一株低温解烃的极小单胞菌t7-7及其用途的制作方法

专利名称：：一株低温解烃的极小单胞菌t7-7及其用途的制作方法一株低温解烃的极小单胞菌T7-7及其用途
技术领域：
：本发明属于微生物生物技术和环境生物
技术领域：
，具体地说，它涉及一株极小单胞菌T7-7(/^w7//womwsp.T7-7)菌株，及其在海洋石油烃污染的生物修复中的应用。
背景技术：
：随着工业的迅猛发展，水污染日益严重，而海洋污染更成为令人关注的世界性环境问题。在海洋各种污染物中，石油污染是最普遍和严重的一种。石油是当今支撑人类生活的主要能源，并且在可预见的将来其主导地位很难被动摇，因此石油在存储、运输和加工过程中造成的环境污染也必将日趋严重。据联合国国际海事组织(IMO)统计，全球每年通过各种途经流入海洋的石油及其制品已达1.0X108~1.5X108吨。海洋石油污染主要来源于海上石油生产、海洋运输、城市污染废水排放等。石油进入水体后，对生物和生态环境造成严重污染，大量的海鸟和鱼类等海洋生物的生存繁殖受到影响，一些有毒化合物也因此进入生物链，给生态环境及人类的生产活动和生活健康带来巨大的危害。目前，治理海洋石油污染已成为当今世界各国环境专家的研究热点。为了消除海洋石油污染，国内外学者做了大量工作，寻求安全、可靠、经济有效的治理方法。石油污染的处理方法主要有物理处理法、化学处理法和生物法三种。物理方法除油时，很难去除表面的油膜和海水中的溶解油；采用化学法实际上是向海洋投加人工合成的化学物质，很有可能会造成二次污染。海洋微生物具有数量大、种类多、特异性和适应性强、分布广、世代时间短、比表面积大的特点，与物理和化学方法相比，利用微生物降解石油烃类化合物的生物修复技术价格低，去除污染物更彻底，且产物是C02、水和醇等无毒害物质，因此该技术在治理海洋石油污染方面具有非常广阔的前景。生物修复(Bioremediation)是指生物尤其是微生物催化降解环境污染物，减少或最终消除环境污染的受控或自发过程。在生物修复作用下，污染物转化为稳定且无毒的代谢终产物，如C02、水、简单的醇和酸及微生物自身，最终从环境中消失。实践表明，生物修复是一种高效、经济且生态可承受的清洁技术。生物修复的基础是自然界中微生物对污染物的生物代谢作用,由于自然界的生物修复过程一般较慢,难以实际推广应用,因此一般指人为促进条件下的生物修复。由于海洋的低温、高盐度的特殊环境条件，因此得到能耐低温、高盐的海洋环境，并在此环境条件下能够对石油烃高效降解的菌株的获得是进行海洋石油污染的生物修复的首要问题。
发明内容本发明的目的是解决海洋石油污染日益严重的问题，提供一种极小单胞菌T7-7(尸肌7/Z附o"wsp.T7-7)和该菌在海洋石油污染的生物修复中的应用。本发明提供的极小单胞菌T7-7(尸,7/^o"ossp.T7-7)菌株，于2007年9月14日保藏于"中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心"(北京市朝阳区大屯路3号，中国科学院微生物研究所)，命名为/>^///^0"^3.丁7-7，其保藏号为CGMCCNo.2172。并于2006年7月12日保藏于"DeutscheSammlungvonMikroorganismenundZellkulturenGmbH(DSMZ)",保藏号为DSM18250T。本发明提供的极小单胞菌T7-7(户^/////0^3^丁7-7)菌株，是从石油污染的海底泥中分离，以液蜡为唯一碳源的情况下在15°C反复驯化培养而获得。本发明提供的极小单胞菌T7-7(PMw7//womwsp.T7-7)的菌落特征在LB平板上培养两天的菌落大小直径0.5lmm，菌落呈圆形，边缘整齐，表面光滑，半透明。