β-甘露聚糖酶复合制剂及其制备方法

专利名称：：β-甘露聚糖酶复合制剂及其制备方法
技术领域：
：.本发明涉及稳定生物活性制品制剂方法的
技术领域：
，特别涉及一种稳定固态或液态e-甘露聚糖酶复合制剂及其制备方法。
背景技术：
：生物活性制品特别是酶通常在贮藏和使用过程中比较容易失活，而不能充分发挥其自身的生物功能，从而限制了这些活性物质的应用。应用于饲料、食品等领域的固态生物活性制品，通常还需要经历干燥、造粒、挤压、膨胀等高温(S012(TC)高湿处理操作，极易导致这些生物制品失去活性。为了解决上述失活问题，专利W02005/074705采用了添加玉米淀粉糖类聚合物作为固相载体和阿拉伯胶、植物蛋白等作为稳定剂提高固态或液态饲用植酸酶制剂的稳定性，但两种制剂过程采用了同种稳定剂，忽视了液、固两种剂型稳定的各异性差别，并且固态制剂仍采用了传统的捏合、挤压、圆球化、千燥等一系列既繁琐又易使酶失活的加工过程；ZL95104797.3提出了使用甘露糖醇和丙氨酸稳定剂减少冻干过程中医用蛋白质的失活；W096/41859发明了4-取代苯基硼酸作为洗涤用酶的稳定剂；W02003/004633采用添加半乳糖、乳糖和果糖的混合糖和白蛋白或葡聚糖稳定剂减少冷冻干燥过程中碱性磷酸酶的失活；ZL200710066875.1提出了采用甘露醇、棉籽糖和海藻糖复合保护剂提高a-半乳糖苷酶稳定性。甘露聚糖酶(0-mannanase，EC3.2.1.78)是一类可以水解甘露聚糖、葡萄甘露聚糖、半乳甘露聚糖等含有￡5-1，4-糖苷键植物多糖的半纤维素酶。其作用底物如魔芋、瓜尔豆胶、田菁胶、椰子肉等富含甘露聚糖的物质在自然界中储量丰富，是仅次于木聚糖的第二大类半纤维素成分。该酶用途广泛，可以应用于功能性低聚糖食品生产(ZL01128868.X)、非淀粉多糖饲料添加剂(US5，429，828、US6，162，473)、石油开采工艺破胶剂(US5，247，995、US5，551，515、US6，936，454)、医药领域高效免疫增强剂(ZL01144307.3)、果汁和咖啡饮品生产的降粘剂(US7148399)、洗涤行业的去污剂(US7，273，736、US7，229，955)、纺织行业苎麻脱胶剂(ZL98111947.6、US6，296，671)、造纸和印染行业的漂白剂(US7，183，093)等。上述e-甘露聚糖酶在生产、储运和使用过程中，存在以下制剂稳定问题在应用条件下会直接造成酶失活；在应用前的储运过程中带来酶活损失；固态制剂方法繁琐复杂易影响酶的活力；因为酶的稳定性问题而使得其应用受限。
发明内容本发明的目的是提出一种稳定固态或液态甘露聚糖酶复合制剂及其制备方法。稳定-甘露聚糖酶的液态制剂是直接向P-甘露聚糖酶溶液添加糖类或醇类或其复合物的保护剂；固态制剂是向酶液中添加糖类或糖类醇类复合物的保护剂后进行干燥、制粒。这两种方法具有制剂简单、易于操作、成本低廉、制剂稳定效果显著等优点。本发明的甘露聚糖酶制剂产品在室温下存放6个月，酶活损失不高于30%;在4i:下冷藏存放12个月，酶活损失不高于10%，可以满足长期稳定保存的要求。本发明提供的e-甘露聚糖酶复合制剂至少包含e-甘露聚糖酶与保护剂制成，原料酶液的的酶活力为10106IU/mL。所述的保护剂是选自1)蔗糖、淀粉、糊精、壳聚糖、果糖、葡萄糖、甘露糖、海藻糖中的一种或多种；2)山梨醇、乙醇或甘油中的一种或多种；或1)和2)的复合物。所述的保护剂是蔗糖、淀粉和山梨醇的复合物，其质量比为蔗糖淀粉山梨醇=150:跳0.11。.所述的保护剂的加入量至少为酶液质量的35%，质量，制成固态酶制剂。所述的保护剂l)的加入量至少为酶液质量的0.3%，质量，制成液态酶制剂。所述的保护剂2)的加入量至少为酶液质量的4%，质量。所述的保护剂1)和2)的复合物的加入量至少为酶液质量的0.5-1%量。所述的e-甘露聚糖酶复合制剂还包含至少一种选自植酸酶、纤维素酶、葡聚糖酶或木聚糖酶中的一种或多种。