专利名称：一种提高酵母细胞海藻糖含量的方法
技术领域：
本发明涉及一种提高酵母细胞海藻糖的方法，特别是一种提高面包干酵母细胞海藻糖含量的方法，属于发酵工程及微生物技术领域。
背景技术：
活性干酵母是由鲜酵母或称压榨酵母经造粒干燥脱水制成，活性干酵母的活性和 贮存时间是评价酵母质量的重要指标。而这些指标与酵母细胞内海藻糖的含量密切相关。海藻糖(Trehalose)，又名蘑菇糖、覃糖，它的分子式为C12H22O11 · 2H20，化学名 α -D- 口比喃葡萄糖基 α -D- 口比喃葡萄糖昔(α -D-glycopyranosyl- α -D-glycopyranosid e)，是由两个葡萄糖分子通过半缩醛羟基缩合而成的非还原性双糖。海藻糖广泛存在于低 等植物、藻类、细菌、丝状真菌、酵母、昆虫中。某些物种对外界恶劣环境，如干旱、高温、脱水、冷冻、高渗透压及毒性物质等，所 表现出来的抗逆耐受力与这些物种体内存在的海藻糖密切相关，具有独特的不同于其它碳 水化合物的生物学特性，能在上述环境下保护生物体细胞蛋白质、脂肪、糖类、核酸等组分 不受损害，可保护DNA防止放射线引起的损伤，外源性的海藻糖也能对生物体及生物大分 子有着良好的非特异性的保护作用，因而这使得其有许多用途，如在医药和微生物学中作 细胞防冻剂、诊断试剂和生物产品的稳定剂、化妆品的有效成份、食品防腐剂、农业上培育 抗旱作物等。海藻糖作为酵母一种应激代谢物，能赋予酵母等微生物抵抗营养缺乏、高温、低 温、干燥、高渗透压、有毒物质等恶劣环境的能力，它具有在严酷环境下保护生物体的生物 膜、脂质体、蛋白质、核酸等结构和功能的特殊功效，它使细胞内保持湿润，防止细胞内各种 养分的损失，从而让这些生物处于无水生活状态，如在生产活性干酵母时，海藻糖含量在 11% (以固形物计)以下的干酵母，其活性保存期短，不易贮存；海藻糖含量在12%至14% 左右时，其保存期间可延长4-6个月；而当海藻糖含量超过16%时，其保存期可达24个月 以上。活性干酵母是由鲜酵母(或称压榨酵母)经造粒干燥脱水制成，干酵母的活性通 常用发酵力表示。一般情况下，要3. 5g鲜酵母才能生产Ig活性干酵母，但就活性(发酵 力)而言，Ig活性干酵母只相当于2-3g鲜酵母复水后检验测活细胞一般为80-90%。鲜 酵母制成活性干酵母，并经一定时间的贮存及使用前的复水过程后，有一定的活性损失。酵母中的海藻糖的含量，对活性干酵母的活性和储藏有很大的影响。在一定程度 上决定了高活性干酵母的活性与耐贮藏能力，海藻糖的量增加，这样有利于细胞在干燥和 贮存过程中的稳定性。较高的海藻糖含量有利于延长活性干酵母的贮存期的延长。而磷的 含量的高低对于海藻糖积累和细胞含氮量水平以及酶的活性都有一定的影响。一般的活性 干酵母的海藻糖的含量达干物质的14%左右，因此，培养酵母工艺一定要考虑海藻糖的积 累程度。酵母合成海藻糖需要经过两个阶段，一是酵母细胞的大量繁殖阶段，此阶段酵母体 内海藻糖含量较低，但可以提供足量的菌体；二是海藻糖的积累阶段，主要是通过控制外界条件使其得以积累。
发明内容
本发明针对现有技术的不足，提出一种提高酵母细胞海藻糖含量的方法，可以在 较短的时间内实现酵母细胞内海藻糖含量达到16%以上。术语说明通风量的单位vvm，是指每分钟通入的空气量与发酵液的量的体积比。细胞浓度是指发酵液中或酵母乳中酿酒酵母的质量浓度。本发明中提及的“面包酵母”是由酿酒酵母菌种生产的产品商品名。本发明的技术方案如下一种提高酵母细胞海藻糖含量的方法，将酵母发酵培养液离心分离获得13-17% 的细胞浓度的酵母乳，向酵母乳中添加麦芽糖、氯化钠和氯化钙的水溶液，酵母乳与水 的质量体积比为1 1，麦芽糖、氯化钠和氯化钙的用量占酵母乳总质量百分比分别为 2. 4-3. 0%麦芽糖，3. 2-4. 0%氯化钠和1. 0%氯化钙，在35°C、pH5. 2、1· 0-1. 2vvm通风条件 下培养2-3小时，离心收集酵母泥，测定酵母中海藻糖含量16-17%，以酵母细胞干重计。所 述质量体积比，单位为g/mL或kg/L。所述的酵母为酿酒酵母。本发明的方法中麦芽糖的添加培养可以提高海藻糖的积累量，这是因为酵母细胞 内含有麦芽糖异构酶可将麦芽糖在短时间内转化为海藻糖。