本发明提供的极小单胞菌T7-7(户M/肌wo"msp.T7-7)的细胞形态特征革兰氏染色阴性，菌体呈短杆状，单端极生鞭毛，能运动，兼性好氧，细胞大小0.2-0.5iim(宽)X0.5-1.0um(长)。本发明提供的极小单胞菌T7-7(i^朋脂mwsp.T7-7)的生理生化特征生长温度4一37。C，生长pH范围6-9，NaCl耐受性高达5.5X。接触酶，亚硝酸盐还原，脲酶，硫化氢产生，分解七叶苷实验均为阳性；M.R.，V-P，吲哚产生，硝酸盐还原，反硝化，淀粉水解，产氨，明胶水解实验为阴性；葡萄糖发酵为氧化型；石蕊牛奶试验为产碱型。降解中长链烷烃及相应的醇、酸。本发明提供的极小单胞菌T7-7(尸^7//卿"^3.17-7)细胞壁脂肪酸分析T7-7与菌株/^朋mo"fls"oe他wa朋"BN9T(Stolzetal，2005)的细胞壁脂肪酸性质比较，主要成分都含有碳16饱和脂肪酸及碳17A-cis-9，10亚甲基脂肪酸，但BN9T中碳19A-cis-11,12亚甲基脂肪酸占有很大比重，而在T7-7中则比重较小。T7-7与菌株户Mw7/z'wowwwoertewa"刚7BN9T仍然有一定的差异(见表一)。本发明提供的极小单胞菌T7-7(尸肌'〃/womwsp.T7-7)的16SrRNA基因序列特征CGMCCNo.2172接种于LB培养基，3(TC摇床培养(180rpm)24小时，离心收集菌体，重新悬浮，加溶菌酶和SDS破壁，由酚-氯仿法提取基因组DNA，并采用上游引物(5'-GAGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3')和下游引物(5，-AAGGAGGTGATCCAGCCGCA-3')，用这对引物对其16SrDNA基因进行PCR扩增，将扩增引物送大连宝生物公司进行测序。PCR条件为94°C，5min;94°C，45s,56.2°C，45s，72°C90s，30个循环；72°C9min，4'C保存。16SrDNA基因序列长度为1493p，在GenBank中的登录号为DQ417606，与/W〃z',朋swoeWe附awm7的16SrDNA(GenBankaccessionNo.AY695828)序列相似性为96.65%，进化距离为0.00568。其16SrDNA的序列如序列表所示。本发明提供的极小单胞菌T7-7(户M/Wwo"cwsp.T7-7)DNA碱基组成(G+CmoP/。)分析根据T7-7DNA的热变性曲线、Pww7/Zwowa5"oeWew朋m'/BN9T和￡.co//K12AS.1.365的热变性曲线(图4)计算，T7-7的Tm值为64.5°C，i^w7//mo"os"oeWema朋//BN9T的Tm值为68.5°C，E.coli的Tm值为64°C，算出T7-7的G+Cmol。/o为52.24%，BN9T的G+Cmol%为62.18%。结果说明T7-7与woeWewa"w7BN9T存在一定的差异。本发日月提f共的丰及刁、单胞菌T7國7(/*"577//附0"0sp.T7隱7)与i>i77//wo"fl1"oeWe附a""〃BN9T之间DNA/DNA同源性测定通过对各个DNA样品的温度对OD260的曲线见图5，根据直线斜率计算菌株T7-7与尸咖7/Z附o"oy"oe他wa"m7BN9T的全基因组DNA同源性为66.67%，低于国际种间杂交标准的70%(Wayneetal，1987)。参照《Bergey'sMamualofSystematicBacteriology》Vol.VIII的内容，根据其形态特征和生理生化特征，细胞壁脂肪酸分析，16SrDNA基因序列在GenBank中的搜索结果，以及DNA碱基组成(G+Cmol。/。)分析和与Pim7//mo"os"oeWew朋"//BN9T之间DNA/DNA同源性测定，经多项分类鉴定T7-7菌株为一新菌，属于极小单胞菌属0"^7//附0"05)，经过ProfessorJ.P.Euz6by的协助，命名为Pww'Wwomwsp.T7-7。