专利名称：：用二价盐和磷酸盐进行絮凝的制作方法
技术领域：
：本发明涉及简单和非常有效的用于从发酵液絮凝细菌细胞，产生目标蛋白的方法。
背景技术：
：当需要具有非常高纯度的蛋白时，例如当蛋白待用于药物领域时，需要非常有效的絮凝过程。许多已知的絮凝剂是无法使用的，因为它们可能在最终医药产品中成为杂质。因此，本发明的目的是对上述问题提供简单而有效的解决方案。
发明内容发明人发现可以以非常有效的方式从发酵液絮凝细菌细胞，产生目标蛋白，即，使用二价盐和磷酸盐的组合，因此我们要求保护一种从发酵液絮凝细菌细胞，产生目标蛋白的方法，包括a)用水将发酵液稀释至1000%(w/w)；b)添加二价盐至其在发酵液中的浓度为高于10毫摩尔每升稀释的发酵液；c)调整磷酸根浓度至其在发酵液中的浓度为高于10毫摩尔每升稀释的发酵液；d)调整发酵液的pH至范围为6.1-10.5的pH；和e)去除细菌细胞，由此获得具有少于100NTU的浊度的蛋白溶液。具体实施例方式本发明涉及简单的和非常有效的从发酵液絮凝细菌细胞，产生目标蛋白的方法，包括添加二价盐和磷酸盐，在此之后去除细菌细胞并获得具有非常低浊度的蛋白溶液。细菌细胞细菌细胞可为芽孢杆菌属(Bacillus)细胞，例如，选自下组的芽孢杆菌属细胞嗜碱芽孢杆菌(Bacillusalkalophilus)、解淀粉芽孢杆菌(Bacillusamyloliquefaciens)>短芽孢杆菌(Bacillusbrevis)、环状芽孢杆菌(Bacilluscirculans)、克劳氏芽抱杆菌(Bacillusclausii)、凝结芽抱杆菌(Bacilluscoagulans)、坚强芽孢杆菌(Bacillusfirmus)、灿烂芽孢杆菌(Bacilluslautus)、迟缓芽孢杆菌(Bacilluslentus)、地衣芽孢杆菌(Bacilluslichenuformis)、巨大芽孢杆菌(Bacillusmegaterium)、短小芽抱杆菌(Bacilluspumilus)、嗜热脂肪芽孢杆菌(Bacillusstearothermophilus)、枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)禾口苏云金芽孢杆菌(Bacillusthuringiensis)；优选为迟缓芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌或枯草芽孢杆菌细胞；特别是地衣芽孢杆菌细胞。在另一个实施方案中，所述细菌细胞可为大肠杆菌(E.coli)细胞，或假单胞菌属菌种O^seudomonassp.)细胞，或链霉菌属菌种(Sti^ptomycessp.)细胞，特别是鼠灰链(Streptomycesmurinus)^[fMMM^^M^MUM(Streptomycesacidiscabies)M胞。目标蛋白根据本发明，所述目标蛋白可为肽或多肽。根据本发明，优选的肽含有5至100个氨基酸；优选10至80个氨基酸；更优选15至60个氨基酸。根据本发明，优选的待回收的肽为甜味蛋白(brazzein)。优选的多肽可为任何可由细菌细胞产生的蛋白。所述蛋白可为胰岛素、thaxomin、白蛋白或酶。在一个优选实施方案中，目标蛋白是待用于药物的酶。在一个优选实施方案中，将所述方法施用于水解酶(根据EnzymeNomenclature；RecommendaionsoftheNomenclatureCommitteeoftheInternationalUnionofBiochemistry为类型EC3)。在一个特别优选的实施方案中，选自下组的酶是优选的蛋白酶、脂肪酶、淀粉酶、和纤维素酶蛋白酶合适的蛋白酶包括那些动物、植物(vegetable)或微生物起源。优选微生物起源的。包括经化学修饰或蛋白工程的突变体。所述蛋白酶可为丝氨酸蛋白酶或金属蛋白酶，优选为碱性微生物蛋白酶或胰蛋白酶样蛋白酶。