专利名称：乙脑病毒的实时荧光定量pcr检测方法及试剂盒的制作方法
技术领域：
本发明涉及生物技术领域中病毒的分子生物学检测方法，特别是涉及乙脑病毒的 实时荧光定量PCR检测方法及试剂盒。
背景技术：
流行性乙型脑炎病毒首先(1953年)在日本从患者脑组织中分离获得，因此 称为日本脑炎病毒(Japanese encephalitis virus，JEV)，所致疾病在日本称日本脑炎 (Japanese encephalitis, JBE)。1950年，我国对该病进行了大量病原学和流行病学研究， 为了与甲型脑炎相区别，定名为流行性乙型脑炎(Japaneseenc印halitis)，简称乙脑。根据 我国《传染病防治法》的有关规定，乙脑在我国属于乙类传染病。乙脑是一种中枢神经系统 感染的急性传染病，也是一种人兽共患的自然疫源性疾病，临床上以高热、意识障碍、抽搐、 呼吸衰竭及脑膜刺激征为特征。乙脑是亚洲最常见的一种病毒性脑炎。据估计，乙脑病毒每 年至少造成50，000例临床病例，其中多数为10岁以下儿童，导致约10，000人死亡，另有约 15，000例病例留有长期的神经-精神性后遗症。近几十年来，乙脑在一些以前无地方性流 行的地区出现了暴发。蚊虫是JEV的主要传播媒介。在动物中，猪是最重要的中间宿主，对 乙脑病毒有扩增作用，使乙脑病毒感染呈猪-蚊-人的链状。尽管成年猪在感染乙脑病毒 后无临床症状，但妊娠母猪却会产生死胎、木乃伊胎以及弱仔。大多数人感染乙脑病毒后表 现为亚临床症状，但儿童却会引起致死性脑炎，孕妇则会导致流产(Chaturvedi MC5Mather A, Chandra A, et al.Transplacental infection withjapanese encephalitis virus. J Infect Dis,1980,141,712-714. Endy TP, Nisalak A. Japanese encephalitis virus ecology and epidemiology. Curr TopMicrobiol Immunol, 2002, 267 :11-48.)。根据〈〈中华 人民共和国动物防疫法》有关规定，农业部会同卫生部组织制定了《人畜共患传染病名录》， 并于2009年1月19日施行。在“人畜共患传染病名录”中即有猪乙型脑炎(http://WWW. ivdc. gov. cn/gg/200902/t20090209_31549. htm[2009-02-04])。乙脑病毒在分类上属于黄病毒科(Flaviviridae)黄病毒属(Flavivir μ s)成员。 乙脑病毒的基因组为单股正链RNA，全长约llkb，基因结构为5'端有95个核苷酸的非编 码区接着一段10 296个核苷酸的编码区，随后是585个核苷酸的3'端的非编码区。基 因组只有一个开放读码框，其编码是由3个432个氨基酸组成的多聚蛋白前体，该多聚蛋 白前体在宿主细胞内，在病毒自身编码的蛋白酶(NS3)及胞内其它酶类作用下，形成3个 结构蛋白(C、pre Μ/Μ、Ε)和 7 个非结构蛋白(NSl、NS2A、NS2B、NS3、NS4A、NS4B、NS5)，其 中C、pre Μ/Μ和E基因分别编码衣壳/核心蛋白(capsid protein)、蛋白囊膜前体蛋白/ 囊膜蛋白(premembrane/membraneprotein)禾口 E 囊膜糖蛋白(envelope glycoprotein)。 C蛋白与基因组RNA构成病毒的核衣壳，对病毒有一定的保护作用。膜蛋白M与病毒的装 配、成熟有关。E蛋白是病毒颗粒表面最重要的成分，由它形成的表面抗原决定簇具有血 凝活性和中和活性，能刺激机体产生中和抗体，保护机体免受病毒攻击，参与病毒的吸附、 穿入、致病并与诱导宿主的免疫应答密切相关。E蛋白基因大小为1500bp，编码500个