本发明提供的极小单胞菌T7-7(Am7"mo"oysp.T7-7)可以在营养培养基，如普通牛肉汁、LB、营养琼脂中生长，也可以在添加葡萄糖的无机盐培养基中生长，也可以以烷烃或原油为碳源生长。菌株在4一37'C之间的一适宜温度下兼性厌氧生长。本发明提供的极小单胞菌17-7(尸肌7//腳"^sp.T7-7)具有一定的降解石油烃的能力，可降解C16C32的正构烷烃和原油。用T7-7生长细胞进行降解实验结果表明，该菌在15—3(TC温度条件下，通过基础培养基生长繁殖过程能同时降解加入的5g/L的烷烃或原油，其基础培养基组成为g/L:KH2P043.48,Na2HP04*12H201.5，(NH4)2S044.0,MgSO4'7H2O0.70，酵母提取物0.05，pH7.07.2。往复摇床180rpm转速培养72h。对中长链垸烃降解率最高的可达40%以上，最低也在10%左右。如图1所示。T7-7还能够利用中长链醇类及酸类较好的生长如图3所示。另外，当菌株T7-7与其他产表面活性剂的解烃菌株混合培养，协同作用于原油时可获得更高的降解率(见图6)。本发明的优点和积极效果本发明提供的P,7/z'mw^平T7-7菌在153(TC最适温度条件下，能够以烃为碳源和能源生长，能够利用16碳32碳的正构烷烃，对原油(5g/L)的降解率可达16%以上，对中长链正构垸烃单独作用时降解率最高可达40%以上；该菌株具有能够适应低温及高盐度极端环境的性质，以及能够对海洋石油污染物进行较有效的降解作用，因此可以应用于海洋石油污染的生物修复。:图1是/^^7//附o"^平T7-7菌对各链长单烷烃的降解效果；图2是尸柳7//腳"^平17-7菌对柴油降解的气相色谱图；A未接菌的对照，B为作用后；图3是户柳7//附0"^印.T7-7利用中长链醇类及有机酸类的生长情况；A.T7-7利用有机酸类的生长情况；B.T7-7对利用醇类的生长情况。图4是T7-7DNA的热变性曲线、户船/〃/附o"as"oeWew朋m7BN9TDNA以及E.coliK12AS.1.365的热变性曲线；A,K12的热变性曲线；B.T7-7'的热变性曲线；.C.尸咖'ffi附o"wwoeWewawm7BN9T的热变性曲线；图5是Pww'〃/附omww.T7-7和Am'〃/附o"oy"oeWewa"w7BN9T基因组杂交复性曲线；图6是Pww〃/wowa;yw.T7-7菌与红平红球菌3C-9(及/wcfococoweo^wpoto3C-9)混合培养时对不同原油降解的气相色谱图；A.孤岛稀油对照；B.孤岛稀油经混合菌降解后；C.官69稠油对照；D.官69稠油经混合菌降解后。表1是尸附/〃/附o"oyw.T7-7和P^/WwowcwBN9T菌株细胞壁脂肪酸含量分析。具体实施方式实施例l本发明提供的i^朋附o"w平T7-7菌株的筛选和育种。从渤海被石油污染的海底区域采集泥样，经纬度坐标为东经118。26'36"及北纬38。5(T30"。取5g泥样于100mL液体石蜡为唯一碳源的无机盐培养基中(培养基组成KH2P043.48,Na2HP04*12H201.5,NH4S042,MgS04*7H200.70,酵母提取物0.05;液体石蜡含量2%;蒸馏水，1000ml;pH7.2;121。C灭菌30min)，置于200r/min低温摇床15°C富集培养7天，划线得到7株菌的混合菌群命名为T7-lT7-7;吸取5mL富集液移至新鲜的100mL液体石蜡培养基中，进行发酵培养，培养条件同上；经过三个周期富集后最终得到两株主体菌，T7-2和T7-7;在LB固体平板上反复划线，挑取单菌落划斜面保存；将两株菌分别取一环接入装有5mLLB培养液的试管内，15'C震荡培养48h，作为种子液；分别取lmL种子液接入装有50mL柴油无机盐培养基的250mL三角瓶中，15。