专利名称：抗人cd52单克隆抗体杂交瘤细胞系、单克隆抗体、工程抗体、载体、试剂盒及其用途的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种可以特异性识别人CD52分子，用于白血病的诊断、预 后判断，清除正常免疫细胞或治疗白血病和自身免疫性疾病的抗人CD52 单克隆抗体杂交瘤细胞系、单克隆抗体、工程抗体、载体、试剂盒及其用途。
技术背景白血病是威胁人类生命健康的主要几种疾病之一，在我国发病率大约 为2.76/100000人。其中急性淋巴细胞白血病多见于儿童，急性髓系白血 病多见于成年人，而慢性白血病多发于40岁以上人群。它是一类起源于造 血(或淋巴)干细胞的恶性疾病。由于干细胞受损，白血病细胞失去进一 步分化成熟的能力，或者增殖与分化能力不平衡，而停滞在细胞发育的不 同阶段，具体表现为细胞在体内无限增殖，而其分化成熟和凋亡受阻。白血 病与其它癌症一样， 一直因为没有特应性的标志导致无法用常规药物准确 杀伤白血病细胞。白血病细胞与正常细胞的区别目前认为主要在于某些生 物分子的表达量不同，利用这些特征，特别是与造血干/祖细胞的区别可以 在一定程度上杀伤白血病细胞而不影响造血的重建。特异性识别某种细胞 膜表面分子的抗体正是实现这一目的的最好工具，目前利用抗体治疗白血 病主要是通过以下三种途径抗体结合白血病细胞后通过补体依赖的细胞 毒和抗体依赖细胞介导的细胞毒直接杀伤白血病细胞；抗体结合白血病细 胞表面分子，通过所引发的下游信号诱导白血病细胞分化或凋亡；通过抗 体的耙向作用将杀伤性药物或效应物带入白血病细胞内达到局部杀伤的目 的等。人类CD52分子属于 一 个未命名的短链 GPI (Glycosy1-phosphatidylinositol，糖基磷脂酰肌醇)锚定糖蛋白家族。 它由一条很短的肽链组成，只有12个氨基酸残基(GQNDTSQTSSPS)，在C 末端通过GPI锚定分子连接于细胞膜表面，N末端3位天冬酰胺连接有一个复杂的糖基。CD52分子是一种分布比较广泛的抗原，分布于造血系统的淋 巴细胞，单核细胞，嗜酸粒细胞上和单核细胞分化的树突状细胞。在雄性生殖系统中的附睾和输精管上皮细胞也有CD52分子的表达。在很多淋巴系 细胞恶性肿瘤和某些急性髓系白血病细胞上也都有CD52分子不同程度的表 达。Quigley應等报道，在92%-100%的毛细胞白血病细胞上都有CD52分 子表达。最近有报道，血液中存在从细胞表面脱落的可溶性CD52分子可以 作为慢性淋巴细胞白血病的标志。CD52在集落形成细胞上没有显著表达， 而在某些被认为是淋巴样祖细胞的CD34+A:D38+细胞上有表达，Hale G等 总结了 5000多例用抗CD52单抗处理的干细胞移植研究中证明CD52抗原在 造血干/祖细胞(CD34+/CD38-)上没有表达。CD52分子本身的功能目前并不清楚，其很多间接功能都是通过其相应 抗体获得的，且都与其自身结构特性有关。作为GPI锚定蛋白，CD52分子 被其抗体结合后导致细胞膜重排尽而引发下游信号，对细胞产生影响。另 外CD52分子在细胞表面往往呈高度有序排列，并且其分子很小，非常有利 于补体的激活。体内应用CD52抗体的实验证明，在体内由CD52抗体介导 的靶细胞杀伤主要是通过补体介导的细胞毒作用(CDC)和抗体介导细胞依 赖的细胞毒作用(ADCC)实现的。而CD52的高表达和有序排列都利于这些 作用在体内的发挥。最近还有很多证据表明CD52分子对恶性白血病细胞可能是必须的高 度糖基化带来的负电荷具有抗粘附作用，增加了白血病细胞的迁移能力； CD52阴性细胞致瘤率降低而回输体内CD52分子会重新出现；CD52分子在 同一个个体中在恶性细胞表面的表达显著高于正常细胞。以上这些事实均表明CD52分子对于有目的的免疫细胞清除或白血病 治疗都是一个良好的靶点，并且对于造血干/祖细胞影响较小，特异性识别 CD52分子的抗体具有巨大的潜在药用价值。目前白血病治疗主要采用控制增殖、诱导凋亡的化疗药物，包括烷化 剂、抗代谢药物等。这些药物在杀死白血病细胞的同时，对正常造血细胞也 有严重损伤，故对机体存在严重的毒副作用。此外，白血病细胞常会对化 疗药物产生耐药，同时化疗后复发率较高，严重影响临床化疗药物治疗的 有效性。