专利名称：铜绿假单胞菌生物被膜形成相关基因fimL及应用的制作方法
铜绿假单胞菌生tlW^細錢因M鹏用
技术领域：
本发明属于微生物生,术领域，特别涉及一种铜绿假单胞菌生物丰 形成相关基
因，即鞭秘动相錢因力附z。
背景默铜绿假单胞菌(Pseucfofflo朋saenygi/wsa)属假单胞菌属，革兰氏阴性菌，它是一 种分布广泛的斜顿病菌，在临床上，它能引起菌血病、耳、眼、^S软组织、骨及关节、心内 膜和呼吸系统等的感染，是人类的三，病菌之一，是引趟巿炎的首，病菌。由于 有形成生 物TO等多重耐药机制，耐药率高，常在临床上引^^员固性、难治性感染，成为临床治疗的棘手问 题。
细菌生物l鹏或称为菌膜，是细菌为适应不禾啲自然环境、维持自身生命而发生的形态学变 化，形成一种有禾盱生存的棘的生命5腺。当生物体内的细菌处于生长发育不禾啲环境时，菌 体周边会分泌多糖复合物，使细菌相互粘连，附^惰性物附fJ生物医学材料或粘膜表面并将其 自身包绕在其中而形成的皿物，使细菌可以停留在一^HS宜的微环境中而不会被冲散。生物被
膜的这种特殊结构可以作为一种屏p章保护细菌抵御抗an物的杀伤和mm宿主免疫系统的清除，
而成为潜在的感染源，导lfe隹治性临床生t^鹏的相关感染。鞭毛介导的泳动(swimming motility) 和IV型菌毛介导的蹭动(twitchingmotility)都参与了生物柳莫的早期形成。其中，蹭动是f魏菌 在固相表面上，依靠IV型菌毛的收縮和延伸，向周围运动的能力。
对生物M^形成机制的研究，国内尚未见相关报道。由于生物MH有非常重要的临床意义，最近 几年，已弓胞国外一些科学家的重视，使他们涉赴匕领職行研究。但其形成机制仍有许多未知 领域等待探索。目前已知，生物被膜的形成大致分为三步个体细胞的吸附；微菌落的形成；及 成突拟鹏的发育。我们对铜绿假单胞菌生物鹏形^"后錢因/m丄的研究可以±真补国内这"^页域 的空白，并完善铜绿假单胞菌生物MIi^成的机理。
发明内容1本发明目的是^^绿假单胞菌生tM^^+目^S因、即鞭，动相关基因力w丄' 并用该基因为新药耙点研制抑制铜绿假单胞菌的新型药物。
本发明^的铜绿假单胞菌鞭^it动相关基因具有如序列表所示核苷 列，其基因 长度为1689bp，位ffl绿假单胞菌基因组169节10946—10950。
，的铜绿假单胞，^动相，因力m丄可以用于以该基因为新药耙点设计并制MCM 物；以及在食品卫生和耐药防治诸方面的鹏。
本发明基因的获得方法^ffl人工Mu转座fe^ (—种基于噬菌体Mu转座子的转座技术)，造 成铜绿假单胞菌基因突变，粒突变子文库。臓曾动能力丧失的突变子，〗顿5amHI酶切基因 组DNA，酶切片段与pUC18载体连接，il31电转化将连接，导入^lf杆菌DH5a，用卡那霉素和氨 节青霉素双抗LB平板筛选阳性转化子，测定转化子中插入片段的核苷,列，发现Mu插入的基 因，确定此基因与铜绿假单胞MII^M动有相关性。
本发明的有^m:
实M现本发明基因的缺失f雜使IV型菌毛介导的蹭动能力丧失。
Mu插入失活的基因泳动能力丧失，说明此基因与铜绿假单胞mH毛的运动有关，3^t鞭^g 动相关新基因的发现以及揭^ff基因的功倉娜有指导意义。
ilii本发明，可以针对^j丄基因设计药物，限制其正常毅，使得细菌无法iliilE斷话动形 成生辦鹏，斷氐其耐药性，达到治疗铜绿假单胞菌弓l起的感染的目的。
图1题曾动能力丧失的阳性转化子的蹭动运动检测图， 1 、野 PA68作为阳',照2、 ^ml::Mu PA68突变株 图2是Mu克隆子酶切产物电泳图，1、 DL15000 2、质粒3、质粒酶切 图3是Mu转座子PCR产物电泳图(用PCR方法检测转化子的Mu转座子)， 4、 DL20005、 Mu克卩好PCR产物。 用Mu-kam Pl和Mu-kam P2作为引物，克隆子质粒DNA为模板，可以扩增出700bp的特异性片 段，说明所检测的克隆子质粒中携带着插入了 Mu转座子的基因片段。
具体实lfi^1
^JS例i: ^fflMu转座技术进行突变子文库的^
(1) 将临床分离糊绿假单胞菌PA68接种于50 ml L-broth培养基(10 g/L胰蛋白腺5 g/L酵 母粉，5g/LNaCl)中，37°C,200 rpm振荡培微夜。
