专利名称：连续单反应釜发酵合成丁醇的制作方法
技术领域：
本发明主要涉及通过发酵法生产丁醇，特别是涉及通过产生微环境来维持产酸和产溶剂相细胞共生(coincident)的亚群的单反应釜(vessel) 丁醇生产。
背景技术：
丁醇(正丁醇(n-butanol)或正-丁醇(η-butyl alcohol))可以通过碳水化合物的发酵来生产，所述碳水化合物降解成产物如包含五和六个碳原子的糖(如葡萄糖)。查尔斯魏兹曼(Charles Weizmarm)在第一次世界大战期间发展了 这种方法(见，例如美国专利1，315，585 ；1, 329，214 ；1, 437，697)。简单地说，魏兹曼方法包括在丙酮丁醇梭杆菌 {Clostridium acetobutylicum)存在下合适的原料的发酵，丙酮丁醇梭杆菌将原料转化成丙酮、丁醇和乙醇(ABE)的溶剂混合物。在溶剂混合物中，丁醇丙酮乙醇的比率通常是 6 ！ 3 ！ I0ABE发酵为两阶段(biphasic)过程在第一(产酸)阶段期间，对数生长伴随乙酸和丁酸的生产，这也引起伴随的和必需的PH下降。在第二(产溶剂)相中，生长停止，并且产生溶剂的同时消耗前述的酸，包括进一步消耗输入的原料。氢气和二氧化碳在发酵过程中不断产生。由此产生的溶剂以稀的含水溶液形式产生，一般为约重量，使得其纯态回收包括其与大量水的分离。正是分离的费用使得通过发酵生产这些化学制品竞争不过从以石油为基础的来源生产溶剂。然而，对全球气候变暖的关注、实现能源独立的愿望和石化衍生原料价格的增加使人们的兴趣回到可将可再生未精制原料转换成简单有机化学制品的工艺上。用梭状芽孢杆菌微生物发酵ABE的一个问题是丁醇对培养物有毒(即，在不考虑糖浓度的情况下，最大耐受丁醇浓度为大约2%)。通过在生产过程中连续除去丁醇可避免其毒性，用于最大量生产溶剂。各种丁醇去除系统，包括吸附、渗透蒸发、渗透萃取、反渗透、 液-液萃取和气提，都不完全成功。此外，上述所有方法都增加了生产成本。因此，本领域仍然需要一种改进的从这些生物体生产溶剂的工艺。
发明内容
本发明介绍了一种通过梭状芽孢杆菌属(CZo1Siridium genus )细胞对碳水化合物进行发酵生产丁醇的方法，其中产酸相(acidogenic-phase)细胞和产溶剂相 (solventogenic-phase)细胞的混合物保持在单反应釜中。本发明系统不需要间歇性调整 PH或排出顶空气体。公开的方法提供了一种移除丁醇产物的工艺，所述丁醇产物并非不可逆地损害细胞，当溶剂的抑制浓度不再存在时，这类细胞可以重新开始合成丁醇。此外，本发明包括包含梭状芽孢杆菌细胞的组合物(compos i t ion )和生物纯培养物。 在一个实施方案中，公开了丁醇生产的连续工艺，该工艺包括在第一反应釜中使梭状芽胞杆菌细胞和缓冲剂与包含碳水化合物的基质相接触，在最佳温度下培养细胞直至达到丁醇抑制浓度，降低第一反应釜中的压力直到出现强烈沸腾，将包含丁醇的共沸物从第一反应釜转移到第二收集反应釜作为冷凝物(condensate)，用清洗流体冲洗反应釜，并不断重复上述步骤。在相关方面，冲洗是冷凝收集体积(condensation collection volume)的功能，当冷凝收集体积占培养物体积的约4% 时，冲洗开始。在另一方面，压力从约760mm Hg下降至约20mm Hg-30mm Hg。在另一方面，当溶剂产量为基质中可同化碳水化合物的约35% -40% (wt/wt)时，补充包含碳水化合物的基质。