D)图解Cripto/GRP78复合体致癌作用的模型。TGF-β通过经Smad2/3途径发信号而潜在抑制许多细胞类型的增殖(左)。Cripto和GRP78相互作用形成复合体，并且协同作用减弱TGF- β -依赖性Smad信号和生长抑制。此外，它们独立地增加细胞增殖/存活。在Cripto和GRP78存在下，TGF-β还可增加细胞增殖(虚线箭头)。图8A-G. Cripto和GRP78协同调节激活蛋白、Nodal和TGF-β信号.稳定表达 Cripto和/或GRP78shRNA的NCCIT细胞通过使用所标明抗体的Western印迹(A)或者完整细胞表面ELISA(B)分析。同样的细胞以激活蛋白-A(C)或Nodal (D)处理，并且磷酸化 Smad2 (pSmad2)和Smad2的最终水平通过使用pSmad2和Smad2抗体的Western印迹测量。 过表达所标明蛋白质和/或shRNA的NCCIT细胞(E)和293T细胞(F，G)以Smad2响应性萤光素酶报告分子转染并根据指示以剂量的TGF-β配体处理。所得到的萤光素酶活性相对于未处理样品标准化并表示为未处理样品的诱导倍数。图9A-G.人ES细胞中细胞表面GRP78介导Cripto信号.使用所标明的抗体对H9 人ES细胞进行完整细胞ELISA (A)或免疫荧光(B)。在(B)中，抗Cripto染色是绿色的并且抗GRP78染色是红色的。(C)H9ES细胞根据指示以的激活蛋白-A或Nodal处理，并且通过使用pSmad2和Smad2抗体的Western印迹测量磷酸化Smad2 (pSmad2)和Smad2的最终水平。用Smad2响应性萤光素酶报告分子转染以空载体(D)或Cripto shRNA(E)稳定感染的NCCIT细胞，并如所标明在N-20抗体存在或缺乏情况下用标明剂量的TGF- β配体处理。 所得到的萤光素酶活性相对于未处理样品标准化并表示为相对于未处理样品的诱导倍数。 (F)说明野生型GRP78和缺乏Ν-20表位的Δ 19-68GRP78构建体的简图。(F，G)如所标明，使用抗HA、抗Flag和抗GRP78抗体对根据指示以构建体转染的293T细胞的裂解液进行免疫沉淀禾口 Western 印迹。*p < 0. 01 ；***p < 0. 001。图10A-F. Cripto需要GRP78受体功能以激活PI3K和MAPK途径并促进NCCIT细胞增殖.稳定表达所标明shRNA的NCCIT细胞进行血清饥饿，然后根据指示以剂量的可溶性Cripto与所标明的或者PI3K抑制剂(LY2940002) (A)或者MEK1/2抑制剂(PD98059) (B) 处理。使用所标明的抗磷酸化Akt (pAkt)、Akt、磷酸化GSK3 β (pGSK3 β )和肌动蛋白抗体 (A)或磷酸化ERK1/2 (pERKl/2)和ERK1/2抗体(B)对细胞裂解液进行Western印迹。(C) 相同的NCCIT细胞以如所标明的Cripto处理，生长8天，然后使用CyQuant增殖测定试剂盒测量增殖。(D)以Cripto shRNA感染的NCCIT细胞在一定范围剂量的N-20抗体或IgG 对照存在下进行125I-Cripto结合。Cripto特异性结合代表着被过量非标记可溶性Cripto 封闭的125I-Cripto结合的量。以Cripto shRNA感染的NCCIT细胞进行(E)血清饥饿，然后在所标明剂量IgG或抗GRP78 (N-20)预处理后根据指示以剂量的可溶性Cripto处理，或者(F)在以IgG或抗GRP78(N-20)抗体预处理后以可溶性Cripto处理。细胞另外生长8 天并且使用CyQuant增殖测定试剂盒测定增殖。、< 0. 01 ；***p < 0. 001。图11A-I.在人乳腺上皮细胞中细胞表面GRP78的免疫中和阻止Cripto的肿瘤生长因子活性.以空载体感染的人乳腺上皮MCFlOA细胞使用IgG或N-20抗体进行完整细胞 ELISA(A)或者根据指示在一定范围剂量N-20抗体或对照IgG抗体存在下进行125I-Cripto 结合(B)。(C)以空载体感染的MCFlOA细胞进行血清饥饿，然后如所标明，根据指示以剂量的可溶性Cripto、N-20抗体和/或IgG处理。如所标明，所得到的细胞裂解液以抗磷酸化 Tyr (pTyr)抗体进行免疫沉淀并且以抗磷酸化Src (pSrc，Y416)或抗Src抗体进行Western 印迹。(D)以空载体感染的MCFlOA细胞进行血清饥饿，根据指示以剂量的可溶性Cripto处理，然后细胞裂解液通过使用如所标明的磷酸化Akt (pAkt)和Akt抗体的Western印迹进行分析。(E)来自空载体感染的或者Cripto感染的MCFlOA细胞的细胞裂解液通过使用如所标明的Cripto和肌动蛋白抗体的Western印迹分析。以空载体或Cripto(F)或者以空载体(G)感染的MCFlOA细胞根据指示以的可溶性Cripto、IgG和/或N-20抗体处理。细胞生长8天并且使用CyQuant增殖测定试剂盒测量增殖。(H)以空载体或Cripto感染的 MCFlOA细胞在根据指示以IgG或N-20抗体预处理之后用可溶性Cripto处理。通过使用 E-钙黏着蛋白和肌动蛋白抗体的Western印迹分析细胞裂解液。(I)以空载体或Cripto 感染的MCFlOA细胞用IgG或N-20抗体预处理，铺板并允许粘附。所得到的细胞粘附使用 CyQuant粘附测定定量。< 0. 001。图12A-C.在NCCIT和MCFlOA细胞中激活蛋白-A和Nodal的促增殖作用需要 Cripto和GRP78.以空载体、Cripto和/或GRP78shRNA感染的NCCIT细胞(A，B)和以空载体或Cripto感染的MCFlOA细胞(C)根据指示在IgG或N-20抗体存在或缺乏情况下以激活蛋白-A或Nodal处理或不处理。细胞另外生长8天并且使用CyQuant增殖测定试剂盒测量增殖。***P < 0. 001 ；**p < 0. 005 ；*ρ < 0. Ol0图 13A-C. GRP78D19-68 抑制经由 erbB2、erbB4 和 PI3K 的 Cripto 信号.如所标明，293T细胞以空载体、ErbB2和/或ErbB4表达载体连同葡萄糖_6_磷酸酶-萤光素酶 (G6Pase-Lux)和b_半乳糖苷酶构建体转染细胞。此外，细胞以(A)空载体、(B)GRP78或(C) GRP78 D19-68转染。细胞不经处理或者如所标明以Cripto (400ng/ml)和/或LY294002 (LY)处理。所得到的萤光素酶活性相对于b_半乳糖苷酶表达标准化并且表示为相对于未处理样品的变化倍数。图14A-B.说明所提出的Cripto/GRP78信号机制和拮抗作用的模型.㈧细胞表面Cripto/GRP78复合体是经由MAPK/PI3K和Smad2/3途径的致癌Cripto信号所必需的。 Cripto与细胞表面GRP78的结合导致通过ErbB2和ErbB4的cSrc/MAPK/PI3K途径的活化。 Cripto与细胞表面GRP78的结合还促进Cripto对由激活蛋白/Nodal/TGF-β配体所发出信号的影响，导致低水平的Smad2/3活化。(B)打断细胞表面Cripto/GRP78复合体致癌功能的试剂包括N-20 GRP78抗体、GRP78 D19-68突变体和sALK4_L75A_Fc。