任一所述的甘露聚糖酶复合制剂，其中所述的e-甘露聚糖酶为微生物来源的13甘露聚糖酶，微生物是芽孢杆菌、青霉菌、链霉菌、曲霉菌、木霉菌、柱霉、假单胞菌、梭菌、纤维单胞菌中的一种或多种，优选芽孢杆菌e-甘露聚糖酶和由芽孢杆菌经基因工程构建的工程菌表达的甘露聚糖酶；所述的甘露聚糖酶复合固态酶制剂的制备方法包括的步骤1)按计量将纯化后的0-甘露聚糖酶溶液与保护剂混合均匀，80120'C干燥，采用2040目或40S0目标准筛挤压筛分制成标准目数的颗粒，得到固体复合制剂；2)粒径小于80目的颗粒用110%水润湿后，.重新制粒。本发明将山梨醇用作P-甘露聚糖酶复合保护剂的主要成分，不但可以起到保持酶制剂活力的作用，还具有抑菌保鲜的功能，真正发挥保护酶制剂的作用。因此本发明所涉及的"稳定"除了指在很大程度上保持酶的现有活力外，还代表着酶制剂在较长的一段时间内不会发霉变质。本发明制剂的制备方法是基于酶的特定用途对发酵粗酶液进行不同方法的纯化处理，获得酶活控制在10106IU/mL范围内的酶溶液，然后根据剂型的需要向该酶溶液中添加保护剂。所述的纯化是基于酶的特定用途的纯化方法。对于采油破胶用酶的纯化是将微生物分批补料发酵制得的粗酶液进行离心纯化操作；对于饲料用酶的纯化是将e-甘露聚糖酶的发酵粗酶液进行絮凝和离心纯化操作；对于食品和医药用酶的纯化是将e-甘露聚糖酶的发酵粗酶液，进行絮凝、离心和超滤等纯化操作。将纯化后的酶溶液，再利用水稀释或真空蒸发浓縮等方法将酶液的酶活控制在1010(1IU/mL。对于固态酶制剂，利用热空气干燥并筛分制粒，所述的干燥是在带有鼓风机的恒温干燥箱中采用80120。C的热空气蒸发带走浆料中的水分；所述的制粒是采用2040目和4080目标准筛挤压筛分制成标准目数的颗粒；所述的颗粒中粒径小于80目的颗粒需要重新回收制粒，其质量占所有颗粒的540%(w/w)。所述的颗粒回收制粒方法在于将粒径小于80目的颗粒用110%水润湿后，重新制粒；对于液态酶制剂，直接搅拌混匀。所述的液态制剂包括以下加工至少一种酶，其中主要酶来6纯化后0-甘露聚糖酶溶液，其f3-甘露聚糖酶的活力为1010eIU/mL。至少添加0.5%(w/w)的蔗糖、壳聚糖、果糖、葡萄糖、甘露糖、海藻糖等糖类化合物中的一种或多种，或4%(w/w)的山梨醇、乙醇、甘油等醇类化合物中的一种或多种，或l%(w/w)糖醇复合物的保护剂，其中由蔗糖、壳聚糖和山梨醇组成的复合物保护效果最好，适宜的配比为蔗糖壳聚糖山梨醇(重量比)=1:12:0.52;将酶液与保护剂混合均匀。本发明生产的液态或固态P-甘露聚糖酶制剂产品在室温(25°C)下存放6个月，酶活损失不高于30%(未加保护剂的酶活损失高于65%);在4'C下冷藏存放12个月，酶活损失不高于10%(未加保护剂的酶活损失高于35%)，可以满足长期稳定保存的要求。图i不同应用的固、液两种e-甘露聚糖酶制剂过程示意图。图2不同单一醇类保护剂对液态e-甘露聚糖酶制剂的保护效果图。图3不同单一糖类保护剂对液态e-甘露聚糖酶制剂的保护效果图。具体实施例方式本发明使用的e-甘露聚糖酶溶液(i)采油破胶用酶微牛物分批补料发酵制得e-甘露聚糖酶的粗酶液，经离心处理后制得，其中产酶微牛物包括芽孢杆菌、青霉菌、链霉菌、曲霉菌、木霉菌、柱霉、假单胞菌、梭菌、纤维单胞菌等各类菌种，优选芽孢杆菌及其经过基因改造后构建的基因工稃菌，但不仅限于此类微生物；(2)饲料用酶日-甘露聚糖酶的发酵粗酶液，再经过絮凝、离心后的酶液；(3)食品和医药用酶e-甘露聚糖酶的发酵粗酶液，再经过絮凝、离心和超滤纯化操作所获得的酶液。将纯化后不同用途的酶利用水稀释或真空蒸发浓縮的方法控制酶液的酶活为10106IU/mL，其中，酶活定义为50'C下每分钟释放出i叫相当于甘露糖的还原糖所需要的酶量为i个活力单位au)。所用的保护剂均为市售的食品级商品。本发明的实施方法如附图1所示。