专利名称：一种高通量的大豆转基因方法
技术领域：
本发明涉及一种高通量的大豆转基因及筛选方法。
背景技术：
大豆是重要的油料作物，也是植物蛋白质及油脂的重要来源。为了提高大豆抗病 虫害及生理逆境的能力、改善大豆品质、增加大豆产量，除了采用传统的育种方法外，可通 过基因工程手段实现有目的的遗传工程改良。大豆的遗传转化是研究大豆基因功能的关 键，但由于大豆的组织培养体系不够完善，大豆组织对农杆菌不敏感等原因，使大豆的遗传 转化难度大、效率低、至今成为世界性难题。探索大豆转基因方法主要包括基因枪法、农杆菌介导法、电激法、PEG法、子房注射 法等，其中以农杆菌介导法和基因枪法为研究较多。农杆菌介导的组培法，存在着遗传转 化操作繁琐、成本高、工作量大、周期长、转化率低，而且受到基因型依赖和菌株特异性的限 制；基因枪法操作简便、受体广泛、一次可转化多个细胞，但是由于基因整合频率不高，转化 基因拷贝数不稳定，也受到基因型的限制，而且需要经过繁琐的组织培养体系才能得到再 生植株，特别是其昂贵的设施条件及实施成本限制了广泛的推广应用。目前，大豆转化的主 要障碍来自缺乏高效稳定的组培技术体统，因此，创建高效简便的花粉管通道法转化大豆 具有重要意义。花粉管通道法(pollen-tube pathway)是周光宇等(1978年)建立并在长期科学 研究中发展起来的一种育种方法，目前已在国内外广泛应用。基本原理是花朵授粉后，花粉 管通过珠心插入到胚囊中，外援基因沿着花粉管到达子房，整合到受精但未分化的合子细 胞中，此时合子细胞壁尚不完整，处于感受态，易使外援基因转入。该方法无需建立外植体 的组培再生体系，在非离体的大豆活体花器官实施基因转化，并通过对后代种子进行筛选， 获得转化植株。该方法已在棉花中被广泛应用，在大豆(刘德璞等，申请号99123707. 2)中 已有成功报道。但是上述大豆花粉管通道转化方法中存在着两大缺陷一是授粉后转化前 需要进行对每朵花序做一一切去柱头处理的大量工作；二是通过繁琐的幼胚组织培养途径 筛选或对收获种子经过初选、移植、再复选和分子鉴定等，其筛选程序繁琐、效率低、工作量 大、筛选周期长等低效技术问题。因此，难以满足大规模高通量的基因转化与筛选的实际应 用要求。同时，剪去柱头的繁琐操作可能导致以下影响1、大豆是自花授粉植物，其授粉发育进程并非同步。过早的切去柱头会影响花粉 管的正常发育，影响授粉效率，降低胚珠受精机率，导致结实率下降，同时影响DNA分子经 花粉管通道进入胚囊。2、由于大豆花的形态结构特殊，花器中的柱头微小，切柱头的工作要求精细，操作 不当容易引起子房受机械损伤，花粉管通道破坏，造成结实率降低，影响转化率。3、柱头组织微小，切柱头的操作难度增加了繁琐的工作量，难以实现大规模高通 量的遗传转化与实际推广应用的要求。
发明内容
本发明的目的在于提供一种高通量大豆转基因方法。该方法避免了农杆菌转化方 法中繁杂的组织培养体系和转化效率低、周期长、受基因型依赖等问题，同时解决了以往花 粉管通道转化大豆方法中需要修剪大量花柱头的操作，以及繁琐的抗性筛选程序及较长的 筛选周期等技术缺陷。本发明提供的大豆转基因方法，包括如下步骤在大豆花的柱头上滴加基因转化 液，成熟后收获种子。上述基因转化液是含待转基因的质粒悬浮液。进一步，上述含待转基因的质粒可以是将待转基因插入含Bar基因的PGREEN载体 的多克隆位点间得到的重组质粒，具体可以是实施例中的PGREEN0229。上述基因转化液是将待转基因的质粒置于0. IXSSC缓冲液中，得到所述基因转 化液，所述待转基因的质粒在所述基因转化液中含量50-100ug/ml，优选是70ug/ml (也即 上述含待转基因的质粒是以50-100ug/ml，优选是70ug/ml的浓度定溶于0. IXSSC缓冲液 中的)。上述含待转基因的质粒悬浮液滴加在所述柱头的体积是5-8 μ 1。具体可以以在柱 头上形成一最大液滴而不落下为最佳。