碱性蛋白酶的实例为枯草杆菌蛋白酶(subtilisin)，特别是那些来源于芽孢杆菌属的，例如枯草杆菌蛋白酶Novo、枯草杆菌蛋白酶Carlsberg、枯草杆菌蛋白酶309、枯草杆菌蛋白酶147和枯草杆菌蛋白酶168(描述于TO89/06279)。胰蛋白酶样蛋白酶的实例为胰蛋白酶(例如猪或牛来源的)和描述于W089/06270和WO94/25583的镰孢属(Fusarium)蛋白酶。其他合适的蛋白酶为可用于胰酶替代的描述于例如WO2005/11M55中的拟诺卡氏菌属(Nocardiopsis)蛋白酶。优选的商业上可获得的蛋白酶包括Alcalase、Savinase,Primase,Duralase、Esperase禾口Kannase(NovozymesA/S)、Maxatase、Maxacal、Maxapem、ProperaseT\Purafect,Purafect0xP、FN2TM和FN3(GenencorInternationalInc.)MM:合适的脂肪酶包括那些细菌或真菌来源的。包括化学修饰的或蛋白质工程的突变体。有用的脂肪酶的实例包括假单胞菌属脂肪酶，例如来自产碱假单胞菌(P.alcaligenes)和类产碱假单胞菌(P.pseudoalcaligenes)(EP218272)、洋葱假单胞菌(P.cepacia)(EP331376)、施氏假单胞菌(P.stutzeri)(GB1，372，034)、荧光假单胞菌(P.fluorescens)、假单胞菌属菌种菌株SD705(W095/06720和WO96/27002)、或威斯康星假单胞菌(P.wisconsinensis)(W096/12012)的脂肪酶。其他有用的脂肪酶可为芽孢杆菌属脂肪酶，例如来自枯草芽孢杆菌(Dartois等(1993)，BiochemicaetBiophysicaActa，1131，253-360)、嗜热脂肪芽孢杆菌(JP64/744992)或短小芽孢杆菌(W091/16422)的脂肪酶。其他合适的脂肪酶为可用于胰酶替代的描述于例如WO2006/136159中的脂肪酶。淀粉酶合适的淀粉酶(α和/或β)包括那些细菌或真菌来源的。包括化学修饰的或蛋白质工程的突变体。淀粉酶包括例如获得自芽孢杆菌属的α-淀粉酶，例如获得自地衣芽孢杆菌特殊菌株，其更加详细地描述于GB1，296,839。其他合适的淀粉酶为可用于胰酶替代的描述于例如WO2006/136161中的淀粉酶。商业上可获得的淀粉酶为Duramyl、TermamylSC、TermamylUltra、Stainzyme,Natalase和BAN(NovozymesA/S)、Rapidase和Purastar(来自GenencorInternationalInc.)。纤维素酶合适的纤维素酶包括那些细菌或真菌来源的。包括化学修饰的和蛋白质工程的突变体。合适的纤维素酶包括来自芽孢杆菌属、假单胞菌属、腐质霉属(Humicola)、镰孢属(Fusarium)、梭孢壳属(Thielavia)、或枝顶孢霉属(Acremonium)的纤维素酶。目标蛋白亦可为葡萄糖异构酶如Sweetzyme(NovozymesA/S)。发酵液本发明可用于任何工业规模的发酵，例如，用于任何具有至少50升，优选至少500升，更优选至少5000升，甚至更优选至少50000升发酵介质的发酵。产生目标蛋白的细菌细胞可通过本领域任何已知方法来发酵。所述发酵介质可为如描述于例如WO98/37179的基本培养基，或所述发酵介质可为包含复合氮源和碳源的复合培养基，其中所述复合氮源可如描述于W02004/003216为部分水解的。发酵可作为分批、重复分批、批次补料、重复批次补料或连续发酵过程进行。在批次补料过程中，完全不将或仅部分将包含一种或多种结构和/或催化元件的化合物在发酵起始前添加至介质，并分别将全部或剩余部分的所述包含一种或多种结构和/或催化元件的化合物在发酵过程中给料。选用于给料的化合物可一同或分别给料于发酵过程。在重复批次补料或连续发酵过程中，在发酵中加合地将完整的起始介质给料。起始介质可与结构元件给料一同给料或分别给料。