专利名称：：Il-24与egf的融合基因原核载体的构建及其应用的制作方法
技术领域：
：本发明属于分子生物学和肿瘤免疫学领域，尤其是一种IL-24与EGF的融合基因原核载体的构建及其应用。技术背景白细胞介素24(Interleukin-24,IL-24),原名黑色素瘤分化相关基因-7(melanomadifferentiationassociatedgenemda-7)，是1995年JiangH等人禾U用减数杂交技术，从P干扰素(Interferon2P,IFN23)和蛋白激酶C激活剂MEZ诱导分化的人恶性黑色素瘤细胞HO-l细胞中克隆的新基因，该基因在诱导分化的黑色素瘤细胞中高表达，并能促进黑色素瘤细胞分化，因此最初命名为MDA-7[JiangH,LinJJ，Suzzdal.Subtractionhybridizationidentifiesanovelmelanomadifferentiationassociatedgenemda-7modulatedduring.humanmelanomadifferentiation',growthandprogression.Oncogene,1995;11(12):2477-2486.]。由于其具有细胞因子样的特征，因此被命名为一种新的细胞因子，即IL-24。放射性杂交图谱分析表明IL-24基因位于人类染色体Iq34.2-lq41区域，该区域包含细胞因子IL-10家族的几个成员。IL-24基因由7025个碱基组成，含7个外显子和6个内含子。外显子大小为64889bp，内含子大小是115~1443bp。其转录的起始点位于5'RACE,5'端上游核酸序列分析显示在-30-25处存在TATA盒，去除TATA盒，启动子不能被激活。IL-24cDNA长1718bp，其中包含一个促进分泌的片段。IL-24转录单位大小是6.33Kb，其前方的DNA是一个2.2Kb大小的5，侧翼序列，包含IL-24启动子。黑色素瘤细胞中，用IFN-e和MEZ处理并不能明显改变启动子活性；相反，终末分化过程中IL-24的表达水平部分受到IL-24cDNA3'端非翻译区富含Au(ARE)序列调节。研究表明，要提高IL-24在黑色素瘤细胞中启动子活性，TATA盒上游的2个AP-1位点和3个C/EBP位点是必需的，AP-1和C/EBP可调节IL-24启动子的活性。IL-24由206个氨基酸序列组成，其N端有一段包含49个氨基酸的信号肽，依其氨基酸序列分析，带信号肽的IL-24分子量大小为23824D，成熟蛋白的分子量为18419D。稳定转染了全长IL-24cDNA的HEK293细胞经培养后，上清SDS-PAGE电泳呈现4条带，分别位于21kDa和30kDa附近，而阴性对照未见任何条带，提示培养上清液中可能含有IL-24包括未切除和切除信号肽的蛋白以及发生糖基化的IL-24。事实上，IL-24的第95、109、126个氨基酸处分别有一个糖基化位点，经内聚糖酶F(N端特异性)或经内聚糖酶F与O端内糖苷酶(O端特异性)处理后，30kDa附近的两条带消失，去糖基化蛋白的大小与预测大小一致。由此表明人IL-24是一个糖基化的细胞因子且糖基化位点位于N端。目前对国内外对IL-24抗肿瘤作用的机制进行了深入的研究，IL-24抑制肿瘤的机制尚未清楚，目前认为通过多种途径发挥抑制肿瘤的作用，国外的研究主要集中在由腺病毒介导IL-24在肿瘤细胞中顺时表达，经国内外的抗肿瘤效应的结果表明，IL-24诱导肿瘤细胞凋亡与改变线粒体通透性，以及线粒体相关凋亡调节因子的含量和比例有关。