专利名称：可用于分离建鲤、黄河鲤和建鲤正交群体的试剂盒的制作方法
技术领域：
本发明涉及鱼类育种领域，尤其涉及一种可用于分离建鲤、黄河鲤和建鲤正交群体的试剂盒，是一种用于鱼混杂群体分离的技术。
背景技术：
在鲤生产中种质混杂现象比较严重，混杂种质的有效利用率更低。因此，从混杂的 种质中鉴别、分离种质成为解决种质混杂问题的一个重要且必须的途径。因而，简单、便捷 的可用于解决混杂种质分离的试剂盒的开发显得很重要。因此，开发一种可用于分离建鲤、 黄河鲤和建鲤正交群体的试剂盒是解决育种和生产实践中造成种质混杂现象的有效方法。
发明内容
本发明的目的是针对建鲤、黄河鲤和建鲤正交群体的分离种质问题，提供一种简 单、便捷、可靠的用于分离建鲤、黄河鲤和建鲤正交群体的试剂盒，以克服现有技术的不足。本发明的目的通过以下技术方案来实现
一种可用于分离建鲤、黄河鲤和建鲤正交群体的试剂盒，所述试剂盒的PCR (聚合酶链 式反应)反应体系由分离包装的IOX扩增缓冲液lml、25mmol/L的Mg2+lml、各2mmol/L的 dNTP 混合物 800ul、IOmmo 1/L 的上游引物 5，一>3，GTGCCTCTTATTGCTTTCTACC 和 IOmmol/ L 的下游引物 5，—>3，GAAACATCTCGCTCGGACTT 各 60ul、5U/ul 的 TaqDNA 聚合酶 30ul、 CldH2Olml、100ng/ul的模板野生型DNA和lOOng/ul的模板突变型DNA各15ul组成，所述试 剂盒还包括试剂盒使用说明书、野生型序列图和突变型序列图。本发明所述的试剂盒采用的分离方法包括
1)获取建鲤、黄河鲤和建鲤正交Fl代群体的血液，并提取血液中的DNA样本；
2)将步骤1)中提取的DNA样本通过本发明所述的试剂盒进行PCR(聚合酶链式反应) 反应，获得的PCR产物用质量浓度为8%的非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳并结合goldview显 色进行检测，然后回收该PCR产物，送往测序公司进行核苷酸序列检测；
3)将步骤2)得到的核苷酸序列检测结果与本发明所述的试剂盒中提供的序列图进行 对照，根据给定的对照(野生型碱基C，突变型为CA)，鉴别并分离出突变型或野生型的种质 资源。本发明的有益效果在于能够方便、快捷的从建鲤、黄河鲤和建鲤正交混合群体中 分离出建鲤，且概念为67. 6%，分离出黄河鲤和建鲤正交Fl代的概率为100%。由于黄河鲤 和建鲤正交Fl代的自交后代可遗传突变型标记，故可用于这种混杂群体的种质分离，且突 变型为自交后代的概率也为100%。
具体实施例方式本发明实施例所述的一种可用于分离建鲤、黄河鲤和建鲤正交群体的试剂盒， 其中，试剂盒的PCR (聚合酶链式反应)反应体系由分离包装的IOX扩增缓冲液1ml、25mmol/L 的 Mg2+Iml、各 2mmol/L 的 dNTP 混合物 800ul、IOmmo 1/L 的上游引物 5，一>3， GTGCCTCTTATTGCTTTCTACC 和 10mmol/L 的下游引物 5，一>3，GAAACATCTCGCTCGGACTT 各 60ul、5U/ul 的 TaqDNA 聚合酶 30ul、ddH201ml、100ng/ul 的模板野生型 DNA 和 100ng/ul 的 模板突变型DNA各15ul组成，所述试剂盒还包括试剂盒使用说明书、野生型序列图和突变 型序列图。本发明实施例所述的试剂盒采用的分离方法包括 1)获取建鲤、黄河鲤和建鲤正交Fl代群体的血液，并提取血液中的DNA样本；
2)将步骤1)中提取的DNA样本通过本发明所述的试剂盒进行PCR(聚合酶链式反应) 反应，获得的PCR产物用质量浓度为8%的非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳并结合goldview显 色进行检测，然后回收该PCR产物，送往测序公司进行核苷酸序列检测；
3)将步骤2)得到的核苷酸序列检测结果与本发明所述的试剂盒中提供的序列图进行 对照，根据给定的对照(野生型碱基C，突变型为CA)，鉴别并分离出突变型或野生型的种质 资源。其中，步骤2)中PCR (聚合酶链式反应)反应步骤为94°C预变性3min ；94°C变性 20s ；56°C退火温度20s ；72°C延伸30s ；33个循环；72°C再延伸IOmin。本发明根据已获取的能够从建鲤、黄河鲤和建鲤的正交Fl代混合群体中进行种 质鉴别的遗传标记，结合遗传标记的检测过程进行系统集成，做成试剂盒。可将待检测个体 提取血液DNA，并进行质量检测，质量检测后，即可通过试剂盒获取目的序列，并与试剂盒中 提供的序列图进行序列比对，确定突变型和野生型，从而达到方便、快捷分离种质资源的目 的。本发明能够方便、快捷的从建鲤、黄河鲤和建鲤正交混合群体中分离出建鲤，且概念为 67. 6%，分离出黄河鲤和建鲤正交Fl代的概率为100%。由于黄河鲤和建鲤正交Fl代的自交 后代可遗传突变型标记，故可用于这种混杂群体的种质分离，且突变型为自交后代的概率 也为100%。
权利要求
一种可用于分离建鲤、黄河鲤和建鲤正交群体的试剂盒，其特征在于所述试剂盒的PCR反应体系由分离包装的10×扩增缓冲液1ml、25mmol/L的Mg2+1ml、各2mmol/L的dNTP混合物800ul、10mmol/L的上游引物5’ >3’ GTGCCTCTTATTGCTTTCTACC和10mmol/L的下游引物5’ >3’ GAAACATCTCGCTCGGACTT各60ul、5U/ul的TaqDNA聚合酶30ul、ddH2O1ml、100ng/ul的模板野生型DNA和100ng/ul的模板突变型DNA各15ul组成。
全文摘要
本发明涉及一种可用于分离建鲤、黄河鲤和建鲤正交群体的试剂盒，其中，试剂盒的PCR(聚合酶链式反应)反应体系由分离包装的10×扩增缓冲液1ml、25mmol/L的Mg2+1ml、各2mmol/L的dNTP混合物800ul、10mmol/L的上游引物5’-->3’GTGCCTCTTATTGCTTTCTACC和10mmol/L的下游引物5’-->3’GAAACATCTCGCTCGGACTT各60ul、5U/ul的TaqDNA聚合酶30ul、ddH2O1ml、100ng/ul的模板野生型DNA和100ng/ul的模板突变型DNA各15ul组成，试剂盒还包括试剂盒使用说明书、野生型序列图和突变型序列图。本发明的有益效果为能够方便、快捷的从建鲤、黄河鲤和建鲤正交混合群体中分离出建鲤，且概念为67.6%，分离出黄河鲤和建鲤正交F1代的概率为100%。
文档编号C12Q1/68GK101974648SQ20101056247
公开日2011年2月16日 申请日期2010年11月29日 优先权日2010年11月29日
发明者苏胜彦, 董在杰, 袁新华 申请人:中国水产科学研究院淡水渔业研究中心