C震荡培养7d，检测菌株对柴油的降解作用，见图2。菌株对单烷烃、柴油及原油的降解作用均通过Agilent6820气相色谱仪进行检测，使用角鲨烷作为内标。具体方法如下将菌株培养后的培养液或者对照样品，加入适量正己垸，完全密闭条件下充分振荡混匀萃取，静置分层后取出大部分有机相，再向混合体系中加入正己烷进行二次萃取，重复萃取3次，萃取的有机相合并在一起加入角鲨烷至终浓度为0.006%(w/v)作内标，定溶至所需体积后按以下方法进行气相色谱分析。经计算得T7-7对柴油的降解率为16.13%。样品用Agilent6820气相色谱仪系统进行分析，色谱柱为SPBTM-5capillarycolumn(30mX0.53腿i.d.，1.5pmthickness)(Supelco)。色谱程序如下进样口280°C;柱温150°C，5min15°C/min程序升温》28D。e，30min;检测器(FID)温度350°C;载气(N2)35mL/min;空气400mL/min;氢气(H2)30mL/min;尾吹(N2)20mL/min。根据未接菌对照和降解后残余峰面积与加入的角鲨烷内标峰面积的比值来表征底物的降解情况。对照峰面积/内标峰面积一降解后峰面积/内标峰面积底物降解率=-X100%对照峰面积/内标峰面积实施例2:本发明提供的Pusillimonassp.T7-7菌株的形态特征和生理生化特征。参照《Bergey，sMannualofSystematicBacteriology》(Vol.VI)的实验方法进行，检测其革兰氏染色，菌体大小和形态，有无鞭毛和芽孢，生长温度，生长pH范围，NaCl耐受性。接触酶，氧化酶，M.R.实验，V-P实验，吲哚产生，硝酸盐还原，亚硝酸盐还原，反硝化，淀粉水解，产氨实验，脲酶，硫化氢产生，明胶水解，葡萄糖发酵，石蕊牛奶试验，分解七叶苷实验。革兰氏染色阴性，菌体呈短杆状，单端极生鞭毛，能运动，兼性好氧，细胞大小0.2-0.5pm(宽)x0.5-l.(Hun(长)。生长温度4—37°C，生长pH范围6-9，NaCl耐受性高达5.5%。接触酶，亚硝酸盐还原，脲酶，硫化氢产生，分解七叶苷实验均为阳性；M.R.，V-P，吲哚产生，硝酸盐还原，反硝化，淀粉水解，产氨，明胶水解实验为阴性；葡萄糖发酵为氧化型；石蕊牛奶试验为产碱型。实施例3:本发明提供的户肌7/^omw平T7-7菌株的细胞壁脂肪酸分析。取适量细菌培养物，置于8ml螺口玻璃管中，加入lml溶液1(45g氢氧化钠溶于150ml甲醇及150ml蒸馏水)，拧紧螺盖，沸水浴5min，取出振荡510秒，再度拧紧螺盖，继续沸水浴25min;待样品管冷却后，加入2ml溶液H(190ml浓盐酸，275ml甲醇溶于135ml蒸馏水)，盖严振荡，随后精确控制80±1。C水浴10min，冰浴冷却；加入1.25ml溶液IH(200ml正己垸与200ml乙醚混合均匀)，快速振荡10min左右，弃去下层水相；有机相中加入3ml溶液IV(10.8克氢氧化钠溶于卯Oml蒸馏水)及几滴溶液V(饱和氯化钠溶液)，快速振荡5min左右，取2/3上层有机相置气相色谱样品瓶中备用。分析方法HP6890气相色谱仪，配备分流/不分流进样口，氢火焰离子化检测器(FID)及HP气相色谱化学工作站(HPCHEMSTATIONverA5.01);色谱柱为Ultra-2柱，长25m，内径0.2mm,液膜厚度0.33pm;炉温为二阶程序升温起始温度170'C，每min5'C升至260'C，随后以40。C/min升至310。C，维持1.5min;进样口温度250。C，载气为氢气，流速0.5ml/min，分流进样模式，分流比100:1，进样量2ial;检测器温度30(TC，氢气流速30ml/min，空气流速216ml/min，补充气(氮气)流速30ml/min。