专利名称：一种基于抗生素标记的超嗜热泉古菌表达载体及其应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种古菌表达载体及其应用，尤其涉及一种基于抗生素标记的超嗜热泉古菌表达载体及其应用，属于生物技术领域。
背景技术：
根据16S rDNA序列，生物界分为真细菌(Eubacteria)，真核生物(Eucarya)和古细菌(Archaebacteria)三个域。目前，古菌分为四个界泉古菌(Crenarchaeota)，广古菌 (Euryarchaeota),初生古菌(Korarchaeota)禾口纳米古菌(Nanoarchaeota)。泉古菌中又有一类超嗜热泉古菌，它们的最适生长温度为70-85°C，最适生长pH值为2-3。超嗜热泉古菌自身合成的蛋白酶、脂肪酶、DNA聚合酶能耐酸、耐高温，它们中的一些酶已成功的应用于工业生产。超嗜热酶在大肠杆菌中异源表达后，其酶活和性质有的发生改变，有的酶基因在大肠杆菌中不表达，或者异源表达后形成包涵体，因而为了更好的研究和利用超嗜热酶， 在古菌自身体系中表达超嗜热酶非常必要。目前存在的超嗜热泉古菌表达体系主要利用 PyrEF基因为选择标记基因，要求宿主必须为尿嘧啶为营养缺陷性菌株，另外这个体系得到的转化子假阳性较高，且相应的选择培养基价格比较昂贵。以抗生素标记作为选择基因，可以克服上述缺陷。然而，在相关的检索中，目前还未见有此类报道。
发明内容
针对现有技术，本发明的目的是提供一种基于抗生素标记的超嗜热泉古菌表达载体及其应用。本发明所述的基于抗生素标记的超嗜热泉古菌表达载体，是一种环状穿梭载体， 其特征在于其包括一个原核复制起点、一个古菌复制起点、氨苄青霉素抗性基因、多克隆位点、阿拉伯糖启动子和抗生素选择标记基因SimR ；所述载体命名为pSSR ；载体的核苷酸序列为SEQ ID NO. 4所示序列。其中上述选择标记基因SimR是一种辛伐他汀抗性基因，由Sac7d基因的启动子和hmg基因组成；其核苷酸序列为SEQ ID NO. 3所示序列。本发明所述的基于抗生素标记的超嗜热泉古菌表达载体的构建方法，步骤是1)设计合成如下引物sac7d 上游5' TAATTGAGCTCCCCTCACTATAACT 3 ‘sadd 下游5' TCTCTTGCATATTAGGTCAAGTTATCT 3 ‘hmg 上游5 ‘ CTTGACCTAATATGCAAGAGATAATTG 3 ‘hmg 下游5 ‘ TATATACCCGGGATGGTTAAGTTAATT 3 ‘2)以 Sulfolobus acidocaldarius 基因组 DNA 为模板，用 sac7d 上游和 sac7d 下游引物进行PCR扩增，得到Sac7d基因的启动子片段；3)以Sulfolobus tokodaii基因组DNA为模板，用hmg上游和hmg下游引物进行PCR扩增，得到hmg基因片段；4)利用重叠延伸PCR将sac7d基因的启动子和hmg基因融合，得到simR基因；5)用Mel和XmaI限制性内切酶双酶切simR基因和pZC载体；6)用T4DNA连接酶对酶切后的simR基因和pZC载体进行连接；7)以步骤6)的含重组载体的连接液转化大肠杆菌感受态细胞，挑取单克隆，提取质粒，获得基于抗生素标记的超嗜热泉古菌表达载体，即PSSR载体。本发明所述表达载体在超嗜热泉古菌中表达超嗜热酶的应用。其中上述超嗜热酶优选是半乳糖苷酶或DNA解旋酶。上述超嗜热泉古菌优选冰岛硫化叶菌。本发明构建了基于抗生素一辛伐他汀(simvastatin)标记的超嗜热泉古菌表达载体。辛伐他汀作为一种抗生素，其原理是作为3-羟基-3-甲基辅酶A (HMG-CoA)还原酶的竞争性抑制剂，辛伐他汀阻碍了 HMG-CoA生成甲羟戊酸，进而阻碍了细胞膜脂的合成，因此，只要在细胞内过量表达HMG-CoA还原酶就能解除辛伐他汀对细胞生长的抑制。本发明的载体以抗生素抗性为选择标记，相对于营养缺陷性标记的载体，该载体具有更广泛的宿主范围，既可以是营养缺陷性菌株，也可以是野生型菌株。实验证实本发明的载体转化冰岛硫化叶菌的效率较高，假阳性较低，可以简便、快速、高效的表达超嗜热酶。表达的超嗜热酶既可在氨基端，也可在羧基端加入组氨酸标签，大大方便了蛋白的纯化，并且经过一步镍柱亲和层析即可得到纯度较高的目的蛋白。预示本发明的表达载体在超嗜热酶的表达方面有很大的应用前景与经济价值。
图1为pSSR载体图谱。图2为转化了 pSSR-lacS载体的冰岛硫化叶菌X_gal显色结果。图3为在冰岛硫化叶菌中表达的HerA蛋白SDS-PAGE结果，其中M是蛋白marker， 1是菌体破壁后的全蛋白，2是经镍柱亲和层析后的蛋白。