在一个方面，这些细胞包括但不限于beijerinkii, C. acetobutylicum, C. aurantibutyricum^ C. tetranomorphum 禾口C. thermocellum0 在才目关方面，梭状芽抱杆菌 beijerinkii 的编号是 NRRL B-50244。在另一个实施方案中，公开了生产丁醇的连续工艺，其包括在第一反应釜中使梭状芽胞杆菌细胞的单培养物和缓冲剂与包含碳水化合物的基质相接触，在最佳温度下培养细胞直至达到丁醇的抑制浓度，升高培养物温度到比最佳温度高约6°c -ire并将第一反应釜的压力从约760mm Hg降低至产生强烈沸腾，将包含丁醇的共沸物从第一反应釜转移至第二反应釜作为冷凝物，用清洗流体冲洗第一反应釜并将培养物冷却至丁醇合成的最佳温度作为冷凝收集体积的功能，并不断重复上述步骤。在一个方面，当溶剂产量为可同化碳水化合物的约35% -40% (wt/wt)时，补充包含碳水化合物的基质。在另一方面，培养物包含产酸和产溶剂相中的细胞混合物。在相关方面，梭状芽胞杆菌细胞为C. beijerinkii。在另一方面，清洗流体为N2气体。在一个方面，最佳温度为约33°C -37°C。在另一方面，温度上升至约43°C -44°C。 在又一方面，压力下降至约110謹Hg-IOCkm Hg。在一个方面，丁醇的抑制浓度为约0.9%-2.0%。在相关方面，丁醇的抑制浓度为约 1. 3%。在另一方面，缓冲剂包括碳酸钙的生物源，其包括海螵蛸和牡蛎壳。在一个方面， 该方法还包括使细胞与分子骨架相接触。在相关方面，分子骨架包括海绵碎片，其中海绵包含碳酸钙、二氧化硅骨针(silica spicules)或纤维素。在一个方面，这种工艺的丁醇产量是可发酵碳水化合物的约35%-40% (w/w), 包括每个循环约20g/L的丁醇产量。在另一方面，该工艺产生顶空气体混合物，其包含约 40-50% H2、约40-50% CO2和0-20% N20在相关方面，顶空气体包含43% H2,43% CO2和
14% N2。在另一个实施方案中，公开了一种组合物，其包括产酸相和产溶剂相梭状芽孢杆菌属细胞的混合种群和包含生物碳酸钙源的缓冲剂。在一个方面，生物碳酸钙源包括海螵蛸碎片和牡蛎壳碎片。在另一方面，缓冲剂为无机碳酸钙源。在另一方面，该组合物还包括纤维素生物质，包括茎、叶、糠、木屑、锯末、枯树、树枝、家居垃圾、纸制品、造纸黑液、草或它们的组合。
在一个方面，细胞为梭状芽孢杆菌腫beijerinkii).在相关方面，梭状芽孢杆菌知的编号是NRRL B-50244。在另一方面，梭状芽孢杆菌beijerinkii插入于固相中，所述固相包括天然海绵、纤维海绵、海藻酸钙微珠和聚丙烯酰胺片(sheet)。在一个实施方案中，公开了梭状芽孢杆菌知NRRL B-50244的生物纯培养物。在一个方面，该培养物可在PH6.0下继续生产丁醇。在另一方面，该培养物包埋于固相中。在相关方面，固相包括天然海绵、纤维海绵、丝瓜海绵、海藻酸钙微珠、软体动物壳的碎片、墨鱼骨碎片和聚丙烯酰胺片。
图1显示了可用于连续单反应釜生产丁醇的设备的示意图2显示了由C. beijerinkii NRRL B-50244培养物生产的丁醇的色谱； 图3图解说明了观察到的自由和包埋细胞的丁醇合成时间过程。实心正方形代表来自于培养物中自由的C知ij^ri/^ii细胞的数据。实心菱形代表来自包埋于海藻酸盐微珠中的C. beijerinkii细胞的数据；
