蝎活性多肽及其制备方法与应用的制作方法

专利名称：蝎活性多肽及其制备方法与应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及生物技术领域，具体的说是涉及蝎活性多肽及其制备方法与应用。
背景技术：
自身免疫性疾病(autoimmune disease)是机体对自身抗原发生免疫反应而导致 自身组织损害所引起的疾病，即人体免疫系统攻击自身的组织。全球约有5 8%的人口 受到约40多种自身免疫性疾病的威胁，包括T细胞介导的类风湿性关节炎、多发性硬化症、 系统性红斑狼疮、白塞病、自身免疫性甲状腺病和I型糖尿病等。在类风湿性关节炎中免疫 系统攻击病患的关节部位，多发性硬化症是神经细胞的神精髓鞘(myelin sheaths)受到攻 击。这些疾病涉及全身一种或多种组织和器官，严重影响人体健康及生命。针对自身免疫 性疾病，目前无有效疗法，且病情反复发作。目前常用对抗自体免疫性疾病的方法，一是利 用类固醇来减缓因免疫系统攻击组织所造成的炎症反应，二是使用免疫抑制药物，抑制免 疫系统的作用，但这两种方法都会造成严重的副作用，而且都只能减缓病情的发展速度，不 能根治疾病。为了改变自身免疫性疾病药物治疗的落后现状，急需探索新的疾病预防和治 疗方法。原态(naive ) T细胞被特异性的抗原物质激活后，进行增殖和分化，一般形成在 功能上 各异的两类细胞，即效应型记忆T细胞(effector memory, TEM)和中央型记忆T细 胞(central memory，TCM)。在人体T细胞膜上存在两种钾通道，一种是电压门控钾通道 Kvl. 3，另一种是中等电导钙激活钾通道IKCal。近年来，研究发现钾通道Kvl. 3在不同类型 T细胞上具有显著的时空表达差异性，当T细胞被激活后，只有发挥免疫功能的TEM细胞可 显著地表达1500 2000个Kvl. 3钾通道。这种钾通道Kvl. 3高表达情况相继在患不同自 身免疫性疾病的病人的TEM细胞中得到证实。因此，T细胞膜上钾通道Kvl. 3给治疗自身 免疫性疾病带来新的希望[J. Clin. Invest.，2003，111 1703 ；Immunity, 2008, 29 :602]。有机小分子药物首先受到更多的关注。如Merck公司、澳大利亚Walter andEliza Hall药物研发中心、美国加利福尼亚大学等机构筛选、分离、合成、改造和鉴定了大量的有 机小分子药物候选物[Mol. Pharmacol，2004，65 1364 Journal of Medicinal Chemistry, 2006,49 (4) 1433 ；Mol. Pharmacol, 2005,68 :1254]。但有机小分子候选药物几乎均作用钾 通道Kvl. 3和其它相似钾通道，因而极可能造成作用较强的毒副反应，如有机小分子药物 作用同源Kvl. UKvl. 2,Kvl. 4,Kvl. 5等活性比Kvl. 3通道低2 70倍。由于筛选设计有 机小分子候选药物具有巨大的挑战性，筛选设计多肽将成为新的趋势。中国传统医药常用“以毒攻毒”的策略治疗人类的疑难杂症，有毒动物，如蝎、蛇、 蜘蛛、蟾蜍、蜈蚣等是首选。现代研究已表明这些有毒动物的毒液中富含动物活性多肽，这 些多肽可特异性作用细胞膜上离子通道。当今，这些动物活性多肽已成为全球竞争研发的 重要药物资源[Nat. Rev. Drug. Discov. 20032 63]。

发明内容
本发明目的是提供稳定的治疗自身免疫性疾病的蝎活性多肽。为实现本发明的目的，本发明采用如下技术方案本发明通过筛选我国蝎活性多肽基因库，得到了许多具有重要药用前景的多肽基因，通过已建立的计算机辅助筛选与设计技术[Biophysical Journal, 2004,87 105 ； Proteins, 2008, 70 744 Journal of Proteome Research, 2010，9 :3118]，虚拟蹄选到 3 个 可能特异性作用钾通道Kvl. 3的蝎活性肽新基因。通过基因工程技术，获得了三种蝎活性 多肽，这三种蝎活性多肽分子内均含有3对二硫键，在体外稳定性强，易于长期保存。根据 蝎活性多肽在分类学上的结构特征，三者属于同一亚型的α-KTX家族，且都作用于钾通道 Kvl. 3。