3氨基酸残基，E蛋白在乙脑病毒毒力中占有重要位置，E基因的单点突变即可使乙脑病毒 丧失其神经毒力/侵袭力。乙脑病毒的SA14-14-2减毒株与其母本株SA14野毒株的E 区比较共有8个氨基酸残基差异，具体位置在E107、E138、E176、E177、E264、E279、E315 和E439位，是毒力减弱的关键氨基酸残基位点(Arroyo J，Guirakhoo F, Fenner S，et al. Molecular basis for attenuation ofneurovirulence of a Yellow fever virus/ Japanese encephalitis virus chimeravaccine(ChimeriVaxJE). J Virol,2001,934-942. Tsarev SA, Sanders ML, Vayghn Dff, et al. Phylogenetic analysis suggests only one serotype ofJapanese encephalitis virus. Vaccine,2000,18,36-43. Mchil PD, Satchidanandam V. Phylogenetic analysis of Japanese encephalitis virus :envelope gene based analysis reveals a fifth genotype,geographicclustering,and multiple introductions of the virus into the Indiansubcontinent. Am J Trop Med Hyg,2001, 65,242-251.)。乙脑病毒的检测主要依赖于ELISA(酶联免疫吸附试验)试剂盒，因此应用较为广 泛。另一方面，乙脑病毒感染后，病毒血症期与IgM抗体出现在时间上并不同步，完全依赖 血清学抗体检测的结果势必会遗漏相当一部分单纯病毒核酸阳性的标本。1985年，美国Cetus公司和加利福尼亚大学联合创建了 一种核酸体外扩增技 术-聚合酶链反应(polymerase chain reaction，PCR)，它的原理类似于DNA的体内复制。 不久，PE-Cetus公司推出了第一台PCR热循环仪，使PCR技术的自动化成为现实。由于PCR 技术具有的高度敏感性、特异性以及操作简便、适用样品的广泛性，所以它及其相关技术的 发展速度惊人，并广泛应用于众多领域。高正琴等人建立了乙脑病毒嵌套式RT-PCR检测方法，用于动物源性样本和实验 室常用细胞培养病毒液的检测，显示出良好的特异性和敏感性，对保证相关生物制品的安 全具有重要意义(高正琴，贺争鸣，邢瑞昌，等.乙脑病毒-嵌套式RT-PCR检测方法的建立 及初步应用.中国人兽共患病杂志.2005，21 (4) :7-10.)。采用核酸扩增的方法检测病毒RNA，现阶段比较成熟的有以下几种普通逆转录 PCR、核酸序列依赖扩增(NASBA)、逆转录实时荧光PCR、逆转录环介导等温扩增(LAMP)等。 然而，这些建立起来的方法，相当一部分是针对细胞培养病毒液，很少直接将方法应用于病 毒载量较低的临床样本检测。近年来，实时荧光定量PCR技术以其灵敏度高、速度快、特异性强等优点在基因表 达水平分析、突变和多态性研究、病原体的定性和定量检测等方面得到广泛应用。荧光定量 PCR定义是指在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号的变化实时检测PCR扩增反 应中每一个循环扩增产物量的变化，通过Ct值和标准曲线实现对起始模板的定量分析。探针法实时荧光定量PCR原理PCR扩增时在体系中含有引物的基础上再加入 一个特异性的荧光探针，该探针为一寡核苷酸，两端分别标记一个报告荧光基团(R)和一 个淬灭荧光基团(Q)。当探针完整的时候，报告基团所发射的荧光能量被淬灭基团吸收， 仪器检测不到信号。随着PCR的进行，Taq酶在链延伸过程中遇到与模板结合的探针，其 5' -3'外切核酸酶活性就会将探针切断，报告基团远离淬灭基团，其能量不能被吸收，即 产生荧光信号。目前仍未见探针法实时荧光定量PCR技术用于临床病人和小型猪样本中乙 脑病毒的定量检测。
