专利名称：铜绿假单胞菌鞭毛运动相关基因pa2950及应用的制作方法
铜绿假单胞鋼秘动相，因尸J2950 ^SiSffl
M领域本发明属于微生物生物技术领域，特别涉及一种铜绿假单胞M毛运动相关基因
背景技术：
铜绿假单胞菌(fteWo鹏nas aeruginosa)属假单胞菌属，革兰氏阴性菌，它是一 种分布广泛的割顿病菌，在临床上，它能引起菌血病、耳、眼、i^^:软组织、骨及关节、心内 膜和呼吸系统等的感染，是人类的三;^C病菌之一，是引娜炎的首要致病菌。由于其具有形成生 物鹏等多重耐药机制，耐药率高，常在临床上引起顽固性、难治性感染，成为临床治疗的棘手问 题。
铜绿假单胞菌具有彰瑞鞭毛，运动活泼。鞭毛作为主要的运动器官，对铜绿假单胞菌提高营 养物质的获得,逃避毒性物质，转移到誠的寄主，找到魏的固着位点和向环境扩散传播起着重 要作用。生物 斷氐了药物的 性，与耐药性紧密相关，在生物被膜的形成过程中，鞭毛的运
动对最初的固着与扩t5:il^^至^M要的作用。对铜绿假单胞M，动相，因进行研究,确 定縫因的功能,为揭示其鞭接动机理和鞭毛在生辦w^成中、在自然别专播中作用的机理提 供基础，为临床治疗和耐药防治,理论依据。
有关铜绿假单胞菌鞭秘动相錢因的功能研究，国内尚无报道，国夕附就此方面有一定 的涉及，其研魅要是在控制鞭毛数目基因、调节鞭毛蛋白合成的调节因子等方風f别于鞭顿 动相关基因的功能、各基因间如何调节,尚存在不少疑点，缺少系统的研究。本研究从这一点 出发，探索与鞭^ig动相关基因的功能阐明其运动相关基因之间的作用机理。
发明内容:本发明目的是Mf共铜绿假单胞，^动相^S因尸」29M，并用该基因为新，点
研制抑制铜绿假单胞菌的新型药物。
本发明^1共的铜绿假单胞菌鞭^动相，因iM295仏其核苷,列如序列^0 ^，其基因 长度为l懸p,位于铜绿假单胞菌基因组282节3309411—3310607。
Ji^的铜绿假单胞菌鞭，动相，因i^^ 可以用于以该基因为新IPE点设计并制皿菌 药物，以及在食品卫生和耐药防治方面的应用。
本发明基因M2W0的获得方法ffiffl人工Mu转座技术(一种基于噬菌体Mu转座子的转座技 术)，造成铜绿假单胞菌基因突变，粒突变子文库。筛选泳动能力丧失的突变子，{顿S棚HI 酶切基因组DNA，酶切片段与pUC18载体连接，i!31电转化将连接产物导入大肠杆菌DH5a，用卡那 霉素和氨节青霉素舰LB平板筛选阳性转化子，测定突变株中插入片段的核苷,列，发现Mu 插入的基因，确定此基因与铜绿假单胞M秘动有相关性。
本发明的有 *:
实^S现，本发明鹏的基因川"50缺失或失活后，倉^f赚毛介导的泳动能力丧失。
Mu插入失活的基因泳动能力丧失，说明此基因与铜绿假单胞M^毛的运动有关，m鞭^ii
动相，基因的发现以及揭^基因的功能都有指导意义。
M本发明，可以针对/^"50基因设计药物，限制其正常駄，使得细菌无法Mii鞭秘动
形成生tlW，斷氐其耐药性，超i胎疗铜绿假单胞菌弓胞的感染的目的。
1
图1是泳动能力丧失的阳性转化子的蹭动运动检测图，其中，1、野生型PA68作为阳' 照， 2、 i^2柳::MuPA68突变株。
图2是Mu克隆子酶切^电泳图，1、 DL15000 2、质粒3、质粒酶切。
图3是Mu转座子PCR,电泳图(用PCR方法检测转化子的Mu转座子)，
其中，4、 DL2000， 5、 Mu克隆子PCR产物。
