专利名称：利用染色体加倍改良万寿菊基因型的方法
技术领域：
本发明属于花卉育种技术领域，具体涉及一种利用染色体加倍改良万寿菊基因型的方法。
背景技术：
万寿菊属植物共有56种，其中有27种为一年生植物。目前广泛应用的万寿菊属植物主要有3种孔雀草(Tagetespatula L.)、万寿菊(Tagetes erecta L.)和三倍体万寿菊(Tagetes erecta×Tagetespatula)(由二倍体的万寿菊和四倍体的孔雀草杂交而得到的三倍体不育品系)。万寿菊和孔雀草具有开花早、花期长、花型紧凑等优点，不仅可以露地栽培美化街景、庭院，而且可以盆栽布置花坛。同时富含叶黄素，是天然色素的重要来源。此外还均含有一些生物活性成分，其提取物被广泛的运用于制作杀虫剂和杀菌剂。
万寿菊属植物具有菊科植物典型的头状花序，在杂交育种过程中，去雄非常困难。目前万寿菊主要通过雄性不育两用系制种，但是孔雀草由于缺乏不育系，仍以常规育种为主，造成育成品种的权力保护困难。孔雀草与万寿菊是同属近缘种，若能将万寿菊的不育性状转育到孔雀草中，即能实现孔雀草的杂交育种，为孔雀草育种开辟新的领域。然而由于两者的倍性不一致，杂交F1代为三倍体，不能结实，从而限制了育性的转育进程。因此当务之急是建立一个稳定、高效的万寿菊加倍技术体系，将雄性不育的二倍体万寿菊加倍成四倍体，再与四倍体孔雀草杂交，通过多代选育，人工创造出不育孔雀草。目前植物细胞加倍技术已在很多物种上得到应用，但国内有关万寿菊加倍的研究尚未见报道。
自然界植物多倍体的发生均来自于细胞核内染色体组的倍性变异，即体细胞分裂过程中偶然发生的染色体加倍以及减数分裂过程中产生未减数配子。人工诱导染色体加倍可采取秋水仙素溶液等化学诱导方法以及异常温度等物理诱导方法。可诱导多倍体的化学药剂很多，但使用最多、最有效的还是秋水仙素。秋水仙素是从百合科的秋水仙(Colchicum autumnale L.)的器官和种子中提取的一种药剂，当它接触处于分裂期的细胞后，能使细胞核纺锤丝立即缩小，阻碍纺锤丝的形成和发展，使染色体不能移向两极，停止在细胞分裂中期，从而产生染色体数加倍的核。利用秋水仙素处理分裂旺盛的组织均能获得理想的多倍体，而萌发的种子和生长点是最好的处理材料。
目前利用秋水仙素进行植物染色体加倍的方法主要有浸种法、滴苗法、涂抹法、组织培养结合化学诱变等。申请人在利用组织培养结合秋水仙素化学诱变加倍万寿菊的过程中，发现对分化的芽点施加不同浓度的秋水仙素后，分化苗玻璃化现象非常严重，无法得到健壮的四倍体植株，且组织培养的操作过程也相对复杂，成本较高。滴苗法、涂抹法的具体操作技术及环境条件控制都较浸种法的要求高，且易出现嵌合体。
发明内容
本发明的目的是克服现有技术存在的缺陷，提供一种稳定、简便、高效的万寿菊染色体数目加倍的方法，以改良万寿菊的基因型，为杂交育种提供基础材料。
本发明通过以下技术方案实现 一种利用染色体加倍改良万寿菊基因型的方法，采用秋水仙素溶液处理万寿菊雄性不育两用系的种子或茎尖，使其染色体数目加倍，从而为万寿菊的基因型改良提供育种的起始材料。