在一个实施方案中，本发明提供了具有如SEQ ID NO 1所示氨基酸序列的蝎活性 肽,命名为ADMR-011。在一个实施方案中，本发明提供了具有如SEQ ID NO 2所示氨基酸序列的蝎活性 多肽,命名为ADMR-016。在另一个实施方案中，本发明提供了具有如SEQ ID NO :3所示氨基酸序列的蝎活 性多肽，命名为ADMR-019。本发明还提供了具有通过在SEQ ID NO :1、SEQ ID NO :2或SEQ ID NO 3所示的 氨基酸序列中取代、缺失或添加一个或多个氨基酸残基所得到的氨基酸序列的多肽。本发明也提供了编码本发明所述蝎活性多肽ADMR-011、ADMR-016和ADMR-019的 DNA分子。由于密码子的简并性，可以存在很多种能够编码本发明所述的特定多肽的核苷酸 序列。在一个实施方案中，本发明提供了可以编码具有SEQ ID NO 1所示氨基酸序列的 蝎活性多肽ADMR-011的DNA分子，其核苷酸序列如SEQ ID NO 4所示。在一个实施方案中，本发明提供了可以编码具有SEQ ID NO :2所示氨基酸序列的 蝎活性多肽ADMR-016的DNA分子，其核苷酸序列如SEQ ID NO 5所示。在另一个实施方案中，本发明提供了可以编码具有SEQ ID NO :3所示氨基酸序列 的蝎活性多肽ADMR-019的DNA分子，其核苷酸序列如SEQ IDNO 6所示。同时本发明提供了具有编码本发明所述蝎活性多肽ADMR-011、ADMR-016和 ADMR-019DNA分子的载体。在一个实施方案中，本发明提供了一种载体，其具有可以编码本发明所述蝎活性 多肽ADMR-011的DNA分子。其中，作为优选，所述载体为具有可以编码所述蝎活性多肽 ADMR-011的DNA分子的pGEX_6p-l。更优选地是，所述载体为具有如SEQ ID NO 4所示核 苷酸序列的pGEX-6p-l。在一个实施方案中，本发明提供了一种载体，其具有可以编码本发明所述蝎活性 多肽ADMR-016的DNA分子。其中，作为优选，所述载体为具有可以编码所述蝎活性多肽 ADMR-016的DNA分子的pGEX-6p-l。更优选地是，所述载体为具有如SEQ ID NO :5所示核 苷酸序列的pGEX-6p-l。在另一个实施方案中，本发明提供了一种载体，其具有可以编码本发明所述蝎活 性多肽ADMR-019的DNA分子。其中，作为优选，所述载体为具有可以编码所述蝎活性多肽ADMR-Oll的DNA分子的pGEX_6p-l。更优选地是，所述载体为具有如SEQ ID NO 6所示核 苷酸序列的pGEX-6p-l。本发明也提供了所述蝎活性多肽ADMR-011、ADMR-016和ADMR-019的制备方法，包 括

步骤1 获取具有可以编码SEQ ID NO =USEQ ID NO 2或SEQ ID NO 3所示的氨 基酸序列的DNA分子；步骤2 将步骤1所获得的DNA分子与表达载体融合，构建重组表达载体，并转化 宿主细胞；步骤3 诱导含重组表达载体的宿主细胞表达融合蛋白，分离纯化表达的融合蛋 白。目前利用基因工程技术获得DNA分子的方法有很多种，包括利用限制性内切酶酶 切具有编码所述蝎活性多肽DNA分子的载体或以具有编码所述蝎活性多肽的DNA分子的 cDNA为模板PCR扩增。在一个实施方案中，本发明所述蝎活性多肽ADMR-Oll的制备方法所述步骤1具体 为以具有编码SEQ ID NO :1所示氨基酸序列的cDNA为模板，用具有SEQ ID NO :7所示核苷 酸序列的上游引物和具有SEQ ID NO :8所示核苷酸序列的下游引物扩增。在一个实施方案中，本发明所述蝎活性多肽ADMR-016的制备方法所述步骤1具体 为以具有编码SEQ ID NO :2所示氨基酸序列的cDNA为模板，用具有SEQ ID NO :9所示核苷 酸序列的上游引物和具有SEQ ID NO :10所示核苷酸序列的下游引物扩增。在另一个实施方案中，本发明所述蝎活性多肽ADMR-019的制备方法所述步骤1具 体为以具有编码SEQ ID NO :3所示氨基酸序列的cDNA为模板，用具有SEQ ID N0:11所示 核苷酸序列的上游引物和具有SEQ ID NO :12所示核苷酸序列的下游引物扩增。