用Mu-k孤Pl和Mu-kamP2作为弓物，克隆子质粒DNA为*鎌，可以扩增出700bp的特异性片 段，说明所检测的克隆子质粒中携带着插入了 Mu转座子的基因片段。
具体实lfe^:
实施例l: 4顿Mu转座技术进行突，文库的^:
(1) 将临床分离糊绿假单胞菌PA68接种于50 ml L-broth培养基(10 g/L胰蛋白胨,5 g/L酵 母粉,5g/LNaCl)中，37°C，200 rpm振荡培养过夜。
(2) 次日按l: 100接种至200mlL—broth培养基中，200rpm， 37。C培养至OD540^0.5，终止培养。
(3) 于2。C 7000 g离心10 min，收集菌体。
(4) 依次用靴积、1/2体积、1/5体积在冰浴中预冷的300mM庶糖溶體織浮、洗涤菌体，2 。C 8000g离心10min，倒净残液。
(5) 根据菌体的多少用不同体积的300mM蔗糖溶液混匀，并ffiil活细胞计数制备j^度约为10" 个cells/ml的感受态细胞。
(6) 将感受态细胞5)^ 100 ul /管， 一部分直接用于电转化，1分在液氮中冷冻后，放一80 。C職中保存。另一部分直接放—8(TC,保絲用。
(7) 取感受态细胞100 u 1、质粒pSMC28和Mu转座复，约50ng，加入到在冰浴中预冷的0.2 cm 电转化杯中(阴'舰照只加感受态细胞不加质粒)，在Bio-Rad电穿孔^Lt设置电容25uF，电阻
200 i^B^iS的电压^电击。
(8) 电击后将转化体系转入職37。C温浴的900"L-broth培养基中。37°C， 225ipm， i歸lh 。
(9) 取100 P L菌液涂布于50 ii g/ml Km抗性平板上，温箱37°C过夜培养，24小时后即可观察结 果。
(10) 腿夜i歸的筛选平ISJ:挑取数个離，分别接种到1 ml的L一broth中，37°C， 200卬m 振荡培养16—18 h。
(11) 取2 n 1菌液1辦鎌，以AX Mu转座子上的特异序列Mul (5， - GCMCTGTCCATACTCTGA-3，) 和Mu2 (5， - CGCTGGGTTTATCGTCGA-3')做引物，用PCR方纟,增Mu转座子片段。同时分别以 铜绿假单胞0^株^M粒pmH2做阴性及阳'l^t照。扩增条件为，先在94C性15min，然后， 94。C变性1 min， 55。C退火1 min， 72。C延伸1 min，共30个循环，雜72。C延伸10 min。
(12) PCR产鹏0.8%琼脂糖繊中电泳检测，EB染色后紫外灯下观察结果并留照片，具有700bp 卡那霉素抗性基因的转化子即为Mu转座复，转化子。
实施例2:突变子的泳动能力的检测
a)在无菌塑料培养皿内铺上一层泳动能力检测培养基(10g/L胰蛋白胨，5g/LNaCl， 0. 3%琼脂糖)。
(2) 从Mu转座子突变文库中活化突'，株。
(3) 用灭菌的牙翻嫩 点种在培养基的表面，30 °C培养12到14小时。
(4) 细菌会 鞭％^动在培养基的表面以接种点为圆心向周围泳动生长，形#小不一的圆环， 以野^MPA68为对照，筛选泳动能力丧失的突变株(图l)。
实施例3:新包杆菌抑真菌相^S因的克隆 1 Mu转座复合,化子基因组DNA的提取
(1) 将铜绿假单胞菌Mu转座复激转化子接于5mL LB液体培养基中，30°C 200r/min过夜培养。