在上述本发明的方法中，是以酵母发酵培养液为起始原料的，关于酵母发酵培养 液的制备可按现有技术。本发明提供以下酵母发酵培养液的制备方法，作为本发明的优选 之一1.培养基(1)种子培养基葡萄糖 20g，KH2PO4 lg, (NH4)2SO4 5g，MgSO4 · 7H20 0. 2g， ZnSO4 · 7H20 0. 05g, pH5. 4，蒸溜水 1000mL。(2)发酵培养基①发酵基础培养基玉米浆(含固形物28wt% )20%，葡萄糖1%，营养盐溶液5%，水74%，均 为体积比。其中，营养盐溶液=KH2PO4 13. 0g, (NH4)2SO4 94. 16g，MgSO4 · 7H20 1. 4g， ZnSO4 · 7H200. 28g，加水配成 1000mL。②发酵过程流加组分糖溶液葡萄糖配成250g/L的溶液。营养盐溶液KH2PO413. 0g, (NH4)2SO4 94. 16g，MgSO4 · 7H20 1. 4g, ZnSO4 · 7H200. 28g，加水配成 1000mL。碱液100g/L的 Na2CO3 溶液。2.种子培养酵母菌种购自中国科学院微生物研究所，名称酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)，代号AS 2. 146，AS 2. 502，AS 2. 503 或 AS 2.504。将酵母斜面菌种，接入装 20mL种子培养基的250mL三角瓶中，30°C 200r/min摇瓶培养24h后，转入装有80mL种子培 养基的500mL三角瓶，300C 200r/min摇瓶培养16h，得到种子培养液，备用。
3.发酵培养将装有25L发酵基础培养基的50L发酵罐中进行实罐灭菌，灭菌条件为120°C，30min。然后降温至32°C时，接入种子培养液3L，调节pH5. 2，控制培养温度30°C，流加糖溶 液和营养盐溶液，控制总发酵时间为18_21h，营养盐溶液在发酵结束前3-5个小时加完，糖 溶液的流加量根据酵母生长情况，使发酵体系中葡萄糖含量一直控制在0. 5%以下。发酵过 程中，控制PH5. 2，搅拌转速控制在200r/min。其他工艺条件优选如下培养温度控制在发酵时间l_8h培养温度30°C，9-15h培养温度32°C，16h到发酵 结束培养温度35 °C。通气量在发酵(前、中期)时间l_15h控制无菌空气体积与发酵液体积比每分钟 在2. 5vvm，在发酵(后期)时间16h到发酵结束的海藻糖积累阶段，调整阀门，将通气量降 至Ij 1. 2 vvm0优选的，以上方法发酵培养步骤中，控制糖溶液加量使发酵体系中葡萄糖含量 0. 30-0. 50%体积比；pH调节剂是10wt% Na2CO3溶液。以上方法制得的酵母发酵培养液，细胞浓度4. 5-5. 5%，经测定其中海藻糖含量为 8-10%。进一步用作本发明方法的原料。酵母菌中海藻糖含量测定方法在酵母细胞内，含有甘露聚糖和不溶性的葡聚糖，会与蒽酮试剂发生反应。因此， 选用合适的提取剂来控制这些物质对海藻糖测定的干扰是酵母中海藻糖测定的关键。酵母 菌用0. 5mol/L冷三氯乙酸提取，所得溶液中仅有海藻糖存在。将三氯乙酸提取液和0. 2% 硫酸蒽酮溶液以1 4的比例混合沸水浴反应2min，并于590nm处测反应液的吸光值。计 算提取液中海藻糖的含量即酵母菌中的海藻糖量。采用纸层析分离洗脱法用纸层析定量分析海藻糖时，滤纸条上所点的两个样为 同一样品，点样量控制在40 100 μ g，其中一个点为参照点，另一个为定量测量点。将点样 后的滤纸条在展开剂正丁醇丙酮水醋酸=10 3 6 2 (ν/ν)中展开、风干，并将 其从中间剪开。带参照点的一半喷雾显色，以确定海藻糖斑点的准确位置，将另一半滤纸条 上与此斑点对应的部分剪下并剪成碎片，放入洗脱液0. lmol/LHCl中室温洗脱16h，洗脱后 上清液用硫酸_蒽酮比色法测定其中海藻糖含量。本发明的方法通过酵母培养积累海藻糖的技术特点及优良效果如下①温度在发酵前期(l-8h)培养温度30°C，中期(9_15h)培养温度32°C，后期 (16h到发酵结束)培养温度35°C。②pH 在酵母的培养过程中，流加10% Na2CO3溶液调节pH5. 