专利名称：玉米耐渍性相关的转录因子基因zm-bRLZ及分子标记与应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及植物生物技术领域。具体涉及到一个位于玉米第9染色体上，与玉米 苗期耐渍性相关的转录因子基因zm-bRLZ的克隆及其功能标记的开发与应用。
背景技术：
南方春玉米和北方夏玉米在正常的栽培季节中，经常遭受洪涝和渍害，因长期渍 水使玉米根系处于低氧状态，导致玉米减产。渍害已成为制约玉米高产稳产的重要非生物 逆境因子。培育耐渍性玉米品种是减少淹水胁迫带来损失的有效途径。许多研究表明，玉米自交系间存在耐渍性的遗传差异，这为通过育种手段进行玉 米耐渍性的遗传改良提供了基因资源。在建立玉米苗期耐渍性鉴定指标的基础上，我们对 120份玉米自交系种质进行了耐渍性的鉴定筛选(姜华武，张祖新，1999)，以耐渍性显著 差异的自交系(HZ32，Mol7，K12等)为材料，我们开展了控制玉米耐渍性的QTL定位、全基 因组的表达谱分析、代谢途径中重要酶基因的表达和活性研究(张祖新等，2003;Zhang et al.，2005b ；Tang et al.，2005)等。然而，由于玉米耐渍性为一复杂性状，存在显著的基因 型与环境互作，同时胁迫强度和时间具有不可预测性，因此，使用常规育种技术对玉米耐渍 性改良比较困难。近年来研究表明，分子设计育种将分子标记辅助选择技术、转基因技术和 常规育种方法有机结合在一起，可为玉米耐渍性的遗传改良提供一套全新的技术方案。优良耐渍基因的发掘、鉴定与克隆是开展玉米耐渍性分子设计育种的前提。近年 来，模式植物(拟南芥和水稻)耐渍响应的关键代谢途径的阐明及其重要基因克隆(Hoeren et al. ,1998 ；Xu et al. ,2006 ；Hattori et al.，2009)，为植物耐渍性的遗传改良提供了 基因资源。当今，在植物耐渍性改良探索中所使用的基因资源主要包括1)导入发酵途径 相关基因如Adhl、Pdcl、Pdc2、Ldh等，提高拟南芥植株对低氧胁迫的耐性；在棉花和水稻中 也有类似的报道(Ellis et al. ,2002 ；Dolferous et al.，2003 ；Ismond et al. ,2003) 2)导入厌氧诱导的转录因子如AtMYB2基因，启动发酵途径和其他代谢途径中相关基因的 表达，增强拟南芥对低氧胁迫的长期适应反应(Hoeren et al.，1998)，但AtMYB2的组成型 超量表达导致转化植株夭折(Dolferous et al.，2003)。3)导入外源物种透明颤菌的血红 蛋白基因vhb，提高植物根系对氧的捕获效率，以缓解长时间淹水造成的厌氧胁迫。因此，在 育种实践中可用的基因资源非常有限，进一步鉴定并克隆玉米耐渍基因仍然十分必要。鉴于此，本发明利用cDNA芯片技术，鉴定并克隆了一个玉米苗期耐渍性响应的转 录因子基因zm-bRLZ，证实了该基因在玉米耐渍性形成中的功能及作用机理，基于基因序列 开发了一对功能性分子标记，为玉米耐渍性的分子设计育种提供了新的基因资源和实用性 标记。
发明内容
本发明的目的是从玉米中克隆一个玉米苗期耐渍性相关的基因的完整编码区DNA片段及其启动子，利用该基因开发实用性分子标记。我们将这个基因命名为zm-bRLZ。本发明利用不同耐渍性的玉米自交系Mol7(引自国家农作物种质保存中心，渍水 敏感)和Hz32(引自国家农作物种质保存中心，耐渍性强)为材料，其中Hz32在西南地区 育种中被广泛应用。我们制作了玉米全生育期均一化cDNA芯片，通过对Hz32和Mol7在淹 水胁迫条件下苗期根系的基因表达差异研究，鉴定得到了一个耐渍性相关的转录因子基因 zm-bRLZ。利用Real time PCR进一步验证了芯片结果，该基因在耐渍材料Hz32中受淹水胁 迫诱导，而在敏感材料Mol7中则变化不明显。使用RACE技术获得了该基因的1199bp全长 cDNA，序列分析显示，该cDNA序列含有1个869bp的开放阅读框，编码282个氨基酸；预测的 蛋白质序列中有一个bZip/bRLZ结构域和一个DNA结合结构域，具有真核生物Leu Zipper 类转录因子的典型特征。洋葱表皮的瞬时表达分析证实，该基因产物在细胞核内累积。