本发明所述制备方法步骤2所述表达载体包括pGEX系列、pET系列、pQ E系列和 PMAL系列。在一个优选实施方案中，表达载体为pGEX系列中的pGEX-6p-l。本发明所述制备方法步骤2所述宿主细胞为大肠杆菌表达菌株，包括Rosetta系 列和BL21系列菌株。在一个优选实施方案中，宿主细胞为Rosetta(DE3)菌株。 实验表明，本发明所述蝎活性多肽ADMR-Ol 1 ,ADMR-016和ADMR-019可特异性作用 于钾通道Kvl. 3，并可在大鼠动物水平有效地治疗多发性硬化症和类风湿性关节炎等自身 免疫性疾病。因此本发明还提供了所述蝎活性多肽在制备治疗或预防钾通道Kvl. 3相关疾 病药物中的应用，所述钾通道Kvl. 3相关疾病包括自身免疫性疾病，具体为多发性硬化症 或类风湿性关节炎。


图1示重组蝎活性多肽ADMR-Oll及其GST融合表达蛋白的电泳检测图，其中，泳 道1为蛋白质分子量Marker ；2泳道为ADMR-Oll未经IPTG诱导的全细胞蛋白；泳道3为 ADMR-011经IPTG诱导的全细胞蛋白；泳道4为亲和层析后的融合蛋白GST-ADMR-011 ；泳道 5为超滤脱盐浓缩后的融合蛋白GST-ADMR-011 ；泳道6为融合蛋白GST-ADMR-011经EK酶 切后的产物；泳道7为经HPLC分离纯化的ADMR-Oll多肽；图2示重组蝎活性多肽ADMR-016及其GST融合表达蛋白的电泳检测图，其中，泳道1为ADMR-016未经IPTG诱导的全细胞蛋白；泳道2为ADMR-016经IPTG诱导的全细胞蛋 白；泳道3为超滤脱盐浓缩后的融合蛋白GST-ADMR-016 ；泳道4为融合蛋白GST-A DMR-016 经EK酶切后的产物；泳道5为经HPLC分离纯化的ADMR-016多肽；图3示重组蝎活性多肽ADMR-019及其GST融合表达蛋白的电泳检测图，其中， 泳道1为超滤脱盐浓缩后的融合蛋白GST-ADMR-019 ；泳道2为融合蛋白GST-ADMR-019经 EK酶切后的产物；泳道3为经HPLC分离纯化的ADMR-019多肽，泳道4为蛋白质分子量 Marker ；图4示重组蝎活性多肽ADMR-Oll与GST蛋白质的色谱分离纯化图；图5示重组蝎活性多肽ADMR-016与GST蛋白质的色谱分离纯化图；图6示重组蝎活性多肽ADMR-019与GST蛋白质的色谱分离纯化图；图7示重组蝎活性多肽ADMR-Ol 1质谱分析图；图8示重组蝎活性多肽ADMR-016质谱分析图；图9示重组蝎活性多肽ADMR-019质谱分析图；图10示IOOpM蝎活性多肽ADMR-Oll对钾通道Kvl. 3电流的抑制示意图；图11示InM蝎活性多肽ADMR-016对钾通道Kvl. 3电流的抑制示意图；图12示 InM蝎活性多肽ADMR-019对钾通道Kvl. 3电流的抑制示意图。
具体实施例方式本发明实施例公开了蝎活性多肽及其制备方法与应用。本领域技术人员可以借鉴 本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技 术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的产品、方法和应用已经通 过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文所 述的产品、方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。依照本发明，通过筛选我国蝎活性多肽基因库，利用基因工程技术，获得了三种新 型蝎活性多肽，分子内均具有3对二硫键，在体外稳定性强，易于长期保存。在一个实施方 案中，本发明提供了具有如SEQ ID N0:1所示氨基酸序列的蝎活性多肽命名为ADMR-011。 在一个实施方案中，本发明提供了具有如SEQ ID NO :2所示氨基酸序列的蝎活性多肽命名 为ADMR-016。在另一个实施方案中，本发明提供了具有如SEQ ID NO :3所示氨基酸序列的 蝎活性多肽命名为ADMR-019。本发明还提供了具有通过在SEQ ID NO :1、SEQ ID NO :2或SEQ ID NO 3所示的 氨基酸序列中取代、缺失或添加一个或多个氨基酸残基所得到的氨基酸序列的多肽。