具体实施例方式本发明通过提供用于抑制Cripto/GRP78复合物形成的方法和用于假定Cripto/ GRP78复合体调节剂的筛选方法克服了现有技术中的局限性。Cripto是在脊椎动物胚胎发生和人肿瘤进展中具有重要作用的多功能细胞表面蛋白质。虽然已经证明其调节多重信号途径，但是先前鉴定的其配偶体不能完全解释它的分子作用。发明人针对鉴定新的Cripto 相互作用蛋白质开展筛选，结果鉴定出葡萄糖调节蛋白78(GRP78)，它是一种在肿瘤细胞表面上也表达的ER蛋白伴侣。如在下面实施例中所示，Cripto与GRP78在多种细胞系的细胞表面上相互作用并且它们的相互作用不依赖于先前在ER内的结合。使用shRNA对内源 GRP78的敲低导致TGF-β信号增强，表明GRP78与Cripto —样抑制该途径。当GRP78和 Cripto共表达时协同对抗TGF-β的反应，包括在贴壁依赖性或不依赖性条件下生长的前列腺癌细胞的Smad磷酸化和生长抑制。下面的实例进一步提供了证据表明，共表达GRP78 和Cripto的细胞在软琼脂中比单独表达任一种蛋白的细胞生长快的多。对GRP78/Cripto复合物形成的抑制可以打断Cripto信号并且降低细胞增殖。细胞表面GRP78的丧失或免疫中和阻断了 Cripto依赖性Nodal信号，激活蛋白/TGF-β信号的拮抗作用和ERK/MAPK和PI3K/Akt/GSK3 β途径的活化。发明人已经证明，GRP78存在于人ES细胞的表面上，其中它与Cripto共定位并且介导Cripto对激活蛋白和Nodal信号的相反作用。此外，细胞表面GRP78的敲低或免疫中和阻断了 Cripto引起增加的细胞增殖、降低的E-钙黏着蛋白表达和降低的细胞粘附的能力。发明人发现，虽然在细胞表面Cripto/ GRP78复合体缺乏情况下激活蛋白-A是细胞抑制剂，但是在细胞表面Cripto/GRP78复合体存在情况下激活蛋白-A和Nodal均增加细胞增殖。这些资料共同表明细胞表面GRP78对于Cripto信号是必需的，并且支持了这样一个想法，即在正常胚胎发育和肿瘤发生过程中 GRP78介导Cripto的功能。CriptoCripto是在发育和癌症进展过程中具有重要作用的GPI锚定信号蛋白(Strizzi 等，2005)。在发育中的小鼠胚胎中，Cripto对于前-后轴的正确建立和胚层形成和心脏发生是必需的。Cripto还被认为是在多能性维持和分化中具有重要作用的胚胎干细胞的标志物(Adewumi等，2007 ；Strizzi等，2005)。虽然在正常成人组织中Cripto表达通常低或缺乏，但是发现在许多人实体肿瘤中水平高并且过表达促进贴壁不依赖性生长、增殖、 存活、迁移、侵袭、血管发生和EMT (Strizzi等，2005)。Cripto还促进体内肿瘤生长，因为 MMTV-Cripto 和 WAP-Cripto 小鼠产生了乳腺肿瘤(Strizzi 等，2005 ；Strizzi 等，2004 ；Sun
10等，2005 ；Wechselberger等，2005)并且靶向Cripto的单克隆抗体降低肿瘤异种移植物在裸鼠中的生长(Adkins等，2003 ；Xing等，2004)。与其它生长因子类似，Cripto在从其GPI锚中断裂之后可从细胞释放，并且已经证明可溶形式的Cripto活化促有丝分裂的ras/raf/MAPK和PI3K/Akt途径(Strizzi 等，2005)。Cripto 还充当 TGF- β 超家族成员例如 Nodal (Schier, 2003 ；Shen, 2007)、 ⑶Fl (Cheng等，2003)和⑶F3 (Chen等，2006)的专一性共受体。该共受体功能是胚胎发育过程所必需的(Schier，2003 ；Strizzi等，2005)并且在成体中可调节正常组织生长和重塑， 如通过Cripto和Nodal在怀孕和哺乳的乳腺中共表达的事实所表明(Bianco等，2002a)。 Cripto共受体功能还促进肿瘤生长，因为最新表明Nodal信号在促进人黑素瘤和乳腺癌细胞的可塑性和致瘤性中起着关键的作用(Postovit等，2008 ；Topczewska等，2006)。Cripto 还抑制由激活蛋白(Adkins) (Gray 等，2003 ；Kelber 等，2008)和 TGF-β 1 (Gray 等，2006) 引起的信号并且抑制对人乳腺上皮细胞和前列腺癌细胞的TGF-βΙ-依赖性抗增殖作用 (Gray等，2006 ；Shani等，2008)。因此，Cripto可通过激活生长/存活途径和通过抑制肿瘤抑制基因途径促进肿瘤发生(Strizzi等，2005)。GRP78发明人已经鉴定出GRP78作为新的Cripto结合配偶体，并且表明这两种蛋白质形成抑制细胞抑制性TGF-β信号和促进肿瘤细胞生长的细胞表面复合体。GRP78已经广泛表征为辅助蛋白质折叠、成熟和装配的ER蛋白伴侣并且还协调未折叠蛋白质反应(UPR) (Bernales等，2006 ；Lee, 2005 ；Lee, 2001)。GRP78在低氧和营养物缺乏条件下被诱导，并且发现在肿瘤细胞中水平高(Lee，2007)。GRP78在肿瘤发生中起着必需作用的证据第一次出现于如下证明中，即用反义核酸对纤维肉瘤细胞中GRP78诱导的抑制致使它们在裸鼠中完全不能形成肿瘤，而它们的体外生长不受影响(Jamora等，1996)。此外，向纤维肉瘤和乳腺肿瘤细胞中递送由GRP78启动子驱动的自杀转基因导致完全消灭小鼠中的相当大的肿瘤 (Chen等，2000 ；Dong等，2004 ；Gazit等，1999)。因此，在实体肿瘤中建立的环境导致诱导 GRP78并且其表达促进肿瘤生长。虽然GRP78主要位于ER中，但是其可以作为跨膜蛋白质存在(Reddy等，2003)并定位在人肿瘤细胞的质膜上，这最初在以毒胡萝卜内酯处理后的人横纹肌肉瘤细胞中证明 (Delpino和Castelli, 2002 ；Delpino等，1998)。随后，细胞表面蛋白质组的总图谱证实 GRP78暴露于肿瘤细胞表面上(Shin等，2003)。的确，GRP78已经显示与MHC类I 一起在细胞表面上作为病毒的共受体起作用(Triantafilou等，2002)并且作为纤维蛋白溶酶原衍生的Kringle 5结构域(Davidson等，2005)和活化的2-巨球蛋白(.2M) (Misra等，2002 ； Misra等，2004)的受体起作用。值得注意的是，GRP78受体功能显示引起生长途径的活化， 导致增加的细胞增殖和抗细胞凋亡行为(Misra等，2006 ；Misra等，2005 ；Misra等，2004)。 GRP78的此类受体功能从GRP78自身抗体的存在已经与增加的前列腺癌进展和降低的患者存活相联系的观察中描绘出癌症相关的关联性(Mintz等，2003)。此外，GRP78在癌症进展中的因果作用由如下发现支持，即靶向质膜上GRP78的自杀肽被证明选择性地杀死肿瘤细胞(Arap等，2004)。重要的是，这些发现验证了细胞表面GRP78作为癌症治疗的推定的靶标。Cripto和GRP78结合并引起促进细胞增殖的细胞内信号
基于Cripto结合位于肿瘤细胞表面上的GRP78的证据，发明人评价了 GRP78作为 Cripto受体起作用的可能性。与该假设相一致并且如下面实例所示，Cripto与细胞表面 GRP78的结合对于肿瘤细胞、ES细胞和乳腺上皮细胞中的Cripto信号是必需的。Cripto与GRP78的结合导致几个下游细胞内信号途径的活化。例如，如下面实例所示，Cripto与细胞表面GRP78的结合对于Cripto作为专一性Nodal共受体和激活蛋白和TGF-β信号的拮抗剂的功能是必需的。GRP78受体功能介导可溶性Cripto肿瘤生长因子活性，包括活化C-SrC/MAPK/PI3K途径，增加细胞增殖，降低E-钙黏着蛋白表达和降低细胞粘附。在Cripto/GRP78复合体存在情况下激活蛋白-A和Nodal具有促增殖作用，而当 Cripto/GRP78复合体被打断时激活蛋白-A是抗增殖的。不希望被任何理论所束缚，这些发现表明，GRP78作为细胞表面Cripto受体/共因子起作用，这对于Cripto对激活蛋白/ Nodal/TGF- β和ΜΑΡΚ/ΡΙ3Κ信号途径的发育和致癌作用是必需的。A. GRP78和Cripto在细胞表面上形成复合体,其不需要先前在ER中结合.如在下面实例中所证明，GRP78与Cripto在细胞表面上形成复合体，这是一个有用的以及潜在治疗暗示的发现。该相互作用看起来是特异性的和排他性的，因为GRP78是所观察到的与Cripto共纯化的仅有的两种细胞表面蛋白质之一并且因为大小与Cripto相似的无关的跨膜蛋白不与GRP78共纯化。同样，在相同条件下I型和II型TGF-β受体均不能免疫沉淀GRP78。结果还表明，Cripto/GRP78结合不依赖于GRP78ER蛋白伴侣功能，因为在单独的细胞群体中这些蛋白质成熟和加工之后的无细胞环境中观察到它们的相互作用。 该结果还支持在细胞表面上该复合体的存在，因为显示在这些条件下结合Cripto的GRP78 来自于质膜。此外，该结果表明对于该特异性结合相互作用所需的信息可以完全包含在这两种蛋白质的三级结构中，并且预期使用特异性地打断它们相互作用的分子可以靶向肿瘤细胞。发明人发现，内源Cripto和内源GRP78可作为来自小鼠胚性癌细胞的复合体分离。不希望被任何理论所束缚，该发现进一步支持了对于它们作为质膜上信号共因子的相互作用的内在作用，并且再一次地反对GRP78只是在ER中过表达Cripto的折叠中起作用的可能性。发明人还通过免疫细胞化学探究了 Cripto和GRP78在同一细胞中的定位并且发现Cripto和GRP78主要共定位于作为部分出现在细胞表面的斑点状结构中。