发明内容本发明所要解决的技术问题是提供一种可特异性识别正常细胞和白血病细胞表达的人CD52分子，并可用于白血病和自身免疫性疾病的诊断、预 后判断，清除正常免疫细胞或杀伤白血病细胞的抗人CD52单克隆抗体杂交 瘤细胞系、单克隆抗体、工程抗体、载体、试剂盒及其用途，提供的单克 隆抗可以在体外抑制多种白血病细胞系的增殖并诱导其凋亡；提供的抗人 CD52单克隆抗体轻链可变区基因和重链可变区基因及其表达产物，两者重 组后表达产生的抗CD52 ScFv片段，能够特异性结合人CD52分子并能够降 低鼠源性抗人CD52抗体的免疫源性。为了解决上述技术问题，本发明采用的技术方案是 一种抗人CD52 单克隆抗体杂交瘤细胞系，所述细胞系的保藏号为CGMCC NO. 2175。一种抗人CD52单克隆抗体由保藏号为CGMCC N0: 2175杂交瘤分泌。所述的抗体是鼠源性单克隆抗体，属于IgG2a亚型。抗人CD52的工程抗体，由保藏号为CGMCC N0: 2175杂交瘤细胞系经 反转录-聚合酶链式合成反应制备产生。所述的抗人CD52的工程抗体，由SEQ ID NO. 2重链可变区氨基酸序列 和SEQ ID N0.4轻链可变区氮基酸序列组成。所述的抗人CD52的工程抗体，编码所述SEQ ID NO. 2重链可变区氨基 酸序列的核苷酸序列如SEQ ID NO. 1所示，编码所述SEQ ID NO. 4轻链可 变区氨基酸序列的核苷酸序列如SEQ ID N0.3所示。含有所述的工程抗体的核苷酸序列的载体，分别含有SEQ ID NO. 1所 述的重链可变区VH基因核苷酸序列和SEQ ID NO. 3所述的轻链可变区VL 基因核苷酸序列的cDNA的Simple-T载体。含有所述的工程抗体的核苷酸序列的载体，含有SEQ ID NO.l所述的 重链可变区VH基因核苷酸序列、SEQ ID NO. 3所述的轻链可变区VL基因核 苷酸序列和接头序列的cDNA的PET22b(+)载体。所述的抗人CD52的单克隆抗体、工程抗体或载体在制备白血病诊断试 剂、免疫抑制类药物或治疗白血病的药物中的应用。一种免疫检测试剂盒，上述的单克隆抗体或工程抗体或载体。所述的免疫检测试剂盒在诊断恶性肿瘤或自身免疫性疾病；或评价恶性肿瘤或自身免疫性疾病的发展和预后；或指导恶性肿瘤或自身免疫性疾 病的治疗中的用途。抗人CD52的工程抗体由保藏号为CGMCC NO: 2175 (保藏于中国微生 物菌种保藏管理委员会普通微生物中心CGMCC NO: 2175，保藏日2007-9-18) 杂交瘤经反转录-聚合酶链式合成反应制备产生，属于IgG2a亚型，该抗体 能特异性结合人CD52分子，在体外对于多种白血病细胞系具有一定的生长 抑制和促凋亡作用。因CD52分子在多种白血病细胞表面均呈高密度有序排 列，还非常有利于ADCC和CDC作用的发挥，是一种良好的靶向治疗位点。 因此抗人CD52单克隆抗体是一种具有巨大潜力药用抗体。人体对鼠源性抗 体的免疫反应(HAMA反应)是鼠源性抗体应用于临床治疗的主要障碍，而 基因工程抗体较好的解决了这个问题，它既保留了鼠源单抗的特异亲和力， 又大大降低了鼠单抗的异源性，因而具有广阔的应用前景。我们应用RT-PCR技术，成功的从杂交瘤细胞中克隆到抗人CD52抗体 的轻重链可变区基因，并将抗CD52抗体的轻重链可变区基因克隆到原核 表达载体，构建抗人CD52抗体的单链抗体，降低鼠源性抗人CD52抗体的 免疫原性，并在大肠杆菌中进行高效分泌性表达，从而提高其产量，降低 生产成本。单链抗体的优势在于较全抗分子量小，穿透能力强，构建周期 短，抗原性低，易于基因工程操作，为进一步研究其它工程抗体奠定基础。 可在大肠杆菌中表达，易于大量生产，生产成本低。所述的抗人CD52单克隆抗体在白血病和自身免疫性疾病的诊断，病程 评价，预后判断和指导治疗中的应用。CD52高表达在很多白血病恶性细胞表面。有文献表明，在病人体内， 恶性细胞表面的CD52密度远远大于体内的正常细胞，CD52抗原具有的高度糖基化带来的细胞表面负电荷的增加被认为与细胞的恶性程度城正相关 性。还有观察报道恶性细胞表面CD52抗原分子可能脱落于血液中，检测病 人血清中的可溶性CD52分子可以作为诊断白血病的一个标志。CD52还表达在正常淋巴细胞表面，单核细胞核和多种抗原提呈细胞表 面，CD52表达量的多少可以对细胞的分类和免疫力的判断提供重要指标。当准备使用CD52抗体药物治疗疾病时，检测细胞表面的CD52表达情 况可以为治疗提供数据支持，治疗过程中继续检测细胞表面的CD52表达情况或者表达CD52的细胞群状况有助于帮助了解治疗效果和病程进展。