本发明也提供了编码本发明所述蝎活性多肽ADMR-011、ADMR-016和ADMR-019的 DNA分子。由于密码子的简并性，可以存在很多种能够编码本发明所述的特定多肽的核苷酸 序列。在一个实施方案中，本发明提供了可以编码蝎活性多肽ADMR-Oll的DNA分子，其 核苷酸序列如SEQ ID NO 4所示。在一个实施方案中，本发明提供了可以编码蝎活性多肽ADMR-016的DNA分子，其 核苷酸序列如SEQ ID NO 5所示。在另一个实施方案中，本发明提供了可以编码蝎活性多肽ADMR-019的DNA分子，其核苷酸序列如SEQ ID NO 6所示。同时本发明提供了具有编码本发明所述蝎活性多肽ADMR-011、ADMR-016和 ADMR-019DNA分子的载体。在一个实施方案中，本发明提供了一种载体，其具有可以编码本发明所述蝎活性 多肽ADMR-Oll的DNA分子。其中，在一个实施方案中，所述载体为具有可以编码所述蝎活 性多肽ADMR-Oll的DNA分子的pGEX_6p-l。更优选地是，所述载体为具有如SEQ ID NO 4 所示的核苷酸序列的pGEX-6p-l。在一个实施方案中，本发明提供了 一种载体，其具有可以编码本发明所述蝎活性 多肽ADMR-016的DNA分子。其中，在一个实施方案中，所述载体为具有可以编码所述蝎活 性多肽ADMR-016的DNA分子的pGEX_6p-l。更优选地是，所述载体为具有如SEQ ID NO 5 所示的核苷酸序列的pGEX-6p-l。在一个实施方案中，本发明提供了一种载体，其具有可以编码本发明所述蝎活性 多肽ADMR-019的DNA分子。其中，在一个实施方案中，所述载体为具有可以编码所述蝎活 性多肽ADMR-Oll的DNA分子的pGEX_6p-l。更优选地是，所述载体为具有如SEQ ID NO 6 所示的核苷酸序列的pGEX-6p-l。为了制备本发明所述蝎活性多肽，本发明也提供了所述蝎活性多肽的制备方法， 包括步骤1 获取具有编码所述蝎活性多肽ADMR-Ol 1 ,ADMR-016或ADMR-019的DNA分 子；步骤2 将步骤1所获得的DNA分子与表达载体融合，构建重组表达载体，并转化 宿主细胞；步骤3 诱导含重组表达载体的宿主细胞表达融合蛋白，分离纯化表达的融合蛋 白。目前利用基因工程技术获得DNA分子的方法有很多种，包括利用限制性内切酶酶 切具有编码所述蝎活性多肽DNA分子的载体或以具有编码所述蝎活性多肽DNA分子的 cDNA为模板PCR扩增。在一个实施方案中，本发明提供了以具有编码所述蝎活性多肽ADMR-011的cDNA 为模板，用具有SEQ ID NO :7所示的核苷酸序列的上游引物和具有SEQ ID NO :8所示的核 苷酸序列的下游引物扩增，获取具有编码所述蝎活性多肽ADMR-011DNA。在一个实施方案中，本发明提供了以具有编码权利所述蝎活性多肽ADMR-016的 cDNA为模板，用具有SEQ ID NO :9所示的核苷酸序列的上游引物和具有SEQ ID N0:10所 示的核苷酸序列的下游引物扩增，获取具有编码所述蝎活性多肽ADMR-016DNA分子。在另一个实施方案中，本发明提供了以具有编码所述蝎活性多肽ADMR-019的 cDNA为模板，用具有SEQ ID NO :11所示的核苷酸序列的上游引物和具有SEQ ID N0:12所 示的核苷酸序列的下游引物扩增，获取具有编码所述蝎活性多肽ADMR-019DNA分子。本发明所述制备方法步骤2所述将步骤1所获得的DNA分子与表达载体融合，构 建重组表达载体，并转化宿主细胞具体为步骤1所得DNA分子通过凝胶电泳回收和双酶切 插入表达载体，构建重组表达质粒，转化大肠杆菌。其中，本发明所述表达载体包括pGEX系列、pET系列、pQ E系列和pMAL系列。在一个优选实施方案中，表达载体为PGEX系列中的pGEX-6p-l。本发明所述转化宿主细胞为大肠杆菌表达菌株，包括Rosetta系列和BL21系列菌 株。在一个优选实施方案中，宿主细胞为Rosetta(DE3)菌株。真核细胞偏爱的密码子和原 核系统有不同，因此，在用原核系统表达真核基因的时候，真核基因中的一些密码子对于原 核细胞来说可能是稀有密码子，从而导致表达效率和表达水平很低。