其步骤如下 A、万寿菊种子染色体加倍 ①催芽处理将万寿菊雄性不育两用系的饱满种子放入垫有用清水润湿的滤纸的培养皿中催芽处理，培养温度为25℃，得到萌动的种子； ②秋水仙素加倍处理将步骤①的萌动种子用0.05％浓度的秋水仙素溶液浸泡，浸泡时间为3～6小时，在浸泡过程中不断搅拌，实现染色体加倍的目的； ③清水冲洗解除处理倒出秋水仙素溶液，将处理过的万寿菊种子放入三角瓶中，用纱布绑扎瓶口，将三角瓶放在流水下冲洗30分钟； ④栽培管理将步骤③水洗后的万寿菊种子播于盛有栽培基质的穴盘中，一穴一粒，两个月后移栽到盛有盆土的瓦盆中，所述的栽培基质为泥炭和珍珠岩按重量份的比例为3∶1混合，盆土为园土+腐叶土+黄沙按重量份的比例为3∶2∶1配制； ⑤染色体倍性鉴定秋水仙素加倍处理的万寿菊植株开花后分别用形态鉴定法、气孔鉴定法和流式细胞仪鉴定法确定万寿菊染色体数目的倍性；或 B、万寿菊茎尖染色体加倍 ①催芽处理选取万寿菊雄性不育两用系的饱满种子放在垫有清水润湿的滤纸的培养皿中，于25℃下培养，待种子萌动后，播种到穴盘，穴盘的栽培基质为泥炭和珍珠岩，按重量份的比例为3∶1混合； ②秋水仙素加倍处理待万寿菊的两片子叶刚刚展开，立即用脱脂棉球包裹幼苗的生长点，每隔4小时用0.025％浓度的秋水仙素溶液滴定茎尖，连续处理2天，处理过程中在所述穴盘上方覆盖遮阳网，以保持脱脂棉球湿润； ③流水淋洗解除处理步骤②处理2天后，摘除脱脂棉球，用清水淋洗万寿菊植株的生长点，以解除秋水仙素处理； ④栽培管理两个月后，将秋水仙素处理茎尖的植株移栽到瓦盆中，盆土的栽培基质为园土+腐叶土+黄沙，按重量份的比例为3∶2∶1配制； ⑤染色体数目倍性鉴定秋水仙素加倍处理的万寿菊植株开花后分别用形态鉴定法、气孔鉴定法和流式细胞仪鉴定法确定万寿菊的染色体加倍情况。
在本发明中，种子萌动是指种子的前端膨大，种皮破裂。
形态鉴定是指加倍万寿菊的植株变矮、茎节变短、茎杆增粗、叶色浓绿、叶片肥厚、小叶变宽、头状花序花茎增大、小花花瓣厚实、种子增粗。
气孔鉴定法是指徒手撕取万寿菊的下表皮，在显微镜下观察其气孔大小，若气孔长度在23.00～35.51μm之间，平均长度为28.55μm者判定为二倍体；若气孔长度在33.15～52.60μm，平均长度为42.07μm者判定为四倍体。
本发明所述的万寿菊种子为万寿菊雄性不育两用系种子，该种子的名称为M525AB，来源于湖北省武汉市华中农业大学园艺林学学院培育。
本方法具有以下优点 1、处理的环境条件容易控制，重复性高。将万寿菊种子放入垫有湿润滤纸的培养皿中，25℃培养催芽，种子萌发环境的湿度和温度容易控制，种子发育过程比较一致，方法的可重复性高。
2、操作简便。相比组织培养结合秋水仙素化学诱变技术，用本发明只需将萌动的种子用秋水仙素溶液浸泡3～6小时或用秋水仙素溶液滴定幼嫩茎尖2天即可，更加省时省力。
3、加倍效率高。本发明中对萌动的万寿菊种子施加秋水仙素处理后，对万寿菊的加倍率达88.89％以上。
图1二倍体和四倍体万寿菊形态比较图。图1A是万寿菊的植株形态图。图左为二倍体万寿菊植株，图右为四倍体万寿菊植株。图1B是万寿菊的头状花序，图左为二倍体的万寿菊花序，图右为四倍体的万寿菊花序。图1C是万寿菊的种子，图左为四倍体的万寿菊种子，图右为二倍体的万寿菊种子。
图2二倍体和四倍体万寿菊的气孔观察情况。图2A是二倍体的气孔，图2B是四倍体的气孔。放大倍数均为10×20倍，bar＝50μm。
图3流式细胞仪分析结果。图3A为二倍体万寿菊的检测结果，图3B为四倍体万寿菊的检测结果。