图1是抗人CD52单克隆抗体对白血病细胞系生长状态的影响。 图2是胎盼兰拒染法检测HI186对多种白血病细胞系的生长抑制作用。 图3是Annexin V试剂盒检测抗人CD52单克隆抗体诱导白血病细胞系 凋亡的作用。图4是PCR扩增VL， VH基因片段电泳图。1: VL 2: VH 3: Marker。 图5是抗人CD52 ScFv表达载体PET22b (+) -ScFv结构示意图。 图6是PCR扩增单链抗体(ScFv)基因片段图谱。1-3: ScFv 4: Marker。 图7是ScFv表达产物的SDS-PAGE (10%)图谱。1:未诱导菌体蛋白； 2:诱导后全菌蛋白；3: Marker; 4:包涵体及不溶性全菌蛋白；5:可溶性蛋白。图8是抗人CD52-ScFv的Western blot分析。1:未诱导菌体蛋白；2: 诱导后全菌蛋白；3: Marker; 4:包涵体及不溶性全菌蛋白；5:可溶性蛋 白。图9是竞争性免疫荧光抑制实验。(1 ) HPB-ALL白血病细胞系检测； (2):正常人外周血检测。相同条件下，由于CD52-ScFV的竞争作用，鼠 源性抗体HI186的反应阳性率或荧光强度明显下降。图10是利用天然细胞膜表面的CD52分子与抗人CD52-ScFv进行的West blot分析。1:抗人CD52-ScFv; 2: Marker; 3:抗人CD52单克隆抗体。图11是抗人CD52单克隆抗体检测REH细胞表面的CD52表达情况。制备抗人CD52的工程抗体的杂交瘤保藏于中国微生物菌种保藏管理 委员会普通微生物中心CGMCC N0: 2175，保藏日2007-9-18。
具体实施方式
下面结合附图和具体实施方式
对本发明的可特异性识别正常细胞和白 血病细胞表达的人CD52分子，并可用于清除正常免疫细胞或杀伤白血病细 胞的抗人CD52工程抗体、载体、试剂盒及其用途作进一步的详细说明一种抗人CD52单克隆抗体杂交瘤细胞系，所述细胞系的保藏号为 CGMCC NO. 2175。一种抗人CD52单克隆抗体由保藏号为CGMCC NO: 2175杂交瘤分泌。所述的抗体是鼠源性单克隆抗体，属于IgG2a亚型。抗人CD52的工程抗体，由保藏号为CGMCC N0: 2175杂交瘤细胞系经 反转录-聚合酶链式合成反应制备产生。所述的抗人CD52的工程抗体，由SEQ ID NO. 2重链可变区氨基酸序列 和SEQ ID N0.4轻链可变区氨基酸序列组成。所述的抗人CD52的工程抗体，编码所述SEQ ID NO. 2重链可变区氨基 酸序列的核苷酸序列如SEQ ID NO. 1所示，编码所述SEQ ID NO. 4轻链可 变区氨基酸序列的核苷酸序列如SEQ ID NO. 3所示。含有所述的工程抗体的核苷酸序列的载体，分别含有SEQ ID NO. 1所 述的重链可变区VH基因核苷酸序列和SEQ ID NO. 3所述的轻链可变区VL 基因核苷酸序列的cDNA的Simple-T载体。含有所述的工程抗体的核苷酸序列的载体，含有SEQ ID NO. 1所述的 重链可变区VH基因核苷酸序列、SEQ ID NO. 3所述的轻链可变区VL基因核 苷酸序列和接头序列的cDNA的PET22b(+)载体。所述的抗人CD52的单克隆抗体、工程抗体或载体在制备白血病诊断试 剂、免疫抑制类药物或治疗白血病的药物中的应用。一种免疫检测试剂盒，上述的单克隆抗体或工程抗体或载体。所述的免疫检测试剂盒在诊断恶性肿瘤或自身免疫性疾病；或评价恶 性肿瘤或自身免疫性疾病的发展和预后；或指导恶性肿瘤或自身免疫性疾 病的治疗中的用途。实施例1小鼠抗人CD52单克隆抗体的制备及荧光标记以分离的人扁桃腺细胞为抗原，常规方法免疫6周龄Balb/c小鼠，首 次基础免疫使用福氏完全佐剂，每隔3周进行一次基础免疫，共三次，2X 107细胞/只，次，最后一次基础免疫后3周后脾内注射加强免疫，1X107 细胞/只；3天后取脾，与NS1小鼠骨髓瘤细胞进行融合，按常规杂交瘤制 备方法进行。融合12天后，收集单克隆生长的融合孔上清，利用间接免疫 荧光法，选择CD52阳性的靶细胞系进行筛选鉴定，选择反应性好，生长状 态好的杂交瘤细胞进行亚克隆，得到稳定分泌抗人CD52单克隆抗体的杂交 瘤细胞株，命名为HI186，液氮冻存。于1996年提交国际白细胞分化抗原会议，被确认为识别人类CD52抗原。