Rosetta (DE3)是携带 PRARE2质粒的BL21衍生菌，可以补充大肠杆菌缺乏的七种稀有密码子(AUA，AGG，AGA，CUA， CCC, GGA及CGG)对应的tRNA，提高外源基因尤其是真核基因在原核系统中的表达水平。 本发明所述制备方法所述步骤3具体为IPTG诱导培养含重组表达载体的宿主 细胞，收集菌体超声波破碎，取上清亲和层析得到融合蛋白，再经脱盐浓缩、小肠激酶酶 切和色谱分离，获取色谱纯的蝎活性多肽。其中，所述亲和层析的层析介质为根据表达 载体的选择性标签选择的与之相匹配的层析介质。在一个优选实施方案中，表达载体为 pGEX-6p-l，亲和层析的层析介质为GST亲和层析胶。在具体实施方案中，本发明所述制备方法具体为以具有编码所述蝎活性多肽 ADMR-Ol 1 ,ADMR-016或ADMR-019的DNA分子的cDNA为模板，用根据编码成熟肽部分的核苷 酸序列设计的引物，获取具有编码所述蝎活性多肽ADMR-011、ADMR-016或ADMR-019的DNA 分子，凝胶电泳回收和双酶切获取的DNA分子及表达载体pGEX-6p-l，连接构建重组表达质 粒，转化大肠杆菌Rosetta (DE3)获得重组菌。然后IPTG诱导培养含重组表达载体的宿主 细胞，收集菌体超声波破碎，取上清GST亲和层析得到融合蛋白，再经脱盐浓缩、小肠激酶 酶切和色谱分离，获取色谱纯的蝎活性多肽ADMR-Ol 1、ADMR-Ol6或ADMR-019。本发明通过膜片钳技术鉴定了所述蝎活性多肽ADMR-011、ADMR-016和ADMR-019 对钾通道Kv 1. 3的药理学活性。结果显示，所述蝎活性多肽ADMR-011、ADMR-016和ADMR-019 可特异性抑制钾通道Kvl.3电流，抑制电流半数的多肽浓度(IC50值)分别为91pM、 2. 58nM、l. 4InM，表明蝎活性多肽ADMR-011、ADMR-016和ADMR-019可特异性作用自身免疫 疾病的靶标钾通道Kvl.3。本发明通过在大鼠动物水平上模拟治疗多发性硬化症和类风湿性关节炎检测蝎 活性多肽ADMR-Ol 1 ,ADMR-016和ADMR-019药物治疗效果。结果显示，蝎活性多肽ADMR-Ol 1、 ADMR-016和ADMR-019治疗后，大鼠多发性硬化症和类风湿性关节炎的症状得到显著改善， 表明蝎活性多肽ADMR-011、ADMR-016和ADMR-019能有效地治疗多发性硬化症和类风湿性 关节炎。本发明通过对蝎活性多肽ADMR-011、ADMR-016和ADMR-019的毒性作用研究，发现 蝎活性多肽ADMR-011、ADMR-016和ADMR-019在超过自身免疫疾病动物模型治疗剂量100倍 的剂量下对小鼠无明显毒性，表明蝎活性多肽ADMR-Ol 1 ,ADMR-016和ADMR-019毒副作用小。因此本发明还提供了所述蝎活性多肽在制备治疗或预防钾通道Kvl. 3相关疾病 药物中的应用，所述钾通道Kvl. 3相关疾病包括自身免疫性疾病，具体为多发性硬化症或 类风湿性关节炎。本发明所述蝎活性多肽ADMR-011、ADMR-016和ADMR-019分子内均具有3对二硫 键，在体外稳定性好，易于长期保存。膜片钳技术鉴定显示可特异性作用钾通道Kvl. 3，特异 性强，是目前国际上已发现的活性强的多肽。动物实验表明，重组多肽ADMR-011、ADMR-016 和ADMR-019可以有效治疗大鼠的多发性硬化症和类风湿性关节炎，药物效果显著，并且对实验动物毒副作用小。本发明所述蝎活性多肽的制备方法简单易行，操作方便，易于生产和 制备高纯度的ADMR-Ol 1、ADMR-Ol6和ADMR-019蝎活性多肽。为了进一步理解本发明，下面结合实施例对本发明提供的蝎活性多肽及其制备方 法与应用进行详细说明。实施例1 蝎活性多肽ADMR-Ol 1、ADMR-Ol6和ADMR-019基因的获取取40只海南斑等蝎(Isometrus maculates)蝎尾腺，用Trizol试剂 (Invitrogen)提取总RNA，提取方法参照Trizol试剂盒说明书。用Poly A TractmRNA Isolation System(Promega)试剂盒纯化 mRNA,并米用 SuperscriptPlasmid System cDNA library construction kit (Gibco/BRL)试剂盒构建 cDNA 文库。