专利名称：闭环式聚合酶链反应系统及其制造方法
技术领域：
本发明属于生命科学与生物技术领域， 一般涉及用于化学及生物化学分析、化学及生物 传感、合成和检测的微型仪器，尤其涉及一种生物、疾病诊断治疗、化学及医药实验检测领 域的闭环式聚合酶链反应系统及其制造方法。
背景技术：
聚合酶链反应(PCR)是20世纪80年代中期发展出来的体外核酸扩增技术，其原理类似于 DNA的体内复制，只是在试管中给DNA的体外合成提供一种合适的条件，能在一个试管内将 一种目标基因或某一 DNA片段于数小时内扩增至十万乃至百万倍，使肉眼能直接观察和判断。
聚合酶链反应技术与聚合酶链反应装置被认为是生物医学领域中的一项革命性创举和里 程碑，并开始用于融微电子学、生物学、物理学、化学、材料学、计算机科学、成型加工技 术为一体的生物芯片，以对细胞、DNA、蛋白质等生物组分进行准确、快捷和大信息量的检测 分析，在疾病诊断治疗、疾病预测预防、新药研究开发、农作物育种、环境检测以及食品安 全监测等多方面具有广泛用途，市场潜力巨大，成为国际生命科学与生物技术产业最重要的 增长点和竞争焦点之一。
目前常见的生物芯片分为三类第一类为微阵列芯片，包括基因芯片、蛋白芯片、细胞 芯片和组织芯片；第二类为微流控芯片，包括各类样品制备芯片、聚合酶链反应芯片、毛细 管电泳芯片和色谱芯片等；第三类为以生物芯片为基础的集成化分析系统，即芯片实验室。 "芯片实验室"可以将诸如样品的前处理、样品制备、待测物分离、试剂输送、生化反应、 结果检测等集成在微小的芯片上来实现的，并依靠一些检测方法如电化学检测法和光学检测 法，将化学信号转换成电信号或光学信号，再经计算机或其他信号处理装置进行解释。这些 微型集成化分析系统携带方便，可用于紧急场合、野外操作甚至放在航天器上。
在芯片上进行聚合酶链反应，可以节约实验试剂，提高反应速度，并可完成多个片段的 扩增反应。当前，由于检测和分析的灵敏度所限，通常在对微量核酸样品进行检测时必须事 先对其进行一定程度的扩增。所以用于聚合酶链反应的芯片无疑为快速大量扩增样品多个DNA
片段提供了有力的工具。而且随着聚合酶链式反应技术的发展，应用聚合酶链反应的DNA生 物传感器也越来越多。
中国专利ZL99114950.5公开了一种由含双链引物的DNA体外扩增技术。首先根据待扩 增的銜BNA序列合成一对特异性的单链引物，再分别合成与其互补的两条引物，并对后者 的3' —末端进行修饰，使其失去延伸能力，然后让它们分别退火成双链引物。将该双链引 物、耐热DNA聚合酶、dNTP底物、模板DNA、镁离子、P C R缓冲液、超纯水等混匀 成反应体系，在热循环仪上进行高温、低温、中温的反复热循环，从而获得上百万拷贝的特异的靶DNA片段。
中国专利ZL94230813. l涉及了一种聚合酶链反应仪，有一个铝板箱壳，壳内装有金属板 反射盒，盒底装有碘钨灯，反射盒一侧安装着离心风扇，风扇出口对着反射盒的开口处，反 射盒上面敞口箱壳上盖着箱盖，箱盖下面固定着电路板和铜质导热模板，导热模板下有数 排用于放置离心管的凸模管体。但是，该发明并不能应用于生物芯片。
中国专利公开说明书CN01221110. 9公开了一种荧光定量聚合酶链反应诊断仪。它包括置 于箱体内的热循环装置，荧光检测装置、控制电路和置于箱体外的计算机，利用计算机、微 处理器控制，在热循环装置对靶基因实施扩增的同时，采用荧光检测装置对被检物和标准物 的荧光强度进行检测，并由计算机软件将被检物和标准物的荧光强度作比较，由于靶基因强 度与荧光强度成比例，因此可自动、快速实现对靶基因浓度的实时定量检测，由于整个检测 过程是在完全密闭的试管中进行，因此检测物不会受到环境污染。然而，该公开说明书公开 的诊断仪较为昂贵