制备的抗人CD52单克隆抗体的杂交 瘤细胞系保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心CGMCC NO: 2175采用小鼠腹腔内诱生法，将HI86细胞株接种Balb/c小鼠腹腔，1.5X 107只，l周后采集腹水，经Protein G S印harose 4FF亲和层析柱层析， 制备HI186抗体纯品。利用共价连接的方法把荧光素偶联到抗体上，经分离纯化制备出偶联 复合物，即荧光标记抗体。实施例2抗人CD52单克隆抗体检测白血病细胞系细胞表面的CD52表达情 况取生长良好的REH细胞离心收集，用PBS调制IX 107ml，每10(^1加 入流式管， 一管加入PE标记CD52抗体， 一管加入PE标记的小鼠IgGl同 型对照，室温避光反应20分钟。加入约2mlPBS洗一次，lOOOrpm离心lO 分钟，弃上清，加入300plPBS，流式细胞仪检测(见图ll)。实施例3抗人CD52单克隆抗体可以在体外有效抑制白血病细胞系的生长取生长良好的CD52阳性白血病细胞系，用含20%FBS的RPMI1640 培养液调至1 X 105/ml，按每孔100^1加入96孔培养板。将细胞分为4组。 对照组l:不添加任何抗体；对照组2:加入20吗/ml羊抗鼠第二抗体；实 验组1:加入10jig/ml Campath-l;实验组2:加入10pg/ml Campath-l和 20|ig/ml羊抗鼠第二抗体。置37'C， 5%二氧化碳培养箱培养24-144小时。(1) 细胞形态变化。白血病细胞系与HI186共培养后，可明显表现出 分散形态，不再具有聚集生长的特征。HI186单独或联合第二抗体作用时， 细胞数目虽然相对对照组有一定的减少，但细胞的聚集生长形态特征仍可 见。见图1。(2) 胎盼兰拒染法检测细胞生长。HI186可抑制多种白血病细胞系的 增殖。见图2。实施例4抗人CD52单克隆抗体可以诱导白血病细胞系凋亡取生长良好的CD52阳性白血病细胞系，用含20%FBS的RPMI1640 培养液调至1 X 105/ml，按每孔100^1加入96孔培养板。将细胞分为4组。 对照组l:不添加任何抗体；对照组2:加入20ug/ml羊抗鼠第二抗体；实 验组l:加入10|ag/mlHI186;实验组2:加入10吗/ml HI186和20|ig/ml羊 抗鼠第二抗体。置37匸，5%二氧化碳培养箱培养48小时。收集细胞，PBS 洗涤，Annexin- V试剂盒(Annexin- V -FLOUS staining Kit; ROCHE)检测细 胞早期凋亡。经检测，HI186对白血病细胞系作用48小时后，白血病细胞 的早期凋亡率明显增高。见下表l，图3。表1 Annexin V试剂盒检测HI186单独或联合第二抗体作用于CD52阳性细胞系时诱实施例5抗CD52抗体的轻重链可变区基因克隆应用RT-PCR方法从抗人CD52抗体杂交瘤细胞(保藏于中国微生物菌 种保藏管理委员会普通微生物中心CGMCC NO: 2175，保藏日2007_9_18) 中克隆抗人CD52抗体的轻重链可变区基因-(1) RNA提取采用Trizol —步法，1)取杂交瘤细胞约106，加入 lmlTrizol，吹打混匀，室温静置5分钟。2)加入0. 2ml氯仿，剧烈振荡15 秒，室温静置2-3分钟。3) 12000rpm， 4°C，离心15分钟。4)取上清，加 入0.5 ml异丙醇室温静置15分钟。5) 12000rpm， 4°C，离心15分钟。6) 弃上清，加入lml75。/。的乙醇洗，7500rpm， 4。C，离心5分钟。7)弃上清， 沉淀晾干，加入30pLDEPC水溶解。(2) 逆转录为CDNA (40ul):取2. 5mMdNTP4y 1， 5xfirst strand buffer8ul， DTT4ul， 01igodT2ul，水16.6ul，混匀后加入RNA约 2ug， 65。C水浴5分钟，快速冰浴2-3分钟。加入50u/u lRNasin0. 4y 1， Superscript II (200u/u 1 ) 1 u 1混匀后37°C水浴>1小时。取出后70°C导细胞凋亡的结果，表中所示为早期凋亡阳性率。对照组 第二抗体抗人CD52单克隆抗体抗人CD52单克隆抗体+第二抗体3. 49% 2. 62% 2. 72% 8. 43%水浴10分钟。一20。C保存。(3) PCR扩增抗CD44抗体的轻重链可变区基因 轻链可变区基因PCR扩增反应体系(50ul):设计通用简并引物，上游引物5， 一GAC ATT GTG CTC ACC CAG WCT SMH — 3，；下游引物5' —CCG TTA GAT CTC CAR BTT KGT SCS — 3，。