图4图解说明了 OD6tltlnm处自由和包埋细胞的细胞生长速率。数据点与图3中的丁醇数据点平行采集。实心正方形代表来自培养物中自由的C知ij^ri/^ii细胞的数据。实心菱形代表来自包埋于海藻酸盐微珠中的C. beijerinkii细胞的数据；
图5 (A)- (C)显示了一系列表明真空蒸馏后丁醇重新开始合成的色谱。(A)显示了蒸馏前的丁醇浓度。(B)显示了蒸馏后的丁醇浓度。(C)显示了再培育(re-incubation)后的丁醇浓度。各峰可键入(keyed to)图2中。所有％值为vol/vol ； 图6显示了图1所示设备的自动化实施方案的示意图。
具体实施例方式在描述本发明的组合物、方法和方法论之前，应该理解，本发明不限于所描述的特定组合物、方法和实验条件，因为这类组合物、方法和条件可以有所不同。也应该理解，本文所使用的术语仅出于描述特定实施方案的目的，并不意图限制，因为本发明的范围将仅在所附权利要求中被限制。如本说明书和所附权利要求所用，单数形式的“一”、“一个”以及“该”包括引用复数形式，除非上下文另有清晰的指示。因此，例如引用“一细胞”包括一个或多个细胞，和/ 或本文所描述类型的组合物，该种类型的组合物在本领域技术人员阅读本公开内容之后将变得显而易见，依此类推。除非另有定义，否则，本文使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属领域技术人员通常的理解相同的含义。任何与本文描述相似或等同的方法和材料可用于本发明的实施和测试，因将理解，各种改进和变型包括在本公开内容的精神和范围内。如本文所用，“产酸相和产溶剂相细胞的混合种群”是指组合数量的梭状芽孢杆菌细胞，其包括主要为丁酸和乙酸产生细胞的亚群和主要为丙酮/ 丁醇/乙醇(ABE)产生细 Ifi白勺L。 Iiftt^llf舌 C beijerinkii ^C. acetobutylicum>C. auran tibutyricum>C. tetranomorphum, C. thermocellum和类似的细菌，所述细菌将碳水化合物、丁酸和其它酸转化成溶剂如丁醇、丙酮、乙醇或异丙醇。在某些方面，亚群来自单菌株或多菌株。在另一方面，在本发明公开的工艺中可使用的细胞可以是天然存在的或人造的(即，从重组操作获得的)。
如本文所用，“生物碳酸钙源”是指碳酸钙的供应来自动物的壳或骨架材料(或其碎片)。例如，属于软体动物门(phylum Mollusca)的动物的壳是生物碳酸钙源。如本文所用，“纤维素生物质”是指具有少量蛋白质、脂质(脂肪、蜡和油)和灰分， 由纤维素、半纤维素和木质素组成的材料。这类生物质包含可同化的碳水化合物(即，碳水化合物基质)。可同化的碳水化合物的实例包括但不限于糖如葡萄糖、乳糖、乳清渗透物、戊糖、淀粉、液化淀粉、经酶处理的液化淀粉、麦芽糊精和玉米浆。在一个方面，可分析这类可同化碳水化合物的右旋糖当量(dextrose equivalents)(例如，用糖化酶和α -淀粉酶处理生物质后使用YSI分析仪，见，例如美国专利5，192，673，或用二硝基水杨酸处理生物质后使用YSI分析仪，见，例如Tasun等人在((Biotech Bio-eng》1970年第12卷第991-992 页发表的文章)。如本文所用，“固相”是指以抵抗变形和体积变化为特点的物质状态。在一个方面， 固相可为多孔或无孔。在相关方面，选定的细菌可在多孔固相上形成菌落，其中菌落化的固相用作新培养物的移植。例如，固相可以是3维分子骨架，其中这样的骨架为细胞生长提供较大的表面积(如海绵)。在相关方面，“包埋”是指细胞插入固相空隙内。