将 cDNA 克隆到 pSPORTl 载 体中，并转化大肠杆菌DH5 α，随机挑选cDNA克隆进行测序。对测序的结果进行序列分析， 共获得可能与钾离子通道相互作用的236个蝎活性肽新基因。通过建立的计算机辅助筛 选与设计技术[Biophysical Journal, 2004,87 105 ；Proteins, 2008, 70 744 Journal of ProteomeResearch，2010，9 3118]，分别预测136个蝎活性肽基因编码多肽的空间结构， 然后通过计算机虚拟筛选它们与钾通道Kvl. 3的相互作用，获得了具有编码蝎活性多肽 ADMR-OlU ADMR-016和ADMR-019DNA分子的cDNA基因，所编码的成熟肽分别为具有如SEQ ID N0:1、SEQ ID NO :2 禾口 SEQ ID NO :3 所示氨基酸序列的蝎活性多肽 ADMR-Ol 1、ADMR_016 禾口 ADMR-019。 实施例2 扩增编码蝎活性多肽ADMR-Ol 1、ADMR-016和ADMR-019的DNA分子1、引物设计分别以蝎活性多肽ADMR-Ol 1、ADMR-016和ADMR-019的cDNA基因序列中编码成熟 肽部分的核苷酸序列作为PCR反应的模板序列设计引物。设计的引物为ADMR-Oll上游引物为SEQ ID NO 7所示的核苷酸序列；ADMR-011下游引物为SEQ ID NO 8所示的核苷酸序列；ADMR-016上游引物为SEQ ID NO 9所示的核苷酸序列；ADMR-016下游引物为SEQ ID NO 10所示的核苷酸序列；ADMR-019上游引物为SEQ ID NO 11所示的核苷酸序列；ADMR-019下游引物为SEQ ID NO 12所示的核苷酸序列；2、扩增DNA分子以蝎毒cDNA为模板，用具有SEQ ID NO :7所示的核苷酸序列的上游引物和具有 SEQ ID NO :8所示的核苷酸序列的下游引物进行PCR扩增。PCR扩增反应体系为IOXtaq buffer (with 1. 5mM Mg2+) 5μ 1dNTP (5mM)4 μ 1上游引物(100ng/ul)Ιμ 下游引物(100ng/ul)Ιμ 模板(5-50ng/y1)1 μ 1Taq 酶(2U/ μ 1)0. 5 μ 1加入灭菌蒸馏水补足体系总量50 μ 1。PCR反应程序为
94°C 预变性300 s
94°C 变性45s〕
55°C退火45s [32个循环
72°C延伸45s J72°C 延伸200s3、重组表达载体构建将PCR扩增产物凝胶电泳回收，用EcoRI和XhoI双酶切，将酶切后的片段插入经 EcoRI和XhoI双酶切的表达载体pGEX-6p-l (购自Pharmacia公司)，构建重组表达质粒， 转化大肠杆菌DH5ci (中国典型培养物保藏中心)。从含氨苄青霉素的LB平板中挑取单菌 落，在含氨苄青霉素的LB液体培养基中37°C培养5小时，然后用PCR扩增的方法对这些培 养物进行鉴定。PCR扩增模板用培养获得的菌液，扩增的引物、反应条件和反应过程同DNA 分子扩增过程。选取PCR鉴定正确的菌种进行测序，获得序列正确的含重组表达载体的菌 种，提取质粒，转化大肠杆菌Rosetta(DE3)(中国典型培养物保藏中心)。蝎活性多肽ADMR-016和ADMR-019的DNA分子扩增反应体系和反应程序以及重组 表达载体构建与ADMR-Oll相同。实施例3蝎活性多肽ADMR-Ol 1、ADMR-Ol6和ADMR-019的表达和纯化提取测序序列正确的含重组表达载体的pGEX-6p-l-ADMR_011菌种的质粒转化大 肠杆菌Rosetta (DE3)。IPTG (华美生物工程公司)诱导培养转化的大肠杆菌，收集菌体，悬 浮于缓冲液(50mM Tris-Cl, l.OmM EDTA,pH8. 0)中，超声波破碎菌体，离心收集上清。所得 上清通过GST亲和层析得到融合蛋白。收集得到的融合蛋白溶液脱盐浓缩、小肠激酶(EK) 酶切，获得蝎活性多肽ADMR-011。利用高效液相色谱对ADMR-011多肽进一步分离，去除GST 蛋白质，得到色谱纯ADMR-Oll多肽。ADMR-Oll多肽理论分子量为4258. 7Da，经质谱分析显 示它的分子量为4258. 