以cDNA为模板，高保真PfuDNA聚合 酶扩增。PCR循环程序为94°C 5分钟;94。C30秒，55。C30秒,72。C30秒， 共30个循环；最后72。C延伸10分钟。重链可变区基因PCR扩增反应体系(50ul):上游引物5， 一CAGGTS MAR CTG CAG SAG TCW GG — 3，;下游引物5， 一TGA GGA GAC KGT GAC HGT GGT SCC—3，。以cDNA为模板，高保真PfuDNA聚合酶扩增。PCR循环程序为94°C 5分钟；94°C, 30秒，55C，30秒，72。C，30秒，共35个循环；最后72。C延 伸10分钟。(4) 测序载体的构建Simple-T载体购自大连宝生物公司。将轻重 链可变区基因PCR产物回收，与Simple-T载体连接后，按常规方法氯化钙 转化，以lOOyg/ml氨苄浓度筛选阳性克隆，送测序，该基因完全符合蛋 白数据库中抗体所具有的若干保守的框架氨基酸的特点，该序列为抗体基 因序列。分别命名为T-VH及T-VL，见图4。实施例6单链抗体基因表达载体PET22b(+)ScFv的构建根据轻、重链可变区的酶切图谱及构建载体PET22b(+)的酶切位点，设计并合成了用于VH， VL基因扩增和拼接的引物。 VH上游引物5' —GAC TCG CCATGG ACC AGG TGC AGC TGC AGG AA—3，； VH下游引物5' —ACC TCC AGA GCC TCC ACC TCC AGA TCC ACC TCC ACC TGA GGA GAC GGT GAC AGG—3'。VL上游引物5' —GGA TCT GGA GGT GGAGGC TCT GGA GGT GGA GGC TCT GAC ATT GTG ATG ACC CAG一3';VL下游引物5， 一CTCGAG CCG TTT GAT TTC CTG—3，。引入克隆用的Nco I /Xho I限制性酶切位点及单链抗体的linker序列 (采用最广泛的(GGGGS) 3为linker)。从所构建的T-VH及T-VL载体中PCR 扩增VH， VL片段，回收后，经重叠延伸拼接法(SOE)通过PCR直接合成ScFv 基因，见图5。将PET22b(+)载体及回收的ScFv基因分别用Nco I /Xho I 双酶切，回收后按常规方法进行连接和转化构建抗人CD52 ScFv表达载体 PET22b(+)ScFv。阳性克隆用NcoI/XhoI双酶切鉴定后测序确定。正确的 克隆用于表达。测序结果表明正确，按氨基酸序列推测738bp，ScFv约为 26. 8KD的蛋白，见图6、图7。实施例7抗人CD52ScFv抗体片段的表达、纯化(1)抗人CD52单链抗体(ScFv)在大肠杆菌中的表达及SDS-PAGE 分析在3ml含100 u g/ml氨苄青霉素的LB培养基中接种一阳性单菌落， 37"C震荡培养过夜后，接种30 u 1于3ml含100 y g/ml氨苄青霉素的LB培 养基中，28。C震荡培养约4小时后，加IPTG至终浓度为0. lmmol/L， IPTG 诱导7小时后收获菌液，加入细菌渗透性释放液(Tris-HC1 25mM， EDTA lmM， PMSF0. lmM，蔗糖(20%, w/v)， NaCl 200mM) 20ml， 4。C轻摇1小时。12000g 再次离心，分别收集上清和菌体。各取适量，加入20 u 1 2XSDS上样buffer, IO(TC煮沸5min。取1上样，10%SDS-PAGE检测表达蛋白，考马斯亮蓝 染色。实验证明实现了重组质粒pET22b (+) ScFv在大肠杆菌中的表达，738bp 片段表达出约28Kd的带(His) 6的蛋白，见图7。(2)抗人CD52单链抗体(ScFv)纯化将按上步收集的菌体沉淀重 悬于1/10培养体积的冰预冷20匪ol/L Tris-HC1 (PH 7.2)，超声破碎细 胞，13000 rpm， 4。C离心30 min，取上清用于纯化。上步收集的上清直接用 于纯化。蛋白采用Pharmacia公司的Chelating S印harose Fast Flow进行纯 化，按操作手册平衡镍柱，挂镍，清洗。将粗分离的样品加入镍离子亲合层 析柱，使目的蛋白结合到柱子上，洗涤后，用6倍柱床体积的含500rnM咪 唑的Tris-HC1缓冲液洗脱，洗脱液用PBS缓冲液透析48小时。