(2) 次日按l: 100接种至200mlL—broth培养基中，200ipm， 37。C培养至ODs4o"0.5，终止蹄。
(3) 于2。C 7000 g离心10 min，收集菌体。
(4) 依7細##^、、 1/2#|R、 1/5#|只在冰浴中预冷的300福蔗糖溶體織浮、洗涤菌体，2 。C画g离心10min,倒净赚。
(5) 根据菌体的多少用不同体积的300mM薪塘溶液混匀,并fflii活细胞计数制备，度约为1011 个cells/ml的感受态细胞。
(6) 将感受态细胞^g 100"滑， 一部分直接用于电转化，1分在液氮中冷冻后，放—80 'C^II中保存。另一部分直接放一80"}*||保#^用。
(7) 取感受态细胞100 u 1、质粒pSMC28和Mu转座复，约50ng，加入到在冰浴中预冷的0.2 cm 电转化杯中(阴'舰照只加感受态细胞不加质粒)，在Bio-Rad电穿孑W灶设置电容25nF，电阻 200 Wf口战的电压誠电击。
(8) 电击后将转化体系转入職37。C温浴的900ulL-broth培养基中。37°C， 225rpm，培养1 h 。
(9) 取100 u L菌液涂布于50 P g/ral Km抗性平feh，温箱37°C过夜±咅养，24小时后即可观察结 果。
(10) 腿夜培养的筛选平肚挑取数个菌落，分别接种到1 ral的L一broth中，37。C， 200卬m 振荡培养16_18 h。
(11) 取2ul菌漸射鎌，以AIMu转座子上的特异序列Mul (5， -GCAACTGTCCATACTCTGA-3，) 和Mu2 (5， - CGCTGGGTTTATCGTCGA-3')做引物，用PCR方法扩增Mu转座子片段。同时分别以 铜绿假单胞離株M粒pHTH2做阴'股阳'断照。扩增^f牛为，先在94。C職性15min，然后， 94。C变性l min， 55。C退火1 min， 72。C延伸1 min，共30个循环，翻72。C延伸10 min。
(12) PCR产鹏0. 8%琼脂撒鹏中电泳检测，EB染船紫外灯下观察结果并留照片，具有700bp 卡那霉素抗性基因的转化子即为Mu转座复，转化子。
实施例2:突变子的蹭动能力的检测
(1) 在无菌塑料培养皿内铺上一层蹭动能力检测培养基[10g/L胰蛋白胨，5g/L酵職，5g/LNaCl， 1% (W/V)颗粒状琼月識]。
(2) 从Mu转座子突变文库中活化突变菌株。
(3) 用灭菌的牙^t兆取皿，乎UtS曾动培养基，将细菌接种到培养基下面的塑料平皿上，37'C1咅养
24小时。
(4) 细菌就会 IV型菌毛的收縮和伸展在培养基TM的塑料表面以接种点为圆心，向周围蔓延生
长，产生圆形的菌晕。
(5) 将培养難轻揭去，用考马司烂她液(10%乙酸，0.06%#马司賠)她塑料平皿20分 沐倒掉染液，用自彩K冲,皿lmin，观察细菌因蹭动而产生的环，筛淑曾动能力丧失或减弱 的突变子(图1)。
实施例3:铜绿假单胞菌生物^ 自皿因的克隆 1 Mu转座复』转化子基因组DNA的提取
(1) 将铜绿假单胞菌Mu转座复激转化子接于5mL LB液体i歸基中，30°C 200r/min过夜培养。
(2) 4°C 5000r/min离心10射中，弃上清，菌体重悬于200^翻早缓冲液。
(3) 加入4tiL 10 mg/ml的RNase， 37。C7JC浴30射中。
(4) 加入8pL 20 mg/mL的蛋白酶K， 20% SDS 5&，于56。C7JC浴30射中。
(5) 分另佣等#^只苯酚，苯酚:氯仿(1:1)和氯仿# 提1次，12000r/min离心10 5Ht。
(6) 加入2倍^f只冷冻的^7jC乙醇，于-20'C放置30射中。
(7) 挑出DNA， 70%乙瞎先涤2次，真空千燥。
(8) 溶于50mL TE， -20°(:保存。 2大量提取大肠杆菌质粒pUC18
(1) 25mL液体LB培养基，接入携带质粒pUQ8的 [杆菌单皿，3CTC、 200r/min培养过夜。
(2) 菌液的OD6oo歡于1.0后，4。C 6000r/min离心10倂中，弃上清。
(3) 加STE溶液(100mMNaCl， 10 mMTris. Cl pH8. 0, lrnMEDTA) 12.5mL洗细胞，4°C 6000r/min 离心10恤弃上清。