因此，为了实现临床样本中乙脑病毒的定量检测，分析人和动物的乙脑病毒感染 状况，进一步提高检测的灵敏度，建立乙脑病毒的探针法实时荧光定量PCR检测方法，以及 研制相应的检测试剂变得十分迫切。
发明内容
本发明提供了用于对乙脑病毒进行实时荧光定量PCR检测的引物和TaqMan探针。本发明所提供的引物和TaqMan探针，是根据乙脑病毒E基因保守区域的保守区域 设计的，用以定量检测样本中乙脑病毒的核酸拷贝数。具体来讲，所述引物的上游引物具有序列表中SEQ ID NO :1的核苷酸序列，下游引 物具有序列表中SEQ ID NO 2的核苷酸序列；所述TaqMan探针具有序列表中SEQ ID NO 3的核苷酸序列。所述TaqMan探针为经过荧光标记的，其5 ’端标记有报告荧光基团，3 ’端标记有淬 灭荧光基团。所述报告荧光基团为FAM，荧光淬灭基团为NFQ。本发明的第二个目的是提供一种灵敏度较高且可准确定量的乙脑病毒的实时荧 光定量PCR检测方法。本发明所提供检测方法，是以本发明的引物和TaqMan探针进行的实时荧光定量 PCR检测方法。所述20ul实时荧光定量PCR反应体系可包括=TaqMan探针+引物Iul (TaqMan探 针浓度250nM，上、下游引物浓度各为900nM)，样品cDNA Iul (1 μ g/mL)，无RNA酶水8ul， Taqman Mix (TaqMan Gene Expression Master Mix 4369016，_ 自胃· (ABI)
司)IOul ο所述实时荧光定量PCR反应条件可为先50°C 2min ；然后95 °C IOmin ；最后 950C 15s,60°C lmin，共40个循环，在每个循环的延伸结束时进行荧光信号检测。所述检测方法还包括标准曲线的建立，方法为用含有目的片段的质粒作为标准 品，将其10倍系列稀释成①8. 86 X IO9拷贝/ μ 1 ；②8. 86 X IO8拷贝/ μ 1 ；③8. 86 X IO7 拷贝/μ 1 ；④8. 86Χ106拷贝/μ 1 ；⑤8. 86Χ105拷贝/μ 1 ；⑥8. 86Χ104拷贝/μ 1 ’⑦ 8. 86 X IO3拷贝/ μ 1 ；⑧8. 86 X IO2拷贝/ μ 1 ；⑨8. 86 X IO1拷贝/ μ 1。将质粒作为模板 进行实时荧光定量PCR检测，得到用于乙脑病毒检测的标准曲线。所述标准曲线的20ul实时荧光定量PCR反应体系包括=TaqMan探针+引物 Iul (TaqMan探针浓度250nM，上、下游引物浓度各为900nM)，质粒DNA Iul (0. 0003219mg/ mL),^c RNA Sl/jC 8ul,Taqman Mix(TaqMan Gene Expression Master Mix 4369016，
国应用系统(ABI)公司)IOul ；实时荧光定量PCR反应条件与上述相同。本发明的第三个目的是提供一种用于对乙脑病毒进行实时荧光定量PCR检测的 试齐U盒。本发明所提供的试剂盒，包括上述用于对乙脑病毒进行实时荧光定量PCR检测的 引物和TaqMan探针。本发明提供了一种乙脑病毒的实时荧光定量PCR检测方法及其专用引物和 TaqMan探针。该方法是以待检样品中的乙脑病毒核酸为检测对象，准确度及精密度均较好。