2。③溶氧在酵母的培养过程中，在通气量不变的情况下，提高搅拌速率可以有效的 提高发酵罐的传氧速率，从而保证细胞生长和代谢所需溶氧供给。本发明方法中，搅拌转速 控制在200r/min，通气量l_15h控制在2. 5vvm，在发酵时间16h到发酵结束是海藻糖积累 阶段，将通气量降到1.2VVm。④在酵母培养获得大量的细胞后，经过离心分离获得13-17%的浓度的酵母乳，在 酵母乳中加入麦芽糖，并添加氯化钠、氯化钙，在35°C通风条件下培养2-3小时，以实现酵 母中海藻糖的高浓度积累。本发明可以在较短时间内，使酵母细胞内的海藻糖从8 %提高到 16%以上。较现有一般的工艺缩小了发酵时间。
由于本发明的原料是酵母乳，酵母细胞浓度为13-17%，而酵母发酵液中酵母的浓度4. 5-5. 5%，因而可以节省发酵设备和动力消耗。
图1本发明方法实施例1酵母乳在加盐、添加麦芽糖的情况下海藻糖积累；图2用硫酸_蒽酮比色法测定实施例1酵母泥中海藻糖含量用纸层析定量分析 海藻糖时，滤纸条上所点的两个样为同一样品，点样量控制在40 100 μ g，其中一个点为 参照点，另一个为定量测量点。
具体实施例方式下面结合实施例，对本发明技术方案做进一步阐述，但本发明所保护范围不仅限 于此。实施例中所用菌种及培养基为酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)菌种购自中国科学院微生物研究所，中 国科学院微生物研究所菌种保藏中心菌种目录代号AS 2. 146 ；AS 2. 502 ；AS 2. 503 ；AS 2. 504。种子培养基葡萄糖20g, KH2PO4 lg, (NH4)2SO4 5g，MgSO4 · 7H20 0. 2g，ZnSO4 · 7H20 0. 05g, pH5. 4，蒸馏水 IOOOmL0发酵培养基包括发酵基础培养基和发酵过程流加组分，如前所述。实施例1酵母菌种酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)AS 2. 146。将酵母斜面菌种， 接入装20mL种子培养基的250mL三角瓶中，30°C 200r/min摇瓶培养24h后，转入装有80mL 种子培养基的500mL三角瓶，30°C 200r/min摇瓶培养16h，得到种子培养液，备用。 将上述种子培养液3L接入已经灭菌的25L发酵基础培养基中(发酵罐容积50L)， 培养条件如下。①温度在发酵的l_8h时间内，培养温度30°C，在发酵9-15h的时间内，培 养温度32°C，在发酵16-20h时间内，培养温度35°C。②pH 在酵母的培养过程中，流加10% Na2CO3溶液调节pH5. 2。③溶氧搅拌转速控制在200r/min，通气量l_16h控制在2. 5vvm, 在发酵16-20h时间内，通过阀门将通气量降到1. 2vvm。流加糖溶液和营养盐溶液，营养盐 溶液流加总量2. 5L，在发酵时间16h加完，糖溶液则根据乙醇反馈和酵母的生长情况进行 流加，使发酵液中葡萄糖含量一直控制在0. 40-0. 45% (体积比)，20h发酵结束，所得发酵 液中酵母细胞4. 78% (干重)，海藻糖含量8.2%。将上述发酵液，用大容量离心机，在3500r/min，时间IOmin的条件下，离心收集酵 母乳。弃离心管上清液，取出酵母乳。在IOOOmL蒸馏水中，加入氯化钠40g，氯化钙10g，麦 芽糖30g，完全溶解，100°C灭菌，用水浴控温至30°C，添加到IOOOg酵母乳中，置于IOL发酵 罐中。控制培养温度35°C，用IOwt % Na2CO3溶液调节pH5. 2 ；1. 20vvm通风条件下，培养时 间3小时，离心收集酵母泥，测定酵母细胞干重中海藻糖含量为16. 88%。实施例2酵母菌种酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)AS 2.502。种子培养液制备同 实施例1。将酵母斜面菌种，接入装20mL种子培养基的250mL三角瓶中，30°C 200r/min摇瓶培养24h后，转入装有80mL种子培养基的500mL三角瓶，30°C 200r/min摇瓶培养16h，得到