上述大豆花选择生长状态良好、发育健壮的花蕾。上述花蕾的花冠高于花萼0_2mm。上述大豆花的柱头上滴加基因转化液的步骤进行两次，两次间隔时间为2小时之 内。上述方法还包括在所述收获种子步骤之后进行种子萌发得到转基因大豆植株。上述方法还包括所述种子萌发后的筛选，所述筛选包括如下步骤在所述种子出 苗后从真叶完全展开至第1三出叶展开之前，在叶面上喷洒除草剂。上述除草剂是浓度为0. 8-1. 2%0 (体积浓度)的草胺磷水溶液，所述除草剂喷洒量 150毫升/平方米土，320棵/每平方土 ；所述叶面喷洒的次数为2次，2次间隔7天。进一步，上述筛选还包括叶面喷洒除草剂后的分子生物学检测，优选是PCR检测、 Southern blot检测和/或Western blot检测；所述PCR检测的所用引物是序列表中序列 2和序列3。本发明提供了一种操作简便、转化效率高、成本低，适用于大豆的大规模基因转化 与高通量筛选的方法。采用本发明提供的方法，不需要剪切柱头，对已完成授粉的完整柱头 顶端直接转化质粒DNA，减少了大量花序组织的前处理操作；不经过幼胚组织培养途径的 繁琐的筛选操作或对种植幼苗的初选、移植和复选等反复的筛选程序，而是直接对Tl代幼 苗实施抗性筛选和分子生物学鉴定，当年可获得Tl代阳性植株的筛选结果。采用本方法对 大豆中品661进行转化和筛选，经PCR鉴定，其平均转化有效率达2. 7%。本发明方法的优点具体如下1、该转化方法操作简便、效率高、易于推广应用，可用于实施大规模的基因转化。 该方法通用性强，不受基因型影响，适合各种大豆品种及品系的基因转化，而且成本低、流 程简单、周期短、工作量小，避免了目前常规转化方法中所存在的组织培养、分化再生难于 解决的问题，同时在南方及大棚温室等适宜的条件下可实现一年两季的基因转化工作。
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2、该筛选方法操作流程简单、时间短、成本低，可用于实施高通量的筛选，而且筛 选抗性苗的阳性率高，减少了分子检测的工作量。3、充分利用大豆适宜的生长季节实施转化获得转基因Tl代种子，可当年直接种 植于土壤或温室中抗性筛选与分子检测，大大缩短了转化及筛选周期。4、本方法避免了因剪切柱头带来的组织损伤，对Tl代种子的结实率及发芽率的 影响小。5、筛选鉴定出的阳性苗无需炼苗和移苗，可继续在原位生长发育至收获种子。
图1 :PGreen-TriGLU 质粒图谱(A)及鉴定图(B)。图2 高通量法转化大豆技术流程。图3 大豆Tl代种子的抗性筛选，A 待筛选的Tl代大豆幼苗；B 大豆幼苗的除草 剂喷洒筛选；C和D 喷洒除草剂10天后的抗性大豆幼苗。图4 =Tl代抗性幼苗的PCR鉴定。M=IOObp DNA Ladder ；P 质粒DNA阳性对照；N 水阴性对照；Lane2、5、6、7为PCR阳性植株；Lanel、3、4为阴性植株。
具体实施例方式下面结合具体实施例对本发明作进一步说明，但本发明并不限于以下实施例。下述实施例中，如无特殊说明，均为常规方法。实施例1、获得转基因大豆一、基因转化1、实验材料1)载体下述实施例中所用载体为pGREEN0229，可以从http://www. pgreen. ac.uk/a-ord-fr. htm网站购置。产品编码PBII0229 (nos-Bar LB)。其余的材料、试剂等， 均可从商业途径得到。2) TriGLUC基因的克隆取幼嫩的栝楼叶组织(采集于北大校园)，利用Trizol法提取总RNA，并通过 常规方法进行RT-PCR反应合成cDNA。以TriGLUC_5和TriGLUC_3为引物(TriGLUC_5 CCTCCATGGCTCTTTTGCCG、TriGLUC-3 CTCTCAATTGAACTTGACTGG)，以栝楼cDNA为模板进行PCR反应克隆得到TriGLUC基因全序列(序列表中序列 1)。合成cDNA具体步骤(1)在RNase-free的PCR管中加入下列组分，并混勻；2μ1 总 RNA(Iyg)3μ 1 lOpmol/μ 1 Oligo dT(16)11. 5μ 1 RNase-free Water(2)72°C，5min ;(3)冰上 2min ；(4)加入下列组分，并混勻；