具体实施例方式 实施例1 2004年，申请人于华中农业大学园艺花卉试验场发现1株万寿菊雄性不育材料，通过多代定向选育，得到一株性状稳定的万寿菊雄性不育两用系，命名为M525AB(He Yanhong，等，Cytological and mappinganalysis of a novel male sterile type resulting from spontaneous floral organ homeotic conversion in marigold(Tagetes erecta L.).Molecular Breeding，2009，DOI10.1007/s11032-009-9372-x.见Springerlink数据库http://springer.lib.tsinghua.edu.cn/content/6218771h8502152j/？p＝3a1acfbf8d8442e49f0238dcb63b9da0&pi＝0)。2008年秋季，收获万寿菊雄性不育两用系M525AB的种子，经过干燥密封保存以备第二年使用。
万寿菊加倍方法按以下步骤进行 ①催芽处理于3月上旬，选取万寿菊雄性不育两用系M525AB的饱满种子放在垫有清水湿润的滤纸的 培养皿中，于25℃下培养，直到获得萌动的种子； ②秋水仙素加倍处理待催芽的万寿菊两用系种子前端膨大，种皮破裂萌动后，用0.05％～0.4％的秋水仙素溶液浸泡3～9小时，在浸泡过程中不断搅拌，使万寿菊种子的染色体加倍； ③流水冲洗解除处理倒出秋水仙素溶液，将处理过的种子放入三角瓶中，用纱布绑扎瓶口，并将三角瓶放在流水下冲洗30分钟解除处理； ④栽培管理将解除处理的万寿菊种子播种到128孔规格的穴盘，一穴一粒，其栽培基质为泥炭和珍珠岩按照重量份3∶1混合，两个月后，统计成活率，并移栽到直径为23厘米的素烧瓦盆，盆土为园土+腐叶土+黄沙按重量份的比例为3∶2∶1配制(所述的园土为通常的菜园土，所述的腐叶土为华中农业大学狮子山森林绿化区的自然表层土，不添加人工营养物质，实施例2相同)，将所述的基质混合，按照常规管理。
⑤染色体数目倍性鉴定万寿菊植株开花后进行形态鉴定，凡是加倍处理后的万寿菊形态出现植株变矮、茎节变短、茎杆增粗、叶色浓绿、叶片肥厚、小叶变宽、头状花序花茎增大、小花花瓣厚实、种子增粗的初步确定为四倍体植株(如图1和表1所示)。同时徒手撕取万寿菊叶片的下表皮，在显微镜下观察并比较其叶片气孔大小，凡是气孔平均长度为28.55μm(幅度范围为23.00～35.51μm)的鉴定为二倍体；气孔平均长度为42.07μm(幅度范围为33.15～52.60μm)的鉴定为四倍体(如图2所示)；最后采集初步鉴定为四倍体的万寿菊叶片利用流式细胞仪(PA-1，由德国partec公司生产)测定染色体数目的倍性，检测结果如图3所示。
试验结果表明，以0.05％秋水仙素浸泡3～6小时的处理中植株的成活率最高，多倍体植株的得率亦达88.89％。而高浓度处理，虽然多倍体的得率达到100％，但是死亡率亦很高(见表2)。因此优选0.05％秋水仙素浸泡3～6小时的处理。
实施例2 本实施例是采用茎尖滴定秋水仙素诱导加倍方法，按照以下步骤进行 ①催芽3月上旬，选取万寿菊雄性不育两用系M525AB的饱满种子放在垫有清水湿润的滤纸的培养皿中，25℃培养，待催芽的种子前端膨大，种皮破裂萌动后，播种到穴盘，穴盘栽培基质同实施例1。
②秋水仙素加倍处理待万寿菊的两片子叶一展开，立即用脱脂棉球包裹幼苗的生长点，每隔4小时利用0.025％～0.4％浓度的秋水仙素溶液进行茎尖滴定，连续处理2天，处理过程中穴盘上方覆盖遮阳网，以保持棉球湿润。
③流水淋洗解除处理2天后，摘除棉球，用清水淋洗生长点，以解除处理。
④栽培管理两个月后，统计成活率，并将植株移栽到直径为23厘米的素烧瓦盆，盆土的配制同实施例1，常规管理同实施例1。
⑤染色体数目倍性鉴定秋水仙素加倍处理的万寿菊植株开花后分别选用形态鉴定法、气孔鉴定法和流式细胞仪鉴定法确定万寿菊的染色体加倍情况，其鉴定方法及评价标准同实施例1。
