建鲤管家基因18sRNA基因部分序列克隆方法及其real time PCR方法
【专利摘要】本发明公开了一种建鲤管家基因18sRNA基因部分序列克隆方法及其real?time?PCR方法，通过对建鲤血液基因组DNA提取，设计引物、PCR扩增，产物纯化，转入T载体，转化入感受态细胞，筛选蓝白斑，质粒测序，设计的引物序列正向序列如SEQIDNO.1所示，反向序列如SEQIDNO.2所示；克隆得到的建鲤18sRNA基因部分序列为SEQIDNO.3所示；然后设计实时定量PCR（real?time?PCR）特异引物，优化扩增反应条件，从而提高扩增效率。本发明可为18sRNA作为管家基因，在利用real?time?PCR对建鲤功能基因的研究中提供有用的方法。
【专利说明】建鲤管家基因18sRNA基因部分序列克隆方法及其real
t i me PCR 方法
[0001]
【技术领域】
[0002]本发明属于分子生物学【技术领域】，尤其涉及一种建鲤管家基因ISsRNA基因部分序列克隆方法及其real time PCR方法。
[0003]
【背景技术】
[0004]在实时定量PCR (real time PCR)中，目标基因的相对表达量是通过管家基因表达量的均一化来确定。理想的管家基因应该是它的表达量不受实验条件影响，而且在各个组织中表达量恒定。大量的研究表明，目前还没有哪个管家基因符合这一条件，最好的管家基因就是其表达量在自己所研究的样品中变化量最小。18S rRNA为核糖体rRNA，由45S rRNA加工而成，经核孔入胞质形成小亚基，参与蛋白质的合成。该基因在所有组织中都高水平表达，在同种细胞或者组织中的表达量一般是恒定的，故被广泛用作real time PCR中的管家基因。
[0005]在用Trizol提取的RNA样品中，不可避免的会有少量的DNA残留，通过DNAse酶处理去除DNA,反转录后,real time PCR扩增的模板仅为cDNA。另外再设计特异的引物,优化反应条件，达到理想的扩增效率，为后续的建鲤功能基因研究提供参考。
[0006]建鲤(Cyprinuscarpio var.jian)是本中心培育出的遗传性状稳定的鲤鱼新品种，具有生长快、体型佳、肉质好等优良的经济性状，已遍及我国27个省。但是目前还没有针对建鲤通过研究18sRNA作为管家基因，并利用real time PCR对建鲤功能基因进行研究。
[0007]
【发明内容】
[0008]发明目的:本发明目的之一在于克隆出建鲤ISsRNA基因的部分序列；本发明目的之二在于基于获得的序列，设计一对特异的real time PCR引物,建立基于SYBR Green I染料技术的建鲤18sRNAreal time PCR方法，从而为18sRNA作为管家基因，在利用real timePCR对建鲤功能基因的研究中提供有用的方法。
[0009]技术方案:
本发明是通过以下技术手段实现的:
一种建鲤ISsRNA基因的部分序列的克隆方法，按照以下步骤进行:建鲤血液基因组DNA提取，设计引物、PCR扩增，产物纯化，转入T载体，转化入感受态细胞，筛选蓝白斑，质粒测序，其中所设计的引物序列如下，其中正向序列如SEQ ID N0.1所示，反向序列如SEQ IDN0.2所示；克隆得到的建鲤18sRNA基因部分序列为SEQ ID N0.3所示。
[0010]所述的建鲤18sRNA基因的部分序列的克隆方法，PCR扩增的反应条件为:95°C3min ；30循环，每个循环的条件可以为94°C、15s，58°C、20s，72°C、30s，循环完以后72°C延长6min ;4°C度保存。
[0011]—种real time PCR扩增以上所述建鲤18sRNA基因部分序列的方法,按以下步骤实现:抽提总RNA，反转录，然后以反转录产物为模板进行real time PCR，荧光染料为SYBRGreen I，其中real time PCR中的建鲤特异引物序列中正向序列如SEQ ID N0.4所示,反向序列如SEQ ID N0.5所示。
[0012]以上所述的real time PCR扩增所述建鲤18sRNA基因部分序列的方法，其中所述real time PCR扩增的反应条件可以为:94°C 3min, 40个循环每个循环条件为94°C、5s,62°C、20s，最后 72°C 3min，4°C保存。
[0013]有益效果
本发明通过克隆建鲤18sRNA的部分序列,然后设计特异的real time PCR引物,优化扩增反应条件，提高了扩增效率。这样，可为18sRNA作为管家基因，在利用real time PCR对建鲤功能基因的研究中提供有用的方法。
[0014]
【专利附图】
【附图说明】
[0015]图1为实施例1目的基因鉴定电泳图，其中M为marker，I为目的条带。
[0016]图2为18sRNA溶解曲线图；
图3为18sRNA标准曲线图。
[0017]【具体实施方式】:
实施例1建鲤18SRNA基因的部分序列的扩增
建鲤来自中国水产科学研究院淡水渔业研究中心宜兴养殖基地，根据GenBank上公布的斑马鱼18sRNA基因的DNA序列设计一对引物，引物序列见表1。
[0018]表1扩增建鲤18sRNA的引物
【权利要求】
1.一种建鲤18SRNA基因的部分序列的克隆方法，按照以下步骤进行:建鲤血液基因组DNA提取，设计引物、PCR扩增，产物纯化，转入T载体，转化入感受态细胞，筛选蓝白斑，质粒测序，其特征在于，所设计的引物序列如下，其中正向序列如SEQ ID N0.1所示，反向序列如SEQ ID N0.2所示；克隆得到的建鲤18sRNA基因部分序列为SEQ ID N0.3所示。
2.根据权利要求1所述的建鲤ISsRNA基因的部分序列的克隆方法，其特征在于，所述PCR扩增的反应条件为:95°C 3min ;30循环，每个循环的条件为94°C、15s，58°C、20s，72°C、30s，循环完以后72°C延长6min ;4°C度保存。
3.一种real time PCR扩增权利要求1中所述建鲤18sRNA基因部分序列的方法，其特征在于，按以下步骤实现:抽提总RNA，反转录，然后以反转录产物为模板进行real timePCR，荧光染料为SYBR Green I，其中real time PCR中的建鲤特异引物序列中正向序列如SEQ ID N0.4所示，反向序列如SEQ ID N0.5所示。
4.根据权利要求3中所述的realtime PCR扩增权利要求1中所述建鲤18sRNA基因部分序列的方法，其特征在于，所述real time PCR扩增的反应条件为:94°C 3min,40个循环每个循环条件为94°C、5s，62°C、20s，最后72°C 3min，4°C保存。
【文档编号】C12N15/10GK103993006SQ201410221021
【公开日】2014年8月20日 申请日期:2014年5月23日 优先权日:2014年5月23日
【发明者】唐永凯, 李红霞, 李建林, 俞菊华 申请人:中国水产科学研究院淡水渔业研究中心