8Da，与根据氨基酸序列推断的分子量一致。其中，对不同阶段得到的 ADMR-Oll多肽及其与GST融合蛋白进行了 PAGE电泳检测，结果见图1，高效液相色谱分离 纯化和质谱分析结果见图4和图7。ADMR-Oll多肽理论分子量为4258. 7Da，经质谱分析显 示它的分子量为4258. 8Da，与根据氨基酸序列推断的分子量一致。蝎活性多肽ADMR-016和ADMR-019的表达和纯化方法和步骤与ADMR-Oll多肽相 同，相关的多肽的分离纯化和质谱检测结果见图2、图3图5、图6、图8和图9。ADMR-016 和ADMR-019多肽理论分子量分别为3912. 6Da、3940. 6Da,经质谱分析，它们分子量分别为 3912. 9Da、3940. 7Da，与根据氨基酸序列推断的分子量一致。实施例4 蝎活性多肽ADMR-011,ADMR-016和ADMR-019对钾通道Kvl. 3的药理学 活性分析将C0S-7细胞在含10%的胎牛血清的DMEM培养基37°C、5% C02条件下培养，将钾 通道Kvl. 3重组质粒分别用Sofast 的转染试剂盒转染，转染细胞在0. 8mg/mL Geneticin 培养基上选择性培养。利用全细胞膜片钳用仪器(EPC-10双通道膜片钳放大器HEKA， Elektronik, Lambrecht, Germany)，对重组蝎活性多肽 ADMR-OlU ADMR-016 和 ADMR-019 的药理学活性进行测定和分析。实验参数的设置、数据的采集和刺激的施加均通过Pulse 软件(Elektronik，Lambrecht, Germany)来控制。仪器的滤波器设置为 IOkHz (Bessel)，电极阻抗为2-5ΜΩ，在电极与细胞膜之间形成高阻(1-5GQ)封接后，进行快电容自动补 偿(c-fast)，稍加负压破膜后，进行慢电容自动补偿(c-slow)，在_70mV的钳制电位下， 从-60mV起给予IOmV步幅递增、80ms步宽的去极化脉冲刺激至+50mV，观察电流情况，将多 肽 ADMR-011、ADMR-016 和 ADMR-019 通过 MPS-2(INBI0 Inc, Wuhan, China)灌注系统实现 精确灌注。将3种蝎活性多肽溶解后，经DAD给药系统(ALA)喷射给药，给药管尖端距记录 细胞ΙΟΟμπι左右，结果见图10、图11和图12。

由图10、图11和图12可知ADMR-Oll对钾通道Kvl. 3的药理学活性为91ρΜ， ADMR-016对钾通道Kvl. 3的药理学活性为2. 58nM，ADMR-019对钾通道Kvl. 3的药理学活 性为1.41nM，是目前国际上已发现的活性强的多肽。实施例5 蝎活性多肽ADMR-011、ADMR-016和ADMR-019治疗多发性硬化症的药效
实验实验动物选取近交系雌性Wistar大鼠(6_8周龄，体重150士 IOg)，豚鼠 (300-400g购自武汉大学实验动物中心)。主要试剂福氏完全佐剂(Gibcol/BRL)，卡介苗、百日咳疫苗(上海生物制品所)， 豚鼠 MBP (Sigma)。全脊髓勻浆-福氏完全佐剂混合乳剂(GPSCH-CFA)的配制将豚鼠处死后，迅速取 出脊髓，用超声破碎仪(Sonics & Materials Inc, America)制成50%的PBS勻浆，与等量 的福氏完全佐剂(卡介苗10mg/ml)混合，用注射器抽打至油包水乳剂。EAE的诱导Wistar大鼠EAE模型=Wistar大鼠双后腿足垫皮内注射 0.4mlGPSCH-CFA乳剂，或同时皮内注射约IX IOltl百日咳疫苗。每日称重，观察神经症状。 饲养2周即出现实验性自身免疫性脑脊髓炎。将实验性自身免疫性脑脊髓炎(EAE)大鼠随机分为分为五组正常对照组(阴性 对照组)、模型对照阴(模型鼠+生理盐水)、A给药组(模型鼠+ADMR-Oll多肽)、B给药组 (模型鼠+ADMR-016多肽)和C给药组(模型鼠+ADMR-019多肽)，每组10只。给药组将 多肽ADMR-Ol 1、ADMR-016和ADMR-019分别按100 μ g · kg-1剂量皮下注射，每天上午1次， 正常对照组和模型对照阴皮下注射等量生理盐水，连续给药。给药14天后，观察大鼠患实 验性自身免疫性脑脊髓炎状况，根据大鼠状况评分，记录每只动物最高临床评分，取它们的 均值为平均临床评分，结果见表1。评分标准为无任何临床症状，0分；尾部张力消失，可见轻度步态笨拙，1分；双 后肢无力，被动翻身后可以恢复，2分；双后肢瘫痪，被动翻身后不能恢复，3分；四肢瘫痪伴 尿、便失禁，4分；濒死状态或死亡，5分。表IEAE模型中各实验组大鼠的评分(