中国专利公开说明书CN03274594. X涉及了一种组成聚合酶链反应试剂盒的容器，该容器 由基座l，带有中间分隔4的桶状液体容纳部分6，和帽7四部分构成，其中塑料基座l，桶 状液体容纳部分6，及其内的分隔板4是一个完整的塑料注塑件，帽7则可以自由取下，分 隔板4将桶状液体容纳部分分隔成第一和第二容室，其中第一容室2嵌入基座并容纳包括缓 冲液与底物的辅助试剂溶液，第二容室3嵌入基座并容纳包括Taq酶及DNA引物和探针的核 心试剂溶液，上层则用石蜡油层5封固。所说的容器可以是具有适当容积的小管或空心圆柱 体。然而，该公开说明书公开的不能广泛应用于生物芯片。
发明内容
本发明的目的是提供一种低成本、快速、高效、高灵敏度地帮助生物分子杂交、检测的 闭环式聚合酶链反应系统，以克服现有聚合酶链反应系统的缺陷。
本发明的另一个目的是提供一种低成本、可靠、高效的聚合酶链反应系统的制造方法， 以克服现有聚合酶链反应系统制造方法中存在的缺陷。
本发明的显著特点是按照本发明制造的闭环式聚合酶链反应系统可以大幅度提高现有 生物芯片或其系统的杂交速度、检测灵敏度和精确度，大幅度扩大现有生物芯片或其系统的 应用范围以及扩大其检测样品种类。
本发明涉及的闭环式聚合酶链反应系统包括具有液体流道的基材，开关阀件，丝状或面 状电加热元件，控制系统。该液体流道具有三段不同温度的区间具有至少一个进口、至少一 个出口和/或气体逸出口，流道的三段温度区由三个开关阀件隔开，每段温度区分别由各自的 WV元,供热；其中，第1度"M钓末端通过第一开关树件与第二温度区韵始端枏连，-第三 温度区的末端通过第二开关阀件与第三温度区的始端相连，第三温度区的末端通过第三开关 阀件与第一温度区的始端相连，第一温度区的工作温度维持在DNA变性温度上下，第二温度 区的工作温度维持在D織退火温度上下，第三温度区的工作温度维持在DNA延伸温度上下， 电加热元件为自测控温式电加热元件或借助测温元件调温的电加热元件，通过导线和/或电极 直接或间接与控制系统相连。
涉及的闭环式聚合酶链反应系统中的最高反应温度最好低于105-C。
具有液体流道的基材是由高分子材料、高分子材料混合物或陶瓷形成的一件或多件组合 式中空型材或一层或多层叠合式内含液体流道的板材。
按照本发明，液体流道表面可以没有经历，也可以经历了亲水、疏水、活化和/或易附合 性处理。 ，
本发明涉及的开关阀件包括至少一个弹性或塑料件， 一个可动件；其中，弹性或塑料件 借助可动件通过包括压电技术的电动，气动，液动，热膨胀，手动和/或磁电驱动而运动。
电加热元件和/或测温元件设置在液体流道外壁或内壁，其上面复有或没有保护层。
本发明涉及的闭环式聚合酶链反应系统的温度区的工作温度维持通过控制系统，相应温 度区的温控器、电加热元件、自然降温、外施风冷、水冷和/或中止电加热元件供热来实现。
电加热元件材料包括固态或液态的氧化物、氮化物、碳化物、金属、硅、导电聚合物、 金属合金、金属氧化物中的一种或多种组成的混合物/化合物。
测温元件材料中包括固态或液态的有机金属化合物、金属、金属合金、金属混合物、金 属氧化物、半导体中的一种或多种。
导线或电极材料包括固态或液态的金属物、金属合金、金属混合物、金属化合物中的一 种或多种。