凝 胶滞后分析证实，该基因蛋白质产物与ADH启动子(M32984. 1)厌氧响应元件(anaerobic responsive element :ARE)体外结合。另外，通过对K12 (引自国家农作物种质保存中心，渍 水敏感)及Hz32两个材料之间的比较测序，成功开发了 一对基于zm-bRLZ基因序列的CAPS 标记，利用K12XHz32 F2群体，将该基因定位于9. 04bin耐渍性QTL峰值处，该QTL贡献率 为7.0%。候选基因的关联分析证实，zm-bRLZ基因启动子区域与3'-非转录区区的多个 单核苷酸多态性(SNP)位点与多个耐渍性指标(如地上部长度、地上部鲜重及地上部长度 系数)均极显著关联。本发明的优点在于(1)本发明首次在玉米中克隆并证实了一个耐渍性相关的转录因子基因，为玉米 耐渍性遗传改良提供了新的基因资源；(2)基于本发明所克隆的基因开发了一对功能性分子标记，可为分子标记辅助育 种提供实用性的分子标记。
序列表SEQ ID NO 1是本发明克隆的与玉米耐渍性相关的转录因子基因zm-bRLZ 的核苷酸序列。序列表SEQ ID NO 2是本发明克隆的与玉米耐渍性相关的转录因子基因zm-bRLZ 编码区。序列表SEQ ID NO 3是本发明克隆的与玉米耐渍性相关的转录因子基因zm-bRLZ 编码的氨基酸序列。序列表SEQ ID NO :4_11是扩增玉米耐渍性相关的转录因子基因zm-bRLZ的引物 序列。序列表SEQ ID NO 12是基因zm-bRLZ的CAPS分子标记的核苷酸序列。图1 是Real time PCR显示zm_bRLZ基因在淹水4h的Hz32被诱导表达情况。图2 是zm-bRLZ基因的外显子、内含子所在位置的示意图。图3 是pEGAD载体示意图。图4 是zm-bRLZ表达产物的洋葱表皮定位。图5 是pGEX-KG载体示意图。图6 是zm-bRLZ蛋白质分离及其凝胶阻滞电泳分析结果，图中泳道1 蛋白质分子量标记；泳道2 纯化的zm-bRLZ蛋白质；泳道3 纯化的zm-bRLZ蛋白质+含ARE元件的 探针；泳道3 游离ARE元件探针。图7 是CAPS标记电泳图，泳道1 =DNA分子量标记DL2000 ；泳道2 =G型基因型；
泳道3 =G型基因型；泳道4 杂合基因型。图8 是zm-bRLZ基因在第9染色体上的定位及耐渍QTL的定位，注作图群体为 K12XHZ32 F2群体，QTL定位群体为K12XHZ32 F2 :3群体。图9 是zm-bRLZ基因与玉米耐渍相关性状的关联分析，注纵坐标表示解释的表 型变异；横坐标表示DNA序列位置；T5表示地上部分长度；T6表示地上部长度系数。
具体实施例方式以下实施实例进一步定义本发明，并描叙了克隆zm-bRLZ基因、阐明基因功能及 其功能标记开发的方法。根据以下的描述和实例，本领域技术人员可以确定本发明的基本 特征，并且在不偏离本发明精神和范围的情况下，可以对本发明做出适当的完善和修改，以 使其适用各种用途和条件。实施例1 利用cDNA芯片筛选得到zm-bRLZ(1)芯片筛选得到差异表达基因zm-bRLZ本发明选用耐渍性较差的Mol7和耐渍性强的Hz32两个玉米自交系为试材。种 子萌发后，于沙钵盆栽培养至两叶一心期。挑选长势一致的若干单株平均分成两组。一组 作为对照，在正常水分和管理条件下生长；另一组采用IX完全培养液[成分=Ca(NO3) 2 820. 7mg/L，KNO3 505. 6mg/L，MgSO4 ·7Η20 616. 2mg/L, KH2PO4 272. 2mg/L, Fe-EDTA 13. 02mg/ L, H3BO3 2. 860mg/L, MnSO4 1. 015mg/L, CuSO4 · 5H20 0. 079mg/L, ZnSO4 · 7H20 0. 220mg/L, H2MoO4 0. 090mg/L]进行lh、2h、4h和8h的淹水处理，淹水深度以水面刚好淹没最下叶片基 部为宜。分别剪取处理和对照的根系，于-70°C保存备用。利用本申请人所在实验室构建的玉米自交系Mol7全生育期均一化cDNA文库(见 Zhang et al.