Saeki[SaekiT,MhashilkarA,Swansonxefal.Inhibitionofhumanlungcan-cergrowthfollowingadenovirusmediatedmda-7geneexpressioninvivo[J].Oncogene,2002;21(29):4558-4566.]等报道用重组复制缺陷腺病毒IL-24(Ad.IL-24)转染人乳癌细胞和非小细胞肺癌(non-smallcelllungcancer，NSCLC)细胞，均可抑制肿瘤细胞生长和诱导其凋亡。Madireddi等从人胎盘基因组文库中分离IL-24启动子区域，GCG序列分析鉴定多个AP.1禾nC/EBP-转录因子识别位点，而AP-1/eJun或C/EBP的异位表达能显著提高黑色素瘤细胞IL-24启动子的表达，显示通过基因调控抑制肿瘤血管生成活性、刺激免疫系统应答和诱导肿瘤细胞凋亡联合的方式来发挥抗肿瘤效应。随着对IL-24在作用机制以及基因治疗方面深入的研究，一方面肯定了IL-24选择性抑制肿瘤生长的功能，另一方面扩展了其临床应用范围；同时也表现出对IL-24的大量需求，所以，通过基因工程手段大规模生产高纯度天然活性的重组人工IL-24成为必然。目前有关对IL-24的表达的文献显示，在国外集中在由腺病毒介导IL-24在肿瘤细胞中瞬时表达，诱导细胞凋亡的效果十分显著，存在问题一是腺病毒的安全性，二是作用效果短暂。重组蛋白具有应用方便，安全的特点，基于IL-24独特的抗肿瘤效应而显示出临床应用的广阔前景，因此国内的研究主要集中在建立IL-24的基因表达系统，开展重组rhlL-24蛋白生物特性研究，开发基因重组的IL-24。IL-24在大肠当中表达的蛋白可抑制肿瘤生长，.促进肿瘤细胞凋亡，如可诱导黑色素瘤、乳腺癌、肺癌和非小细胞肺癌等肿瘤细胞的凋亡，抑制肿瘤细胞的生长。[MhashilkarAM,SchrockRD,Hindi'.Mdal.Melanomadifferentiationassociatedgene-7(mda國7):anovelanti-tumorgeneforcancergenetherapy[J].MolMed,2001;7(4):271-282.]但是以往大量的临床研究表明，细胞因子治疗肿瘤需要反复注射，能近距离的作用于肿瘤细胞的细胞因子为数不多，积聚在正常组织周围的细胞因子又会发生炎症反应，发生副作用，所以增强细胞因子的肿瘤靶向VGF(豆病毒生长因子)肽段中的C环是EGF受体特异性结合位点，称为EGF受体干扰序列，一共有16个氨基酸序列。EGFR(表皮生长因子受体)在多种肿瘤细胞表面高表达，如下图所示<table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table>EGF受体干扰序列能与EGFR结合，但不具有刺激肿瘤细胞生长的作用，已在肿瘤靶向治疗中得到了应用。本发明前一些研究人员证实/IFN-r-EGF融合蛋白能增强IFN-r的抗癌活性[CHENWANG-Qiu,"al.EnhancedAntitumorEffectofanIFN隱r-EGFFusionProtein.BIOMEDICALANDENVIRONMENTALSCIENCES,1997(10):387-395)，并构建了EGF受体干扰序列-IL-18融合基因(Jian-XinLu,etal.RationaldesignofanEGF-IL18fUsionprotein:Implicationfordevelopingtumortherapeutics.BiochemicalandBiophysicalResearchCommunications,2005，(334):157-161.]王晓鸣等证实带有EGF受体干扰序列的r-干扰素可以提高抗肿瘤细胞增殖活性[王晓鸣，金奇，李玉英，带有EGF受体干扰序列的r-干扰素新分子抗肿瘤细胞增殖活性的提高.中国科学(B辑)，1991，3(3):289-295]。因此将EGF受体千扰序列与IL-24的基因进行融合，可以增强IL-24的肿瘤细胞的靶向性，减少IL-24的剂量及注射的次数。