如本文所用，“清洗流体”是指用于洗出其它液体或气体的液体或气体。例如，CO2 和N2气体为清洗流体。生物产生的1-丁醇可以用本领域公知的方法从发酵培养基中分离。例如，可通过离心、过滤、倾析或类似的方法从发酵培养基中除去固形物。然后，使用方法如蒸馏、液-液萃取或以膜为基础的分离来从发酵培养基中分离1- 丁醇。由于1- 丁醇与水形成低沸点共沸混合物，因此蒸馏只能用来将混合物分离至其共沸组成(azeotropic composition)。 蒸馏通常与另一分离方法结合以围绕共沸物获得分离。可与蒸馏结合使用以分离和纯化 1- 丁醇的方法包括但不限于倾析、液_液萃取、吸附和以膜为基础的技术。1- 丁醇-水混合物形成了非均相共沸物，使得蒸馏可与倾析结合用来分离并纯化 1-丁醇。在一种方法中，将含1-丁醇的发酵液蒸馏至接近共沸组成。然后，使共沸混合物凝结，并通过倾析从发酵培养基中分离1-丁醇。倾出的含水相可回到第一精馏塔作为回流。倾出的富含1-丁醇的有机相可在第二精馏塔中通过蒸馏进一步纯化。也可用液-液萃取与蒸馏结合来从发酵培养基中分离1-丁醇。在这种方法中，使用合适的溶剂来液-液萃取发酵液中的1-丁醇。然后蒸馏含1-丁醇的有机相以从溶剂中分离1-丁醇。也可用蒸馏与吸附结合来从发酵培养基中分离1-丁醇。在这种方法中，蒸馏含有 1-丁醇的发酵液至接近共沸组成，然后通过使用吸附剂如分子筛除去剩余的水(国家可再生能源实验室2002年6月出版的Aden等人的报告NREL/TP-510-32438，稀酸预水解和酶水解联用对玉米秸秆从木质纤维素生物质至乙醇的工艺设计和经济)。此外，蒸馏与渗透蒸发的结合已被用于从发酵培养基中分离和纯化1-丁醇。在该方法中，蒸馏含有ι-丁醇的发酵液至接近共沸组成，然后用亲水膜通过渗透蒸发除去剩余的水(Guo等人在《J. Membr. Sci.》2004年第245卷第199-210页发表的文章)。
在所有这 些蒸馏方法中，由于通常用来蒸馏丁醇-水共沸物的温度(例如，约 93°C)会不可逆地损害营养态(vegetative state)的细胞，因此必须将发酵生物体从待蒸馏发酵液中分离出来。因此，与本发明方法相比，上面所述蒸馏工艺不能应用在与活性培养物相同的反应釜中而不破坏细胞。已应用各种工艺从生产性培养物中原位除去丁醇。研究的技术包括吸收、渗透蒸发、反渗透、液_液萃取和气提。上述方所有法都显著地增加生产费用，并且没有一个是最佳的。对丁醇显示出高度选择性的以膜为基础的系统被C acetobutylicum琳C. beijerinkii沾污和堵塞。气提法对希望从中除去挥发性组分的模型溶液运作良好 (见，例如美国专利申请20050089979)，但是，当例如使培养物保持平静地用于生产丁醇时，是禁止惰性气体通过待清洗溶液产生强烈泡沫的。在本发明中，公开了一种丁醇生产工艺，包括在第一单独反应釜中使梭状芽胞杆菌细胞的单培养物和缓冲剂与含碳水化合物的基质相接触，在最佳温度下培养细胞直至达到丁醇抑制浓度，并降低同一单独反应釜中的压力直到出现强烈沸腾，将包含丁醇的共沸物从第一反应釜转移到第二收集反应釜中作为冷凝物，用清洗流体冲洗第一反应釜作为冷凝收集体积的功能，其中当收集的冷凝物体积为发酵体积的约4-5%时开始冲洗，并不断重复上述步骤。因而，所得丁醇-水共沸物的蒸馏在与活性培养物相同的反应釜内进行。此夕卜，蒸馏后，同样的培养物可以用来重新开始生产丁醇。在一个方面，该工艺中消耗的每克葡萄糖或其它糖类(包括但不限于乳糖)产生至少0.4克丁醇。在另一方面，该工艺由可发酵碳水化合物可达到约80% -90%的最大丁醇产量。