专利名称：用于肠易激综合征诊断的新基因组生物标记的制作方法
用于肠易激综合征诊断的新基因组生物标记与相关申请的交叉参考本申请要求于2009年11月25日提交的美国申请号61/264，634的优先权，为了所有目的将该美国申请的教导内容整体引入本文作为参考。
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肠易激综合征(IBS)是所有胃肠道病症中最常见的，影响全部群体的10-20%且在所有消化系统病患者中占50%以上。然而，研究表明，受IBS困扰的患者中仅约10%-50%实际上寻求医学帮助。具有IBS的患者呈现不一样的症状，例如主要与排便有关的腹痛、腹泻、便秘、或腹泻便秘交替、腹胀、腹气、和大便中过度粘液。超过40%的IBS患者具有严重的症状，使得他们不得不休假，简化其社会生活，避免性交，取消约会，停止旅行，服用药物，甚至因害怕尴尬而困在家中。在美国估计的IBS健康护理费用是每年$8百万(Talley等人，Gastroenterol. ,109:1736-1741 (1995))。IBS的确切病理生理学并未得到充分理解。然而，存在对内脏痛觉感受的提高敏感性，称为外周敏化。这种敏化涉及初级传入神经元的传导过程的阈值降低和放大量的增加，可归因于多种介质，包括单胺类(例如儿茶酚胺和吲哚胺)、P物质以及多种细胞因子和前列腺素类例如E型前列腺素(参见例如,Mayer等人,Gastroenterol. , 107:271-293 (1994))。在IBS的病因学中还牵涉肠运动机能障碍，这导致腔内内容物和/或气体的处理异常(参见例如，Kellow 等人，Gastroenterol. , 92:1885-1893 (1987) ;Levitt 等人,Ann. Int. Med.，124:422-424 (1996))。心理学因素也可以促成IBS症状，表现出，即使不是失常所触发的，也与失常(包括抑郁与焦虑)结合在一起(参见例如，Drossman等人，Gastroenterol. Int.,8:47-90 (1995))。IBS的原因并未得到充分理解。肠壁衬有肌肉层，肌肉层收缩和舒张，将食物从胃通过肠道移动到直肠。通常，这些肌肉以协调的节奏收缩和舒张。在IBS患者中，这些收缩比正常的一般更强且持续更久。因此，在某些情况下，食物被迫更快速地通过肠，引起气体、气胀和腹泻。在其他情况下，出现相反情况食物通过减慢并且大便变硬且干燥，引起便秘。IBS的确切病理生理学有待阐明。虽然肠运动障碍和改变的内脏感受被认为是症状发病机理的重要贡献者(Quigley, Scand. J. Gastroenterol. , 38 (Suppl. 237) : 1-8(2003) ;Mayer 等人，Gastroenterol.，122:2032-2048 (2002))，但这种病状目前一般被视为脑-肠轴的病症。近来，也已提出肠道感染和肠炎症的作用。研究已记载在细菌学确认的胃肠炎后IBS发作，而其它研究已提供在IBS中低度粘膜炎症(Spiller等人，Gut,47:804-811 (2000) ；DunIop 等人，Gastroenterol. ,125:1651-1659 (2003) !Cumberland等人，Epidemiol. Infect.，130:453-460 (2003))和免疫激活(Gwee 等人，Gut，52:523-526
(2003)；Pimentel 等人，Am. J. Gastroenterol. ,95:3503-3506 (2000))的迹象。肠菌群也被涉及，并且近期研究证实益生生物双歧杆菌(Bifidobacterium)通过调节免疫活性在治疗该病症中的功效(O，Mahony 等人，Gastroenterol. , 128:541-551 (2005))。下丘脑-垂体-肾上腺轴(HPA)是人的核心内分泌应激系统(De Wied等人，Front. Neuroendocrinol.，14:251-302 (1993)),并且提供在脑和肠免疫系统之间的重要连接。响应身体和心理应激物两者都可以发生该轴的激活(Dinan, Br. J. Psychiatry,164:365-371 (1994))，这两者都已牵涉IBS的病理生理学(Cumberland等人，Epidemiol.Infect. ,130:453-460 (2003))。具有IBS的患者已被报道，在儿童期中具有增加比率的性和身体滥用，以及在成人期中更高比率的紧张生活事件(Gaynes等人，Baillieres Clin.Gastroenterol.，13:437-452 (1999))。此类社会心理创伤或不良的认知应对策略将显著影响症状严重性、日常功能和健康后果。