发明内容本发明的目的之一在于提供一种IL-24与EGF融合基因。本发明的目的之二在于提供一种IL-24与EGF融合基因原核表达载体。本发明的目的之三在于提供一种IL-24与EGF融合基因原核表达载体的构建方法。本发明的目的之四在于提供一种IL-24与EGF融合蛋白。本发明的目的之五在于提供一种IL-24与EGF融合蛋白在制备抗肿瘤药物中的应用。本发明是通过以下技术方案来实现的一种IL-24与EGF融合基因，该融合基因的核苷酸序列如SEQIDNo.l所示。一种IL-24与EGF融合基因原核表达载体，该载体具有如SEQIDNo.l所示的核苷酸序列。一种IL-24与EGF融合基因原核表达载体的构建方法，该方法的步骤如下(D.IL-24的扩增与纯化根据人IL-24GeneBank序列设计引物，其上游引物5，-CGCGGATCCGCAAGAATTCCACTTTGGGC-3，，含BamHI酶切位点；其下游引物5，-CCCAAGCTTGAGCTTGTAGAATTTCTGCATC-3，，含Hindlll酶切位点；模板为插入人IL-24完整编码区基因的质粒PMAL-c2x;扩增的反应条件为95。C预变性2分钟，以95"C变性36秒，56"C退火36秒，72。C延伸l分钟24秒，扩增25个循环，再以72°C延伸5分钟，PCR扩增产物经8g/L琼脂糖凝胶电泳，将目的条带切下，用DNA试剂盒回收纯化；(2).重组质粒pET22b-IL-24的构建与鉴定将步骤(l)中纯化的PCR产物和载体pET22b用BamHI和HindIII双酶切后，分别用DNA试剂盒回收纯化酶切产物，在T4DNA连接酶作用下定向连接IL-24至pET22b，将连接产物转化入DH5a感受态细菌中，在LA(Amp)培养基中筛选培养，挑取阳性克隆，培养后提取质粒，采用BamHI和HindIII双位点单、双酶切鉴定，测序；(3).IL-24与EGF融合基因的获得第一次PCR:上游引物5，TGGCTCTGCCCAGGGCCAAGAAGGG-3，含BamHI酶切位点和连接肽片断；下游引物5，-CCCAAGCTTGAGCTTGTAGAATTTCTGCATC-3，含Hindlll酶切位点，以重组质粒pET22b-IL-24为模板，采用上述引物进行PCR扩增，扩增的反应条件为94。C预变性3分钟，以95t:变性30秒，47匸退火1分钟，72"C延伸1分钟30秒，扩增30个循环，再以72"C延伸10分钟，PCR扩增产物经8g/L琼脂糖凝胶电泳，将目的条带切下后，用DNA试剂盒回收纯化；第二次PCR:上游弓i物5，-CGCGGATCCCGCTGCTCCCATGGCTACACTGGTATTCGTTGCCAAGCAGTAGTTCTC-3，含BamHI酶切位点和EGF受体片断；下游引物5，-CGCGGATCCGCAAGAATTCCACTTTGGGC-3，，含Hindlll酶切位点，以第一次PCR回收产物为模板，采用上述引物进行PCR扩增，扩增的反应条件为94。