用地衣芽孢杆菌(ATCCI4580)发酵制得P-甘露聚糖酶粗酶液，然后根据酶的不同用途分别制得用于采油生物破胶、饲料添加剂、食品医药用酶等场合的(3-甘露聚糖酶溶液，其酶活为10106IU/mL，再向该溶液中加入至少一种糖类或醇类或其复合物保护剂(添加量至少为0.3%(w/w))制成液态酶制剂；或向(3-甘露聚糖酶溶液中加入至少一种糖类或糖醇复合物保护剂(添加量至少为酶液质量的35%(w/w))，再利用80120'C的热空气干燥和两种不同目数的标准筛筛分，加工制成一定粒径的固态酶制剂。实施例1:收集由芽孢杆菌分批补料发酵生产的e-甘露聚糖酶粗酶液(酶活为87312IU/mL)，基于酶的特定用途选择纯化操作(1)采油破胶用酶将10L上述e-甘露聚糖酶的粗酶液，用三足离心机以2000rpm转速进行离心操作去除大部分的菌体等固形物，制得大约9.5L澄清的e-甘露聚糖酶溶液(酶活为82597IU/mL);(2)词料用酶将10L上述|3-甘露聚糖酶的粗酶液，参照韩健等(生物加工过程，5(2):29-35，2007)方法加入絮凝助剂(氯化钙、聚铝、阳离子和阴离子聚丙烯酰胺等)进行絮凝操作，并用三足离心机以2000rpra转速离心分离去除大部分絮凝助剂、菌体和杂蛋白等固形物，制得大约10.5L酶活为77882iu/mL的e-甘露聚糖溶液；(3)食品和医药用酶将iol上述e-甘露聚糖酶的粗酶液，参照ZhangJun等方法(BiotechnologyLetters,22(17):1375-1378，2000)经过壳聚糖为絮凝助剂的絮凝操作、三足离心机离心分离以及两个截留分子量分别为.lOkDa与50kDa中空纤维超滤膜分离，获得了纯度更高的P-甘露聚糖酶溶液(酶活为766600IU/raL)。纯化后{3-甘露聚糖酶溶液再通过用水稀释或真空蒸发浓縮的方法将酶液的酶活控制在1010"IU/mL。实施例2:以食品和医药用酶为例，将发酵获得的P甘露聚糖酶粗酶液(酶活为87312TI]/mL)进行絮凝、离心和10kDa、50kDa超滤纯化处理操作，并经适当稀释后获得P-甘露聚糖酶溶液(酶活为13794lU/mL)。取5L上述P-甘露聚糖酶溶液，向其中加入5g蔗糖、10g壳聚糖和10g山梨醇作为液态酶制剂复合保护剂，并通过搅拌混合均匀，制得甘露聚糖酶的液态制剂产品(酶活为34526工U/mL)，4°C卜7令藏保存或室温保存备用，其储存稳定性如表1。表ie-甘露聚糖酶液态酶制剂储存稳定性<table>tableseeoriginaldocumentpage6</column></row><table>实施例3:以饲料添加酶制剂为例，将发酵获得的粗酶液(酶活为87312lU/mL)进行絮凝和离心纯化处理操作，并经适当稀释后获得了P-甘露聚糖酶溶液(酶活为57307IUZmL)。取5L上述(3-甘露聚糖酶溶液，向其中加入100g蔗糖和10g山梨醇搅拌混合均匀后，再加入5000g淀粉将P-甘露聚糖酶溶液变成浆态，利用105'C的热空气对该浆料进行干燥，千燥程度以最终产品的含水量要求为控制指标，人约干燥需要4小时。将制得的含复合保护剂的0-甘露聚糖酶固态粒状制剂过两次标准筛处理，标准筛目数分别为2040目和4()80目，最终获得两种不同粒径的e-甘露聚糖酶固态酶制剂，其中目数为2040酶制剂质量为2154g(平均酶活为62980IU/g);目数为4080酶制剂质量为1798g(平均酶活为62493lU/g),4'C下冷藏保存或室温保存备用，其储存稳定性见表2。另外，收集到目数大于80目的固态酶粉质量约为1160g(平均酶活为30458IU/g)，可以用5%的水润湿，再重新干燥制粒进行回收利用。表2P-甘露聚糖酶固态酶制剂储存稳定性<table>tableseeoriginaldocumentpage6</column></row><table>实施例4:实施方法同实施例2，改变液态酶制剂复合保护剂添加的配比，分别以蔗糖、壳聚糖与山梨醇质量浓度(g/L)之比为l:1:1、2:2:1、3:3:1、2:1:2、3:3:2、3:1:3、1:2:3、2:3:3禾P1:2:2加入到3-甘露聚糖酶溶液巾，保护效果如表3所示。