这些发现支持Cripto和GRP78在质膜上一起起作用的结论，但是还表明，它们在对于信号蛋白质所普遍的囊泡运输过程中是相关的。此外，细胞表面染色的斑点状性质与先前显示两种蛋白质均与脂筏相关的报导一致(Triantafilou 和 Triantaf ilou，2003 ；Watanabe 等，2007)。B. GRP78作为细胞表面受体起作用GRP78在ER中作为蛋白伴侣和UPR的协调者起着保护性作用，但是它还在细胞表面上表达，其在细胞表面上的功能理解甚少。细胞表面GRP78已经被鉴定为是人乳腺癌样品中的肿瘤特异性抗原，并且在前列腺癌患者血清中发现了靶向GRP78的自身抗体并且显示靶向GRP78的自身抗体充当癌症侵袭性增加的生物标志物(Arap等，2004 ；Mintz等， 2003)。而且，由融合至凋亡诱导序列的GRP78结合模体构成的嵌合肽抑制前列腺和乳腺癌小鼠模型中的肿瘤生长(Arap等，2004 ；Liu等，2007)。资料表明GRP78不仅仅是肿瘤细胞的选择性细胞表面标志物，而且还是介导Cripto对激活蛋白/Nodal/TGF-β和ΜΑΡΚ/ΡΙ3Κ 信号的效应的受体/共因子。虽然对GRP78和激活蛋白/Nodal/TGF-β信号之间存在功能性联系的发现似乎是独特的，但是先前研究已经表明细胞表面GRP78具有受体活性并且可以介导生长/存活信号。例如，在I-LN前列腺癌细胞中，2-巨球蛋白(2-M)通过细胞表面 GRP78发信号引起MAPK和PI3K途径活化，产生促增殖和抗细胞凋亡行为(Misra等，2006 ； Misra等，2004)。来自前列腺癌患者血清的靶向GRP78的抗体类似地显示出活化MAPK/PI3K 途径并且增加细胞增殖。有趣的是，细胞表面GRP78也显示在介导内皮细胞中经由Akt的 GPI锚定的T-钙黏着蛋白依赖性存活信号转导中具有必不可少的作用(Philippova等， 2008)。Cripto、T-钙黏着蛋白和GRP78每一个定位在脂筏中，表明GRP78受体功能也许局限在这些质膜微域中。下面的结果表明，对于Cripto与TGF-β配体和它们的受体功能性相互作用的能力而言需要GRP78。不希望被任何理论所束缚，发明人预期，GRP78将充当质膜上的锚或支架，允许Cripto采用对于其与TGF-β配体以及它们的受体形成复合体并且改变它们的信号特性所需要的构象或定向。Cripto的CFC介导与GRP78的结合以及与类型I信号受体 ALK4和ALK7的结合。不希望被任何理论所束缚，发明人预期，Cripto与GRP78或者ALK4/7 之间的结合相互作用不是彼此排斥的，而是GRP78将促进Cripto与ALK4/7和配体如Nodal 和激活蛋白之间复合物的形成。GRP78除了作为Cripto对TGF-β配体信号的作用的必不可少的介导物的作用之外，结果还显示GRP78与可溶性Cripto偶联活化ΜΑΡΚ/ΡΙ3Κ途径。 该发现表明，GRP78或者作为跨膜受体起作用，或者与一种或者两者偶联。虽然通常认为 GRP78是局限在ER腔内的可溶性蛋白质，但是表明相当大部分的GRP78作为具有两个推定跨膜螺旋的整合膜蛋白质存在(Reddy等，2003)。Reddy等对ER微粒体使用有限的胰蛋白酶消化表明，膜相关GRP78的N-末端和C-末端区在ER腔内/细胞外，而蛋白质的中间三分之一在细胞质中(Reddy等，2003)。该罕见的跨膜拓扑学与这样的事实一致，即已经表明细胞外蛋白质结合GRP78的N-末端或C-末端附近(Davidson等，2005 ；Gonzalez-Gronow 等，2006 Jakobsen 等，2007 ；Philippova 等，2008).C. Cripto结合GRP78的N-末端附近下面的资料表明，Cripto结合至GRP78的最N-末端，因为N-末端N_20抗体封闭结合并且缺乏N-20表位的GRP78缺失突变体不能够结合Cripto。N-20抗体还显示竞争性的封闭Kringle 5 (Davidson等，2005)和T-钙黏着蛋白(Philippova等，2008)的细胞效应，表明这些蛋白质结合GRP78的N-末端。此外，2-M和促增殖性前列腺癌患者来源自身抗体结合至定位于GRP78的邻近N-20表位的N-末端的部位(Gonzalez-Gronow等，2006)。 这些细胞外蛋白质的每一种结合GRP78最N-末端的事实表明它们具有相似的激活GRP78 受体功能的方式并且它们还彼此竞争对GRP78的结合。P. GRP78 结合 Cripto 的 CFC.Cripto和GRP78之间相互作用的特异性被如下证明进一步支持，即Cripto的CFC 结构域对于GRP78结合似乎是必需的和足够的。该发现是值得注意的，因为它表明Cripto 可通过其EGF-样结构域结合TGF-β，如发明人先前证明的那样(Gray等，2006)，而同时通过其CFC结构域结合GRP78。发明人推测，包含Cripto、GRP78、TGF-β和TGF-β受体的更大级别的蛋白质复合体也可形成并导致TGF-β信号的降低和/或改变。此外，Cripto 的CFC结构域结合GRP78的观察进一步肯定了 GRP78对Cripto通过其它TGF- β配体例如 Nodal和激活蛋白调节信号的可能影响。例如，先前已经表明，Cripto的CFC结构域特异性地结合激活蛋白/Nodal I型受体ALK4(Yeo和衡行11^11，2001)，并且因此61^78可与41^4 竞争与Cripto的结合。备选地，GRP78可参与包含ALK4、Cripto和激活蛋白/Nodal的蛋白质复合体。E. Cripto相关GRP78的靶向敲低抑制TGF- β信号.多条线的证据表明，Cripto和GRP78每一个促进肿瘤形成并且两种蛋白质均选择性地表达于癌细胞的细胞表面。如本文所述，现在已经发现，先前已经表明涉及促进肿瘤生长的这两种蛋白质在细胞表面形成复合体。该发现将这些蛋白质在物理上以及通过抑制 TGF-β信号的机制上关联起来。最初，GRP78在TGF-β信号中的作用通过开发能够降低与质膜上Cripto结合的 GRP78水平的shRNA评价。该shRNA(SEQ ID NO :5)增强TGF-β依赖的Smad2磷酸化，这提供了内源61^78可限制16 -0信号的证据。据发明人所知，该发现是GRP78影响TGF-β 信号的首次证明，并且重要的是，其构成了一个新的机制，通过该机制细胞表面的GRP78可传送其致瘤信息。该结果还与内源Cripto在这些细胞中具有相似作用的先前证明不谋而合(Gray等，2006)并且与GRP78结合细胞表面上的Cripto以对抗生长抑制性的TGF-β信号的假设相一致。F. GRP78和Cripto协同减弱细朐抑制件TGF- β信号并財曾强人前歹U腺癌细朐的增葙.当GRP78和Cripto —起表达时比单独表达时更大程度地抑制TGF-β -依赖性 Smad2磷酸化作用的证明表明它们一起作用抑制TGF-β信号。不希望被任何理论所束缚， 由于Smad磷酸化的水平直接依赖于受体活化的程度，该结果表明Cripto和GRP78通过降低TGF-β激活其受体的能力发挥它们的抑制性效应。这样的解释得到如下事实的进一步支持，即Cripto和/或GRP78在这些细胞中的过表达不改变TGF-β受体水平。此外，未能检测到GRP78与其I型或II型TGF- β受体之间的相互作用表明GRP78可通过结合Cripto 或者通过直接结合TGF-β或者两者发挥其对TGF-β信号的抑制性效应。发明人进一步地证明，Cripto和GRP78协同起作用以增强细胞生长并抑制TGF- β 的细胞抑制性效应。当细胞在贴壁依赖性条件下生长时，Cripto和GRP78每一个减弱 TGF-β的生长抑制性效应，并且有趣的是，它们的共表达导致TGF-β性质上从抗增殖转变成促增殖。虽然对于Cripto和GRP78对细胞对TGF-β的增殖反应的联合作用的机制尚未确立，但是已经显示TGF-β在其细胞抑制效应已经丧失的条件下增加增殖/存活 (Paradali和Moustakas，2007)。同样地，发明人发现，Cripto和GRP78可协同封闭贴壁不依赖性条件下TGF-β的细胞抑制效应。然而，与在单层中观察到的不同，TGF-β处理不能增强共表达Cripto和GRP78的细胞在软琼脂中的生长。另一个差异是，当GRP78和Cripto 单独表达时并且更显著地当它们共表达时，在缺乏TGF-β处理的情况下，GRP78和Cripto 增加在软琼脂中的集落生长。