C预变性2分钟，以95°C变性30秒，51°C退火1分钟，72"C延伸1分钟30秒，扩增30个循环，再以72°C延伸10分钟，PCR扩增产物经8g/L琼脂糖凝胶电泳，将目的条带切下后，用DNA试剂盒回收纯化；(4).IL-24与EGF融合基因原核表达载体的构建与鉴定将步骤(3)中第二次PCR纯化的产物和载体PET22b用BamHI和HindIII双酶切后，分别用DNA试剂盒回收纯化酶切产物，在T4DNA连接酶作用下定向连接IL-24融合基因至PET22b;用电击转化的方法将连接产物转化入DH5a感受态细胞中，在LA(Amp)培养基中筛选培养，挑取阳性克隆，培养后提取质粒，采用BamHI和HindIII双位点单、双酶切鉴定，选取阳性克隆，测序。而且，所述电击转化的方法步骤为(1)在-8(TC冰箱中取出感受态细胞置冰上融化，同时将电转杯也放在冰上预冷；(2)打开电击仪，调整到Ecl档，电压为1800V;(3)将上述连接产物10pL与感受态细菌40pL混合，在冰上震动电转杯以确保细胞与DNA悬液位于电转杯底部；(4)用纸巾擦去电转杯上的冷凝水和冰渣，放入电转仪中，启动对细胞的电脉冲；(5)脉冲结束后，尽可能快地取出电转杯，室温下迅速加入900pLSOC培养液于电转杯中，混匀后转入Ep管中，于37'C恒温箱中培养lh;用培养lh的电转产物涂布在LA(Amp)平板上，倒置平皿于37"C恒温箱中培养12-16h。一种IL-24与EGF融合蛋白，该融合蛋白由具有如SEQIDNo.l所示的核苷酸序列编码。而且，该融合蛋白是由如下步骤得到(1)将IL-24与EGF融合基因原核表达载体电击转化入感受态细菌E.co/氾L21，并在LA(Amp)培养基中筛选培养；(2)挑取阳性克隆，将含有IL-24与EGF融合基因原核表达载体的E.co//BL21在LB(Amp)中培养，以1%的接种于LB(Amp)培养液中，于37°C培养约为至A600nm约为0.6时，加入lmmol/LIPTG，于3(TC继续诱导培养4h，离心收集菌体，经超声破碎后，提取融合蛋白，通过Gluthathion-Sepharose4B亲和层析柱进行纯化。而且，所述的电击转化的方法步骤为、(1)在-8(TC冰箱中取出感受态细胞置冰上融化，同时将电转杯也放在冰上预冷；(2)打开电击仪，调整到Ecl档，电压为1800V;(3)将上述连接产物.10pL与感受态细菌40pL混合，在冰上震动电转杯以确保细胞与DNA悬液位于电转杯底部；(4)用纸巾擦去电转杯上的冷凝水和冰渣，放入电转仪中，启动对细胞的电脉冲；(5)脉冲结束后，尽可能快地取出电转杯，室温下迅速加入900pLSOC培养液于电转杯中，混匀后转入Ep管中，于37"C恒温箱中培养lh;用培养lh的电转产物涂布在LA(Amp)平板上，倒置平皿于37。C恒温箱中培养12-16h。一种IL-24与EGF融合蛋白在制备抗肿瘤药物中的应用。本发明的有益效果和优点是1.本发明通过重组PCR技术构建IL-24与EGF融合基因，通过设计引物将IL-24和EGF连接处引入一段柔性得连接臂，使IL-24与EGF发挥各自的生物学功能，EGF与肿瘤细胞表面高表达的EGF受体结合，增强了对肿瘤细胞的耙向性。2.本发明构建了IL-24与EGF融合基因原核高效表达载体，其表达工程菌具有表达量高，表达稳定的优点，所采取的纯化工艺稳定可靠，效率高，原核表达具有操作方便、快捷，需时较短，表达量大，适合工业化生产的优点。..3.本发明IL-24与EGF融合蛋白大多以可溶性非包含体形式存在于胞质中，方便后继的纯化步骤或检测，经阴离子交换柱层析纯化，纯度大于80%，IL-24与EGF融合蛋白处理后，培养的A549肺癌细胞均增殖缓慢，生长得到抑制，而且随着浓度梯度增加抑制更加明显。图1为本发明重组IL-24融合基因质粒与pET22b构建示意图；图2为本发明IL-24与EGF受体干扰序列融合基因双酶切鉴定电泳图；其中M:DNAmarker;1:pET22b(BamHI+HindlII);2:IL-24融合基因重组PET22b(BamHI+Hindl11)。