权利要求
1.作用于钾通道Kvl.3的α-KTX家族蝎活性多肽，其特征在于，具有如SEQ ID NO=U SEQ ID NO :2或SEQ ID NO 3所示的氨基酸序列。
2.具有通过在SEQID NO =USEQ ID NO :2或SEQ ID NO :3所示的氨基酸序列中取代、 缺失或添加一个或多个氨基酸残基所得到的氨基酸序列的多肽，其可特异性作用于钾通道 Kvl. 3。
3.编码权利要求1或2所述蝎活性多肽的DNA分子。
4.编码SEQID NO 1所示氨基酸序列的DNA分子，其特征在于，具有如SEQ ID NO 4 所示的核苷酸序列。
5.编码SEQID NO :2所示氨基酸序列的DNA分子，其特征在于，具有如SEQ ID NO 5 所示的核苷酸序列。
6.编码SEQID NO 3所示氨基酸序列的DNA分子，其特征在于，具有如SEQ ID NO 6 所示的核苷酸序列。
7.具有权利要求3所述DNA分子的载体。
8.根据权利要求7所述载体，其特征在于，所述载体为pGEX-6p-l。
9.根据权利要求8所述载体，其特征在于，所述载体具有如SEQID NO 4, SEQ ID NO 5或SEQ ID NO 6所示核苷酸序列。
10.权利要求1所述蝎活性多肽的制备方法，包括步骤1 获取具有可以编码SEQ ID NO =USEQ ID NO :2或SEQ ID NO 3所示的氨基酸 序列的DNA分子；步骤2 将步骤1所获得的DNA分子与表达载体融合，构建重组表达载体，并转化宿主 细胞；步骤3 诱导含重组表达载体的宿主细胞表达融合蛋白，分离纯化表达的融合蛋白。
11.根据权利要求10所述制备方法，其特征在于，所述步骤1具体为以具有编码SEQID NO :1所示氨基酸序列的cDNA为模板，用具有SEQ ID NO :7所示的核苷酸序列的上游引物 和具有SEQ ID NO :8所示的核苷酸序列的下游引物扩增。
12.根据权利要求10所述制备方法，其特征在于，所述步骤1具体为以具有编码SEQID NO :2所示氨基酸序列的cDNA为模板，用具有SEQ ID NO :9所示的核苷酸序列的上游引物 和具有SEQ ID NO :10所示的核苷酸序列的下游引物扩增。
13.根据权利要求10所述制备方法，其特征在于，所述步骤1具体为以具有编码SEQID NO 3所示氨基酸序列的cDNA为模板，用具有SEQ IDNO 11所示的核苷酸序列的上游引物 和具有SEQ ID NO :12所示的核苷酸序列的下游引物扩增。
14.根据权利要求10所述制备方法，其特征在于，步骤2所述表达载体为pGEX-6p-l。
15.根据权利要求10所述制备方法，其特征在于，步骤2所述宿主细胞为 Rosetta(DE3)菌株。
16.权利要求1所述蝎活性多肽在制备治疗或预防钾通道Kvl.3相关疾病药物中的应用。
17.根据权利要求16所述应用，其特征在于，所述钾通道Kvl.3相关疾病为自身免疫性疾病。
18.根据权利要求17所述应用，其特征在于，所述自身免疫性疾病为多发性硬化症或类风湿性关节炎。
全文摘要
本发明涉及生物技术领域，公开了三种蝎活性多肽及其制备方法与应用。本发明三种蝎活性多肽分别为具有如SEQ ID NO1所示氨基酸序列的ADMR-011、具有如SEQ ID NO5所示氨基酸序列的ADMR-016和具有如SEQID NO9所示氨基酸序列的ADMR-019。本发明所述制备方法为获取具有编码蝎活性多肽的DNA分子与表达载体融合构建重组表达载体转化宿主细胞，诱导表达融合蛋白，分离纯化表达的融合蛋白。本发明还提供了所述蝎活性多肽在制备治疗或预防钾通道Kv1.3相关疾病中的应用。
文档编号C12N15/12GK102127160SQ20101058827
公开日2011年7月20日 申请日期2010年12月14日 优先权日2010年12月14日
发明者吴英亮, 曹志贱, 李文鑫, 韩松 申请人:武汉摩尔生物科技有限公司