因此，结果表明GRP78和Cripto以取决于特定生长条件而变的方式影响细胞生长和TGF-β反应性。与贴壁不依赖性条件相反，在生长在贴壁依赖性条件下的细胞中，不同的信号途径可响应环境而活化。例如，肿瘤细胞利用信号途径例如FAK和Src促进贴壁不依赖性生长和避免失巢凋亡(Mitra和Schla印fer，2006)。因此，虽然特定的机制有待阐明， 但是从TGF-β发源的具有与特定生长环境明确相关的信号途径的信号的集中可导致生长效应的细微差别。不管发明人观察的差别如何，然而，发明人已经一致性的发现，当Cripto 和GRP78蛋白质一起表达时Cripto和GRP78对TGF-β反应性的效应大于它们单独表达时。因此，细胞表面Cripto-GRP78复合体表现出在贴壁依赖性和贴壁不依赖性生长条件下抑制细胞抑制性TGF-β反应的明确且一致的作用。TGF-β是主要的肿瘤阻抑因子并且其细胞抑制功能的丧失与肿瘤起始和进展相关(Pardali和Moustakas，2007)。这种生长抑制性TGF-β信号的丧失将源于受体信号的减少，Smad功能受损或者转录调节物或其它靶标的破坏，它们一起构成了细胞抑制性程序 (Siegel和Massague，2003)。的确，TGF-β信号频繁地加重了抵抗抗增殖效应的肿瘤的生长和扩散(Pardali和Moustakas，2007)。Cripto和GRP78每一种已经单独涉及到人癌进展并且这些蛋白质中的每一个在肿瘤细胞表面上选择性表达。在此发明人已经提出证据证明这两种蛋白质在细胞表面上物理性相互作用。发明人还进一步提供了证明，即它们协同增强肿瘤细胞生长并且逆转TGF-β的肿瘤阻抑因子效应。不希望被任何理论所束缚，这些结果支持这样的一个想法，即该复合体导致恶性肿瘤增加并且其通过在受体水平抑制TGF-β 信号赋予肿瘤细胞以竞争性增殖的优势。依据这些发现，预期细胞表面Cripto_GRP78复合体代表着具有重要治疗潜能的称心如意的靶标，因为其具有仅影响癌症细胞而不影响其正常组织对等物的固有选择性优势。G. GRP78/Cripto/TGF~ β 配体结果显示，GRP78介导Cripto的共受体功能并且涉及细胞表面GRP78在胚胎发生和干细胞调节过程中的新的和必不可少的作用。在胚胎发育过程中Cripto作为Nodal和相关TGF- β配体的共受体起着至关重要的作用，并且在斑马鱼和小鼠中的遗传学研究已经表明Cripto和相关的EGF-CFC蛋白质对于中胚层和内胚层形成、心脏发生和左/右不对称性的建立是必不可少的。Cripto还已经被公认为是胚胎干细胞的标志物并且在干细胞维持和分化中起着重要的作用。从Cripto-无效小鼠产生的ESC不能够经历心肌发生和自发分化成神经元。如在下面实例中所示，内源GRP78是Cripto信号包括Cripto-依赖性Nodal 信号的必需的介导者。此外，发明人提供了证明，即GRP78出现在人ES细胞的表面上，它在表面上与Cripto共定位。对hES细胞上GRP78的抗体阻断封闭了 Nodal信号，表明在这些细胞中对于Nodal信号需要GRP78。这些结果支持靶向Cripto和GRP78之间的界面将有助于对hES细胞需要优先分化成神经元的神经变性疾病的基于细胞的治疗。数项研究也支持Cripto对促进肿瘤表型的激活蛋白/Nodal/TGF-β信号的调节作用(Adkins 等，2003 ；Gray 等，2003 ；Gray 等，2006 ；Salomon, 2006 ；Shani 等，2008 ；Shen, 2003 ；Shukla 等，2008 ；Topczewska 等，2006)。Cripto 抑制 TGF- β 信号以及 TGF- β 对乳腺上皮细胞(Gray等，2006)和原代角质形成细胞(Shukla等，2008)的细胞抑制性效应。 Cripto还抑制TGF- β对前列腺癌细胞的抗增殖效应，这是一种被GRP78过表达所增强的效应(Shani等，2008)。与TGF-β —样，激活蛋白-A抑制大多数上皮细胞的增殖并且已经提出激活蛋白/TGF-β信号的拮抗作为致癌性Cripto的机制。与之相反，已经证明Nodal促进黑素瘤和乳腺癌可塑性和致瘤性(Hendrix等，2007 ；Postovit等，2008 ；Salomon, 2006 ； Topczewska等，2006)并且结果表明这将需要经由Cripto和GRP78的信号。在本发明中， 发明人已经证明使用shRNA或N-20GRP78封闭性抗体靶向NCCIT上的细胞表面GRP78消除了 Cripto对通过激活蛋白、TGF-β和Nodal的信号的影响。该影响可能是通过Cripto和GRP78之间的相互作用介导的，因为将两种蛋白质一起敲低比将任一个蛋白质单独敲低具有更深远的影响。重要的是，这是内源Cripto抑制激活蛋白-A和激活蛋白-B信号的首次证明并且证实了内源Cripto阻断通过TGF-β的信号的先前证明。这些发现还支持GRP78 具有作为Cripto共因子的新作用，这对于Cripto对激活蛋白/Nodal/TGF-β信号的潜在致癌效应是必需的。H. GRP78介导Cripto牛长因子活件Cripto除了对激活蛋白/Nodal/TGF-β信号具有效应外，还激活丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)和磷脂酰肌醇-3-激酶(ΡΙ3Κ)途径(De Santis等，1997 ；Ebert等，1999 ； Strizzi等，2005)。这些途径在大多数人癌症中被异常活化并且广泛认为它们具有促进多种致瘤后果包括增加肿瘤细胞存活和增殖的能力(Dhillon等，2007 ；Shaw和Cantley， 2006)。已经显示，用可溶性Cripto处理HC-Il乳腺上皮细胞导致SH2-衔接蛋白Shc的酪氨酸磷酸化、Shc与Grb2的结合以及p42/44Erk/MAPK途径的活化(Kannan等，1997)。可溶性Cripto还引起PI3K的p85调节亚基的磷酸化，导致SiHa颈癌细胞中Akt的磷酸化和活化(Ebert等，1999)。Cripto不结合EGF受体家族成员(Kannan等，1997)，并且据报导 MAPK/PI3K途径被可溶性Cripto的活化是ALK4-不依赖性的(Bianco等，2002b)。在用可溶性Cripto处理细胞之后c-Src被活化并且c_Src活化对于MAPK和PI3K途径的Cripto 依赖性活化是必需的(Bianco等，2003)。此外，据报导GPI-锚定蛋白聚糖磷脂酰肌醇蛋白聚糖-1结合Cripto并促进Cripto依赖性c-Src活化(Bianco等，2003)。然而，尚未鉴定出介导c-Src活化和MAPK/PI3K信号的跨膜Cripto受体。下面的资料证明细胞表面GRP78 介导Cripto的肿瘤生长因子活性。Cripto/GRP78 复合体还影响 Akt/ErK 信号。对 NCCIT 细胞中 Cripto/GRP78 复合体的敲低或抗体破坏阻断了可溶性Cripto诱导Akt、GSK3b和p42/44的磷酸化。I. Cripto/GRP78复合体转换激活蛋白-A和Nodal的增殖效应响应于激活蛋白、Nodal和TGF- β配体的Smad2/3信号取决于细胞类型和细胞环境具有对细胞增殖、凋亡和分化可变性并且甚至具有相反的作用。Smad2/3途径的肿瘤阻抑制因子功能已经被广泛表征，并且从其具有抑制多种细胞类型增殖的能力以及在一些情况下引起终末分化或凋亡的能力得出来的。现在已经广泛确立，Smad2/3信号下游的细胞抑制性转录程序对于正常的组织稳态和肿瘤抑制是至关重要的，并且已经在数个类型的人癌症，包括乳腺癌中观察到该途径的破坏或改变。然而，激活蛋白/Nodal/TGF-β配体在肿瘤细胞已经变得抵抗Smad2/3途径的抗增殖效应的条件下加重肿瘤表型。肿瘤细胞通常分泌高水平的这些配体，这些配体作用于肿瘤细胞和肿瘤微环境内的其它细胞类型包括基质成纤维细胞、内皮细胞和免疫细胞。在该环境中Smad2/3的活化可引起增强的肿瘤细胞增殖、 运动性、侵袭和上皮间质转化(EMT)以及增加的血管发生和降低的免疫监视。加在一起， 这些效应可导致肿瘤生长和转移的增强并且产生针对阻断人癌症中TGF-β信号的治疗成就。发明人还显示，取决于细胞表面Cripto/GRP78复合体的存在与否，激活蛋白-A 对细胞增殖具有相反的作用。在空载体感染的NCCIT细胞和其中Cripto/GRP78复合体完整的Cripto-过表达性MCFlOA细胞中激活蛋白-A具有促增殖效应。