，2005a)，使用BioRobotics试剂盒(剑桥公司，英国)将10886个插入片段 PCR产物点制于尼龙膜上，制成cDNA芯片(方法见Zhang et al. , 2005b) 将Hz32和Mol7 淹水处理lh、2h、4h和对照的总RNA样品，各自分离其mRNA并反转录，得到33P标记的第一 链cDNA产物做探针，用于与cDNA芯片杂交。预杂交液(6X柠檬酸盐缓冲液SSC，0. 5% 十二烷基硫酸钠SDS，5 XDenhardt' s试剂，100 μ g/ml鲑鱼精DNA)中68°C预杂交3h，然 后加入探针于杂交液(6XSSC，0. 5%十二烷基硫酸钠，100 μ g/mL鲑鱼精DNA)中杂交过夜。 杂交结束后洗膜液(0.1 XSSC，0.5%十二烷基硫酸钠)中，65°C洗膜lh。洗好的膜用利用 FLA-3000A Plate/Fluorescent Image Analyzer (东京电力，日本)扫描。选取处理与对照 差异在3倍以上的克隆进行测序分析。其中，zm-bRLZ基因在HZ32中受淹水胁迫高效诱导 表达，在Mo 17中变化不显著。(2)实时定量PCR验证分别取Hz32和Mol7淹水lh、2h、4h和8h处理及对照的总RNA各5 μ g，进行cDNA 第一链的合成。反转录选用 RevertAid H Minus First Strand cDNA Synthesis Kit (购 自MBI，Lithuania公司试剂盒，按照试剂盒的说明书操作)进行。选取玉米看家基因 actin (NMJ)Ol 155179) AAGTACCCGATTGAGCATGG, GATGGAGTTGTACGTGGCCT 为对照。PCR 引物见表 1.所示。荧光定量 PCR 使用 CFX96 Real-TimeSystem C1000 Thermal Cycler (Bio-RAD， USA)，使用宝生物工程(大连)有限公司SYBRGreen PCR MasterMix试剂盒。荧光 定量反应体系为20 yL:含有SYBR Mix 10 μ L，正反向引物TTCATCCGGGAGAGCGGCGA， GCGAAACCGAAGCCGGGTGAdO μ moL/L)各0. 8 μ L，模板2 μ L和焦碳酸二乙酯处理过的无菌 水。扩增条件为94°C预变性2min ；94°C IOs, 60°C 30s, 72°C 15s，38个循环。每组实验3 个生物学重复，2次技术重复。结果表明，实时定量PCR与芯片结果相符合(图1)。表1 zm-bRLZ基因组序列扩增引物
权利要求
一个分离克隆的控制玉米耐渍性的转录因子基因zm bRLZ，它的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO1所示。
2.权利要求1所述的基因，它的cDNA序列如序列表SEQID NO :2所示。
3.一种控制玉米耐渍性的转录因子基因zm-bRLZ的CAPS标记，其PCR引物组合为 bRLZ-7 CAACTCAAATAGCTGGTGGC, bRLZ-8 CCCGGTCAACCCTTGTTTTGTATG, PCR 产物酶切所用 的限制性核酸内切酶为Msp I。
4.权利要求1或2所述的基因在玉米遗传改良中的应用。
5.权利要求3所述的标记在玉米分子标记辅助育种中的应用。
全文摘要
本发明属于植物基因工程技术领域。涉及一种玉米耐渍性相关的转录因子基因zm-bRLZ的克隆及应用，该基因的核苷酸序列如SEQ ID No1所示，全长4027bp，含6个外显子。其cDNA序列如SEQ ID NO2所示，编码282个氨基酸。在淹水胁迫下，该基因在玉米自交系Hz32幼苗根系中上调表达，在Mo17中其表达水平不变。基因蛋白质产物与ADH启动子厌氧响应因子体外结合，表明zm-bRLZ基因对厌氧诱导基因具有调控作用。利用玉米耐渍性自交系Hz32和高度敏感系K12中zm-bRLZ基因序列差异，开发了一对CAPS标记。利用K12×Hz32 F2群体，将该基因定位于9.04bin耐渍性QTL峰值处。候选基因关联分析证实，zm-bRLZ基因启动子区域及3′-UTR区的多个SNP位点与多个耐渍性指标均极显著关联。
文档编号C12N15/11GK101974537SQ201010284678
公开日2011年2月16日 申请日期2010年9月13日 优先权日2010年9月13日
发明者姜媛媛, 张祖新, 邱法展, 邹锡玲, 郑用琏 申请人:华中农业大学