专利名称：转化奎宁酮为r-3-奎宁醇的酵母菌株及其转化方法
技术领域：
本发明涉及一种发酵奎宁酮生产R-3-奎宁醇的酵母菌株及其生产方法。
背景技术：
目前，大多数药物以外消旋体药物为主，而以光学纯的对映体作为药物是绝大多 数手性药物的发展趋势。3-奎宁酮盐酸盐(C7H11NO · HCl，CAS No :1193-65-3)，是一种用于合成阿扎司琼、 帕洛诺司琼的一种中间体，结构中含有潜手性酮基。R-3-奎宁醇，化学名R-(-)_l-氯杂双环[2.2.2]辛_3_醇，分子式为C7H13NO, 分子量为127. 18，CAS登录号25333-42-0，R-3-奎宁醇纯品为白色晶体，其熔点为217 224°C，沸点为120°C，比旋光度为-44. 5°，在水里的溶解度为100g/100mL ；R_3_奎宁醇是 很多抗胆碱药物的重要中间体，例如索利那辛、瑞伐托酯等都是含有R-3-奎宁醇结构的最 新抗胆碱药物，其对于治疗尿失禁和慢性阻塞性肺病有很好的疗效。R-3-奎宁醇盐酸盐 (C7H13NO -HCl CAS No :42437_96_7)，是3-奎宁酮还原得到单一旋光性的手性物质，是一种 用于合成各类药物的重要手性醇，如用于治疗老年痴呆症的他沙立定(Talsaclidine)和 用于治疗慢性肺栓塞的瑞伐托酯(Revatropate)等。现有的合成R-3-奎宁醇的方法主要有化学合成和微生物合成两种方法。化学方法合成1、以4-乙烯基吡啶为原料合成3-奎宁醇；4-乙烯基吡啶在冷的高锰酸钾盐水溶液中被氧化为(4-吡啶)-1，2_乙二醇， (4-吡啶)-1，2_乙二醇在酸性环境中被氢化为相应的哌啶乙二醇盐酸盐，哌啶乙二醇盐酸 盐在30(TC下在活性氧化铝的催化下生成3-奎宁醇。2、以3-奎宁酮为原料合成3-奎宁醇3-奎宁酮在乙醇中经过硼氢化钠还原以后得到3-奎宁醇，此反应在乙醇中进行 非常迅速，是制备3-奎宁醇比较实用的方法。化学合成法多以奎宁酮为反应前体，过渡元素为手性催化剂，通过多步反应得到 R-3-奎宁醇，反应步骤多，副反应多，理论产率只有50%，并且奎宁醇的光学活性不高，对 环境污染严重。酶或微生物制备法3、2003年M. Ikunaka报道了一种用蜂蜜曲霉(Aspergillus melleus)的蛋白酶来 拆分3-奎宁醇衍生物的方法，转化率达到了 42%，ee值达96%。但是这种外消旋物质酶 动力学拆分的理论最大转化率为50%，并有衍生反应。
发明内容
本发明的目的是提供一种能够高效地用奎宁酮生产R-3-奎宁醇的酵母菌株及其 生产方法。
本发明是采用如下技术方案实现的一株转化奎宁酮为R-3-奎宁醇的酵母菌株， 命名为深红酵母Rhodotorula rubra X15，在国家知识产权局指定的保藏单位保藏，保藏单 位名称为中国普通微生物菌种保藏管理中心，保藏编号为CGMCC No :3664。一种利用酵母菌株转化奎宁酮为R-3-奎宁醇的方法，其采用如下步骤(1)、种子活化培养；(2)、发酵扩大培养；(3)、取发酵扩大培养所得的深红酵母发酵液，离心收集菌体，得湿菌体，在磷酸氢二钠-磷酸二氢钠缓冲液中洗涤后重新悬浮于同一缓冲液中，再加入底物奎宁酮盐酸盐， 添加葡萄糖，在30°C、摇床上反应，反应72 84小时后，蒸干溶液，用二氯甲烷溶解搅拌，滤 除不溶物，减压蒸除溶剂，得到白色固体R-3-奎宁醇。深红酵母菌落特征菌落为深红色，圆形，隆起，不透明，表面光滑，湿润，边缘整 齐；深红酵母细胞为圆形或椭圆形，通过革兰氏染色为阳性菌，单端出芽生殖，无假菌丝生 成，经生理生化和18S rRNA鉴定，鉴定为深红酵母Rhodotorula rubra，命名为Rhodotorula rubra Xl5。