图3为IL-24与EGF融合蛋白与IL-24蛋白分别对A549肺癌细胞生长的抑制率图；其中固表示IL-24与EGF融合蛋白的抑制率；令表示IL-24蛋白的抑制率。具体实施方式本发明通过以下实施例进一歩详述，下述实施例是说明性的，不是限定性的，不能以下述实施例来限定本发明的保护范围。IL-24的扩增与纯化.一种IL-24与EGF融合基因，其中该融合基因的核苷酸序列如SEQIDNo.l所示。一种IL-24与EGF融合基因原核表达载体，其中该载体具有如SEQIDNo.l所示的核苷酸序列。一种IL-24与EGF融合基因原核表达载体的构建方法，其中该方法的歩骤如下(DIL-24的扩增与纯化根据人IL-24GeneBank(NM006850)序列设计引物，上游引物5，-CGCGGATCCGCAAGAATTCCACTTTGGGC-3，，含BamHI酶切位点；下游引物5，-CCCAAGCTTGAGCTTGTAGAATTTCTGCATC-3，，含HindIII酶切位点；引物由上海英骏公司合成；模板为插入人IL-24完整编码区基因的质粒PMAL-c2x;扩增的反应条件为95"C预变性2分钟，以95t:变性36秒，56'C退火36秒，72匸延伸1分钟24秒，扩增25个循环，再以72。C延伸5分钟，PCR扩增产物经8g/L琼脂糖凝胶电泳，将目的条带切下，用DNA试剂盒回收纯化。(2)重组质粒pET22b-IL-24的构建与鉴定将步骤(l)中纯化的PCR产物和载体pET22b用BamHI和HindIII双酶切后，分别用DNA试剂盒回收纯化酶切产物，在T4DNA连接酶作用下定向连接IL-24至pET22b，将连接产物转化入DH5a感受态细菌中，在LA(Amp)培养基中筛选培养，挑取阳性克隆，培养后提取质粒，采用BamHI和HindIII双位点单、双酶切鉴定，送交大连宝生物有限公司测序。(3)IL-24与EGF融合基因的获得第-一次PCR:上.游引物5，TGGCTCTGCCCAGGGCCAAGAAGGG-3，含BamHI酶切位点和连接肽片断；下游引物5,-CCCAAGCTTGAGCTTGTAGAATTTCTGCATC画3，含Hindlll酶切位点，引物由上海英骏公司合成；以重组质粒pET22b-IL-24为模板，采用上述引物进行PCR扩增，扩增的反应条件为94。C预变性3分钟，以95°C变性30秒，47。C退火l分钟，72。C延伸1分钟30秒，扩增30个循环，再以72r延伸10分钟，PCR扩增产物经8g/L琼脂糖凝胶电泳，将目的条带切下后，用DNA试剂盒回收纯化；第二次PCR:上游引物5'TAGTTCTC-3，含BamHI酶切位点和EGF受体片断；下游引物5，画CGCGGATCCGCAAGAATTCCACTTTGGGC-3，，含HindIII酶切位点，引物由上海英骏公司合成；以第一次PCR回收产物为模板，采用上述引物进行PCR扩增，扩增的反应条件为94'C预变性2分钟，以95°C变性30秒，51°C退火l分钟，72。C延伸1分钟30秒，扩增30个循环，再以72°C延伸10分钟，PCR扩增产物经8g/L琼脂糖凝胶电泳，将目的条带切下后，用DNA试剂盒回收纯化。(4)IL-24与EGF融合基因原核表达载体的构建与鉴定将歩骤(3)中第二次PCR纯化的产物和载体PET22b用BamHI和HindIII双酶切后，分别用DNA试剂盒回收纯化酶切产物，在T4DNA连接酶作用下定向连接IL-24融合基因至PET22b;用电击转化的方法将连接产物转化入DH5a感受态细胞中，在LA(Amp)培养基中筛选培养，挑取阳性克隆，培养后提取质粒，采用BamHI和HindIII双位点单、双酶切鉴定，选取阳性克隆，送交上海英俊公司测序；pET22b大小为5493bp，扩增产物IL-24融合基因大小为558bp，进行琼脂糖凝胶电泳鉴定，电泳图中出现两条明显的条带，分别在5500bp和600bp左右，大小与预期值基本吻合，表明目的基因已正确插入pET22b中，阳性克隆测序结果预期的融合基因序列一致。