相反，当通过敲低或 N-20抗体阻断将这些细胞中的Cripto/GRP78复合体破坏时，激活蛋白-A具有抗增殖效应。与激活蛋白-A —样，在表达完整Cripto/GRP78复合体的这些细胞中，Nodal增强增殖。然而，与激活蛋白-A不同，Nodal对其中Cripto/GRP78复合体被破坏的细胞的增殖没有影响。 激活蛋白-A和Nodal之间的这种差异可能反映出这样的一个事实，即Cripto对于Nodal 信号是必需的而对于激活蛋白-A信号是不需要的。这些资料表明，细胞表面上的Cripto/ GRP78复合体可通过促进Nodal的促有丝分裂效应并引起激活蛋白-A性质上从细胞抑制转变成促增殖而促进肿瘤生长。因此，Cripto引起从上皮-细胞抑制性向间质-促增殖性转变的细胞反应，并且这类似于当肿瘤细胞变成对Smad2/3的细胞抑制效应抵抗时所观察到的情况。这些结果暗示了通过它激活蛋白和Nodal变成促肿瘤发生性的机制，并且该效应似乎是GRP78依赖性的。有趣的是，发明人发现，激活蛋白-A和Nodal在Cripto/GRP78复合体存在下是促有丝分裂性的，然而在这些复合体缺乏情况下激活蛋白-A具有细胞抑制性效应并且Nodal对增殖无影响。因此，细胞表面Cripto/GRP78复合体可促进MAPK/PII 和Smad2/3途径之间的交叉通讯，使得细胞抑制性Smad2/3信号在性质上变成促增殖性的。 因此，细胞表面Cripto/GRP78复合体作为细胞信号节点起作用以调节多种肿瘤和干细胞行为。如下事实支持Cripto和GRP78之间存在生物学相互作用，即Cripto和GRP78具有重叠的分布和功能。Cripto (Ding等，1998)和GRP78 (Luo等，2006)敲除小鼠均是早期胚胎致死性的。Cripto还可调节胚胎干细胞行为(MinChiotti，20(^)并且发明人在此已经证明 Cripto和GRP78在干细胞中共定位并且协同调节激活蛋白和Nodal信号。就此而论，发现 GRP78对于作为多能性干细胞前体的胚胎内细胞团的增殖和存活是必需的(Luo等，2006)。 此外，Cripto (Xu等，1998 ；Xu等，1999)和GRP78 (Mao等，2006)在发育中的心脏中显著表达并且它们中的每一个已经涉及到心脏发生。最后，向Cripto—样(Strizzi等，2005)，GRP78 增加了恶性肿瘤并且通过增强肿瘤细胞存活、增殖和血管发生向肿瘤细胞提供了竞争性生长优势(Dong等，2008 ；Lee, 2007)。重要的是，Cripto和GRP78均选择性地表达于人肿瘤细胞的质膜上并在它们的正常组织对等物上不表达，并且它们中的每一个均独立地验证可作为体内的肿瘤特异性治疗靶标。因此，Cripto/GRP78复合体代表着具有显著治疗潜力的新的且称心如意的靶标。IV. Cripto/GRP78相互作用的抑制剂Cripto/GRP78相互作用可以通过抑制Cripto/GRP78复合物形成和/或功能的Cripto靶向性化合物和/或GRP78靶向性化合物选择性地抑制。在某些实施方案中， Cripto靶向性或GRP78靶向性化合物可以是抗体、双功能抗体、适体、抗体片段例如f (ab) 或f (ab)2区、抑制性肽、小分子、反义分子或siNA(例如siRNA或shRNA)。这些化合物可以由技术人员通过测试Cripto/GRP78结合和/或下游信号被候选化合物改变的筛选法产生。 在某些实施方案中，Cripto靶向性化合物可特异性影响或结合Cripto的CFC结构域并且抑制Cripto/GRP78结合和/或信号。在另外的实施方案中，GRP78靶向性化合物可与GRP78 的N-末端区或最N-末端区，例如GRP78的N-20抗体表位结合或相互作用。A.抗体本发明的某些方面涉及选择性结合Cripto和/或GRP78的一种或更多种抗体。这些抗体可以用于治疗癌症(例如黑素瘤、肝癌、结直肠癌、胰腺癌、肺癌、NSCLC、头颈癌症)。 此外，这些抗体可用于评估Cripto和/或GRP78在组织中，例如癌性组织或癌前组织中的表达。在某些实施方案中，N-20抗体或结合GRP78的N-20表位的抗体可用于靶向GRP78并破坏Cripto/GRP78复合体的形成。在某些实施方案中，希望产生抗所鉴定靶向性肽或它们的受体的抗体。适当的靶向性肽或受体或其部分可通过连接体、多连接体或衍生的氨基酸与一种或更多种试剂偶联、结合、连接、缀合或化学交联。这可以如下开展以致于产生双特异性或多价组合物或疫苗。进一步地构想，在制备这些组合物中使用的方法是本领域技术人员熟悉的并且将适宜向人施用，即可药用。优选的试剂是载体钥孔血蓝蛋白(KLH)或牛血清白蛋白(BSA)。术语“抗体”用于指具有抗原结合区的任何抗体样分子，并且包括抗体片段例如 Fab，、Fab、F(ab，)2、单结构域抗体(DAB)、Fv、scFv(单链Fv)等等。用于制备和使用多种基于抗体的构建体和片段的技术在本领域众所周知。用于制备和表征抗体的方法也是本领域众所周知的(见例如Harlow和Lane，1988 ；通过参考并入本文)。在本发明的多个实施方案中，可以针对噬菌体展示文库得到和筛选来自一个或更多个患病个体的循环抗体。结合循环抗体的靶向性肽可充当天然抗原，例如位于靶组织内皮细胞表面上的受体蛋白质的模拟位。例如，在患有前列腺癌个体中的循环抗体可以结合特异性或选择性地位于前列腺肿瘤中的抗原。如在下面更详细地讨论，可以通过噬菌体展示针对此类抗体鉴定靶向性肽。此类靶向性肽可以用于通过例如使用已知技术如免疫亲和纯化、Western印迹、电泳后的条带切除和蛋白质/肽测序和/或计算机同源性检索，鉴定被抗体识别的天然抗原。技术人员将认识到，针对疾病特异性或选择性抗原的抗体可用于多种应用中，例如疾病状态的检测、诊断和/或预后、患病组织成像和/或治疗剂的靶向递送。在某些实施方案中，Cripto和/或GRP78抗体是单克隆抗体。单克隆抗体(MAb) 被认为具有某些优势，例如重现性和大规模生产，并且通常优选使用它们。因此，本发明提供人、小鼠、猴、大鼠、仓鼠、兔甚至鸡来源的单克隆抗体。由于小鼠单克隆抗体具有易制备性和立即可用性，因此常优选小鼠单克隆抗体。“人源化”抗体是本发明特别考虑的，它们是携带有人恒定区和/或可变区结构域的来自小鼠、大鼠或其它物种的嵌合抗体、双特异性抗体、重组和工程化抗体及其片段。用于开发针对患者疾病的“客户定制”抗体的方法同样也是已知的并且此类客户定制的抗体也在考虑之内。1.用于抗体产生的方法可以使用本领域众所周知的技术制备Cripto和/或GRP78选择性抗体。例如，用于产生单克隆抗体(MAb)的方法通常以与制备多克隆抗体的方法相同的路线开始。简言之，以根据本发明的LEE或CEE组合物免疫动物并从所免疫动物收集抗血清来制备多克隆抗体。广范围的动物种类可以用于产生抗血清。有代表性地，用于产生抗血清的动物是兔、小鼠、大鼠、仓鼠、豚鼠或山羊。动物的选择可以根据操作的难易程度、成本或预期的血清量决定，这将是本领域技术人员已知的。为了产生更强烈的免疫反应和帮助产生抗血清，特定免疫原成分的免疫原性可以通过使用称作佐剂的非特异性免疫反应刺激剂增强。适宜的佐剂包括所有可接受的免疫刺激化合物，例如细胞因子、趋化因子、辅因子、毒素、合胞体、合成的组合物或者编码此类佐剂的LEE或CEE。可以使用的佐剂包括IL-1、IL-2、IL-4、IL-7、IL-12、γ -干扰素、GMCSP、BCG、氢氧化铝、MDP化合物如thur-MDP和nor_MDP、CGP (MTP-PE)、脂质A和单磷酰脂质A (MPL)。还考虑了 RIBI，其包含在2%鲨烯/Tween 80中的从细菌提取的MPL、海藻糖二霉菌酸酯(TDM) 和细胞壁支架(CWQ三种成分。甚至可以使用MHC抗原。示例性的常常优选的佐剂包括完全弗氏佐剂(包含杀死的结核分枝杆菌的非特异性的免疫反应刺激剂)、不完全弗氏佐剂和氢氧化铝佐剂。除了佐剂之外，还希望共同施用已经显示上调T细胞免疫或者下调阻抑因子细胞活性的生物反应调节剂(BRM)。此类BRM包括，但不限于，西咪替丁(CIM ； 1200mg/d) (Smith/ Kline, PA)；低剂量环磷酰胺(CYP ；300mg/m2) (Johnson/Mead, NJ)，细胞因子例如Y -干扰素、IL-2或IL-12或者编码涉及免疫辅助功能蛋白质的基因，例如B-7。用于产生多克隆抗体的免疫原组合物的量根据免疫原的性质以及用于免疫的动物而变化。可采用多种途径施用免疫原，包括但不限于皮下、肌内、真皮内、表皮内、静脉内和腹膜内。可以通过在免疫后不同点从所免疫动物抽取血液检测多克隆抗体的产生。