5本发明具有以下优点1、首次建立了乙脑病毒探针法实时荧光定量PCR检测方法，利用此检测方法既可 以对临床病人脑脊液和小型猪脑组织中的乙脑病毒进行检测，也可以对生物制品中的乙脑 病毒进行检测。2、本检测方法与乙脑病毒的其它常规检测方法如病毒的分离培养鉴定、全病毒 ELISA法和嵌套式PCR相比，灵敏度较高，具有取样便捷，检测效率得到了很大的提高，并且 有效的防止了污染。3、本检测方法与乙脑病毒的其它常规检测方法，如病毒的分离培养鉴定、全病毒 ELISA法和嵌套式PCR相比，具有操作程序简单易用的特点，并可进一步制成检测试剂盒， 操作程序化，适合大面积推广和应用。4.本检测方法不仅能够评价人和猪的乙脑病毒感染状况，同时也为乙脑病毒的流 行病学、致病机理等相关领域的研究提供了依据。5.本检测方法也可用于动物源性生物制品和实验室常用细胞培养物中外源性乙 脑病毒的污染监测，为生物制品的安全性检测提供了有效工具。综上所述，本发明能快速、准确地检测出人(如临床病人脑脊液样本)和小型猪 (如小型猪脑组织样本)的乙脑病毒，对保障实验用小型猪的质量和人类健康具有重要意 义；本发明也可用于动物源性生物制品和实验室常用细胞培养物中外源性乙脑病毒的污染 监测，对控制人和动物源性相关生物制品的质量及进出口动物检验检疫领域中有具有较大 的实际意义，能够保证相关生物制品的质量，控制乙脑病毒传播和人民用药安全。本发明的 检测方法及试剂盒可用于乙脑的诊断及生物制品的乙脑病毒检定，应用前景广阔。下面结合具体实施例对本发明做进一步详细说明。
图1为10倍系列稀释pMD-JEV-E质粒标准品的乙脑病毒探针法实时荧光定量PCR 检测扩增曲线图2为乙脑病毒的实时荧光定量PCR检测的标准曲线图3为乙脑病毒探针法实时荧光定量PCR检测23份样本荧光扩增曲线图4为乙脑病毒探针法实时光定量PCR检测特异性的荧光扩增曲线
具体实施例方式下述实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中末注明 具体条件的实验方法，通常按照常规条件如sambrook等人所编《分子克隆实验指南》中所 述的条件，或按照制造厂商建议的条件。所用引物及TaqMan探针由美国应用系统(ABI)公 司合成，所有序列测定工作均由宝生物工程(大连)有限公司完成。实施例1、用于对乙脑病毒(JEV)进行实时荧光定量PCR检测的引物及TaqMan探 针的设计参照GenBank收录的乙脑病毒SA14基因组全序列(GeneBank :U14163)，将与乙脑 病毒基因组结构极为相似的登革病毒和西尼罗河病毒分别进行序列比对，选择E基因保守 区域，采用ABI Primer Express 3. 0实时荧光定量PCR引物设计软件，设计合成TaqMan探
6针及引物。探针的荧光标记选择FAM(5’端)作为报告发光基团，NFQ(3’端)为淬灭基团。 序列如下上游引物(JEV-I):5，-GAGAAACAGAGAACTCCTCATGGAA-3，(序列表中 SEQID NO: 1)；下游引物(JEV-2):5，-CTGTGACCCAAGAGCAACAAC-3，(序列表中 SEQ ID NO :2)。TaqMan 探针5，FAM-CACGCCACAAAACAG-NFQ 3，(序列表中 SEQ ID NO 3)。实施例2、乙脑病毒的实时荧光定量PCR检测一、标准曲线的建立1、构建pMD-JEV-E重组质粒1. 1目的基因-乙脑病毒E基因的克隆1.1.1乙脑病毒RNA的提取以下操作必须严格按照要求在P2实验室负压生物安全柜内进行。(1)无菌条件下将乙脑动物脑组织样本50mg或乙脑病人脑脊液500 μ L或乙脑病 毒液300 μ L置入1. 5mL洁净离心管，加入500 μ L Trizol Reagents (购自美国Promega公 司)，充分振荡，室温静置5min。(2)加入10(^1^氯仿，用力振荡1086(3，室温静置51^11，41、1200017/1^11离心 IOmin0(3)小心将上层水相转移到另一洁净离心管仲，加等体积异丙醇，充分混勻， 12000r/min 离心 IOmin0(4)弃上清，加入500 μ L 75%乙醇(用无RNA酶水新鲜配制)，充分混勻，12000r/ min离心lOmin，小心吸取大部分乙醇。将离心管敞口在室温空气中干燥IOmin等待乙醇挥