前述步骤(4)中电击转化的方法步骤为(1)在-80。C冰箱中取出感受态细胞置冰上融化，同时将电转杯也放在冰上预冷；(2)打开电击仪，调整到Ecl档，电压为1800V;(3)将上述连接产物lO^L与感受态细菌40pL混合，在冰上震动电转杯以确保细胞与DNA悬液位于电转杯底部；(4)用纸巾擦去电转杯上的冷凝水和冰渣，放入电转仪中，启动对细胞的电脉冲；(5)脉冲结束后，尽可能快地取出电转杯，室温下迅速加入900pLSOC培养液于电转杯中，混匀后转入Ep管中，于37"C恒温箱中培养lh;用培养lh的电转产物涂布在LA(Amp)平板上，倒置平皿于37X:恒温箱中培养15h。一禾中IL-24与EGF融合蛋白，其中该融合蛋白由具有如SEQIDNo.l所示的核苷酸序列编码，并且该融合蛋白是由如下步骤得到其一将IL-24与EGF融合基因原核表达载体电击转化入感受态细菌E.co/氾L21(转化感受态E.co/氾L21大肠杆菌感受态制备按常规方法进行)，在LA(Amp)培养基中筛选培养，电击转化的方法如下(1)在-8(TC冰箱中取出感受态细胞置冰上融化，同时将电转杯也放在冰上预冷。(2)打开电击仪，调整到Ecl档，电压为1800V，(3)将上述连接产物10pL与感受态细菌40pL混合，在冰上震动电转杯以确保细胞与DNA悬液位于电转杯底部。(4)用纸巾擦去电转杯上的冷凝水和冰渣，放入电转仪中，启动对细胞的电脉冲。(5)脉冲结束后，尽可能快地取出电转杯，室温下迅速加入900pLSOC培养液于电转杯中，混匀后转入Ep管中，于37。C恒温箱中培养lh。用培养lh的电转产物涂布在含Amp的LA平板上，倒置平皿于37。C恒温箱中培养12-16h。其二挑取阳性克隆，将含有重组表达质粒的E.coliBL21在LB(Amp)中培养。以1。/。的接种于LB(Amp)培养液中，于37。C培养约为至A600nm约为0.6时，加入lmmol/LIPTG，于30。C继续诱导培养4h。离心收集菌体，经超声破碎后，提取融合蛋白，通过Gluthathion-Sepharose4B亲和层析柱进行纯化。将纯化融合蛋白进行SDS-PAGE(浓縮胶浓度为50g/L，分离胶浓度为120g/L)分析后，用考马斯亮蓝R250染色4h，用甲醇-冰醋酸脱色液脱色后观察结果。结果表明，经3(TC温度诱导表达4小时后得最高表达量，约占菌体总蛋白的25%，分析表明融合蛋白表达融合蛋白主要为包涵体，超声波破碎后，经阴离子柱纯化后，纯度达80%以上。IL-24与EGF融合蛋白生物学活性的检测收获稳定表达的IL-24与EGF融合基因的IL-24与EGF融合蛋白，对A549肺癌细胞进行体外抗肿瘤测试。向96孔细胞培养板中每孔加入200pLA549肺癌细胞。表达纯化的IL-24与EGF融合蛋白过滤除菌后分别加入96孔细胞培养板中。使终浓度分别为5mg/L、10mg/L、20mg/L和40mg/L，同时设立相应浓度梯度的IL-24蛋白组、pET22b蛋白组、A549肺癌细胞对照组及空白组均设6个复孔。置手37。C、50mg/LC02条件下培养72h后，用MTT法测定A570值，计算不伺浓度融合蛋白及IL-24蛋白对A549细胞生长的抑制率。抑制率=[(对照组平均A值-实验组平均A值)/对照组平均A值)]x100结果表明，IL-24蛋白、IL-24与EGF融合蛋白处理后，培养的A549肺癌细胞均增殖缓慢，生长抑制，而且随着浓度梯度增加而明显。