结果表明，T7-7与菌株Am'〃/附o"a;y"oeWew朋"/ZBN9T(Stolzetal，2005)的细胞壁脂肪酸性质比较，主要成分都含有碳16饱和脂肪酸及碳17A-cis-9,10亚甲基脂肪酸，但BN9中碳19A-ds-11，12亚甲基脂肪酸占有很大比重，而在T7-7中则比重较小。T7-7与菌株户i^/〃/zwowoy"oeWe附cwm7BN9T仍然有一定的差异(见表l)。表1T7-7与BN9T菌株细胞壁脂肪酸含量分析<table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table>实施例4:本发明提供的i^朋mo"awp.T7-7菌株的16SrRNA基因的PCR扩增和序列测定。极小单胞菌T7-7(尸us/〃/momw平T7-7)的16SrRNA基因序列特征CGMCCNo.1565接种于LB培养基，25'C摇床培养(180rpm)24小时，离心收集菌体，重新悬浮，加溶菌酶和SDS破壁，由酚-氯仿法提取基因组DNA，并采用上游引物(5，-GAGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3，)和下游引物(5，-AAGGAGGTGATCCAGCCGCA-3，)，用这对引物对其16SrDNA基因进行PCR扩增，将扩增引物送大连宝生物公司进行测序。PCR条件为94°C，5min;94°C，45s，56.2°C，45s，72°C90s，30个循环；72°C9min，4。C保存。16SrDNA基因序列长度为1493p，在GenBank中的登录号为DQ417606，与Aw/W/wowoswoe"ewa"m'z'的16SrDNA(GenBankaccessionNo.AY695828)序列相似性为96.65%，进化距离为0.00568。实施例5:本发明提供的？肌7///朋^平T7-7菌株DNA碱基组成(G+Cmol。/。)分析(Marmuretal,1962;周志伟等，1991;Mandeletal，1968)。DNA样品溶于O.lxSSC中，在DU-7Beckman分光光度计上调整DNA的浓度，将稀释到0.5左右，DNA纯度OD230/OZ)260/OD280二0.454:1:0.515，然后测定Tm值。使用ShimadzuUV-VIS-NIRrecordingspectrophotometerUV-365仪器测定Tm值，在波长260nm处首先记录25。C的吸光度值，然后温度开始上升，每上升3-5。C记录一次杯内温度T和OD260，(9D值开始上升表示变性开始，直至OD值不变，将OD值乘相应温度的相对膨胀系数(Vt)与25'C时相比Vt/V25求得相对光密度，以T为横坐标，以相对OD为纵坐标，绘制热变性曲线，曲线中点相对应的T即为熔链温度(Tm值)。按照以下公式计算，对照菌株为E.coliK12AS1.365。G+Cmol%=(Tmsample-TmE.coli)x2.44+51.2根据T7-7DNA的热变性曲线、Pww7Z/附omwwoeWewo"m7BN9T和五.co//K12AS丄365的热变性曲线(图3)计算，T7-7的Tm值为64.5°C，尸M^〃/mo"aywoe"em朋w7BN9T的Tm值为68.5°C，E.coli的Tm值为64°C，算出T7-7的G+Cmol。/。为52.24%，BN9T的G+Cmol%为62.18%。结果说明T7-7与户ww7/z'附owos"oertewa"w〃BN9T存在一定的差异。实施例6:本发日月提f共的尸177//附0"05s/.T7-7菌株与户ww'〃/mo"os"oeWe附o""z'z'BN9T之l司DNA/DNA同源性测定。