(3) Western blot鉴定主要参考分子克隆方法进行Western印迹，结果证明条带为表达产物，见图8。实施例8抗人CD52 ScFv抗体活性测定竞争性免疫荧光抑制试验1) 细胞系检测取CD52表达阳性细胞HPB-ALL细胞系，制成1乂106细胞悬液；加入不 同量的HI186-ScFv，室温避光孵育l小时；再加入O. 5ugPE标记的HI186 单克隆抗体，室温避光孵育20分钟；加入2ml冷PBS缓冲液，重悬，1000 转/分钟离心5分钟，弃上清；加入300ul含P/。多聚甲醛的PBS缓冲液， 流式细胞仪检测。2) 正常人外周血检测每管加入正常人抗凝外周血100u 1，加入不同量的HI186-ScFv，室温 避光孵育1小时；再加入0. 5 u g PE标记的抗人CD52单克隆抗体，室温避 光孵育20分钟；加入2ml溶血素室温避光反应10分钟后1000转/分钟离 心5分钟，弃上清；加入2ral冷PBS缓冲液，重悬，1000转/分钟离心5分 钟，弃上清；加入300ul含P/。多聚甲醛的PBS缓冲液，流式细胞仪检测。经抗人CD52 ScFv竞争后，HI186与HPB-ALL细胞系结合的阳性率降 低为未竞争时的33%，与外周血白细胞反应时荧光强度明显下降，证明抗人 CD52 ScFv可竞争性抑制HI186与HPB-ALL细胞系及正常人外周血白细胞的 结合，即抗人CD52ScFv能够与细胞表面的CD52抗原特异性结合，见图9。 结合变性细胞膜CD52分子活性的Western Blot检测取生长良好的HPB-ALL细胞约1X107，用冰冷的PBS洗涤细胞，4°C， 3000g离心5分钟。向细胞沉淀中加入200ul预冷的1X细胞裂解液裂解细 胞，4°C， 30分钟。4。C离心，10000g， IO分钟，取上清。尽快加入40ul6 X加样缓冲液，沸水浴10分钟。室温10000g离心10分钟，弃沉淀取上清。 上样，每孔加50ul上清，进行SDS-PAGE凝胶电泳。电泳结束后，分别应 用抗人CD52单克隆抗体和抗人CD52 ScFv,进行western blot检测。结果显示抗人CD52 ScFv与抗人CD52单克隆抗体的反应性一致，均能 识别分子量大约为30KD的蛋白。SEQUENCE LISTING 〈110〉协和干细胞基因工程有限公司〈120〉抗人CD52单克隆抗体杂交瘤细胞系、单克隆抗体、工程抗体、载体、试剂 盒及其用途<130〉〈160〉 4<170〉 Patentln version 3.3〈210〉 1<211〉 342〈212〉 ■<213〉 小鼠(Mus musculus)〈220〉〈221〉 CDS〈222〉 (1)..(342)<400〉 1cag gtg cag ctg cag gaa tct gga gga ggc ttg gtg caa cct gga gga 48 Gin Val Gin Leu Gin Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gin Pro Gly Gly 15 10 15tec atg aaa etc tct tgt get gcc tct gga ttc act ttt agt gac gcc 96 Ser Met Lys Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asp Ala 20 25 30tgg atg gac tgg gtc cgc egg tct cca gag aag ggg ctt gag tgg gU Trp Met Asp Trp Val Arg Arg Ser Pro Glu Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45144get gaa att 3ga_ aac aaa get aaa aat cat gta aca tac tat get gcg Ala Glu lie Arg Asn Lys Ala Lys Asn His Val Thr Tyr Tyr Ala Ala 50 55 60192tct gtg咖ggg agg Ser Val Lys Gly Arg 65tlx txc atx tea aga gat gat tec aaa agt agt Phe Ser lie Ser Arg Asp Asp Ser Lys Ser Ser 70 75 80240gtc tac ctg cag atg