本发明涉及的闭环式聚合酶链反应系统的制造方法包括方法A或方法B;其中， 方法A包括
1) 挤出、注塑和/或压制制得带有流道和/或开关阀件安装空间的基材；
2) 对电加热/测温元件即将固定处进行表面处理后或不进行表面处理直接将固态的电加 热/测温元件和/或其导线/电极材料溅射、粘合或缠绕在流道内壁或外壁，或将液态的电加热 元件材料、测温元件材料、导线材料和/或电极材料印刷或喷涂在流道内壁或外壁；
3) 在自然空气或惰性气体中、低于69(TC温度下烧结由液态材料形成的层或线至少0.5 分钟，以制得电加热元件、测温元件、导线和/或电极；
4) 在电加热元件、测温元件、导线和/或电极上面施加保护层和/或安置开关阀件，使流 道前尾接合成闭环式结构；或
5) 系统组合； 方法B包括-
1) 挤出制造内有流道的中空型材；
2) 开设开关阀件安装空间、液体进出口和/或气体逸出口；
3>在中空型材外壁上,固^ 阻丝/-膜和/或测温簿膜，或印耕或喷涂液态的龟加热 元件材料、测温元件材料、导线材料和/或电极材料；
4)在自然空气或惰性气体中、低于690'C温度下烧结由液态材料形成的层或线至少0.5 分钟，以制得电加热元件、测温元件、导线和/或电极； 5) 在电加热元件、测温元件、导线和/或电极上面施加保护层和/或安置开关阀件，使流 道前尾接合成闭环式结构或
6) 系统组合。
附图1是本发明所涉及的闭环式聚合酶链反应系统中闭环结构部分示意图。 附图2是本发明所涉及的另一实施例的闭环式聚合酶链反应系统中闭环结构部分示意 图。、
附图3是本发明所涉及的再一个实施例的闭环式聚合酶链反应系统中闭环结构部分示意图。
附图4是本发明所涉及的又一个实施例的闭环式聚合酶链反应系统中闭环结构部分剖面 示意图。 、
附图5是本发明所涉及的闭环式聚合酶链反应系统示意图。
具体实施例方式
附图1至附图5是根据本发明精神构成的几种形式的闭环式聚合酶链反应系统的示意图。 但本发明涉及的闭环式聚合酶链反应系统并不仅限于这些图例。
如附图1至附图5所示，本发明实施例中包括基材盖板(l)，基材底板(2)，液体流道 (3)，测温元件(4)，电加热元件(5)，气体逸出口(6)，基材中间板(7)，弹性或塑料件(8)， 可动件(9)，控制系统(IO)，导线或控制线(ll)，导线或控制线(12)，导线或控制线(13),开 关阀件(14)，液体流道进口 (20)，液体流道出口 (30)，第一开关阀件(VI)，第二开关阀件(V2)， 第三开关阀件(V3)，第一温度区(Z1)，第二温度区(Z2)，第三温度区(Z3)。
附图中箭头指向是液体流动方向。
下面结合附图和实施例对本发明进一步说明，但本发明并不限于在实施方式说明范围内。 实施方式l
如附图1至附图5所示的闭环式聚合酶链反应系统及其闭环结构部分包括具有液体流道 (3)的基材(基材盖板(1)，基材底板(2)，基材中间板(7))，开关阀件(14)(细分为第一开关阀 件<￥1>，第二开，件(V2)，第三开关阀件〈V3))，丝状或面状电加热元件(分，控餅系统(M))， 聚合酶链反应系统中的液体流道(3)具有三段不同温度的区间(细分为第一温度区(Z1)，第二 温度区(Z2)，第三温度区(Z3)),液体流道(3)具有至少一个进口(20)、至少一个(30)出口和/ 或气体逸出口(6)，液体流道(3)的三段温度区由三个开关阀件(第一开关阀件(V1)，第二开关