提取两菌株的DNA，溶于15mLTE中，置冰水混合物中，150w超声15次，使DNA片段在25X105dalton(即300~760bp)之间；将剪切过的待测DNA样品(A，B)分别用0.1XSSC精确配制成O￡>260=1.5，取样品A、B各3mL分别装于两只离心管中，再取A、B各1.5mL装在1只离心管中，混匀为样品M。A、B、M均加入10XSSC0.72mL混匀，基)-5-取代-噻吩、5-取代-2-羧基噻吩、3-取代菲、2-取代芴、l-取代-2-溴-4-氟苯、3-取代苯并噻吩、2-取代喹啉或者4-取代喹啉；M为Al，In或者Ga。5、权利要求4所述具有调控发光波长性质的金属配合物的制备方法，其特征在于，分别将配体2-乙烯基-8-羟基喹啉和金属氯化物溶解在甲醇中，再将两溶液混合均匀，其中配体2-乙烯基-8-羟基喹啉和金属氯化物摩尔量之比为3:1，每摩尔配体2-乙烯基-8-羟基喹啉或有机乙酸盐加入四氢呋喃溶液10-20升，氮气保护下反应5-24h,分离、甲醇洗涤、干燥得到三-[2-位乙烯基取代的8-羟基喹啉]金属配合物。6、根据权利要求5所述具有调控发光波长性质的金属配合物的制备方法，其特征在于，所述金属氯化物为三氯化铝或氯化铟。序列表<110〉南开大学<120>—株低温解烃的极小单胞菌T7-7及其用途<160>1<170>PatentinVersion2.1<210〉1<211>1493<212〉DNA<213>极小单胞菌T7-7(户附/〃z'附owosT7-7)<400〉1attgaacgct3gCggg3tgCtttacacatgc犯gtcga^cggcagcgcg已aaagagcttg60ctctttttggcggcgagtggcg認gggtgagtaatatatcggaacgtgcccagtagcgg120gggataactacgcgaaagcgtggctaataccgcatacgccctacggggga鄉gggggg3180ttcttcggaacctctcactattggagcggcttagctagttggtg鄉ta3240aggctcacca鄉ccgcgatctgtagctggtttg卿gg3cgaccagccacactgggact300g卿cacggcccagactcctacgggaggcagC3gtgggg3attttggac已atgggggc犯360ccctgatccagccatcccgcgtgtgcgatgaaggccttcgggttgt3鄉cacttttggc420cggcgccgg已taatacctggcgtcactgacggtacctgcagaataagcac480cggctaact已cgtgccagcagccgcggtaatacgtagggtgcaagcgttaatcggaatt已540CtgggCgt33agcgtgcgcaggcggttxgga^g3aag3tgtgaaatcccagagcttaac600tttggaactgcatttttaactctcgaactagagtatgtcag鄉ggggt已gaattccacg660tgtagcagtga已atgcgtag卿tgtggaggaat3ccg3tggcgaaggcagccccctggg720ataat已ctgacgctcatgcacg猫gcgtggggagca認aggattagataccctggtag780tccacgccctaaacgatgtcaactagctgttggggccttcgggccttagtagcgcagct已840已cgcgtgaagttgaccgcctggggagtacggtcgcaagattaaaactcaaaggaattgac900ggggacccgcacaagcggtggatgatgtggattaattcgatgcaacgcgaaaaaccttac960ctacccttgacatgtctgga￡Lgcttcaagagattgaagtgtgctcgcaagagaaccggaa1020CaC6LggtgCtgcatggctgtcgtcagctcgtgtcgtg卿tgttgggttaagtcccgcaa1080cgagcgcaacccttgtcattagttgctacgaaagggcacttgccggtgac1140已已accggagga鄉tggggatgacgtcaagtcctcatggcccttatgggtagggcttcac1200acgtcatacaatggtcgggac卿gggtcgccaacccgcgsgggggagccaatccc3g犯1260acccgatcgtagtccggattgcaggctgcaactcgcctgcatg犯gtcggaatcgctagt1320aatcgcggatc已gcatgtcgcggtgaatacgttcccgggtcttgtacacaccgcccgtca1380caccatgggagtgggttttaCC3g犯gt3gttagcctaacCgC33ggggggcgattacca1440cggtaggattC3tg已Ctggggtgaagtcgtaacaaggtagccgtatcggaagg149权利要求1.一种极小单胞菌T7-7(Pusillimonassp.T7-7)菌株，保藏于“中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心”，命名为Pusillimonassp.T7-7，其保藏号为CGMCCNo.2172。2、根据权利要求1所述的菌株，其特征在于该菌株的菌落特征在LB平板上培养两天的菌落大小直径0.5lmm，菌落呈圆形，边缘整齐，表面光滑，半透明；该菌株的细胞形态特征革兰氏染色阴性，菌体呈短杆状，单端极生鞭毛，能运动，兼性好氧，细胞大小宽0.2-0.5ymX长0.5-1.0um;该菌株的生理生化特征生长温度4一37'C，生长pH范围6-9，NaCl耐受性高达5.5%;接触酶，亚硝酸盐还原，脲酶，硫化氢产生，分解七叶苷实验均为阳性；M.R.，V-P，吲哚产生，硝酸盐还原，反硝化，淀粉水解，产氨，明胶水解实验为阴性；葡萄糖发酵为氧化型；石蕊牛奶试验为产碱型；降解中长链垸烃及相应的醇、酸。3、根据权利要求1所述的菌株，其特征为16SrDNA序列如序列表所示。4、一种权利要求l所述菌株的应用，其特征是用于海洋石油污染的生物修复。5、根据权利要求4所述菌株的应用，其特征是该菌株在15—30'C温度条件下，通过基础培养基生长繁殖过程能同时降解C16C32的正构垸烃和原油；其基础培养基组成为g/L:KH2P043.48,Na2HP04M2H201.5，(NH4)2S044.0,MgS04'7H200.70，酵母提取物0.05,pH7.0-7.2;往复摇床180rpm转速培养72h，对中长链烷烃降解率最高可达40%以上；对原油降解率达到16%以上。全文摘要一株低温解烃的极小单胞菌T7-7及其用途。本发明菌株是从石油污染的海底泥中分离，以液蜡为唯一碳源的情况下在15℃反复驯化培养而获得，其命名为Pusillimonassp.T7-7，其保藏号为CGMCCNo.2172。该菌可在普通牛肉汁、LB、营养琼脂营养培养基中生长，也可在添加葡萄糖的无机盐培养基中生长，还可以以烷烃或原油为碳源生长。本发明提供的T7-7菌在15～30℃最适温度条件下，能够以烃为碳源和能源生长，能够利用16碳～32碳的正构烷烃，对原油(5g/L)的降解率可达16％以上，对中长链正构烷烃降解率最高可达40％以上；当该菌株与其他产表面活性剂的解烃菌株混合培养，协同作用于原油时可获得更高的降解率，因此可用于海洋石油污染的生物修复。文档编号C12N1/20GK101225366SQ20071005975公开日2008年7月23日申请日期2007年9月24日优先权日2007年9月24日发明者刘如林,丹李,梁凤来,谢玉娟,挺马,磊黄申请人:南开大学