在重复批次补料过程中，以规则的时间间隔去除部分包含生物质的发酵液，而在连续过程中，部分发酵液的去除连续进行。由此用对应于移除的发酵液的量的一部分新鲜介质来补充至发酵过程。在本发明的一个优选实施方案中，优选来自批次补料发酵过程的发酵液。MM本发明的方法可适用于未经处理的发酵液或首先经历，但不限于例如pH调整和/或温度调整的发酵液。根据本发明，所述发酵液可用水稀释至1000%(w/w)；优选所述发酵液可用水稀释10-1000%(w/w)；更优选所述发酵液可用水稀释100-900%(w/w)；更优选所述发酵液可用水稀释200-800%(w/w)；更优选所述发酵液可用水稀释200-800%(w/w)；且特别是所述发酵液可用水稀释300-700%(w/w)0根据本发明，用水稀释意味着所述稀释介质可为水，或可为来自目标蛋白生产的超滤渗透物，或可为来自目标蛋白生产的再循环水，或可为来自加热器的冷凝物，或可为任何上述提及的组合，例如，水和超滤渗透物的混合物。然后将二价盐，特别是钙盐和/或镁盐，例如氯化钙或氯化镁，添加至发酵液。一个优选实施方案是钙盐，特别是氯化钙。所述二价盐应添加至其在发酵液中的浓度为高于10毫摩尔每升；优选至其在发酵液中的浓度为10-100毫摩尔每升；更优选至其在发酵液中的浓度为20-90毫摩尔每升；更优选至其在发酵液中的浓度为30-80毫摩尔每升；更优选至其在发酵液中的浓度为40-70毫摩尔每升；特别是至其在发酵液中的浓度为50-70毫摩尔每升。二价盐的给药通常是连线(in-line)或在混合罐中，或通过本领域中任何其他已知方法进行的。然后可将发酵液中的磷酸根浓度调整至其浓度为高于10毫摩尔每升；优选至其在发酵液中的浓度为10-50毫摩尔每升；更优选至其在发酵液中的浓度为10-40毫摩尔每升；更优选至其在发酵液中的浓度为10-30毫摩尔每升；更优选至其在发酵液中的浓度为10-20毫摩尔每升。磷酸根浓度通常是通过添加磷酸盐如NaH2P04、Na2HP04或H3P04来调整的。磷酸盐的给药通常是连线或在混合罐中，或通过本领域中任何其他已知方法进行的。钙和磷酸根的添加导致pH减少，通常至低于pH6.0的pH。通过将pH移至高于PH6，磷酸根和钙沉淀为具有低溶解度的固体形式。令人惊讶的是，该沉淀非常有效地挟带(entrap)细菌细胞。因此，在添加了钙和磷酸根之后，即将发酵液的PH调整至高于6.0的pH，特别是至6.1至10.5的pH；优选至6.2至10.5的pH；更优选至6.3至10.5的pH；更优选至6.4至10.5的pH；更优选至6.5至10.5的pH；特别是至7.0至10.0的pH，特别是至8.0至9.0的pH。pH调整可通常通过任何本领域已知的碱例如NaOH或KOH进行。然后通过本领域已知方法如，但不限于过滤例如鼓式过滤(drumfiltration)、膜过滤、板框压滤机终端过滤(flter-pressdeadendfiltration)、错流过滤或离心来去除絮凝的细菌细胞。在去除细菌细胞之后，获得了具有低于100NTU(=比浊法浊度单位)的蛋白溶液；特别是具有低于90的浊度的蛋白溶液；更优选具有低于80的浊度的蛋白溶液；更优选具有低于70的浊度的蛋白溶液；更优选具有低于60的浊度的蛋白溶液；特别是具有5-50范围的浊度的蛋白溶液。浊度是如本领域中已知并根据专利US4，198，161测量的，例如，通过来自HachLange的Hach2100P便携式浊度计。后续的下游操作然后可以通过本领域已知方法进一步处理所得的蛋白溶液。例如，可通过常规方法，包括但不限于进一步过滤如超滤和渗滤，提取，喷雾干燥，蒸发，沉淀或结晶，来回收蛋白。然后可将分离的蛋白进一步通过多种本领域已知方法包括但不限于层析(例如离子交换、亲和、疏水、层析聚焦和尺寸排阻)，电泳方法(例如制备性等电聚焦)、差示溶解度(例如硫酸铵沉淀)或提取来进行纯化和/或修饰。本发明进一步由下述实施例来说明，其不意欲以任何方式限制要求保护的本发明的范围。实施例1仅用钙絮凝(地衣芽孢杆菌/淀粉酶)该实验的目的是为了说明聚沉(coagulation)的全部作用无法通过仅添加钙获得(磷酸根是必需的)。