(2) 4'C 5000r/min离心10射中，弃上清，菌体重悬于200&裂解缓冲液。
(3) 力口入4mL 10 mg/ml的RNase, 37。C水浴30併中。
(4) 加入8^l 20 mg/mL的蛋白酶K， 20% SDS 5jjL，于56。C水浴30 ^H中。
(5) 分别用等#%口、苯酚，苯酚:氯仿(l:l)和氯仿各抽提l次，12000r/min离心10射中。
(6) 加入2倍^KR冷冻的^7jC乙醇，f2(rC敗置30射中。
(7) 挑出DNA， 70%乙瞎先涤2次，真空千燥。
(8) 溶于50|_iL TE， -20。C保存。
2大量提取规杆菌质粒pUC18
(1) 25mL液体LB培养基，接入携带质粒pUC18的大肠杆菌单01:， 30°C、 200r/min培养过夜。
(2) 菌液的OD6oo散于1.0后，4°C 6000r/min离心10射中，弃上清。
(3) 加STE溶液(100 mM NaCl ， 10 mM Tris. Cl pH8.0, 1 mM EDTA) 12. 5mL M胞，4°C 6000r/min 离心10赠，弃上清。
(4) 加溶液I (50 mM葡錄糖，10 mM EDTA, 25mM Tris.Cl， pH8.0) 0. 5mL再向各管中加入溶 菌酶(反应浓度20ng/mL),轻微混，37。C7K浴15-30min。
(5) 加溶液II (0.2 M NaOH， 1% SDS) lmL轻轻混匀Mig明，冰浴10^t1。
(6) 加入溶液III (3 M KAc， 5 M乙酸，pH4.8) 0. 75mL剧烈振荡后，冰浴30^Ht。
(7) 4'C 12000r/min离心5併中，^Ul清。
(8) 力口入0. 7 #%口、的异丙醇，室MW 15赠。
(9) 4°C 12000r/min离心10辦中，弃上清。
(10) 加入lOO^L TE溶液溶lft亥酸。
(11) 加入RNase (Si^浓度为100pg/mL) 37。CtK浴30射中。
(12) 靴积漂酚:氯仿(1:1)，抽提，振荡均匀，4'C 12000r/min离心15併中，^Ul清。
(13) 加入2 ff^f只的^7K乙醇和1/10 #^只的3mol/L NaAc (pH4. 8)， -20°C^S 20射t沉淀DNA。
(14) 4。C 12000r/min离心10射中，弃上清。
(15) 加入lmL70T。的冷乙醇洗DNA沉淀两次，干燥。
(16) 加入50pL TE溶解质粒，-2(TC保存。
3基因组DNA和质粒pUC18的酶切(50mL体系) 10 X buffer 5yL fefflHI 2" DNA 10uL ddH20 33 yL
混匀，30t^浴过夜。
4酶的灭活与纯化
(1) 酶切体系置于65。C水浴15併中，之后降M^温。
(2) TE补^400pL，等^f只的苯酚:氯仿(1:1)抽提一次。
(3) 加入2倍^i口、的^7jC乙醇和1/10 ^f只的3mol/L NaAc (pH4.8)， -20。C方夂置20射^沉淀DNA。
(4) 4°C 12000r/min离心10倂中，弃上清。
(5) 加入lmL70"/。的冷乙ei先DNA沉淀两次，真空千燥。
(6) pUC18溶于88^L lm mol/L Tris^Cl，基因组DNA溶于lpL TE。 5 pUC18去磷酸《七