发干净。(5)加入50 μ L无RNA酶水溶解沉淀。(6)用紫外分光光度仪测定所得RNA浓度(浓度为1 μ g/mL)，立即进行逆转录或 置于-70°C保存。乙脑病毒RNA也可以从其他商业渠道获取，或以公开文献介绍的其它方法提取。1.1.2 逆转录逆转录的反应体系为20 μ L，依次加入下列成分4μ L MgCl2 (25mM)、2 μ LReverse Transcription 10 X Buffer (Reverse Transcription System (逆转录作用系统，购自美 国 Promega 公司)>2 μ L dNTP Mixture (IOmM) >0. 5 μ L RecombinantRNasin Ribonuclease inhibitor ((重组)核糖核酸酶抑制剂，购自美国Promega公司)(40unit/μ L)、0. 5 μ L随 机引物(50pmol，Reverse Transcription System(逆转录作用系统)，购自美国Promega公 司)、0· IyL AMV 反转录 Sl (15unit/y L, Reverse Transcription System (逆转录作用系 统，购自美国Promega公司)、6 μ L RNA,4. 9 μ 1无RNA酶水。逆转录反应条件为室温lOmin，42°C 15min, 95°C 5min, 4°C 5min。所得 cDNA 即可 用作PCR反应模板。L1.3PCR 扩增PCR的反应体系为50 μ L，依次加入下列成分5 μ L 10ΧΕΧ Buffer (MgCl2Plus, TaKaRa Ex Taq，购自宝生物工程(大连)有限公司)、4yL dNTP Mixture (IOmM)、
70. 5 μ L lE 向弓I *:CGAAGTTGGCATTTTTGTGC(50pmol)、0.5yL$ 向弓| 物 GCTCGCAACGGAAACAATCG (50pmol) ,0. 25 μ L EX Taq (5unit/ μ L，购自宝生物工程(大连)有 限公司)、5 μ L cDNA、34. 75 μ L 无 RNA 酶水。PCR 反应条件为94°C 30sec，55°C 30sec，72°C lmin，共 30 个循环。1. 1. 4琼脂糖凝胶电泳检测配制1 %琼脂糖凝胶(含0. 5 μ g/mL溴化乙锭)。取PCR扩增产物5 μ L，与1 μ L的 6 X载样缓冲液混勻，加到凝胶孔格中。电泳缓冲液为IXTAE缓冲液，电泳条件为IlOV恒 压/30min，凝胶成像系统下拍摄记录电泳结果。结果得到了 622bp的目的条带，用Agarose Gel DNA Purification Kit (琼脂糖凝胶回收试剂盒，购自宝生物工程(大连)有限公司) 回收并纯化。1. 2乙脑病毒E基因重组质粒的构建将乙脑病毒E基因片段与pMDIS-T载体(购自宝生物工程(大连)有限公司) 进行连接，连接反应体系2XRapid Ligation Buffer 5 μ L(宝生物工程(大连)有限 公司试剂盒)，PMD18-T 载体 0. 5 μ L (浓度 50ng/ μ L)，目的基因 4 μ L (45 μ g/mL)，T4 DNA Ligase 0. 5μ L(5U/y L)。然后将连接产物热转化至 Ε· coliCompetent Cell JM109 中，涂 布LB平板，37°C过夜培养。