(4) 加溶液I (50 mM葡萄糖，10 mM EDTA， 25mM Tris.Cl， pH8.0) 0. 5mL再向各管中加入溶 菌酶(反应浓度20^ig/mL)，轻微混，37。C7]C浴15-30min。
(5) 加溶液II (0.2 M NaOH, 1% SDS) lmL轻轻混匀至透明，冰浴10射中。
(6) 加入溶液in (3 M KAc， 5 M乙酸，pH4.8) 0.75mL剧烈振荡后，冰浴30射中。
(7) 4°C 12000r/min离心5併中，肚清。
(8) 力口入0. 7 ^f只的异丙醇，室^fi 15溯。
(9) 4'C 12000r/min离心10辦中，弃上清。
(10) 力口入100^L TE溶液溶解核酸。
(11) 力口入RNase (反应浓度为100^ig/rnL) 37。C7JC浴30 ^H中。
(12) ^^P凍酚:氯仿(1:1)，抽提，振荡均匀，4°C 12000r/min离心15射中，社清。
(13) 加入2 ft^f只的^7K乙醇和1/10 #|只的3mol/LNaAc (pH4.8)， -20。C體20倂t沉淀DNA。
(14) 4'C 12000r/min离心10溯，弃上清。
(15) 加入lmL70。/。的冷乙^ 先DNA沉淀两次，干燥。
(16) 加入50nLTE溶解质粒，-2(TC保存。
3基因组DNA和质粒pUC18的酶切(50^L体系) 10 X buffer 5uL
fern HI 2 ia
DNA 10 PL
ddH20 33 y L
混匀，30。C水浴过夜。 4酶的灭活与纯化
(1) 酶切体系置于65。C7K浴15舰之后降鼓温。
(2) TE补^400&，等^f只的苯酚:氯仿(1:1)抽提一次。
(3) 加入2倍^f只的^7K乙醇和1/10 ^R的3mol/LNaAc (pH4. 8)， -20。C方j[K 20辦t沉淀DNA。
(4) 4°C 12000r/min离心10併中，弃上清。
(5) 加入lmL7W。的冷乙IMDNA沉淀两次，真空千燥。
(6) pUC18溶于88nL lm mol/L Tris~Cl，基因组DNA溶于l^iL TE。 5 pUC18去磷酸化
pUC18 88|oL
lOXbuffer lO^L CIAP (碱性磷酸酶) 2pL 置于37。C7K浴30^H中。 6去磷酸化酶的除去-
(1) TE补^200^iL，加入2pL 0.5 mol/L EDTA。
(2) 75。CtR浴10倂中，使酶失活，并降S^温。
(3) 等^f只的苯酚:氯仿(1:1)抽提一次。
(4) 加入2倍^f只的5^JC乙醇和1/10 #|只的3mol/L NaAc (pH4. 8)， -2CTC方爐20倂t沉淀DNA。
(5) 4°C 12000r/min离心10倂中，弃上清。
(6) 加入lmL7(^的冷乙il^DNA沉淀两次，真空千燥。
(7) 繊溶于5|A ddH20中。 ， 7基因组DNA和质粒pUC18的连接(15^1体系)
DNA 1mL ddH20 IO^iL pUC18 W
混匀，45。C7]C浴5粥中后，ffiil冰浴，再加T4连接酶1.5pL， 10Xbuffer 1.5^iL， 14-16。C 水浴过夜。
8连接产物的处理
(1) TE补^200^iL。
(2) 加入2倍^f只的^7]C乙醇和1/10 ^fR的3raol/L NaAc (pH4. 8)， -20。C方JCS 20併t沉淀DNA。
(3) 4°C 12000r/min离心10 ^!中，弃上清。
(4) 加入lraL7(F。的冷乙醇洗DNA沉淀两次，真空干燥。
(5) 沉淀溶于5pL ddH20中。
9 ;yg杆菌DH5a感受态细胞的制备
(1)将;^杆菌单鹏接种于5mLLB液体培养基中，37°C、 200转/併中过夜培养。
(2) 过夜培养的菌液按l: lOO接种于lOOmL LB液体培养基中，37°C、 220 r/min振荡培养。
(3) 菌液OD柳在0.5-0.6之间时终止培养并置于冰上。
(4) 转移至250mL离心中，4°C、 6000r/min离心10min，雌菌体。
(5) 100mL预冷的ddH2O悬浮洗涤细胞，4°C 6000r/min离心10併中，收集菌体。
(6) 50mL预冷的l(F。甘油悬浮洗涤细胞，4°C 6000r/min离心10併中，收集菌体。