还可以给于第二次加强剂量(例如注射提供)。重复加强或滴定过程直到达到适宜的滴度。当得到所渴望水平的免疫原性时，可将免疫的动物放血并将分离的血清储存，和 /或动物可以用于产生MAb。对于兔多克隆抗体的产生，可以通过耳静脉或备选地通过心脏穿刺从动物中取血。使所取出的血液凝固，然后离心从全细胞和血液凝块中分离血清部分。血清可以用于多种应用中，或者通过众所周知的方法纯化想要的抗体部分，例如使用另一抗体即结合至固体基质上的肽的亲和层析或者通过使用例如蛋白质A或蛋白质G层析。可以通过使用众所周知的技术，例如在美国专利4，196，265中例证的那些技术容易地制备MAb，该美国专利通过参考并入本文。有代表性地，该技术涉及以所选择的免疫成分，例如纯化或部分纯化的蛋白质、多肽、肽或结构域免疫适宜的动物，而不管它是野生型的或者突变体成分。免疫成分以有效刺激抗体产生性细胞的方式施用。用于产生单克隆抗体(MAb)的方法通常以与产生多克隆抗体的方法相同的路线开始。啮齿类例如小鼠和大鼠是优选的动物，然而，也可以使用兔、绵羊或青蛙细胞。使用大鼠可以提供某些优势(Goding，1986，第60-61页)，但是优选小鼠，BALB/c小鼠是最优选的，因为这是最常规使用的并且通常得到更高百分比的适宜融合体。通常如上所述，以抗原注射动物。抗原可以与佐剂混合，例如弗氏完全佐剂或不完全佐剂。以同一抗原或者编码抗原的DNA进行加强施用将以大约两周的间隔进行。在免疫之后，选择具有产生抗体潜能的体细胞，特别是B淋巴细胞(B细胞)用于 MAb生产方案中。这些细胞可以从活组织检查的脾脏、扁桃体或淋巴结中得到，或者从外周血液样品得到。脾脏细胞和外周血细胞是优选的，前者是因为它们是处于分裂中的浆母细胞阶段的抗体产生性细胞的丰富来源，并且后者是因为外周血容易得到。通常将免疫一组动物，并且具有最高抗体滴度的动物的脾脏将被取出并通过用注射器将脾脏勻浆得到脾脏淋巴细胞。有代表性地，来自所免疫小鼠的脾脏包含大约5X107 至2X108个淋巴细胞。然后将来自所免疫动物的抗体产生性B淋巴细胞与永生化骨髓瘤细胞的细胞融合，骨髓瘤细胞通常与所免疫动物为同一物种。适用于杂交瘤产生融合方法中的骨髓瘤细胞系优选地是非抗体产生性的、具有高的融合效率和酶缺乏，酶缺乏使得它们不能够在支持仅想要的融合细胞(杂交瘤)生长的某些选择培养基中生长。可使用本领域技术人员已知的许多骨髓瘤细胞中的任何一种(Goding，第65-66 页，1986 ；Campbell，第75-83页，1984)。例如，当免疫的动物是小鼠时，可以使用P3-X63/ Ag8、X63-Ag8. 653、NS1/1. Ag 41、Sp210_Agl4、F0、NSO/U、MPC-IU MPC11-X45-GTG 1. 7 和 S194/5XX0Bul ；对于大鼠可使用 R210. RCY3,Y3-Ag 1. 2. 3、IR983F 和 4B210 ；并且与人细胞融合体相关的可使用 U-266、GM1500-GRG2、LICR-L0N-HMy2 和 UC7^_6。一个优选的小鼠骨髓瘤细胞是NS-I骨髓瘤细胞系(也称作P3-NS-l-Ag4_l)，其可以通过请求细胞系库编号GM3573容易地从NIGMS人基因突变细胞库中得到。可以使用的另一个小鼠骨髓瘤细胞系是8-氮鸟嘌呤抗性小鼠骨髓瘤SP2/0非生产者细胞系。用于产生抗体产生性脾脏或淋巴结细胞与骨髓瘤细胞的杂合体的方法通常包括在促进细胞膜融合的一种试剂或多种试剂(化学的或电的)存在下以21的比例混合体细胞与骨髓瘤细胞，虽然比例可以大约20 1至大约1 1变化。使用仙台病毒的融合方法已经由Kohler和Milstein描述(1975 ；1976)，并且使用聚乙二醇(PEG)的那些方法，例如37% (v/v)PEG,由Gefter等描述(1977)。电诱导融合方法的使用也是适当的(Goding, 第 71-74 页，1986)。融合过程通常以低的频率，大约1X10_6至1X10_8，产生能存活的杂合体。然而， 这不存在难题，因为通过在选择性培养基中培养，可存活的融合杂合体可与亲本、未融合的细胞(特别是正常情况下将连续无限分裂的未融合骨髓瘤细胞)区别开来。选择性培养基通常是在组织培养基中包含阻断核苷酸从头合成的试剂的培养基。示例性且优选的试剂是氨基蝶呤、甲氨蝶呤和偶氮丝氨酸。氨基蝶呤和甲氨蝶呤阻断嘌呤和嘧啶两者的从头合成， 而偶氮丝氨酸仅阻断嘌呤的合成。当使用氨基蝶呤或甲氨蝶呤时，培养基补充有次黄嘌呤和胸腺嘧啶核苷作为核苷酸的来源(HAT培养基)。当使用偶氮丝氨酸时，培养基补充有次黄嘌呤。优选的选择培养基是HAT。仅能够利用核苷酸补救途径的细胞能够在HAT培养基中存活。骨髓瘤细胞缺乏补救途径的关键酶，例如次黄嘌呤磷酸核糖转移酶(HPRT)，并且因此它们不能存活。B细胞能够利用该途径，但是它们在培养时具有有限的寿命并通常在大约两周内死亡。因此，能够在选择培养基中存活的仅有的细胞是从骨髓瘤和B细胞形成的那些杂合体细胞。这种培养提供一群杂交瘤，从这些杂交瘤中可以选择特异性的杂交瘤。有代表性地，杂交瘤的选择可以如下开展，即通过在微量滴定板中进行单克隆稀释来培养细胞，接着测试各个克隆上清液(大约两周至三周之后)的预期反应性。测定将是敏感的、简单的和快速的，例如放射免疫测定、酶免疫测定、细胞毒性测定、空斑测定、斑点免疫结合测定等等。然后将所选择的杂交瘤进行连续稀释并克隆成各个抗体-产生性细胞系，然后克隆可以无限繁殖以提供MAb。细胞系可以用来以两个基本方式生产MAb。第一，可将杂交瘤样品注射入(常常注射入腹腔)用于提供最初融合的体细胞和骨髓瘤细胞的组织相容性动物类型中(例如同基因小鼠中)。任选地，在注射前，动物以碳氢化合物，特别是油类例如降植烷(四甲基十五烷)致敏。所注射的动物产生分泌由所融合细胞杂合体产生的特异性单克隆抗体的肿瘤。然后可以抽取动物的体液，例如血清或腹水，以提供高浓度的MAb。第二，各个细胞系可体外培养，其中MAb可天然地分泌进入培养基中，从培养基中可以容易地得到高浓度的MAb。如果需要的话，通过任一种方法产生的MAb可以使用过滤、离心和多种层析方法如HPLC或亲和层析进一步纯化。本发明单克隆抗体的片段可以通过包括用酶例如胃蛋白酶或木瓜蛋白酶消化的方法和/或通过化学还原断裂二硫键从如此产生的单克隆抗体得到。备选地，本发明包括的单克隆抗体片段可以使用自动肽合成仪合成。还考虑了可使用分子克隆方法产生单克隆。在一个实施方案中，从所免疫动物脾脏分离的RNA制备组合的免疫球蛋白噬菌体文库，并且通过使用表达抗原的细胞和对照细胞淘洗选择表达适当抗体的噬菌粒。该方法相对于常规杂交瘤技术的优势是在一轮中可以产生和筛选大约IO4次量的抗体，并且通过H和L链组合产生新的特异性，这进一步提高发现适当抗体的机会。在另一实例中，LEE或CEE可以用于在无细胞体系中体外产生抗原。这些可以用作用于筛选单链抗体文库的靶标。这可以极其快速地鉴定许多不同的抗体，而无需使用动物。备选地，本发明包括的单克隆抗体片段可以使用自动肽合成仪合成，或者通过在大肠杆菌中表达全长基因或基因片段合成。全部为人的单克隆抗体可以使用转基因动物产生，例如包括携带人IgH和 Igkappa基因座部分，包括大多数可变区库，对于Cmicro、Cdelta和Cgammal、Cgamma2或 Cgamma4任一的基因，以及对于它们的功能必需的顺式元件的种系配置的巨碱基大小YAC 的XenoMouse (Green，1999)。可以繁殖在遗传背景上小鼠免疫球蛋白产生不足的IgH和 Igkappa转基因。在XenoMouse品系中的Ig转基因上编码的大且复杂的人可变区库支持开发大的外周B细胞分隔和产生多种与来自成人相似的初次免疫库。以人抗原免疫 XenoMouse小鼠通常导致强烈的次级免疫反应，这可以最终作为具有亚纳摩尔亲和性的一大组抗原特异性的完全人IgGkappa mAb收集到。来自XenoMouse动物的单克隆抗体已经显示在体外和体内均具有治疗潜能，并且基于人临床试验似乎具有正常人抗体的药物代谢动力学。2.抗体结合物本发明还提供选择性结合Cripto或GRP78的连接至至少一种试剂形成抗体结合物抗体，通常是单克隆类型的抗体。为了增加抗体分子作为诊断或治疗剂的有效性，抗体可以与至少一个想要的分子或部分共价结合或复合。此类分子或部分可以是，但不限于，至少一个效应子或报告分子。效应子分子包括具有所希望活性如细胞毒性活性的分子。连接至抗体的效应子分子的非限定性实例包括毒素、抗肿瘤剂、治疗酶、放射性标记的核苷酸、抗病毒剂、螯合剂、细胞因子、生长因子和寡或多核苷酸。