表3不同配比的复合保护剂对液态e-甘露聚糖酶的保护效果<table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table>实施例5:实验操作方法同实施例2，采用不同的液态酶制剂单一保护剂，分别向P-廿露聚糖酶溶液中加入葡萄糖、甘露糖、果糖、蓆糖和壳聚糖，保护效果如附图2所示，分别向13-甘露聚糖酶溶液中加入乙醇、甘油和山梨醇，保护效果如附图3所示。实施例6:实验操作方法同实施例3，改变液态酶制剂复合保护剂添加的种类和配比，分别以淀粉、蔗糖与山梨醇质量百分数之比为80:20:0.2、120:20:0.2、100:5:0.2、丄00:15:0.2、100:25:0.2、100:20:0、100:20:0.3以及以糊精、蔗糖与山梨醇质量百分数之比为ioo:20:0.2加入到e-甘露聚糖酶溶液中，制得固态酶制剂，其保护效果如表4所示。表4不同配比的保护剂对固态e-甘露聚糖酶的保护效果4.<table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table>*注表中保护剂的单位(％)指保护剂占P-廿露聚糖酶溶液的质量百分比。权利要求1、一种β-甘露聚糖酶复合制剂，其特征在于至少包含β-甘露聚糖酶保护剂所述原料酶液的酶活力为10～106IU/mL。2、根据权利要求l所述的P-甘露聚糖酶复合制剂，其特征在于所述的保护剂是选自1)蔗糖、淀粉、糊精、壳聚糖、果糖、葡萄糖、甘露糖、海藻糖中的一种或多种；2)山梨醇、乙醇或甘油中的一种或多种；或1)和2)的复合物。3、根据权利要求2所述的β-甘露聚糖酶复合制剂，其特征在于所述的保护剂是蔗糖、淀粉和山梨醇的复合物，其质量比为蔗糖淀粉山梨醇=150:100:0.11。4、根据权利要求2所述的β-甘露聚糖酶复合制剂，其特征在于所述的保护剂的加入量至少为酶液质量的35%，质量。5、根据权利要求2所述的甘露聚糖酶复合制剂，其特征在于所述的保护剂l)的加入量至少为酶液质量的O.3%，质量。6、根据权利要求2所述的β-甘露聚糖酶复合制剂，其特征在于所述的保护剂2)的加入量至少为酶液质量的4%，质量。7、根据权利要求2所述的β-甘露聚糖酶复合制剂，其特征在于所述的保护剂1)和2)的复合物的加入量至少为酶液质量的0.5-1%，质量。8、根据权利要求i所述的β-甘露聚糖酶复合制剂，其特征在于还包含至少一种选自植酸酶、纤维素酶、葡聚糖酶或木聚糖酶中的一种或多种。9、根据权利要求1-8任一所述的β-甘露聚糖酶复合制剂，其特征在于所述的β-甘露聚糖酶为微生物来源的β-甘露聚糖酶，微生物是芽孢杆菌、青霉菌、链霉菌、曲霉菌、木霉菌、柱霉、假单胞菌、梭菌、纤维单胞菌中的一种或多种，优选芽孢杆菌β-甘露聚糖酶和由芽孢杆菌经基因工程构建的工程菌表达的β-甘露聚糖酶。10、权利要求4所述的β-甘露聚糖酶复合制剂的制备方法，其特征在于包括的步骤1)按计量将纯化后的β-甘露聚糖酶溶液与保护剂混合均匀，80120℃干燥，采用2040目或40S0目标准筛挤压筛分制成标准目数的颗粒，得到固体复合制剂；2)粒径小于80目的颗粒用110%水润湿后，重新制粒。全文摘要本发明涉及一种稳定固态或液态β-甘露聚糖酶复合制剂及其制备方法。该β-甘露聚糖酶复合制剂至少包含β-甘露聚糖酶与保护剂，原料酶液的酶活力为10～10⁶IU/mL。保护剂选自1)蔗糖、淀粉、糊精、壳聚糖、果糖、葡萄糖、甘露糖、海藻糖中的一种或多种；2)山梨醇、乙醇或甘油中的一种或多种；或1)和2)的复合物。本发明在室温下保存6个月酶活损失不高于30％(未加保护剂的酶活损失高于65％)，在4℃下保存12个月酶活损失不高于10％(未加保护剂的酶活损失高于35％)，可以满足长期稳定保存的要求。文档编号C12N9/96GK101173264SQ20071006009公开日2008年5月7日申请日期2007年10月31日优先权日2007年10月31日发明者何志敏,刘朝辉,崴齐申请人:天津大学