种子培养液，备用。将上述种子培养液3L接入已经灭菌的25L发酵基础培养基中(发酵罐容积50L)， 培养条件如下。①温度在发酵的l_8h时间内，培养温度30°C，在发酵9-15h的时间内，培 养温度32°C，在发酵16-19h时间内，培养温度35°C。②pH 在酵母的培养过程中，流加10% Na2CO3溶液调节pH5. 2。③溶氧搅拌转速控制在200r/min，通气量l_16h控制在2. 5vvm, 在发酵16-20h时间内，通过阀门将通气量降到1. 2vvm。流加糖溶液和营养盐溶液，营养盐 溶液流加总量2. 5L，在发酵时间16h加完，糖溶液则根据乙醇反馈和酵母的生长情况进行 流加，使发酵液中葡萄糖含量一直控制在0. 40-0. 48% (体积比)，19h发酵结束，所得发酵 液中酵母细胞4. 56% (干重)，海藻糖含量9.0%。
将上述发酵液，于3500r/min离心lOmin，收集酵母乳。弃离心管上清液，取出酵母 乳。在IOOOmL蒸馏水中，加入氯化钠32g，氯化钙10g，麦芽糖24g，完全溶解，100°C灭菌，用 水浴控温至30°C，添加到IOOOg酵母乳中，置于IOL发酵罐中。控制培养温度35°C，用10% Na2CO3溶液调节pH5. 2 ；1. 20vvm通风条件下，培养时间3小时，离心收集酵母泥，测定酵母 细胞干重中海藻糖含量为16. 00%。实施例3酵母菌种酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)AS 2.503。种子培养液制备同 实施例1。将酵母斜面菌种，接入装20mL种子培养基的250mL三角瓶中，30°C 200r/min摇瓶 培养24h后，转入装有80mL种子培养基的500mL三角瓶，30°C 200r/min摇瓶培养16h，得到 种子培养液，备用。
将上述种子培养液3L接入已经灭菌的25L发酵基础培养基中(发酵罐容积50L)， 培养条件如下。①温度在发酵的l_8h时间内，培养温度30°C，在发酵9-15h的时间内，培 养温度32°C，在发酵16-20h时间内，培养温度35°C。②pH 在酵母的培养过程中，流加10% Na2CO3溶液调节pH5. 2。③溶氧搅拌转速控制在200r/min，通气量l_16h控制在2. 5vvm, 在发酵16-20h时间内，通过阀门将通气量降到1. 2vvm。流加糖溶液和营养盐溶液，营养盐 溶液流加总量2. 5L，在发酵时间16h加完，糖溶液则根据乙醇反馈和酵母的生长情况进行 流加，使发酵液中葡萄糖含量一直控制在0. 40-0. 45% (体积比)，20h发酵结束，所得发酵 液中酵母细胞5. 72% (干重)，海藻糖含量7. 72%。将上述发酵液在3500r/min离心lOmin，，离心收集酵母乳。弃离心管上清液，取出 酵母乳。在IOOOmL蒸馏水中，加入氯化钠36g，氯化钙10g，麦芽糖26g，完全溶解，100°C灭 菌，用水浴控温至30°C，添加到IOOOg酵母乳中，置于IOL发酵罐中。控制培养温度35°C， 用10% Na2CO3溶液调节pH5. 2 ；1. 20vvm通风条件下，培养时间3小时，离心收集酵母泥，测 定酵母细胞干重中海藻糖含量为16.01%。实施例4酵母菌种酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)AS 2.504。种子培养液制备同 实施例1。将酵母斜面菌种，接入装20mL种子培养基的250mL三角瓶中，30°C 200r/min摇瓶 培养24h后，转入装有80mL种子培养基的500mL三角瓶，30°C 200r/min摇瓶培养16h，得到种子培养液，备用。将上述种子培养液3L接入已经灭菌的25L发酵基础培养基中(发酵罐容积50L)， 培养条件如实施例1，20h发酵结束，所得发酵液中酵母细胞5. 11 % (干重)，海藻糖含量 6. 2%。将上述发酵液在3500r/min离心lOmin，收集酵母乳。弃离心管上清液，取出酵母 乳。在IOOOmL蒸馏水中，加入氯化钠38g，氯化钙10g，麦芽糖28g，完全溶解，100°C灭菌，用 水浴控温至30°C，添加到IOOOg酵母乳中，置于IOL发酵罐中。控制培养温度35°C，用10% Na2CO3溶液调节pH5. 2 ；1. 20vvm通风条件下，培养时间3小时，离心收集酵母泥，测定酵母 细胞干重中海藻糖含量为16. 22%。