相反，报告分子被定义为可使用测定法检测的任何部分。与抗体缀合的报告分子的非限定性实例包括酶、放射性标记、半抗原、 荧光标记、磷光分子、化学发光分子、生色团、发光分子、光亲和性分子、有色颗粒或者配体， 例如生物素。Cripto和/或GRP78抗体可以用作抗体结合物的基础。除了抗体分子的抗原结合位点之外，抗体分子中用于结合生物活性分子的位点包括位于可变结构域中的可结合病原体、B细胞超抗原、T细胞共受体⑶4和HIV-I包膜的位点(Sasso等，1989 ；Shorki等，1991 ；SiIvermann 等，1995 ；Cleary 等，1994 ；Lenert 等，1990 ；Berberian 等，1993 ；Kreier 等，1991)。此外，可变结构域参与抗体自身结合(Kang等，1988)，并且包含由抗抗体识别的表位(独特位)(Kohler等，1989)。某些抗体结合物的实例是其中抗体被连接至可检测标记的那些结合物。“可检测标记”是由于它们的特异性功能特性和/或化学特征而可以被检测到化合物和/或元素，它们的使用使得与其连接的抗体可以被检测和/或根据需要被进一步定量。另一个此类实例是包含连接至细胞毒性剂或抗细胞剂的抗体的结合物的形成，并且可以称作“免疫毒素”。抗体结合物通常优选作为诊断剂。抗体诊断通常分为两类，即用于体外诊断的那些，例如在多种免疫测定中，和/或用于体内诊断方案的那些，通常称作“抗体导向的成像”。许多适当的成像剂是本领域已知的，如用于附着抗体的方法的那些(见例如美国专利5，021，236，4，938，948，和4，472，509，每一文献通过参考并入本文)。所使用的成像部分可以是顺磁离子；放射性同位素；荧光染料；NMR可检测的物质；X射线成像。以顺磁离子为例，可以以实例方式提到的离子例如铬(III)、锰(II)、铁(III)、铁 (II)、钴(II)、镍(II)、铜(II)、钕(III)、钐(III)、镱(III)、钆(III)、钒(II)、铽(III)、 镝(III)、钬(III)和/或铒(III)，其中钆是特别优选的。用于其它背景，如X射线成像的离子包括但不限于镧(III)、金(III)、铅(II)并且特别是铋(III)。用于治疗和/或诊断应用的放射性同位素包括砹21V4碳、51铬、36氯、57钴、58钴、 铜67、152 铕、镓67、3 氢、碘123、碘125、碘131、铟 m、59 铁、32 磷、铼186、铼 188J5 硒、35 硫、锝99m 和 / 或钇9°。125I对于某些实施方案是优选的，并且锝99m和/或铟111由于它们能量低并且对大范围的检测具有适应性也是经常优选的。可以根据本领域众所周知的产生放射性标记的本发明单克隆抗体。例如，单克隆抗体可以通过与碘化钠和/或碘化钾和化学氧化剂如次氯酸钠，或酶性氧化剂如乳过氧化物酶接触被碘化。根据本发明的单克隆抗体可以通过配体交换过程以锝99m标记，例如通过以亚锡溶液还原过锝酸盐，将还原的锝螯合在kphadex柱上并且向该柱应用抗体。备选地，可以使用直接标记技术，例如通过孵育过锝酸盐、还原剂例如SNCl2、缓冲溶液如邻苯二甲酸钠-钾溶液和抗体。常用于将作为金属离子存在放射性同位素结合至抗体的中间的功能基是钆喷酸(DTPA)或乙二胺四乙酸(EDTA)。在荧光标记中考虑用作结合物的包括Alexa 350、Alexa 430、AMCA、BODIPY 630/650、BODIPY 650/665、BODIPY-FL, B0DIPY-R6G、BODIPY-TMR、BODIPY-TRX、Cascade 811^丄73丄75、6呼六11、异硫氰酸荧光素、冊乂、6-(^、俄勒同绿488、俄勒同绿500、俄勒冈绿 514、太平洋蓝、REG、罗丹明绿、罗丹明红、肾造影剂、ROX、TAMRA, TET、四甲基罗丹明、和/或德克萨斯红。本发明考虑的另一类型的抗体结合物是预期主要用于体外使用的那些，其中抗体与第二个结合配体和/或酶(酶标签)连接，当与生色底物接触时酶产生有色的产物。适宜的酶实例包括尿素酶、碱性磷酸酶、(辣根)过氧化氢酶或葡萄糖氧化酶。优选的第二个结合配体是生物素和/或抗生物素蛋白和链亲和素化合物。此类标签的使用是本领域技术人员众所周知的并且描述于例如美国专利3，817，837 ；3, 850，752 ；3, 939，350 ；3, 996，345 ； 4，277，437 ；4, 275，149和4，366，241中；每一美国专利通过参考并入本文。分子与抗体的位点特异性附着的另一已知方法包括抗体与基于半抗原的亲和性标签的反应。基本上，基于半抗原的亲和性标签与抗原结合位点中的氨基酸反应，由此破坏了该位点并封闭特异性的抗原反应。然而，这并不是有利的，因为这导致抗原丧失结合抗体结合物。包含叠氮基的分子还可用于通过由低强度紫外线产生的活性氮烯中间体与蛋白质形成共价键(Potter和Haley，1983)。具体而言，嘌呤核苷酸的2_和8_叠氮类似物已经用作位点定向光探针来鉴定粗细胞提取液中的核苷酸结合蛋白(Owens和Haley，1987 ； Atherton等，1985)。2-和8-叠氮核苷酸也已经用于所纯化蛋白质的核苷酸结合结构域作图(Khatoon等，1989 ；King等，1989 ；以及Dholakia等，1989)并且可以用作抗体结合剂。用于抗体附着或缀合至其结合物部分的数个方法是本领域已知的。一些附着方法涉及使用金属螯合复合物，采用例如有机螯合剂，如钆喷酸酐(DTPA) ；二亚乙基三胺； N-氯-ρ-甲苯磺酰胺；和 / 或 tetrachloro-3a-6 α-diphenylglycouril-3 与抗体连接 (美国专利4，472，509和4，938，948，每一美国专利通过参考并入本文)。单克隆抗体还可在偶联剂如戊二醛或高碘酸盐存在下与酶反应。带有荧光素标记物的结合物在这些偶联剂存在下或者通过与异硫氰酸酯反应制备。在美国专利4，938，948中，使用单克隆抗体实现乳腺肿瘤的成像并且可检测的成像部分使用连接体如对羟基苯甲亚胺酸甲酯或3-(4-羟基苯基)-丙酸-N-琥珀酰亚胺酯与抗体连接。在另外的实施方案中，考虑了通过使用不改变抗体结合位点的反应条件向免疫球蛋白的Fc区选择性引入巯基的免疫球蛋白的衍生化。公开了根据该方法学产生的表现出改善的寿命、特异性和敏感性的抗体结合物(美国专利号5，196，066，通过参考并入本文)。 在文献中已经公开了其中报告分子或效应子分子结合至Fc区糖残基的效应子或报告分子的位点特异性附着(0' Siannessy等，1987)。已经报导该方法产生当前处于临床评定中的有希望用于诊断和治疗的抗体。3.双功能性抗体在某些实施方案中，双功能性抗体可以用于靶向Cripto和/或GRP78。例如，双特异性的Fc- 二聚体可用于靶向和结合Cripto和GRP78两者，并且构想这种结合将抑制随后的Cripto/GRP78复合体的信号，例如Nodal信号、激活蛋白/TGFi^信号、ERK/MAPK信号和 /或PI!3K/Akt/GSK3i3信号。在某些实施方案中，双功能性的或双特异性的抗体可以结合至少一部分的Cripto EGF样区、Cripto CFC结构域、GRP78的氨基酸19-68，和/或GRP78的 N-20区。备选地，包含多个scFv分子的双链抗体、三链抗体或四链抗体可用于以例如增加的亲和性结合Cripto和/或GRP78。位于双特异性抗体中V结构域之间不同长度的连接体可用于指导双链抗体(例如大约60kDa)、三链抗体(例如大约90kDa)或四链抗体(例如大约120kDa)的形成，如取决于所希望的特定应用，例如体内或体外成像或治疗所希望的那样以优化大小、柔性和效价 (Robinson等2008 ；Todorovska等，2001)。多功能性抗体表现出对这些scFv多聚体增强的结合效价，导致高的亲和力和降低的脱落。在一些实施方案中，多功能性抗体可以有利地用于肿瘤靶向，因为大约60-100kDa的某些分子表现出与亲本Ig(例如大约150kDa)相比增加的肿瘤渗透性和快速的清除率。在某些实施方案中，设计多特异性Fv模块以交联两个或更多个不同的靶抗原。这些双特异性和三特异性多聚体可以通过不同scFv分子的结合形成(Dutertre和Teillaud，2006 ；Pluckthun 等，1997 ；Kortt 等，2001 ；Hudson 等，1999 ；Atwell 等，1996)。B. Cripto/GRP78 靶向件肽Cripto靶向性或GRP78靶向性蛋白质或肽可以用于抑制Cripto/GRP78复合体的形成和/或功能。