本发明的有益效果是，本发明利用酮基还原酶或者具有还原酶活性的微生物静息 细胞催化底物奎宁酮，底物无需衍生化处理，只需一步还原反应就可得到反应物，理论产率 100%，更由于酶的高特异性，R-3-奎宁醇的光学纯度在97% e. e.，采用固定化深红酵母全 细胞催化还原奎宁酮盐酸盐，反应转化率达到86%，R-3-奎宁醇的光学纯度达到99. 3%, 这种方法反应条件温和、反应步骤少、能量消耗少、产率高、产物纯度高，属于环境友好、可 持续型生产方式。
具体实施例方式实施例1一株转化奎宁酮为R-3-奎宁醇的酵母菌株，命名为深红酵母Rhodotorularubra X15，在国家知识产权局指定的保藏单位保藏，保藏单位名称为中国普通微生物菌种保藏管 理中心，保藏编号为CGMCC No :36640一种利用所述的酵母菌株转化奎宁酮为R-3-奎宁醇的方法，采用如下步骤(1)种子活化将深红酵母Rhodotorula rubra X15菌株从保存的甘油菌转接于 种子液体培养基中，于30°C、150 250rpm培养24h。取培养好的菌悬液稀释，均勻涂布到 种子固体平板培养基中，25°C培养箱培养48h后，用牙签挑单菌落再次接种于种子液体培 养基试管中，300C、150 250rpm培养过夜，取5mL培养好的菌悬液转接到装有150mL种子 液体培养基的500mL三角瓶中置摇床30°C振荡培养，转速为150 250rpm。所述种子固体培养基蛋白胨5g/L，酵母膏15g/L，氯化钠4g/L，葡萄糖10g/L，琼 脂20g/L，pH为5. 0，种子液体培养基为缺少琼脂的种子固体培养基。(2)发酵培养，培养基配方葡萄糖12g/L，蛋白胨0. 5g/L，酵母膏0. 5g/L，硫酸镁 0. lg/L，磷酸二氢钾0. lg/L，硫酸铵0. 15g/L,2mol/L盐酸调pH为5. 0，在接种量为6%，转 速450r/min，通气量为6L/min的条件下，经30°C，3天的发酵培养，得深红酵母发酵液；(3)取6L深红酵母发酵液，离心收集菌体，得到IOg湿菌体，在用20mmol/L、pH为 7. O的磷酸氢二钠-磷酸二氢钠缓冲液洗涤2次后重新悬浮于IOOml同一缓冲液中，再加入10g/L、pH为7. 0的100ml的底物奎宁酮盐酸盐，添加葡萄糖0. 2g，在30°C，160r/min的摇 床上反应，反应72小时后，在100°C条件下蒸干溶液，用纯度大于99. 0%的二氯甲烷溶解搅 拌1小时，滤除不溶物，在-0. 85Mpa, 35 40°C条件下减压蒸除溶剂，得到白色固体R-3-奎 宁醇0. 866g，利用HPLC检测固体纯度，奎宁醇纯度为99.0%，奎宁酮及其他杂质为1%。R-3-奎宁醇ee值采用3_奎宁醇衍生成苯甲酸3_奎宁酯，然后用HPLC检测。首 先将0. 123mL的苯甲酰氯滴入含有少量三乙胺的二氯甲烷中，0. 5小时后加入0. lg的本反 应完成后的R-3-奎宁醇，常温搅拌4 6小时，将溶剂减压蒸除，直接溶于纯度大于99. 0% 的乙酸乙酯，并用HPLC测定ee值。色谱条件如下，柱型Chiralpak AD-H，柱温25°C，流动 相速度lmL/min，检测波长254nm，流动相比例97%正己烷，3%异丙醇。经HPLC测定，本 反应完成后的R-3-奎宁醇的ee值为99. 3%。实施例2一种利用所述的酵母菌株转化奎宁酮为R-3-奎宁醇的方法，采用如下步骤(1)种子活化将深红酵母Rhodotorula rubra X15菌株从保存的甘油菌转接于 种子液体培养基中，于30°C、130 270rpm培养24h。