具体实施例方式实施例1、辛伐他汀抗性基因simR的获得1)获得sac7d启动子DNA片段设计引物sac7d上游和Sac7d下游，引物Sac7d上游中加入了 ^icI酶切位点，引物sac7d上游和sac7d下游的序列如下sac7d 上游5' TAATTGAGCTCCCCTCACTATAACT 3 ‘sac7d 下游5' TCTCTTGCATATTAGGTCAAGTTATCT 3 ‘以 Sulfolobus acidocaldarius 基因组 DNA (GenBank :CP000077)为模板，用引物 sac7d上游和sac7d下游PCR扩增sac7d启动子DNA片段。PCR 反应体系10XPCRbuffer 5yL，上游、下游引物(ΙΟμΜ)各 lyL，模板 lyL， dNTPs (各 2. 5mM) 4 μ L，pfu 酶(2. 5U/ μ L) 1 μ L,最后补水至 50 μ L。反应条件94°C热变性5min ；94°C变性45s，55°C退火45s，72°C延伸lmin，共30个循环；72°C延伸IOmin。
PCR产物在0. 5 X TBE配制的琼脂糖凝胶中电泳，DNA回收试剂盒(omega公司)回收目的片段，方法参考其说明书，回收产物_20°C保存备用。得到纯的sac7d启动子DNA片段，其DNA序列是如SEQ ID NO. 1所示序列。幻获得hmg基因片段设计引物hmg上游和hmg下游，引物hmg下游中加入了 XmaI酶切位点，引物hmg 上游和hmg下游的序列如下hmg 上游5' CTTGACCTAATATGCAAGAGATAATTG 3 ‘hmg 下游5' TATATACCCGGGATGGTTAAGTTAATT 3 ‘以 Sulfolobus tokodaii 基因组 DNA(GenBank :BA000023)为模板，用引物 hmg 上游和hmg下游PCR扩增hmg基因片段。PCR反应体系10 XPCR buffer 5 μ L，上游、下游引物(10 μ Μ)各 1 μ L，模板 1 μ L， dNTPs (各 2. 5mM) 4 μ L，pfu 酶(2. 5U/ μ L) 1 μ L,最后补水至 50 μ L。反应条件94°C热变性5min ；94°C变性45s，56°C退火45s，72°C延伸aiiin，共30个循环；72°C延伸IOmin。PCR产物在0. 5 X TBE配制的琼脂糖凝胶中电泳，DNA回收试剂盒(omega公司)回收目的片段，方法参考其说明书，回收产物_20°C保存备用。得到纯的hmg基因片段，其DNA序列是如SEQ ID N0. 2所示序列。3)辛伐他汀抗性基因SimR的获得以得到的Sac7d启动子DNA片段和hmg基因片段为模板进行重叠延伸PCR反应， 反应分为两步。第一步，不加引物的预延伸。反应体系10XPCR buffer 5 μ L，sac7d启动子DNA片段2 μ L，hmg基因片段 0. 5 μ L，dNTPs (各 2. 5mM) 4 μ L，pfu 酶(2. 5U/ μ L) 1 μ L,最后补水至 50 μ L。反应条件94°C热变性5min ；94°C变性45sJ4°C退火45s，72°C延伸3min，共5个循环；72°C延伸IOmin。第二步，预延伸完成后，加入引物进行PCR扩增。反应体系在第一步的反应体系中加入sac7d上游引物(10 μ M) 1 μ L，hmg下游引物(10μΜ)1μ 。反应条件94°C热变性5min ；94°C变性45s，56°C退火45s，72°C延伸:3min，共20个循环；72°C延伸IOmin。PCR产物在0. 5 X TBE配制的琼脂糖凝胶中电泳，DNA回收试剂盒(omega公司)回收目的片段，方法参考其说明书，回收产物_20°C保存备用。得到纯的SimR基因片段，其DNA序列如SEQ ID N0. 3所示序列。实施例2、基于抗生素标记的超嗜热泉古菌表达载体(pSSR)载体的构建用Mel和XmaI限制性内切酶双酶切simR基因的PCR产物和pZC载体(Peng et al.，2009，Mol Microbiol, 74 :928-929)。双酶切体系如下10 X buffer4 5 μ L, BSA 0. 5 μ L, simR 基因片段或 pZC 载体 20 μ L, SacI (20U, NEB 公司)1 μ L，XmaI (10U，NEB公司)lyL，补充水至50 μ L，37°C酶切过夜。