例如，可以使用例如体外细胞噬菌体展示筛选肽文库以鉴定可结合 Cripto和/或GRP78以抑制Cripto/GRP78复合物形成的肽或蛋白质。多种方法可以用于此目的，包括例如 Mintz PJ 等 Nat Biotechnol 2003 21 (1)57-63 ；Kim Y 等 Biochemistry 45(31)9434-44 Jakobsen CG 等 Cancer Res 2007 67 (19) 9507-17 ；和 Gonzalez-Gronow M 等Cancer Res 2006 66 11424-31中描述的那些，它们通过参考并入本文。如本文中所使用，蛋白质或肽通常指，但不限于从基因翻译的大于大约200个氨基酸直至全长序列的蛋白质；大约100至200个氨基酸的多肽；和/或从大约3个至大约100个氨基酸的肽。为了方便起见，术语“蛋白质”、“多肽”和“肽”在本文中互换使用。在某些实施方案中，包含GRP78的N-20表位的肽可用于结合Cripto并抑制 Cripto/GRP78复合物的形成。如本文所示，GRP78的N-20表位对于Cripto/GRP78结合是至关重要的；因此，包含GRP78的N-20表位的肽可用于竞争性地拮抗Cripto/GRP78复合物的形成。N-20表位由GRP78信号肽下游的前50个残基内的20个氨基酸组成。N-20抗体可以购自Santa Cruz Biotechnology (CA，美国)。类似地，在另外的实施方案中，包含Cripto 的CFC结构域的肽可用于结合GRP78并抑制Cripto/GRP78复合物的形成。如在下面实例中所示，Cripto的CFC结构域对于Cripto/GRP78结合是至关重要的；因此，包含Cripto的 CFC结构域的肽可用于竞争性地拮抗Cripto/GRP78复合物的形成。使用125I-标记的可溶性Cripto的结合测定法，例如在Kelber等中描述的那些， 可用于本发明中。例如，Cripto与完整MCFlOA或NCCIT细胞的结合可被未标记的Cripto 竞争性阻断，并且重要的是可被N-20GRP78抗体竞争性阻断。该测定法或其改良形式可用于筛选能够破坏Cripto/GRP78结合的肽。在某些实施方案中，至少一种蛋白质或肽的大小可包括，但不限于，1、2、3、4、5、6、 7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、 33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、 58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、 83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、大约 110、大约 120、大约 130、大约140、大约150、大约160、大约170、大约180、大约190、大约200、大约210、大约 220、大约230、大约M0、大约250、大约275、大约300、大约325、大约350、大约375、大约 400、大约425、大约450、大约475、大约500、大约525、大约550、大约575、大约600、大约 625、大约650、大约675、大约700、大约725、大约750、大约775、大约800、大约825、大约 850、大约875、大约900、大约925、大约950、大约975、大约1000、大约1100、大约1200、大约1300、大约1400、大约1500、大约1750、大约2000、大约2250、大约2500或更多个氨基酸残基。如本文中所使用，“氨基酸残基”指本领域已知的任何天然存在的氨基酸、任何氨基酸衍生物或任何氨基酸模拟物。在某些实施方案中，蛋白质或肽的残基是连续的，没有任何非氨基酸打断氨基酸残基序列。在另外的实施方案中，序列可以包含一个或更多个非氨基酸部分。在特定的实施方案中，蛋白质或肽残基序列可被一个或更多个非氨基酸部分打
24断。因此，术语“蛋白质或肽”包括包含在天然存在蛋白质中发现的20种常见氨基酸中至少一种或者至少一种修饰或罕见氨基酸，包括但不限于下表2所示的那些的氨基酸。
权利要求
1.抑制细胞中Cripto信号以降低细胞增殖的方法，包括将细胞与一定量的选择性的 GRP78/Cripto靶向性化合物接触，所述的GRP78/Cripto靶向性化合物有效抑制Cripto和 GRP78之间复合体的形成，由此降低细胞的增殖。
2.权利要求1的方法，其中所述复合体的形成被a)抗GRP78抗体、b)结合至在Cripto 的GRP78-结合结构域或CFC结构域中的表位的抗体或c)缺乏天然GRP78的氨基酸19-68 位的GRP78突变体抑制。
3.权利要求2的方法，其中抗体是结合GRP78的N-20表位的抗GRP78抗体。
4.权利要求2的方法，其中抗体是人单克隆抗体或人源化单克隆抗体。
5.权利要求2的方法，其中抗体是双特异性抗体。
6.权利要求2的方法，其中抗体结合至报告分子。
7.权利要求6的方法，其中报告分子是放射性配体或荧光性标签。
8.权利要求2的方法，其中抗体是抗GRP78scFV、F(ab)或F(ab)2。
9.权利要求1的方法，其中靶向性化合物是shRNA、siRNA或siNA。
10.权利要求9的方法，其中靶向性化合物是包括SEQID NO :5或SEQ ID NO :4的 ShRNA0
11.权利要求2的方法，其中靶向性化合物是缺乏天然GRP78的氨基酸19-68位的 GRP78突变体。
12.权利要求11的方法，其中缺乏天然GRP78的氨基酸19-68位的GRP78突变体是 Δ19-68GRP78。
13.权利要求1的方法，其中施用是全身施用、局部施用、部位施用、肠胃外施用、静脉内施用、腹膜内施用、通过吸入施用或者肿瘤内施用。
14.权利要求1的方法，其中所述细胞是乳腺、结肠、胃、胰、肺、卵巢、子宫内膜、睾丸、 膀胱、前列腺、头、颈、子宫颈、胃、胆囊或肾上腺皮质细胞。
15.权利要求1的方法，其中细胞是癌性细胞、癌前细胞或恶性细胞，并且其中方法进一步定义为治疗受试者中高增生性疾病的方法。
16.权利要求15的方法，其中高增生性疾病是癌症。
17.权利要求16的方法，其中癌症选自乳腺癌、结肠癌、胃癌、胰腺癌、肺癌、卵巢癌、子宫内膜癌、睾丸癌、膀胱癌、前列腺癌、头颈癌、宫颈癌、胆囊癌或肾上腺皮质癌。
18.权利要求16的方法，其中方法包括向受试者施用第二癌症治疗。
19.权利要求18的方法，其中第二癌症治疗是化学治疗、放射治疗、基因治疗、免疫治疗或外科手术。
20.权利要求19的方法，其中第二癌症治疗是化学治疗。
21.权利要求20的方法，其中化学治疗是紫杉醇、顺钼或碳钼。
22.权利要求1的方法，其中方法进一步定义为促进干细胞分化成为神经元细胞的方法，其中细胞是干细胞，并且其中抑制Cripto和GRP78之间复合体的形成促进细胞分化成为神经元细胞。
23.权利要求22的方法，其中细胞是人胚胎干细胞。
24.权利要求23的方法，其中人胚胎干细胞是Η9或BG02。
25.权利要求23的方法，其中干细胞是诱导的多能干细胞(iPSC)。
26.筛选Cripto/GRP78复合物形成抑制剂的方法，包括a)获得候选调节剂；b)将候选调节剂与Cripto和GRP78接触；和c)测量Cripto/GRP78复合体的形成；其中在候选调节剂存在下Cripto/GRP78复合体形成的降低或Cripto/GRP78复合体信号的降低表明候选调节剂是Cripto/GRP78复合物形成的抑制剂。
27.人源化单克隆抗GRP78抗体，其中抗体结合GRP78的N-20表位，并且其中所述结合抑制Cripto/GRP78复合体的形成。
28.权利要求26的抗体，其中抗体包含在药物组合物中。
29.权利要求28的组合物，其中药物组合物被配制成用于肠胃外、静脉内或瘤内施用。
全文摘要
本发明提供用于治疗高增生性疾病的组合物和方法，包括破坏高增生性细胞中的Cripto/GRP78复合物的形成。在某些实施方案中，抗体和/或siRNA可用于抑制Cripto/GRP78结合，任选地与其它癌症治疗相结合。还提供用于鉴定可选择性抑制Cripto/GRP78结合的治疗化合物的方法。
文档编号C12N15/11GK102272157SQ200980154121
公开日2011年12月7日 申请日期2009年11月9日 优先权日2008年11月7日
发明者G·沙尼, J·A·科尔博, W·维尔, 彼得·C·格雷 申请人:研究发展基金会