在另一相关方面，该工艺的丁醇产量为约20-40g/L。在另一方面，梭状芽胞杆菌细胞为C beijerinkii、C. acetobutylicum, C auran tibu tyricum > C. thermocellum 或 C. tetranomorphum 0 在才目关方面，细胞为 C beijerinkii NRRL B-50244。一般来说，发酵进行至少约36h，然而，发酵可进行140h或以上。对于本发明，在对数后期至稳定期维持细胞浓度用于连续生产溶剂，需要时，更换用尽的培养基和细胞。根据所使用的梭状芽孢杆菌菌株，细胞可被搅动或保持静止。例如，当使用C beijerinkii騎, 培养物将保持静止以用于生产丁醇。对于本发明，原料可以是简单的糖如葡萄糖、乳糖(例如，在乳清渗透物中所含有的)、戊糖；复合糖类如淀粉、液化淀粉、经酶处理的液化淀粉、麦芽糊精和玉米浆；或可包括纤维素生物质。这类原料作为水溶液和/或悬浮液加入。在一个方面，当从包含纤维素生物质的原料获得基质溶液时，发酵前可将这类生物质碾磨或微粒化。碾磨减少了含碳水化合物原料组分的大小，从而使生物质较易被选定的细菌分解。可采用灭菌来杀死底菌 (background bacteria)，使所选细菌蓬勃生长。通常情况下，将碳水化合物/糖类与水混合，然后像许多发酵系统常见的那样进行灭菌(见，例如美国专利5，753，474)。再次，可分析组成原料/糖类的碳水化合物的右旋糖当量(例如，在用糖化酶和α-淀粉酶处理生物质后用YSI分析仪分析(见，例如美国专利5，192，673)或通过二硝基水杨酸处理生物质后用 YSI分析仪分析(见，例如Tasun等人在((Biotech Bio-eng》1970年第12卷第991-992页发表的文章))。除了包含碳水化合物的基质，细胞还与营养培养基接触。有用的营养培养基包括本领域公知的那些营养培养基，如P2和蛋白胨葡萄糖酵母提取物(TGY)。也可以使用其它营养培养基。营养培养基可任选包含添加剂例如盐和/或微量元素。在一方面，培养基为乳糖产孢培养基(LSM)，如表1定义。
权利要求
1.一种用于生产丁醇的连续工艺，其包括(a)在第一反应釜中使梭状芽胞杆菌细胞的液体培养物和缓冲剂与包含碳水化合物的基质相接触；(b)在溶剂生产的最佳温度下培养细胞直到达到丁醇抑制浓度；(c)降低第一反应釜中的压力直到出现强烈沸腾；(d)将包含丁醇的共沸物从第一反应釜转移到第二收集反应釜中作为冷凝物；(e)用清洗流体冲洗第一反应釜；以及(f)不断重复步骤(b)_(e)。
2.根据权利要求1所述的工艺，其中冲洗为冷凝收集体积的功能，以及其中所述冲洗在冷凝收集体积为培养物体积的4% -5%时开始。
3.根据权利要求1所述的工艺，还包括当溶剂产量为基质中可同化碳水化合物的约 35%-40% (wt/wt)时，补充含有碳水化合物的基质。
4.根据权利要求1所述的工艺，其中培养物包括产酸和产溶剂相细胞的混合物。
5.根据权利要求1所述的工艺，其中梭状芽胞杆菌细胞选自beijerinkii,C. acetobutylicum、C. aurantibutyricum> C. tetranomorphum 私 C. thermoceIlum0
6.根据权利要求1所述的工艺，其中压力从约760mmHg下降至约20mm Hg-30mm Hg。
7.根据权利要求1所述的工艺，其中丁醇的抑制浓度为约0.9% -2. 0%。