试验结果表明，0.025％～0.4％浓度秋水仙素滴定万寿菊的茎尖后，高浓度处理中幼苗生长点大多死亡，最后无法成苗而整株死亡，仅有0.025％秋水仙素处理得到了加倍的植株，加倍效率为55.55％(表3)，但是其中嵌合体的比例达到40％。相比实施例1，茎尖滴定法处理繁琐，多倍体得率低，且嵌合体的频率高。因此，优选的方法是对萌动的万寿菊种子施加0.05％秋水仙素浸泡3～6小时的处理为宜。
表1秋水仙素处理万寿菊种子后加倍植株的形态变异统计
表2萌动种子施加秋水仙素后诱导万寿菊多倍体得率统计表
表3秋水仙素茎尖滴定诱导万寿菊多倍体得率的统计
权利要求
1.一种利用染色体加倍改良万寿菊基因型的方法，其特征在于，采用秋水仙素溶液处理万寿菊雄性不育两用系的种子或茎尖，使其染色体数目加倍，实现基因型改良，其步骤如下A、万寿菊种子染色体加倍
①催芽处理将万寿菊雄性不育两用系的饱满种子放入垫有用清水润湿的滤纸的培养皿中催芽处理，培养温度为25℃，得到萌动的种子；
②秋水仙素加倍处理将步骤①的萌动种子用0.05％浓度的秋水仙素溶液浸泡，浸泡时间为3～6小时，在浸泡过程中不断搅拌，实现染色体加倍的目的；
③清水冲洗解除处理倒出秋水仙素溶液，将处理过的万寿菊种子放入三角瓶中，用纱布绑扎瓶口，将三角瓶放在流水下冲洗30分钟；
④栽培管理将步骤③水洗后的万寿菊种子播于盛有栽培基质的穴盘中，一穴一粒，两个月后移栽到盛有盆土的瓦盆中，所述的栽培基质为泥炭和珍珠岩按重量份的比例为3∶1混合，盆土为园土+腐叶土+黄沙按重量份的比例为3∶2∶1配制；
⑤染色体倍性鉴定秋水仙素加倍处理的万寿菊植株开花后分别用形态鉴定法、气孔鉴定法和流式细胞仪鉴定法确定万寿菊染色体数目的倍性。或
B、万寿菊茎尖染色体加倍
①催芽处理选取万寿菊雄性不育两用系的饱满种子放在垫有清水润湿的滤纸的培养皿中，于25℃下培养，待种子萌动后，播种到穴盘，穴盘的栽培基质为泥炭和珍珠岩，按重量份的比例为3∶1混合；
②秋水仙素加倍处理待万寿菊的两片子叶刚刚展开，立即用脱脂棉球包裹幼苗的生长点，每隔4小时用0.025％浓度的秋水仙素溶液滴定茎尖，连续处理2天，处理过程中在所述穴盘上方覆盖遮阳网，以保持脱脂棉球湿润；
③流水淋洗解除处理步骤②处理2天后，摘除脱脂棉球，用清水淋洗万寿菊植株的生长点，以解除秋水仙素处理；
④栽培管理两个月后，将秋水仙素处理茎尖的植株移栽到瓦盆中，盆土的栽培基质为园土+腐叶土+黄沙，按重量份的比例为3∶2∶1配制；
⑤染色体数目倍性鉴定秋水仙素加倍处理的万寿菊植株开花后分别用形态鉴定法、气孔鉴定法和流式细胞仪鉴定法确定万寿菊的染色体加倍情况。
2.权利1所述的方法在万寿菊基因型改良上的应用。
全文摘要
本发明属于花卉育种技术领域，具体涉及一种利用染色体加倍改良万寿菊基因型的方法。特征是，采用秋水仙素溶液处理万寿菊雄性不育两用系的种子或茎尖，使其染色体数目加倍，从而为万寿菊的基因型改良提供育种的起始材料。本发明的步骤包括催芽处理、秋水仙素加倍处理、清水冲洗解除处理、栽培管理、染色体倍性鉴定等。优选的处理为对万寿菊萌动种子施加0.05％浓度的秋水仙素溶液浸泡3～6小时的为宜，植株的成活率高，加倍效率亦达到88.89％。本发明可以有效的控制种子萌发时的环境温度和湿度，试验的重复性高，且操作简便，省时省力。本发明适用于万寿菊基因型改良。
文档编号C12Q1/68GK101766119SQ201010103440
公开日2010年7月7日 申请日期2010年1月27日 优先权日2010年1月27日
发明者何燕红, 郭冬, 胡燕, 叶要妹, 包满珠 申请人:华中农业大学