(7) 用2mL予敬令的lTO甘油悬浮洗涤细胞，4'C 6000r/min离心10溯，弃上清，尽量吸干管壁 上的残留液体。
(8) 用200mL预冷的10T。甘油培养基S1;细胞。
(9) 100倍稀释后测菌液OD6Go，用预冷的10%甘油培养液将菌液稀释至浓度为2xl0""-3xl(^个 细BS/mL (100600约相当于2>101()个细11/1111)。
(10) 将菌液，，每管95pL。用于电转4fc^-7(TC保存。
大肠杆菌DH5a的电转化方法
(1) 5^ DNA连接产物与95pL大肠杆菌感受态细胞混匀，冰浴5-10射中。
(2) 混^tl转移至预冷的0.2cm电转化杯中(阴',照不加混合物，只加感受态细胞)，在Bio-Rad 电转化处设置2.50kv，进行电击。
(3) 从电转化杯中吸出电转化体系，并用lmL37X:预热的S0C液体培养基(20^胰蛋白胨，5g/L 酵^ih 0.5g/LNaC120mM葡萄糖，10mM氯化镁)稀释后，37°C， 150转/併中培养1小时。
(4) 菌液，涂布于含20咖ol/L MgS04 50pg/mL卡那霉素和IOO吗/mL氨节青霉素的LB固体 培养基上，37。C倒置过夜培养。
克隆子的筛选、鉴定
(1) /Aa夜培养的舰平feJ:挑取转化子，小量提M粒，用限制性内切酶MI酶切，并以 pUC185a/ H I酶切产物为对照。
(2) 以DL15000为DNA标准，在O. 8%琼脂撒 中电泳检测鉴定，钐隨同时具有pUC18载体带 和外源目的基因带的克隆子(图2)。
(3) 同时以从转化子中提取的质粒为纟鎌，用Mu转座子DNA片段的Mu转座子检测弓卿Mu-kam Pl和Mu-kara P2进行PCR (具^^"法同实施例1中皿)。电泳检测PCR产物，以DL2000为DNA标准， 以质粒pHTH2为顿照，若能扩增出700bp的特异性带，贝i脱明转化子质粒中含有AXMu转座子 DNA片段，克隆^i力(图3)。 (4)对成功克隆的转化子质^ffl行测序。 12克隆子质粒的DNA测序
将用15%甘油管保存的转化子菌液，用以Mii转座子两端的反向序列为依据设计的AM42P2作为 引ttiS行测序。^Lt海英俊公司进行DNA测序，测定转座子插入位点侧翼的核苷,列。
13.基因推断
测序结果在铜绿假单胞菌的基因组数据库(http〃www. pseudomonas.com)或GenBank (http:〃丽.ncbi. nlm. nih.印v/)的BLAST中进行序列t浏最终发5^f需基因。
序列表
<110>南开大学
<120〉铜绿假单胞菌生物W^細錢因何^Zffl
<160〉 1
〈10>1
<211〉1689
〈12>DNA
<213〉铜绿假单胞菌(ftm/cww)way am/^ ay") <400>1
atggtcacag gagccacgtc cctcagtctg gtgcgcgacg agttgttcgc caccatggaa 60 c郷ccgaac agggtcttga gcagttcatt gccgagcggc agaatggcag cctactgcag 120 cacgccgtcg aatgcctgca acagatccgc ggcaccctca acctgatcga gctggccggc 180 gccgagctgc tggcccagga agccctgcag ctggcgaccg acattcccac cggcgtcagc 240 gaggagcgcg acggccagct ggcagccctg ggcaacgccc tgtacgtgct gcgccgctac 300 ctggagaacg tcgaggccaa tcgccaggag atccccgaac tgctcttgcc ggcgatcaac 360 gaagtgcgct gtgccgcagg gcagccggcg ctgccggaaa gtttcttctt cagcgcccga 420 ctggatatcc cgcggccgcc gagcaccgcc atcgaccacc tgccttccga agccgaactg 480 ggcgaggaaa gccggcggat gcgccacatg taxxagatcg gcctgctcgg gctgatccgc 540 gaacagaacc tctatcccag cctcaagttg