8.一种用于生产丁醇的工艺，其包括(a)在第一反应釜中使梭状芽胞杆菌细胞的液体培养物和缓冲剂与包含碳水化合物的基质相接触；(b)在最佳温度下培养细胞直至达到丁醇抑制浓度；(c)将培养物的温度升高到溶剂生产最佳温度上约6°C_11°C并降低第一反应釜中的压力直到开始强烈沸腾；(d)将包含丁醇的共沸物从第一反应釜转移到第二收集反应釜中作为冷凝物；(e)用清洗流体冲洗第一反应釜并将培养物的温度冷却至最佳温度；以及(f)不断重复步骤(b)_(e)。
9.根据权利要求8所述的工艺，其中最佳温度为约33°C_37°C。
10.根据权利要求9所述的工艺，其中步骤(c)中温度升高到约43°C_44°C。
11.根据权利要求8所述的工艺，其中冲洗和冷却为冷凝收集体积的功能，其中当冷凝收集体积为培养物体积的约4% -5%时，冲洗和冷却开始。
12.根据权利要求8所述的工艺，其中压力从约760mmHg下降至约IlOmm Hg-IOOmmHg。
13.根据权利要求8所述的工艺，其中抑制浓度为约0.9% -2. 0%。
14.根据权利要求8所述的过程，还包括当溶剂产量为基质中可同化碳水化合物的约 35% -40% (wt/wt)时，补充含有碳水化合物的基质。
15.根据权利要求8所述的工艺，其中缓冲剂包括生物碳酸钙源。
16.根据权利要求15所述的工艺，其中生物源为海螵蛸或牡蛎壳。
17.根据权利要求8所述的工艺，还包括使细胞与海绵碎片相接触。
18.根据权利要求17所述的工艺，其中海绵包含碳酸钙、二氧化硅骨针或纤维素。
19.根据权利要求8所述的工艺，其中该工艺由可发酵碳水化合物达到约80%-90%之间的丁醇产量。
20.根据权利要求8所述的工艺，其中该工艺的丁醇产量为约20-40g/L。
21.根据权利要求8所述的工艺，其中该工艺产生顶空气体混合物，其包含约40-50% H2,40-50% CO2 和 0-20% N2。
22.根据权利要求21所述的工艺，其中该工艺产生顶空气体混合物，其包含约43%H2、 43% CO2 和 14% N2。
23.一种组合物，其包含产酸相和产溶剂相梭状芽孢杆菌细胞的混合种群以及含有生物碳酸钙源的缓冲剂。
24.根据权利要求23所述的组合物，其中生物碳酸钙源为海螵蛸碎片或牡蛎壳碎片。
25.根据权利要求23所述的组合物，其中细胞为梭状芽孢杆菌beijerinkii。
26.根据权利要求25所述的组合物，其中Cbeijerinkii为WRL B-50244。
27.根据权利要求25所述的组合物，其中梭状芽孢杆菌知ij'ari/^ii包埋于固相中，所述固相选自天然海绵、纤维海绵、丝瓜海绵、海藻酸钙微珠和聚丙烯酰胺片。
28.一种梭状芽孢杆菌力eiJeri/^ii NRRL B-50244的生物纯培养物。
29.根据权利要求28所述的生物纯培养物，其中该培养物包埋于固相中，所述固相选自天然海绵、纤维海绵、海藻酸钙微珠和聚丙烯酰胺片。
全文摘要
本发明公开了一种用梭状芽孢杆菌产酸相细胞和产溶剂相细胞的混合种群在单个反应釜中通过碳水化合物发酵生产丁醇的方法。所描述的本发明系统不需要间歇性调整pH或排出顶空气体。该方法提供了一种用于除去不可逆损害细胞的丁醇产物的工艺，并且描述了这类细胞可在相同的单个反应釜中重新开始合成丁醇的条件。如所公开的，本发明还描述了包含梭状芽孢杆菌细胞的组合物和生物纯培养物。
文档编号C12R1/145GK102439161SQ200980158890
公开日2012年5月2日 申请日期2009年2月26日 优先权日2009年2月23日
发明者尤金·T·巴特勒三世 申请人:尤金·T·巴特勒三世