aac age tta aga cct gaa gac act ggc att tat Val Tyr Leu Gin Met Asn Ser Leu Arg Pro Glu Asp Thr Gly lie Tyr 85 90 95288tac tgt acc acc etc gac aag tgg ggc caa ggc act cct gtc acc gtc Tyr Cys Thr Thr Leu Asp Lys Trp Gly Gin Gly Thr Pro Val Thr Val 100 105 110336tec tea Ser Ser342〈210〉 2〈211〉 114〈212〉 PRT〈213〉 小鼠(Mus musculus)〈400〉 2Gin Val Gin Leu Gin Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gin Pro Gly Gly 15 10 15Ser Met Lys Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asp Ala 20 25 30Trp Met Asp Trp Val Arg Arg Ser Pro Glu Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45Ala Glu lie Arg Asn Lys Ala Lys Asn His Val Thr Tyr Tyr Ala Ala 50 55 60Ser Val Lys Gly Arg Phe Ser lie Ser Arg Asp Asp Ser Lys Ser Ser 65 70 75 80Val Tyr Leu Gin Met Asn Ser Leu Arg Pro Glu Asp Thr Gly lie Tyr 85 90 95Tyr Cys Thr Thr Leu Asp Lys Trp Gly Gin Gly Thr Pro Val Thr Val 100 105 110Ser Ser〈210〉 3〈211〉 339〈212〉 DNA〈213〉 小鼠(Mus musculus)〈220〉〈221〉 CDS〈222〉 (1)..(339)〈400〉 3 g3C Eltt gtgAsp lie 1ValMeta_cc Thr 5C3gGinact ThrProetc Leuact Thr 10ttg Leuteg Sergtt Val3CCThratt lie 15Gly48Gin Progec Alatec Ser 20ate lietct Sertgc Cys鄉 Lystea Ser 25￡lgtSerGinage Seretc Leutta Leu 30gat Aspagt Ser96gat gga Asp Gly朋g Lys 35Thrtat Tyrctg Leuaat Asntgg Trp 40Leutta Leucag Gin郷 ArgCC3Pro 45ggc Glycag Gintct Ser144CC3 33gPro Lys 50cgceta Leuate liettt Phectg Leu 55gtg Valtct SergC3Alactg Leugac Asp 60tct Serggc Glygtc Valcct Pro192gSLC aggAsp Arg 65ttc Phegict Thrggc Gly缚t Ser 70gga GlySerggg GlyThrgat Asp 75Uc Pheaca Thrctg Leu卿 Argate lie 80240Asn Arggtg ValGluget Ala 85gag Glugat Aspttg Leugg3 Glyatt lie 90tat Tyrtat Tyrtgc Cystgg Trpc犯 Gin 95ggt Gly288aca cat Thr Histtt Pheccg Pro 100tgg Trpa_cg Thrttc Pheggt Glygga Gly 105ggc Glyacc Thr胆gC￡lgGing朋 Glu 110ate lieLys336egg Arg339〈210〉 4〈211〉 113 <212〉 PRT〈213〉 小鼠(Mus musculus) 〈400〉 4Asp lie Val Met Thr Gin Thr Pro Leu