来源芽孢杆菌细胞为含有嗜热脂肪芽孢杆菌淀粉酶(W02006/136161中所述的SEQIDNO1)的地衣芽孢杆菌细胞。发酵我们使用1500升的规模；使用含有蛋白源的盐培养基，采用无机氮作为主要氮源和葡萄糖给药作为碳源。因为来自发酵的剩余磷酸根浓度，磷酸根浓度并非零，而是为2.8mM(参见下表1)。钙以CaC12(36%)添加。钙浓度在0至69.5mM之间变化。发酵液的pH(在调整之前)为6.7。在添加了钙和磷酸根之后，通过使用NaOH将pH调整至7.0。将絮凝溶液以3500rpm(=2493g)离心5分钟。表1实验条件"#1Γ^Ι稀释(自来水)600%添加的Ρ04浓度O^M总Ρ04浓度2.8mM添加的Ca浓度WWPH调整设定点pH7.0表2:结果添加的C(Ca)淤渔浊度mM%w/wNTU0.03.6%100023.25.8%100046.39.2%63169.59.5%360用于稀释的自来水含有2_3mM数量级的Ca。这未反映在实验数据中。浊度读数的最大值是1000NTU。因此，当列出浊度为1000NTU时，这实质上意味着>1000NTU。实验1阐明了不添加磷酸根无法获得低浊度(<100)的酶溶液。7实施例2■■舞酬隨疑(MHffi滅/浦IS)该实验的目的是为了衡量获得合适聚沉作用所需的磷酸根添加水平。因为磷酸根的添加降低PH，起始pH会取决于添加的磷酸根的量而变化。为了确证改善的聚沉并非仅为该差异的作用，准备了两个系列的样品一个为“如原样(as-is)”，而另一个中在添加钙和磷酸根之后pH调整至5.0。然后将两个系列均调整至本实验的PH设定点(10.0)。来源芽孢杆菌细胞为含有嗜热脂肪芽孢杆菌淀粉酶(W02006/136161中所述的SEQIDNO1)的地衣芽孢杆菌细胞。发酵发酵和絮凝如实施例1中所述用下述特定条件来进行表3:实验条件权利要求1.一种从发酵液絮凝细菌细胞，产生目标蛋白的方法，包括a)用水将发酵液稀释至1000%(w/w)；b)添加二价盐至其在发酵液中的浓度为高于10毫摩尔每升稀释的发酵液；c)调整磷酸根浓度至其在发酵液中的浓度为高于10毫摩尔每升稀释的发酵液；d)调整稀释的发酵液的pH至范围为6.1-10.5内的pH；并e)去除细菌细胞，由此获得具有少于100NTU的浊度的蛋白溶液。2.权利要求1的方法，其中所述细菌细胞是芽孢杆菌属(Bacillus)细胞。3.权利要求2的方法，其中所述芽孢杆菌属细胞是地衣芽孢杆菌(Bacilluslicheniformis)细胞。4.权利要求1的方法，其中所述细菌细胞是大肠杆菌(E.coli)细胞。5.权利要求1的方法，其中所述目标蛋白是酶。6.权利要求5的方法，其中所述酶选自下组蛋白酶、脂肪酶、淀粉酶和纤维素酶。7.权利要求1的方法，其中所述二价盐是钙盐。8.权利要求1的方法，其中所述二价盐浓度在10-100毫摩尔每升的范围。9.权利要求1的方法，其中所述磷酸根从NaH2P04、Na2HP04或H3P04获得。10.权利要求1的方法，其中所述磷酸根浓度是10-50毫摩尔每升的范围。11.权利要求1的方法，其中所述细菌细胞是通过过滤或离心去除的。12.权利要求1的方法，其中所述目标蛋白为医药产品。13.权利要求1的方法，其中将pH调整至6.5-10.5范围内的pH。全文摘要一种从发酵液絮凝细菌细胞，产生目标蛋白的方法，包括a)用水将发酵液稀释至1000％(w/w)；b)添加二价盐至其在发酵液中的浓度为高于10毫摩尔每升稀释的发酵液；c)调整磷酸根浓度至其在发酵液中的浓度为高于10毫摩尔每升稀释的发酵液；d)调整稀释的发酵液的pH至范围为6.1-10.5内的pH；和e)去除细菌细胞，由此获得具有少于100NTU的浊度的蛋白溶液。文档编号C12N1/02GK102471755SQ201080030690公开日2012年5月23日申请日期2010年6月30日优先权日2009年7月9日发明者J.R.佩德森,P.F.平德申请人:诺维信公司