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5 μ 1 dNTP(10mM each)
2. 5 μ 1 5x M-MLV RT buffer
1 μ 1 M-MLV
共25 μ 1体系
(5)42°C，60min ；
PCR反应体系为
GoTaq Flexi0. 125 μ
5XFlexi Buffer5. 0μ 1
MgCl2 (25 μ Μ)3. 0μ 1
cDNA模板2. 0μ 1
正向引物(TriGLUC-5)0. 5μ 1
反向引物(TriGLUC-3)0. 5μ 1
dNTPs1. 875 μ
ddH2012μ 1
反应条件
权利要求
一种大豆转基因方法，包括如下步骤在大豆花的柱头上滴加基因转化液，成熟后收获种子。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于所述基因转化液是含待转基因的质粒悬浮液。
3.如权利要求2所述的方法，其特征在于所述含待转基因的质粒是将待转基因插入 到含Bar基因的pGREEN载体的多克隆位点间得到的重组质粒。
4.如权利要求3所述的方法，其特征在于所述基因转化液是将待转基因的质粒置于 0. IXSSC缓冲液中，得到所述基因转化液，所述待转基因的质粒在所述基因转化液中含量 50-100ug/ml，优选是 70ug/ml。
5.如权利要求1-4中任一所述的方法，其特征在于所述含待转基因的质粒悬浮液滴 加在所述柱头的体积是5-8 μ 1。
6.如权利要求1-5中任一所述的方法，其特征在于所述大豆花是花冠高于花萼0-2mm 的花蕾。
7.如权利要求1-6中任一所述的方法，其特征在于所述大豆花的柱头上滴加基因转 化液的步骤进行两次，两次间隔时间为2小时之内。
8.如权利要求1-7中任一所述的方法，其特征在于所述方法还包括在所述收获种子 步骤之后进行种子萌发得到转基因大豆植株；所述方法优选还包括在所述种子萌发后的筛 选，所述筛选包括如下步骤在所述种子出苗后从真叶完全展开至第1三出叶展开之前，在 叶面上喷洒除草剂。
9.如权利要求8所述的方法，其特征在于所述除草剂是浓度为0.8-1. 2%0 (体积浓 度)的草胺磷水溶液；所述除草剂喷洒量150毫升/平方米土，每平方土种植320棵苗；所 述叶面喷洒的次数为2次，2次间隔7天。
10.如权利要求8或9所述的方法，其特征在于所述筛选还包括叶面喷洒除草剂后的 分子生物学检测，优选是PCR检测、Southern blot检测和/或Western blot检测；所述 PCR检测的所用引物是序列表中序列2和序列3。
全文摘要
本发明公开了一种高通量大豆转基因方法。该方法，包括如下步骤在大豆花的柱头上滴加基因转化液，成熟后收获种子。本方法避免了因剪切柱头带来的组织损伤，对T1代种子的结实率及发芽率的影响小。本发明提供的方法还包括筛选，该筛选包括如下步骤在所述种子出苗后从真叶完全展开至第1三出叶展开之前，在叶面上喷洒除草剂；进一步筛选可以包括分子生物学检测，上述筛选方法操作流程简单、时间短、成本低，可用于实施高通量的筛选，而且筛选抗性苗的阳性率高，减少了分子检测的工作量。
文档编号C12Q1/68GK101948869SQ20101027311
公开日2011年1月19日 申请日期2010年9月6日 优先权日2010年9月6日
发明者于祥春, 付力文, 任姣, 何善平, 安成才, 张起涛, 杨扬, 滑瑞, 邬倩, 黄萍 申请人:北京大学