pUC18 88^L
10X buffer 10pL CIAP (碱性磷酸酶) 2^L 置于37。C7JC浴30^H中。 6去磷酸鶴的除去
(1) TE补y^M200ML,加入2pL 0.5 mol/L EDTA。
(2) 75。C水浴10辦中，使酶失活，并降M^温。
(3) 等体积的苯酚:氯仿(1:1)抽提一次。
(4) 加入2 fg^f只的^7K乙醇和1/10^f只的3mol/LNaAc (pH4.8)， -2(TC體20辦t沉淀DNA。
(5) 4°C 12000r/min离心10射中，弃上清。
(6) 力口入lmL7Wo的冷乙S^DNA沉淀两次，真空千燥。
(7) 沉淀溶于5MLddH2。中。
7基因组DNA和质粒pUC18的连接(15^1体系) DNA lpL ddH20 攀 pUC18 1mL
混匀，45。C7K浴5射中后，腿冰浴，再加T4连接酶1. 5mL， 10Xbuffer 1. 5mL， 14-16°C 水浴过夜。
8连接,的处理
(1) TE补趕200nL。
(2) 加入2倍^i口、的^7K乙醇和1/10体积的3mol/L NaAc (pH4.8)， -20。C方夂置20併中沉淀DNA。
(3) 4°C 12000r/min离心10射中，弃上清。
(4) 加入lmL70"/。的冷乙醇洗DNA沉淀两次，真空干燥。
(5) 沉淀溶于5MLddH20中。
9 ，杆菌DH5a感受态细胞的制备
(1) 将;^杆菌单麟接种于5mLLB液体培养基中，37°C、 200转/倂中过夜培养。
(2) 过夜i歸的菌液按l: 100接种于100mL LB液体培养基中，37°C、 220 r/min振荡培养。
(3) 菌液ODeoo在0. 5-0. 6之间时终止培养并置于冰上。
(4) 转移至250mL离心中，4°C、 6000r/min离心10min,收集菌体。
(5) 100mL预冷的ddH2O悬浮洗涤细胞，4°C 6000r/rain离心10併中，收集菌体。
(6) 50mL预冷的l(m甘油悬浮洗涤细胞，4°C 6000r/min离心10辦中，收集菌体。
(7) 用2mL预冷的lW。甘油悬浮洗涤细胞，4。C 6000r/min离心10併中，弃上清，尽量吸干管壁 上的残留液体。
(8) 用200^L预冷的1(m甘油培养^g;t细胞。
(9) 100倍稀释后测菌液OD6qo，用预冷的10%甘油培#^将菌 释至浓度为2xl()w-3xl0W个 细H/mL (10D6oo约相当于2.5xloW个细M/ml)。
(10) 将菌液，，毎管95mL。用于电转tt^-7(TC保存。 10 :^杆菌DH5a的电转化方法
(1) 5pL DNA连接产物与95nL大肠杆菌感受态细胞混匀，冰浴5-10條
(2) 混^t/转移至预冷的0.2cm电转化杯中(阴'顿照不加混^tl，只加感受态细胞)，在Bio-Rad 电转化^Ol设置2.50kv，进行电击。
(3) 从电转化杯中吸出电转化体系，并用lmL37'C预热的S0C液体培养基(20g/L胰蛋白胨，5g/L 酵娜，0.5g/LNaC120mM葡繊，lOmM氯化镁)糖后，37°C， 150转/倂中i歸1小时。
(4) 菌液^涂布于含20咖ol/L MgS04 50pg/mL卡那霉素和lOOpg /mL氨节青霉素的LB固体 培养基上，37。C倒置过夜培养。
11克隆子的 、鉴定-.