将选定的含有阳性克隆的单菌落进行培养，提取质粒DNA，用 EcoR I和Hind III限制性内切酶进行酶切鉴定并测序。酶切结果获得了 622bp的目的条 带及pMDIS-T质粒条带，与预期结果相符。测序结果表明获得了序列及插入位置均正确的 含目的基因的重组质粒，命名为PMD-JEV-E。测定质粒DNA浓度，计算拷贝数，结果拷贝数为 8. 86 X IO1 拷贝 /yL，-40°C保存。2、标准品检测将pMD-JEV-E质粒DNA作为模板进行乙脑病毒探针法实时荧光定量PCR检测，建 立标准曲线。具体操作如下将质粒DNA进行10倍系列稀释成①8. 86 X IO9拷贝/ μ L ；② 8. 86X IO8 拷贝 / μ L ；③8. 86X IO7 拷贝 / μ L ；④8. 86X IO6 拷贝 / μ L ；⑤8. 86X IO5 拷 贝 / μ L ；⑥8. 86Χ104 拷贝 / μ L ；⑦8. 86X IO3 拷贝 / μ L ；⑧8. 86X IO2 拷贝 / μ L ；⑨ 8.86Χ101拷贝/yL。每个稀释度重复平行试验3次。标准品检测反应体系为20 μ 1，依次加入下列成分=TaqMan探针+引 物1 μ L (TaqMan探针浓度250ηΜ，上、下游引物浓度各为900ηΜ))，质粒DNA 1 μ L(0. 0003219mg/mL)，^c RNA Sl/jC 8 μ L, Taqman Mix(TaqMan Gene ExpressionMaster Mix 4369016，购自美国应用系统(ABI)公司)10yL。标准品检测反应条件为先50 V 2min ；然后95 °C IOmin ；最后95 °C 15s, 60°C lmin，共40个循环，在每个循环的延伸结束时进行荧光信号检测。标准品探针法实时荧光定量PCR扩增曲线如图1所示(①8. 86 X IO9拷贝/ μ L ； ②8. 86 X IO8 拷贝 / μ L ；③8. 86 X IO7 拷贝 / μ L ；④8. 86 X IO6 拷贝 / μ L ；⑤8. 86 X IO5 拷贝/μ L ；⑥8. 86Χ104 拷贝/yL ；⑦8. 86X IO3 拷贝 / μ L ；⑧8. 86 X IO2 拷贝 / μ L ；⑨ 8. 86X IO1 拷贝 /μ L0 )。3、标准曲线的绘制 根据所得Ct值与其对应的标准品的对数值绘制标准曲线(图2)，标准曲线的R平 方值为0. 998，荧光定量PCR反应的扩增效率为99. 022%。标准曲线显示本发明建立的乙
8脑病毒探针法实时荧光定量PCR检测方法有9个数量级的线性检测范围，进一步说明该检 测方法具有非常高的灵敏度。二、乙脑病毒探针法实时荧光定量PCR检测以1份临床确诊的乙脑病人脑脊液cDNA和22份乙脑病毒阳性的小型猪脑组织 cDNA作为模板进行乙脑病毒探针法实时荧光定量PCR检测。每份样本重复平行试验3次。样本检测体系为20 μ L，依次加入下列成分(TaqMan探针浓度250ηΜ，上、下游引 物浓度各为 900ηΜ，样品 cDNA 1 μ L (1 μ g/mL)，无 RNA 酶水 8 μ L, TaqmanMix (TaqMan Gene Expression Master Mix 4369016，购自美国应用系统(ABI)公司)10yL。检测反应条件为先50°C 2min ；然后 95°C IOmin ；最后 95°C 15s，60°C lmin,共 40 个循环，在每个循环的延伸结束时进行荧光信号检测。探针法实时荧光定量PCR检测检测23份样本扩增曲线如图3所示，结果显示以 乙脑病人脑脊液cDNA、乙脑病毒阳性的小型猪脑组织cDNA为模板均出现了目的荧光扩增 曲线。试验一、乙脑病毒探针法荧光定量PCR检测方法的重复性分析乙脑病毒探针法荧光定量PCR检测方法的重复性分析方法为将含乙脑病毒E基 因的重组质粒pMD-JEV-E的DNA分别进行10倍系列稀释后，各取1 μ L作为模板，采用上述 反应体系进行实时荧光定量PCR检测，每份样本重复平行试验3次，分两个批次进行，试验 结果取Ct平均值，通过统计计算Ct标准差(SD)、(^变异系数(CV)。重复性分析结果结果见 表1 批内重复测定其变异系数CV值小于1. 9%，批间重复测定CV值小于0. 8%，均说明本 发明所建立的乙脑病毒探针法荧光定量PCR检测方法的稳定性良好。表1乙脑病毒探针法荧光定量PCR检测方法的重复性试验结果