虽然IBS的病因学并未完全表征，但医学界已出现了共同的定义和标准，称为罗马II标准(Rome II criteria),以帮助基于病史来诊断IBS。罗马II标准要求在I年的时期中3个月的连续或复发性腹痛或不适，该腹痛或不适通过排便得到缓解和/或与大便频率或稠度的变化以及下述中的两种或更多种相关改变的大便频率、改变的大便形状、改变的大便通过、粘液的通过、或气胀和腹胀。再一个必要条件是缺乏可以引起这些症状的任何结构的或生物化学的病症。因此，罗马II标准仅在存在大量病史时可以使用，并且仅在不存在可以用于解释这些症状的异常肠解剖学或代谢过程时是可靠的。类似地，近来由医学界发展的罗马III标准仅可以在有特定的一组症状的呈现、详细病史和体格检查时使用。文献充分表明，由于IBS与其他疾病或病症在症状上的相似性，将患者诊断为具有IBS可能是困难的。事实上，因为IBS的症状与多种其他肠道病的症状相似或等同，所以在作出正确诊断前可能花费数年。例如，具有炎性肠病(IBD)但显示出诸如气胀、腹泻、便秘和腹痛等轻度体征与症状的患者可能难以与具有IBS的患者区分。因此，在IBS和IBD之间的症状相似性致使快速和准确诊断变得困难。区别性诊断IBS和IBD的困难使得这些疾病的早期和有效治疗受到阻碍。不幸的是，目前尚没有可以用于确定地区分IBS与其他呈现相似症状的肠疾病或病症的快速和准确的诊断方法。本发明满足了此需要并且还提供相关优点。发明概述本发明提供方法、系统和代码，其可以用于准确地分类来自个体的样品是否与肠易激综合征(IBS)或其亚型有关。作为非限制性例子，本发明可以使用统计学算法和/或经验数据，用于将来自个体的样品分类为IBS样品。本发明还可以使用统计学算法和/或经验数据的组合，用于排除呈现IBS样症状的一种或多种疾病或病症和归入(rule in) IBS。因此，本发明提供了 IBS的准确诊断预测、IBS亚型的分类、和可以用于指导治疗决定的预后信息。在一个方面，本发明提供用于在有需要的受试者中诊断肠易激综合征(IBS)的方法，该方法包括(a)从得自受试者的生物学样品中分离和/或扩增RNA ； (b)在适于将检测试剂转化成包含检测试剂和IBS RNA生物标记的复合物的条件下，使分离和/或扩增的RNA与检测试剂接触；(c)检测复合物的水平；和((1)确定复合物的水平更紧密地类似于与IBS相关的第一参考水平还是类似于与不存在IBS相关的第二参考水平，从而在受试者中诊断IBS或其亚型，其中生物标记是来自基因的RNA，所述基因选自表4中的基因，例如(XDC147。在另一个实施方案中，基因选自表6中的基因。在一个更优选的实施方案中，基因选自表7中的基因。在另一个方面，本发明提供了用于监控受试者中肠易激综合征(IBS)的进展或消退的方法，所述方法包括(a)从在第一时间点取自受试者的第一生物学样品，确定第一生物标记谱；(b)从在第二时间点取自受试者的第二生物学样品，确定第二生物标记谱；和(c)比较所述第一和所述第二生物标记谱，以(i )确定哪个生物标记谱最类似或最不类似于与IBS相关的第一参考谱，(ii)确定哪个生物标记谱最不类似或最类似于与不存在IBS相关的第二参考谱，或(iii)确定前述相似性中的至少2个，其中所述生物标记谱包含表4中的至少2种生物标记的表达信息，从而监控所述受试者中IBS的进展或消退。在另一个实施方案中，生物标记谱包含表 6中的至少2种生物标记的表达信息。在一个更优选的实施方案中，生物标记谱包含表7中的至少2种生物标记的表达信息。在另外一个方面，本发明提供了用于向有需要的受试者分配IBS治疗的方法，该方法包括Ca)从得自受试者的生物学样品中分离和/或扩增RNA ； (b)在适于将检测试剂转化成包含检测试剂和IBS RNA生物标记的复合物的条件下，使分离和/或扩增的RNA与检测试剂接触；(c)检测复合物的水平；(d)确定复合物的水平更紧密地类似于与IBS相关的第一参考水平还是与不存在IBS相关的第二参考水平；和(e)如果所述水平更紧密地类似于与IBS相关的所述第一参考水平，那么分配IBS治疗，其中IBS RNA生物标记选自表4中的基因。