取培养好的菌悬液稀释，均勻涂布到 种子固体平板培养基中，30°C培养箱培养48h后，用牙签挑单菌落再次接种于种子液体培 养基试管中，30°C、150 250rpm培养过夜，取5mL培养好的菌悬液转接到装有150mL种子 液体培养基的500mL三角瓶中置摇床30°C振荡培养，转速为150 250rpm。所述种子固体培养基蛋白胨5g/L，酵母膏15g/L，氯化钠4g/L，葡萄糖10g/L，琼 脂20g/L，pH为5. 0，种子液体培养基为缺少琼脂的种子固体培养基。(2)发酵培养，培养基配方葡萄糖15g/L，蛋白胨0. 5g/L，酵母膏0. 5g/L，硫酸镁 0. lg/L，磷酸二氢钾0. lg/L，硫酸铵0. 15g/L，调pH为5. 0，在接种量为6%，转速450r/min， 通气量为6L/min的条件下，经30°C，3天的发酵培养，得深红酵母发酵液；(3)取6L深红酵母发酵液，离心收集菌体，得到10g湿菌体，在用20mmol/L、pH为 7. 0的磷酸氢二钠-磷酸二氢钠缓冲液洗涤2次后重新悬浮于100ml同一缓冲液中，再加 A 10g/L、pH为7. 0的100ml的底物奎宁酮盐酸盐，添加葡萄糖0. 2g，在30°C，160r/min的 摇床上反应，反应84小时后，在100°C条件下蒸干溶液，用纯度大于99. 0%的二氯甲烷溶解 搅拌1. 5小时，滤除不溶物，在67Kgf/cm2，35 40°C条件下减压蒸除溶剂，得到白色固体 R-3-奎宁醇0. 867g，利用HPLC检测固体纯度，奎宁醇纯度为99. 1%，奎宁酮及其他杂质为 1%。R-3-奎宁醇ee值的检测方法同实施例1，测得R-3-奎宁醇ee值为99. 4%。
权利要求
一株转化奎宁酮为R-3-奎宁醇的酵母菌株，其特征在于其命名为深红酵母Rhodotorula rubra X15，在国家知识产权局指定的保藏单位保藏，保藏单位名称为中国普通微生物菌种保藏管理中心，保藏编号为CGMCC No3664。
2.一种利用权利要求1所述的酵母菌株转化奎宁酮为R-3-奎宁醇的方法，其特征在 于，其采用如下步骤(1)、种子活化培养；(2)、发酵扩大培养；(3)、取发酵扩大培养所得的深红酵母发酵液，离心收集菌体，得湿菌体，在磷酸氢二 钠-磷酸二氢钠缓冲液中洗涤后重新悬浮于同一缓冲液中，再加入底物奎宁酮盐酸盐，添 加葡萄糖，在30°C、摇床上反应，反应72 84小时后，蒸干溶液，用二氯甲烷溶解搅拌，滤除 不溶物，减压蒸除溶剂，得到白色固体R-3-奎宁醇。
全文摘要
本发明涉及一种利用奎宁酮生产R-3-奎宁醇的酵母菌株及其生产方法，本发明涉及的酵母菌株为深红酵母Rhodotorula rubra X15，现保藏在中国普通微生物菌种保藏管理中心，保藏号为CGMCC No3664，本发明涉及的生产方法采用如下步骤1、种子活化培养，2、发酵扩大培养，3、取发酵培养液，离心收集并洗涤菌体，再加入底物奎宁酮盐酸盐，添加葡萄糖，在摇床上反应72～84小时后，蒸干溶液，用二氯甲烷溶解搅拌，滤除不溶物，减压蒸除溶剂，得到白色固体R-3-奎宁醇。采用本发明可以得到产物产率高、纯度高的R-3-奎宁醇，且其方法对环境无破坏、能耗低。
文档编号C12P17/18GK101864370SQ20101019750
公开日2010年10月20日 申请日期2010年6月11日 优先权日2010年6月11日
发明者宋水山, 张霞, 邱健, 马宏, 黄媛媛 申请人:河北省科学院生物研究所