(1) 舰夜i歸的鹏平fei挑取转化子，小量提M粒，用限制性内切酶fe/iH酶切，并以 pUC18M I酶切产物为对照。
(2) 以DL15000为DNA标准，在0.8%琼脂输鹏中电泳检测鉴定，钐隨同时具有pUC18载体带 和夕卜源目的基因带的克隆子(图2)。
(3) 同时以从转化子中提取的质粒为t鎌，用Mu转座子DNA片段的Mu转座子检测弓物Mu-kam Pl 和Mu-kam P2进行PCR (具体方法同实施例1中所述)。电泳检测PCR产物，以DL2000为DNA标准， 以质粒pHTH2为正,照，若能扩增出700bp的特异性带，贝i脱明转化子质粒中含有A!Mu转座子 DNA片段，克隆成功(图3)。
(4) 对成功克隆的转化子质f腿行测序。 12克隆子质粒的DNA测序
将用15%甘油管保存的转化子菌液，用以Mu转座子两端的反向序列为依据设计的AM42P2作为 引物进行测序，委肚海英俊公司进行DNA测序，测定转座子插入位点侧翼的核苷,列。 13.基因推断
测序结果在铜绿假单胞菌的基因组数据库(http〃www. pseudomonas.com)或GenBank (http:〃麵.ncbi. nlm. nih. gov/)的BLAST中进行序列t浏最终发现所需基因。
序列表
<110>南开大学
<120>铜绿假单胞011^动相，因^"50皿用
<160> 1
<10> 1
<211>1197
<212>DNA
<213>铜纟录假单胞菌(iVw^o附o/ oy am(g7-"asa) <400>1
atgatcatcaaaccgcgcgtgcgtggcttcatctgcgtcactacccatccggcaggctgc60
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ccgaagaaggtcctggtcatcggttcctccaccggctatggcctggctgcccgcatcacc180
gccgcgttcggttccggcgccgataccctcggggtgttcttcgagcgtccgggcagcgag240
agcaagccgggcaccgccggctggtacaactcggcgactttcgagaagttcgcccacgag300
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gcgccgcgccgtacccatccgaagagcggcgaagtgttctcctcgaccctcaagccgatc■
ggcaagtcggtcagcttccgtggcctggacaccgacaaggaagtgatcaaggacgtggtc540
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tggcagatgtggatcgacgcgctgctggaggccgacgtgctggccgacggcgcgaagacc660
accgcgttcacctacctgggcgagaagatcacccacgacstctactggaacggttccatc720
ggcgcggccaagaaggatctcgaccagaaggtcctcggtatccgcgacaagctcgccccg780
ctgggcggcgacgcgcgcgtctcggtgctcaaggcggtggtgacccaggccagctcggcg940
atcccgatgatgccgctgtacctgtcgctgttgttcaaggtgatgaaggagcagggcacc1000
cacgaaggttgcatcgagcaggtcgacggcctgtaccgggagagcctgtacggcgccgag1060
ccgcgcctcgacgatgaaggccgcctgcgtgccgactacaaggaactgcagccggaagtg1120
cagtcccgcgtcgaggagttgtgggacaaggtaaccaacgagaacctttacgagctgacc1180
gacttcgccggctacaagagcgagttcctcaacctgttcggtttcgaggtcgctggggtc1140
gactacgagcaggacgtcaacccgggcgtgcggatcgccaacctgatccaggcctga119权利要求
1、一种铜绿假单胞菌鞭毛运动相关基因PA2950，其核苷酸序列如序列表所示，其基因长度为1197bp，位于铜绿假单胞菌基因组282节3309411-3310607。
2、 权利要求1所述的铜绿假单胞翻秘动相关基因州"50的应用，用于以该基因为新药 耙点设计并制織菌药物。
全文摘要
本发明公开了铜绿假单胞菌鞭毛运动相关基因PA2950。属于微生物生物技术领域。本发明与铜绿假单胞菌致病性的研究息息相关，此基因大小为1197bp，国际上对该基因的功能没有报道。实验发现该基因的缺失能够使鞭毛介导的泳动能力丧失。鞭毛是铜绿假单胞菌主要的运动器官和重要的毒力因子，用铜绿假单胞菌鞭毛运动相关基因PA2950为新药靶点研制抗菌药物，为临床治疗和耐药防治服务。
文档编号C12N15/31GK101195827SQ20071006018
公开日2008年6月11日 申请日期2007年12月26日 优先权日2007年12月26日
发明者乔明强, 张秀明, 徐海津, 李迎丽, 芳 白, 白艳玲 申请人:南开大学