atgggccgcg cgctggcgcg cctcgacagc 600 ctgcacggcg gggtggcccg ttcgcggctg tgctggatcg gcgccgcggc gatcgagtcg 660 atcgtcgatg gccaactgtt gccacgcaag tcgcgtaagc aactgttctc gcgcatcgac 720 cgcgagctca agcaattgct gatcggccct gcctacgagg cgccgcgcca tctgctcaag 780 gaactgcttt acctggtggc gctgtccgat ggccagggcc cgcgttcgcg cgaggtccgc 840 gaactgcttg ggctggcgcc gctgccgttc accgaccact tgctggaaga ggaatcgcag ■ cgcttgtccg gtcccggcca gtcggtgatg cgttcgctgt ccacggcgat ccgcgaggaa 960 ctcgccgggg tcaaggacat gctcgacctg atcgagcgcg gcgtggccca gccggacagc 1020 ctgaccaacc tgcatgcgca actgggcaag aactcggccg gcaccgccct gcagacccag ggcgtcgccg attcgccgcc ggcgttgctg agcatggtcg gcaacctcga gcgcggcgag cccgggcagg aagccgatgc attcgccgtg atcg鄉鄉ccaaggccgg cctggccctg tccaatggcg acaagctcaa cctggccaac ggtctctggt tcctcggtca ggagcgcgcc atccagcagc gcatgatcga gaccgcgcag gccgacgccc tgaccagtct cgaatactat ggccagccgg acgtcctcga cctcgccagc gccgcctga
ctgagcaaga ccctcggcat ggtcggcctg 1080 ctacccaccg tggccgcctg ggctgccagc 1140 cgcctggccg atgcggtgct ctacgtggaa 1200 cgccgcatca tccggccgac tccggcggag 1260 caccagttgg ccgaggcgcg catcgtggtg 1320 gccaagcgtg cgatcaccgc gtacctggaa 1380 gtcccggcca gcctgcaggc ggtccggggt 1440 gcgctgctgg tcggcggctg cgccgactac 1500 已tgccgtcgg aacagatgct ggaaaccctc 1560 ctcgagggcg gtgccgtgct gcgtccgcag 1620 gccagcgtca aggcgctcgg actgccggtg 1680
1689
权利要求
1、一种铜绿假单胞菌鞭毛运动相关基因fimL，其核苷酸序列如序列表所示，其基因长度为1689bp，位于铜绿假单胞菌基因组169节10946-10950。
2、 权利要求l戶脱的铜绿假单胞繊秘动相錢因7 m/:的应用，用于以该基因为新舰 点设计并制紘鹏物。
全文摘要
本发明公开了铜绿假单胞菌生物被膜形成相关基因fimL。属于微生物生物技术领域。本发明与铜绿假单胞菌致病性的研究息息相关，此基因大小为1689bp，国际上对该基因的功能没有报道。实验发现该基因的缺失能够使IV型菌毛介导的蹭动能力丧失。IV型菌毛及它所介导的蹭动在铜绿假单胞菌生物被膜形成的早期起着必不可少的作用。生物被膜的形成提高了铜绿假单胞菌的耐药性，常在临床上引起顽固性、难治性感染，成为临床治疗的棘手问题。用铜绿假单胞菌生物被膜形成相关基因fimL为新药靶点研制抗菌药物，为临床治疗和耐药防治服务。
文档编号C12N15/31GK101195826SQ20071006018
公开日2008年6月11日 申请日期2007年12月26日 优先权日2007年12月26日
发明者乔明强, 单志英, 张秀明, 徐海津, 芳 白, 白艳玲 申请人:南开大学