Thr Leu Ser Val Thr lie Gly 15 10 15Gin Pro Ala Ser lie Ser Cys Lys Ser Ser Gin Ser Leu Leu Asp Ser 20 25 30Asp Gly Lys Thr Tyr Leu Asn Trp Leu Leu Gin Arg Pro Gly Gin Ser 35 40 45Pro Lys Arg Leu lie Phe Leu Val Ser Ala Leu Asp Ser Gly Val Pro 50 55 60Asp Arg Phe Thr Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Arg lie 65 70 75 80Asn Arg Val Glu Ala Glu Asp Leu Gly lie Tyr Tyr Cys Trp Gin Gly 85 90 95Thr His Phe Pro Trp Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Gin Glu lie Lys 100 105 110Arg
权利要求
1、一种抗人CD52单克隆抗体杂交瘤细胞系，其特征是所述细胞系的保藏号为CGMCC NO.2175。
2、 一种抗人CD52单克隆抗体，其特征是由保藏号为CGMCC NO: 2175 杂交瘤分泌。
3、 根据权利要求2所述的抗人CD52单克隆抗体，其特征是所述的抗 体是鼠源性单克隆抗体，属于IgG2a亚型。
4、 权利要求2的抗人CD52的工程抗体，其特征是由保藏号为CGMCC N0: 2175杂交瘤细胞系经反转录-聚合酶链式合成反应制备产生。
5、 根据权利要求4所述的抗人CD52的工程抗体，其特征是由SEQ ID NO. 2重链可变区氨基酸序列和SEQ ID N0.4轻链可变区氨基酸序列组成。
6、 根据权利要求5所述的抗人CD52的工程抗体，其特征是编码所述 SEQ ID NO. 2重链可变区氨基酸序列的核苷酸序列如SEQ ID NO. 1所示，编 码所述 >SEQ ID NO. 4轻链可变区氨基酸序列的核苷酸序列如SEQ ID NO. 3 所示。
7、 含有权利要求4所述的工程抗体的核苷酸序列的载体，其特征是分 别含有SEQ ID NO. 1所述的重链可变区VH基因核苷酸序列和SEQ ID NO. 3 所述的轻链可变区VL基因核苷酸序列的cDNA的Si即le-T载体。
8、 含有权利要求4所述的工程抗体的核苷酸序列的载体，其特征是含 有SEQ ID NO. 1所述的重链可变区VH基因核苷酸序列、SEQ ID NO. 3所述 的轻链可变区VL基因核苷酸序列和接头序列的cDNA的PET22b(+)载体。
9、 权利要求2-3中任一项所述的抗人CD52单克隆抗体或权利要求4-5 中任一项所述的抗人CD52的工程抗体或7、 6中任一项所述的载体在制备 白血病诊断试剂、免疫抑制类药物或治疗白血病的药物中的应用。
10、 一种免疫检测试剂盒，其特征是含有至少一种权利要求2 — 3 所述的单克隆抗体或权利要求4一6工程抗体或权利要求7 — 8的载体。
11、权利要求10所述的免疫检测试剂盒在诊断恶性肿瘤或自身免疫性 疾病；或评价恶性肿瘤或自身免疫性疾病的发展和预后；或指导恶性肿瘤 或自身免疫性疾病的治疗中的用途。
全文摘要
本发明公开了一种抗人CD52单克隆抗体杂交瘤细胞系、单克隆抗体、工程抗体、载体、试剂盒及其用途，能够在体内外特异性结合人类CD52抗原，通过多种机制单独或协调作用，有目的清除正常免疫细胞活杀伤白血病细胞。本发明涉及抗人CD52单克隆抗体HI186重链和轻链可变区基因，由所述基因编码的多肽，含有所述基因的载体及所述的基因和多肽在制备用于白血病或自身免疫病的诊断和治疗药物中的应用。重链和轻链可变区基因来自抗人CD52单克隆抗体。本发明采用基因工程技术成功制备人源化单链抗人CD52基因工程抗体，为白血病和免疫系统疾病的诊断和治疗提供了一种新的有效药物。
文档编号C12N5/12GK101619305SQ20071005993
公开日2010年1月6日 申请日期2007年10月19日 优先权日2007年10月19日
发明者何大水, 鸣 佘, 立 周, 浩 屈, 廖晓龙, 毅 张, 张丽艳, 张宇光, 张金香, 朱卫彬, 王冬梅, 袁向飞, 郭桂庆, 黄丽华 申请人:协和干细胞基因工程有限公司