但与相同浓度梯度的IL-24蛋白组，20mg/L和40mg/LIL-24融合蛋白作用72h后，A549细胞的生长受到明显的抑制，抑瘤效果明显优于IL-24蛋白。本IL-24与EGF融合蛋白可以添加到制备抗肿瘤药物中，例如添加到抗肺癌、肝癌、口腔癌以及乳腺癌的药物中。序列表SEQUENCELISTING(1)SEQIDNo.1的信息(i)序列特征(A)长度558bp(B)类型核酸(C)链性单链(D)拓扑结构线性(ii)分子类型DNA'(iii)序列描述SEQIDNo.l:线的为EGF序列，斜体的为连接肽序列)权利要求1.一种IL-24与EGF融合基因，其特征在于该融合基因的核苷酸序列如SEQIDNo.1所示。2.—种IL-24与EGF融合基因原核表达载体，其特征在于该载体具有如SEQIDNo.l所示的核苷酸序列。3.—种如权利要求2所述的IL-24与EGF融合基因原核表达载体的构建方法，其特征在于该方法的步骤如下(D.IL-24的扩增与纯化根据人IL-24GeneBank序列设计引物，其上游引物5，-CGCGGATCCGCAAGAATTCCACTTTGGGC-3，，含BamHI酶切位点；其下游引物5，-CCCAAGCTTGAGCTTGTAGAATTTCTGCATC-3，，含Hindlll酶切位点；模板为插入人IL-24完整编码区基因的质粒PMAL-c2x;扩增的反应条件为95'C预变性2分钟，以95。C变性36秒，56。C退火36秒，72'C延伸1分钟24秒，扩增25个循环，再以72°C延伸5分钟，PCR扩增产物经8g/L琼脂糖凝胶电泳，将目的条带切下，用DNA试剂盒回收纯化；(2).重组质粒pET22b-IL-24的构建与鉴定将步骤(l)中纯化的PCR产物和载体pET22b用BamHI和HindIII双酶切后，分别用DNA试剂盒回收纯化酶切产物，在T4DNA连接酶作用下定向连接IL-24至pET22b，将连接产物转化入DH5a感受态细菌中，在LA(Amp)培养基中筛选培养，挑取阳性克隆，培养后提取质粒，采用BamHI和HindIII双位点单、双酶切鉴定，测序；(3).IL-24与EGF融合基因的获得第一次PCR:上游引物5'TGGCTCTGCCCAGGGCCAAGAAGGG-3，含BamHI酶切位点和连接肽片断；下游引物5，-CCCAAGCTTGAGCTTGTAGAATTTCTGCATC-3，含Hindlll酶切位点，以重组质粒pET22b-IL-24为模板，采用上述引物进行PCR扩增，扩增的反应条件为94"C预变性3分钟，以95。C变性30秒，47。C退火1分钟，72"C延伸1分钟30秒，扩增30个循环，再以72"C延伸10分钟，PCR扩增产物经8g/L琼脂糖凝胶电泳，将目的条带切下后，用DNA试剂盒回收纯化；第二次PCR:上游弓l物5，-CGCGGATCCCGCTGCTCCCATGGCTACACTGGTATTCGTTGCCAAGCAGTAGTTCTC-3，含BamHI酶切位点和EGF受体片断；下游引物5，-CGCGGATCCGCAAGAATTCCACTTTGGGC-3，，含HindIII酶切位点，以第一次PCR回收产物为模板，采用上述引物进行PCR扩增，扩增的反应条件为94。C预变性2分钟，以95°C变性30秒，51°C退火1分钟，72r延伸1分钟30秒，扩增30个循环，再以72°C延伸10分钟，PCR扩增产物经8g/L琼脂糖凝胶电泳，将目的条带切下后，用DNA试剂盒回收纯化；(4).IL-24与EGF融合基因原核表达载体的构建与鉴定将步骤(3)中第二次PCR纯化的产物和载体PET22b用BamHI和HindIII双酶切后，分别用DNA试剂盒回收纯化酶切产物，在T4DNA连接酶作用下定向连接IL-24融合基因至PET22b;用电击转化的方法将连接产物转化入DH5a感受态细胞中，在LA(Amp)培养基中筛选培养，挑取阳性克隆，培养后提取质粒，采用BamHI和HindIII双位点单、双酶切鉴定，选取阳性克隆，测序。