重复性质粒拷贝数C T值C τ平均值 C τ MeanC τ标准差 CT SDCτ变异系数 Ct CV123批内重复测定IO520. 5637520‘9012221. 1184120. 8611240. 27949340.0133978IO^24. 5034124. 634424.7841824.6406630.14049030.0057015IO327. 7449827.9163328.2140727.9584590.23736290.0084898IO230.8368231.1444731. 2218831. 0677240.20367950.006555910'32.9712934. 080934. 1166433. 7229420.65119580.0193101批间重复测定IO516. 6205516.6533316. 870816.714890. 1360090.0081369IO420. 7820420.6893420. 7429920.738120. 0465450.0022444IO323.4062623.3291623. 4663923.400610. 0687910.0029397IO226. 36926.4069226. 4151326.397010.024610.000932310'30. 5247830. 6380730. 9883230.717060.2416520. 007867 试验二、乙脑病毒探针法实时荧光定量PCR检测方法的特异性 将乙脑病毒SA14-14-2疫苗株(购自中国药品生物制品检定所)cDNA、乙脑病毒 Nakayama株(购自中国药品生物制品检定所)cDNA、BHK_21细胞(购自中国药品生物制品 检定所)cDNA作为模板进行探针法实时荧光定量PCR检测，评价反应系统的特异性。反应体系及反应条件与实施例2相同。每份样本重复平行试验2次。探针法实时荧光定量PCR检测特异性扩增曲线如图4所示，结果显示以乙脑病 毒-SA14-14-2疫苗株cDNA、乙脑病毒-Nakayama株cDNA为模板出现了目的荧光扩增曲线， 而以脑脊髓炎病毒(GDVII)cDNA、BHK-21细胞cDNA为模板没有出现目的荧光扩增曲线。结 果说明本发明用于对乙脑病毒进行实时荧光定量PCR检测的引物和TaqMan探针的特异性 良好，定量反应体系特异性良好。实施例3、乙脑病毒探针法实时荧光定量PCR检测试剂盒将用于对乙脑病毒进行实时荧光定量PCR检测JEV TaqMan assay mix 5(^1^0^9]\&111探针浓度25011]\1，上、下游引物浓度各为90011]\0、邛￥ TaqMan mix 500 μ L, JEV 阳性质控品50 μ L、阴性质控品50 μ L以及无RNA酶水500 μ L共同包装，得到乙脑病毒的实 时荧光定量PCR检测试剂盒(50次反应)。
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权利要求
用于对乙脑病毒进行实时荧光定量PCR检测的引物和TaqMan探针，是根据乙脑病毒E基因保守区域的保守区域设计的，用以定量检测样本中乙脑病毒的核酸拷贝数。