阀件(V2)，第三开关阀件(V3))隔开，每段温度区分别由各自的电加热元件(5)供热；其中， 第一温度区(Zl)的末端通过第二开关阀件(V2)与第二温度区(Z2)的始端相连，第二温度区的 末端通过第三开关阀件(V3)与第三温度区(Z3)的始端相连，第三温度区(Z3)的末端通过第一 开关阀件(V1)与第一温度区的始端相连，第一温度区(Z1)的工作温度维持在DNA变性温度上 下，第二温度区(Z2)的工作温度维持在DNA退火温度上下，第三温度区(Z3)的工作温度维持 在DNA延伸温度上下，电加热元件(5)为自测控温式电加热元件或借助测温元件(4)调温的电 加热元件，通过导线或控制线(ll， 12， 13)，和/或电极(未图示)直接或间接与控制系统(10) 相连。操作时，液体朝附图中箭头指向方向流动。
实施方式2
在控制系统(10)控制下，反应前，第一开关阀件(V1)、第二开关阀件(V2)、第三开关阀 件(V3)均开启(进出口开关件(未图示)关闭)，然后按顺序将第一开关阀件(V1)、第三开关 阀件(V3)和第二开关阀件(V2)关闭，以将液体流道(3)中的空气从气体逸出口(6)(此时气体 逸出口开启)排出。聚合酶链反应链反应操作开始时，使反应液体由装置中的液体进入口 (20) 进入第一温度区(Z1)，此时，开关阀件(V1， V2， V3)及进出口开关件(未图示)均已关闭，进 行变性反应。达到预定时间，开关阏件(V2， V3)顺序开启(但第三开关阀件(V3)瞬时关闭)， 以依靠开关阀件(14)中的弹性或塑料件(8)的快速运动而产生的吸力，驱使第一温度区(Z1) 内的液体进入第二温度区(Z2)(此时之后关闭开关阀件(V2， V3))，进行退火反应。达到预定 时间，开关阀件(V1， V3)顺序开启(但第一开关阀件(V1)瞬时关闭)，进行延伸反应，达到预 定时间。如此循环，直至整个聚合酶链反应结束，开启出口开关件(未图示)排出已完成聚合 酶链反应的液体。
实施方式3
在控制系统(10)控制下，以外力(如气力，弹性超声波力，(未图示))将待聚合酶链反 应的液体从进口驱入第一温度区(Z1)，此时，开关阀件(V1， V2， V3)及出口开关件(未图示) 均已关闭，进行变性反应。达到预定时间，开关陶件(V2)开启，反应液体在外力作用下进入 第二温度区(Z2)，进行退火反应。达到预定时间，开关阀件(V3)开启，反应液体在外力作用 下迸入第三温度区(Z3)，进行延伸反应，达到预定时间。开关阀件(V1)开启反应液体在外力 作用下进入第一温度区(Z1)，再进行变性反应，如此循环，直至整个聚合酶链反应反应结束， 开启出口开关件(未图示)排出已完成聚合酶链反应的液体。
权利要求
1、一种闭环式聚合酶链反应系统，该系统包括具有液体流道的基材，开关阀件，丝状或面状电加热元件，控制系统，其特征在于该液体流道具有三段不同温度的区间具有至少一个进口、至少一个出口和/或气体逸出口，流道的三段温度区由三个开关阀件隔开，每段温度区分别由各自的加热元件供热；其中，第一温度区的末端通过第一开关阀件与第二温度区的始端相连，第二温度区的末端通过第二开关阀件与第三温度区的始端相连，第三温度区的末端通过第三开关阀件与第一温度区的始端相连，第一温度区的工作温度维持在DNA变性温度上下，第二温度区的工作温度维持在DNA退火温度上下，第三温度区的工作温度维持在DNA延伸温度上下，电加热元件为自测控温式电加热元件或借助测温元件调温的电加热元件，通过导线和/或电极直接或间接与控制系统相连。
2、 根据权利要求1所述的闭环式聚合酶链反应系统，其特征在于所述的具有液体流道的基材是由高分子材料、高分子材料混合物或陶瓷形成的一件或多件组合式中空型材或一层 或多层叠合式内含液体流道的板材。