在另一个实施方案中，基因选自表6中的基因。在一个更优选的实施方案中，基因选自表7中的基因。在一些实施方案中，本发明的方法进一步包括将样品分类为IBS-便秘型(IBS-C)、IBS-腹泻型(IBS-D)、IBS-混合型(IBS-M)、IBS-交替型(IBS-A)、或感染后 IBS(IBS-PI)样品。在其他实施方案中，该方法进一步包括将非IBS样品分类为正常、炎性肠病(IBD)、或非IBD样品。在一些实施方案中，用于诊断IBS、监控IBS的进展或消退和/或分配IBS治疗的方法包括检测表2、表4、表6和表7中的至少2、3、4、5种或更多种生物标记。在其他实施方案中，该方法进一步包括检测选自下述的生物标记细胞因子、生长因子、抗嗜中性粒细胞抗体、抗酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)抗体、抗微生物抗体、抗组织转谷氨酰胺酶(tTG)抗体、脂质运载蛋白、基质金属蛋白酶(MMP)、脂质运载蛋白和MMP的复合物、组织金属蛋白酶抑制剂(TIMPs)、球蛋白(例如α -球蛋白)、肌动蛋白切割蛋白(actin-severingprotein)、SlOO蛋白、血纤肽、降钙素基因相关肽(CGRP)、速激肽、生长素释放肽、神经降压肽、促皮质素释放激素(CRH)、弹性蛋白酶、C-反应蛋白(CRP)、乳铁蛋白(Iactoferrin)、抗乳铁蛋白抗体、钙防卫蛋白、血红蛋白、N0D2/CARD15、血清素重摄取转运蛋白(SERT)、色氨酸羟化酶-1、5-羟色胺(5-HT )、乳酮糖、及其组合。在一些其他实施方案中，本发明的方法进一步包括确定症状谱，其中通过鉴定所述个体中至少一种症状的存在或严重性，确定所述症状谱；和使用基于所述诊断标记谱和所述症状谱的算法，将所述样品分类为IBS样品或非IBS样品。这些及其他目的、方面和实施方案将在下面的详述和附图中更显而易见。附图简述图I描述在经由RMA算法加工后8个训练样品的基因表达数据的盒须图。样品HGl和2对应于IBS-C样品，HG3、4和5对应于IBS-D，并且HG6、7和8对应于健康对照样品。图2描述基于ANOVA分析的头5种差异表达基因的基因图。图3描述使用阵列上的所有探针组执行的无监督分层聚类分析的聚类结果。
图4描述使用阵列上的所有未掩蔽的探针组执行的无监督分层聚类分析的聚类结果的热图。来自IBS患者和健康志愿者的转录物的总体表达分析。得自3个IBS-D、2个IBS-C和3个健康志愿者的总RNA在含有超过35，000种人基因的Affymetrix阵列上进行分析。3个正常和5个IBS样品的无监督分层聚类分析。红色指示相对于所有实验的平均表达值升高的基因。绿色指示相对于该平均表达值降低的基因。图5描述基于所有未掩蔽的探针组的基因表达谱显现样品的分离的多维量表图。图6描述主成分分析结果。左图(A)显示多少百分比的总变异可以由最前面的主成分来解释。右图(B)显示通过头2种主成分的样品分离。图7A-C描述在每对组别之间，具体地，在(A)IBS-C和IBS-D组，(B)IBS-C和对照组，以及(C) IBS-D和对照组之间，比较的火山图。图8描述在来自IBS-M、IBS-C、IBS-D和对照(HV)受试者的样品中F0XD3、PI4K2A、ACSS2、ASIP和0R2L8基因的差异基因表达的qRT-PCR验证结果。图9A-C描述在来自IBS-M、IBS_C、IBS-D和对照(HV)受试者的样品中所选的候选生物标记的差异基因表达的qRT-PCR验证结果。
图10A-C描述在来自IBS-M、IBS-C、IBS-D和对照(HV)受试者的样品中36种所选差异表达基因(DEGs)的表达的实时定量PCR验证结果。图11描述在来自IBS-M、IBS-C、IBS-D和对照(HV)受试者的样品中5种靶基因(SERT、TPH1、MA0-A、TLR4 和 TLR7)的实时定量 PCR 结果。来自于2007年8月14日提交的美国专利
发明者H·宫, S·辛格, N·霍 申请人:雀巢产品技术援助有限公司