2.根据权利要求1所述的引物和TaqMan探针，其特征在于所述引物的上游引物具有 序列表中SEQ ID NO :1的核苷酸序列，下游引物具有序列表中SEQ ID NO :2的核苷酸序列； 所述TaqMan探针具有序列表中SEQ ID NO 3的核苷酸序列。
3.根据权利要求2所述的引物和TaqMan探针，其特征在于所述TaqMan探针为经过 荧光标记的，其5’端标记有报告荧光基团，3’端标记有淬灭荧光基团。
4.根据权利要求3所述的引物和TaqMan探针，其特征在于所述报告荧光基团为FAM， 荧光淬灭基团为NFQ。
5.一种乙脑病毒的实时荧光定量PCR检测方法，是以权利要求1-4任一项所述的引物 和TaqMan探针进行的实时荧光定量PCR检测方法。
6.根据权利要求5所述的检测方法，其特征在于检测中，20u L实时荧光定量PCR 反应体系包括TaqMan探针+引物1 y L(TaqMan探针浓度250nM，上、下游引物浓度各为 900nM) ,Wm cDNA 1 u L(1 u g/mL)，% RNA Sl/jC 8 u L, TaqmanMix (TaqMan Gene Expression Master Mix 4369016，购自美国应用系统(ABI)公司)10yL。
7.根据权利要求5所述的检测方法，其特征在于所述实时荧光定量PCR检测的反应 条件为先50°C 2min ；然后95°C lOmin ；最后95°C 15sec,60°C lmin,共40个循环，在每个 循环的延伸结束时进行荧光信号检测。
8.根据权利要求5或6或7所述的检测方法，其特征在于所述检测方法还包括标准曲 线的建立，方法为用含乙脑病毒E基因的重组质粒pMD-JEV-E的DNA作为标准品，将其10 倍系列稀释成 8. 86X 109 拷贝 /ii L、8. 86X 108 拷贝 /ii L、8. 86X 107 拷贝 /ii L、8. 86X106 拷贝 /u L>8. 86X 105 拷贝 /ii L、8. 86X 104 拷贝 /ii L、8. 86X 103 拷贝 /ii L、8. 86X 102 拷 贝/ ii L、8. 86 X 101拷贝/ P L。各取1 ii L质粒DNA作为模板DNA，进行实时荧光定量PCR检 测，每份样本重复平行试验3次，得到用于乙脑病毒检测的标准曲线。
9.根据权利要求8所述的检测方法，其特征在于所述建立标准曲线的20y L实时荧 光定量PCR反应体系包括TaqMan探针+引物1 i L(TaqMan探针浓度250nM，上、下游引物 浓度各为 900nM)，质粒 DNA 1 u L (0. 0003219mg/mL)，无 RNA 酶水 8 ii L，Taqman Mix 10 u L ； 实时荧光定量PCR反应条件与权利要求7相同。
10.一种用于对乙脑病毒进行实时荧光定量PCR检测的试剂盒，包括权利要求1-4任一 项所述用于对乙脑病毒进行实时荧光定量PCR检测的引物和TaqMan探针。
全文摘要
本发明公开了一种乙脑病毒的实时荧光定量PCR检测方法及试剂盒。所述引物和TaqMan探针，是根据乙脑病毒E基因保守区域的保守区域设计的，用以定量检测样本中乙脑病毒的核酸拷贝数。具体来讲，所述引物的上游引物具有序列表中SEQ IDNO1的核苷酸序列，下游引物具有序列表中SEQ ID NO2的核苷酸序列；所述TaqMan探针具有序列表中SEQ ID NO3的核苷酸序列。本发明对控制人和动物源性相关生物制品的质量及进出口动物检验检疫领域中有具有较大的实际意义，能够保证相关生物制品的质量，控制乙脑病毒传播和人民用药安全。本发明的检测方法及试剂盒可用于临床病人脑脊液样品和小型猪脑组织样品及生物制品的乙脑病毒检定，应用前景广阔。
文档编号C12N15/11GK101942526SQ20101022572
公开日2011年1月12日 申请日期2010年7月5日 优先权日2010年7月5日
发明者贺争鸣, 高正琴 申请人:中国药品生物制品检定所