3、 根据权利要求1所述的闭环式聚合酶链反应系统，其特征在于所述的液体流道表面没有经历或经历了亲水、疏水、活化和/或易附合性处理。
4、 根据权利要求l所述的闭环式聚合酶链反应系统，其特征在于所述的开关阀件包括至少一个弹性或塑料件， 一个可动件；其中，弹性或塑料件借助可动件通过包括压电技术的电动，气动，液动，热膨胀，手动和/或磁电驱动而运动。
5、 根据权利要求l所述的闭环式聚合酶链反应系统，其特征在于所述的电加热元件和 /或测温元件设置在液体流道外壁或内壁，其上面复有或没有保护层。
6、 根据权利要求1所述的闭环式聚合酶链反应系统，其特征在于所述的温度区的工作 温度维持通过控制系统，相应温度区的温控器、电加热元件、自然降温、外施风冷、水冷和/ 或中止电加热元件供热来实现。
7、 根据权利要求l所述的闭环式聚合酶链反应系统，其特征在于所述的电加热元件材 料包括固态或液态的氧化物、氮化物、碳化物、金属、硅、导电聚合物、金属合金、金属氧 化物中的一种或多种组成的混合物/化合物。
8、 根据权利要求1所述的闭环式聚合酶链反应系统，其特征在于所述的测温元件材料 中包括固态或液态的有机金属化合物、金属、金属合金、金属混合物、金属氧化物、半导体 中的一种或多种。
9、 根据权利要求l所述的闭环式聚合酶链反应系统，其特征在于所述的导线或电极材 .料包括固态或液态的金属物、金属合金、金属混合物、金属化合物中的一种或多种。
10、 如权利要求1所述的闭环式聚合酶链反应系统的制造方法，其特征在于其制造方法包括方法A或方法B，其中，方法A包括1) 挤出、注塑和/或压制制得带有流道和/或开关阀件安装空间的基材；2) 对电加热/测温元件即将固定处进行表面处理后或不进行表面处理直接将固态的电加热/测温元件和/或其导线/电极材料溅射、粘合或缠绕在流道内壁或外壁，或将液态的电加热 元件材料、测温元件材料、导线材料和/或电极材料印刷或喷涂在流道内壁或外壁；3) 在自然空气或惰性气体中、低于690℃温度下烧结由液态材料形成的层或线至少0.5 分钟，以制得电加热元件、测温元件、导线和/或电极；4) 在电加热元件、测温元件、导线和/或电极上面施加保护层和/或安置开关阀件，使流 道前尾接合成闭环式结构；或5) 系统组合； 方法B包括1) 挤出制造内有流道的中空型材；2) 开设开关阀件安装空间、液体进出口和/或气体逸出口；3) 在中空型材外壁上缠绕固态热电阻丝/膜和/或测温簿膜，或印制或喷涂液态的电加热 元件材料、测温元件材料、导线材料和/或电极材料；4) 在自然空气或惰性气体中、低于690℃温度下烧结由液态材料形成的层或线至少0.5分钟，以制得电加热元件、测温元件、导线和/或电极；5) 在电加热元件、测温元件、导线和/或电极上面施加保护层和/或安置开关阀件，使流道前尾接合成闭环式结构；或6) 系统组合。
全文摘要
本发明涉及一种闭环式聚合酶链反应系统及其制造方法，该系统包括具有液体流道的基材，开关阀件，丝状或面状电加热元件，控制系统；液体流道具有三段不同温度的区间具有至少一个进口、至少一个出口和/或气体逸出口，流道的三段温度区由三个开关阀件隔开，每段温度区分别由各自的加热元件供热。
文档编号C12M1/34GK101200694SQ20071006002
公开日2008年6月18日 申请日期2007年10月25日 优先权日2007年10月25日
发明者刘文韬, 刘津平, 霞 高 申请人:刘文韬