权利要求
一种提高酵母细胞海藻糖含量的方法，将酵母发酵培养液离心分离获得13-17％的细胞浓度的酵母乳，向酵母乳中添加麦芽糖、氯化钠和氯化钙的水溶液，酵母乳与水的质量体积比为1∶1，麦芽糖、氯化钠和氯化钙的用量占酵母乳总质量百分比分别为2.4-3.0％麦芽糖，3.2-4.0％氯化钠和1.0％氯化钙，在35℃、pH5.2、1.0-1.2vvm通风条件下培养2-3小时，离心收集酵母泥，测定酵母中海藻糖含量16-17％，以酵母细胞干重计；所述的酵母为酿酒酵母；所述质量体积比，单位为g/mL或kg/L。
2.如权利要求1所述的提高酵母细胞海藻糖含量的方法，其特征在于所述酵母发酵培 养液的制备，步骤如下(1)培养基种子培养基葡萄糖 20g, KH2PO4Ig, (NH4) 2S045g，MgSO4 ·7Η20 0. 2g，ZnSO4 · 7Η20 0. 05g， ρΗ5· 4，蒸馏水 IOOOmL ；发酵培养基①发酵基础培养基玉米浆(含固形物28wt %)20%,葡萄糖1 %，营养盐溶液5 %，水74%，均为体积比；其 中，营养盐溶液配方为 KH2PO413. 0g, (NH4) 2S0494. 16g，MgSO4 · 7H20 1. 4g，ZnSO4 · 7Η200· 28g， 加水配成IOOOmL ；②发酵过程流加组分糖溶液葡萄糖配成250g/L的溶液；营养盐溶液:KH2P0413. 0g, (NH4)2S0494. 16g， MgSO4 · 7H20 1. 4g，ZnSO4 · 7H20 0. 28g，加水配成 IOOOmL ；碱液:100g/L 的 Na2CO3 溶液；(2)种子培养酵母菌种为酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)，代号AS 2. 146，AS 2.502， AS 2. 503或AS 2. 504;将酵母斜面菌种，接入装20mL种子培养基的250mL三角瓶中， 300C 200r/min摇瓶培养24h，转入装有80mL种子培养基的500mL三角瓶，30°C 200r/min摇 瓶培养16h，得到种子培养液，备用；(3)发酵培养将装有25L发酵基础培养基的50L发酵罐中进行实罐灭菌，灭菌条件为120°C，30min ； 然后降温至32°C时，接入种子培养液3L，调节pH5. 2，控制培养温度30°C，流加糖溶液和营 养盐溶液，控制总发酵时间为18_21h，营养盐溶液在发酵结束前3-5个小时加完，糖溶液的 流加量根据酵母生长情况，使发酵体系中葡萄糖含量一直控制在0.5%以下；发酵过程中， 控制pH5. 2，搅拌转速控制在200r/min。
3.如权利要求2所述的提高酵母细胞海藻糖含量的方法，其特征在于步骤(3)发酵培 养中所述培养温度控制如下在发酵时间l_8h培养温度30°C，9-15h培养温度32°C，16h到 发酵结束培养温度35 °C。
4.如权利要求2所述的提高酵母细胞海藻糖含量的方法，其特征在于步骤(3)发酵培 养中通气量在发酵时间l_15h控制无菌空气体积与发酵液体积比每分钟在2. 5vvm，在发 酵时间16h到发酵结束的海藻糖积累阶段，调整阀门，将通气量降到1. 2vvm。
全文摘要
本发明涉及一种提高酵母细胞海藻糖含量的方法，将酵母发酵培养液离心分离获得13-17％的细胞浓度的酵母乳，向酵母乳中添加麦芽糖、氯化钠和氯化钙的水溶液，在35℃、pH5.2、1.0-1.2vvm通风条件下培养2-3小时，离心收集酵母泥，所得酵母中海藻糖含量达16％以上，本发明可以在较短时间内，使酵母细胞内的海藻糖从8％提高到16％以上，较现有工艺缩小了发酵时间、节省了发酵设备和动力消耗。
文档编号C12R1/865GK101818183SQ201010146889
公开日2010年9月1日 申请日期2010年4月15日 优先权日2010年4月15日
发明者徐汝意, 李丕武, 王瑞明, 王腾飞, 马春玲 申请人:山东轻工业学院