4.根据权利要求3所述的IL-24与EGF融合基因原核表达载体的构建方法，其特征在于所述电击转化的方法步骤为(1)在-8(TC冰箱中取出感受态细胞置冰上融化，同时将电转杯也放在冰上预冷；(2)打开电击仪，调整到Ecl档，电压为1800V;(3)将上述连接产物10pL与感受态细菌40pL混合，在冰上震动电转杯以确保细胞与DNA悬液位于电转杯底部；(4)用纸巾擦去电转杯上的冷凝水和冰渣，放入电转仪中，启动对细胞的电脉冲；(5)脉冲结束后，尽可能快地取出电转杯，室温下迅速加入900pLSOC培养液于电转杯中，混匀后转入Ep管中，于37"C恒温箱中培养lh;用培养lh的电转产物涂布在LA(Amp)平板上，倒置平皿于37。C恒温箱中培养12-16h。5.—种IL-24与EGF融合蛋白，其特征在于该融合蛋白由具有如SEQIDNo.l所示的核苷酸序列编码。6.根据权利要求5所述的IL-24与EGF融合蛋白，其特征在于该融合蛋白是由如下步骤得到(1)将IL-24与EGF融合基因原核表达载体电击转化入感受态细菌E.co/z'BL21，并在LA(Amp)培养基中筛选培养；(2)挑取阳性克隆，将含有IL-24与EGF融合基因原核表达载体的E.co//BL21在LB(Amp)中培养，以1%的接种于LB(Amp)培养液中，于37°C培养约为至A600nm约为0.6时，加入lmmol/LIPTG，于30。C继续诱导培养4h，离心收集菌体，经超声破碎后，提取融合蛋白，通过Gluthathion-Sepharose4B亲和层析柱进行纯化。7.根据权利要求6所述的IL-24与EGF融合蛋白，其特征在于所述的电击转化的方法步骤为(1)在-80。C冰箱中取出感受态细胞置冰上融化，同时将电转杯也放在冰上预冷；(2)打开电击仪，调整到Ecl档，电压为1800V;(3)将上述连接产物10pL与感受态细菌40pL混合，在冰上震动电转杯以确保细胞与DNA悬液位于电转杯底部；(4)用纸巾擦去电转杯上的冷凝水和冰渣，放入电转仪中，启动对细胞的电脉冲；(5)脉冲结束后，尽可能快地取出电转杯，室温下迅速加入900pLSOC培养液于电转杯中，混匀后转入Ep管中，于37"C恒温箱中培养lh;用培养lh的电转产物涂布在LA(Amp)平板上，倒置平皿于37。C恒温箱中培养12-16h。8.—种IL-24与EGF融合蛋白，其特征在于在制备抗肿瘤药物中的应用。全文摘要本发明涉及一种IL-24与EGF的融合基因原核载体的构建及其应用，其中IL-24与EGF融合基因的核苷酸序列如SEQIDNo.1所示；IL-24与EGF融合基因原核表达载体，其中该融合基因具有如SEQIDNo.1所示的核苷酸序列；IL-24与EGF融合蛋白，其中该融合蛋白具有如SEQIDNo.1所示的核苷酸序列编码。本发明证明IL-24与EGF融合蛋白在治疗肺癌细胞中的应用，能够明显提高IL-24抑制肺癌细胞生长的作用。本发明能使IL-24与EGF发挥各自的生物学功能，增强了对肿瘤细胞的靶向性，所采取的纯化工艺稳定可靠，效率高，适合工业化生产。文档编号C12N15/62GK101225397SQ20071006020公开日2008年7月23日申请日期2007年12月25日优先权日2007年12月25日发明者包乐媛,杜连祥,樊欣迎,贺王,王建玲,王春霞,路福平申请人:天津科技大学