酶切产物在0. 5 X TBE配制的琼脂糖凝胶中电泳，DNA回收试剂盒(omega公司)回收目的片段。回收产物_20°C保存备用。酶切后的PCR产物和pZC载体进行连接反应，反应体系如下IOXligation buffer 1 μ L，T4DNA 连接酶(NEB 公司)1 μ L，酶切后的 PCR 产物 3 μ L，酶切后的pZC载体2 μ L，补充水至10 μ L，16°C反应2小时。连接液转化大肠杆菌DH5 α (invitrogen公司)，转化步骤如下100 μ L感受态细胞中加入10 μ L连接液，混勻，冰浴30分钟。42°C水浴热激90 秒，冰上放置3分钟，加入LB培养基500yL，置于37°C下，150rpm震荡培养1小时。收集菌体，用200 μ L LB培养基重悬，涂布在LB平板上(含有氨苄青霉素)，37°C培养14小时。 挑取平板上的单克隆提取质粒(omega公司试剂盒)，经测序验证其序列正确，该载体命名为 pSSR0pSSR载体序列如SEQ ID NO. 4所示序列，pSSR载体图谱如图1所示。pSSR载体是一个大肠杆菌一冰岛硫化叶菌的穿梭载体，序列的第3-51位为古菌中的阿拉伯糖核心启动子，第77-247位为多克隆位点，第M7-1803位为冰岛硫化叶菌选择标记基因simR序列，第20654925位为大肠杆菌选择标记基因ampR序列，第3200-8100位为来源于冰岛硫化叶菌的质粒PRN2部分序列。实施例3、利用pSSR载体表达β -半乳糖苷酶1) pSSR-lacS 载体的构建设计引物IacS上游和IacS下游，引物IacS上游中加入了 SphI酶切位点，引物 IacS下游中加入了 Mil酶切位点，引物IacS上游和IacS下游的序列如下IacS 上游5' CGTGCTGCATGCCTCCTCTTATTATTAG 3‘IacS 下游5' TATATAGTCGACCTAGTGTTGCAAGGCAG 3‘以 Sulfolobus solfataricus 基因组 DNA(GenBank :AE006641)为模板，用引物 IacS上游和IacS下游PCR扩增IacS基因片段。PCR反应体系10 XPCR buffer 5 μ L，上游、下游引物(10 μ Μ)各 1 μ L，模板 1 μ L， dNTPs (各 2. 5mM) 4 μ L，pfu 酶(2. 5U/ μ L) 1 μ L,最后补水至 50 μ L。反应条件94°C热变性5min ；94°C变性45s，退火45s，72°C延伸aiiin，共30个循环；72°C延伸IOmin。PCR产物在0. 5 X TBE配制的琼脂糖凝胶中电泳，DNA回收试剂盒(omega公司)回收目的片段，方法参考其说明书，回收产物_20°C保存备用。用SphI和Mil限制性内切酶双酶切IacS基因的PCR产物和pSSR载体。双酶切体系如下10XH buffer 5 μ L, IacS 基因片段或 pSSR载体 20 μ L，SphI (Takara 公司)2 μ L， Sail (Takara公司)2 μ L，补充水至50 μ L，37°C酶切过夜。酶切产物在0. 5 X TBE配制的琼脂糖凝胶中电泳，DNA回收试剂盒(omega公司)回收目的片段。回收产物_20°C保存备用。酶切后的PCR产物和pSSR载体进行连接反应，反应体系如下IOXligation buffer 1 μ L，T4DNA 连接酶(NEB 公司)1 μ L，酶切后的 PCR 产物 3 μ L，酶切后的载体2 μ L，补充水至10 μ L，16°C反应2小时。
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连接液转化大肠杆菌DH5 α (invitrogen公司)，转化步骤如下100 μ L感受态细胞中加入10 μ L连接液，混勻，冰浴30分钟。42°C水浴热激90 秒，冰上放置3分钟，加入LB培养基500yL，置于37°C下，150rpm震荡培养1小时。收集菌体，用200 μ L LB培养基重悬，涂布在LB平板上(含有氨苄青霉素)，37°C培养14小时。 挑取平板上的单克隆提取质粒(omega公司试剂盒)，经测序验证其序列正确，该载体被命名为 pSSR-lacS。2) pSSR-lacS载体转化冰岛硫化叶菌冰岛硫化叶菌感受态细胞制备所用菌株为 S. islandicus E233S(Deng et al.,2009, Extremophiles,13 735-746)，该菌株为尿嘧啶和乳糖营养缺陷性菌株。硫化叶菌培养基成分为Brock培养基(Brocket al.，1972,Arch Mikrobiol,84 54-68)，蛋白胨(3g/L)，蔗糖(2g/L)，尿嘧唆(2g/L)。从_80°C取出E233S菌种，常规方法接种到30ml液体培养基中活化，75°C高温摇床培养，当菌液的0D600在0. 8左右时，按体积比5%的接种量转接到新鲜培养基中培养。重复转接4次后，转接到IOOml培养基中培养，当0D600在0. 2左右时停止培养，将培养物转移到2个IOOml的离心管中，6000rpm离心IOmin收集细胞，弃上清。每管加入30ml20mM蔗糖溶液，轻柔地吸吹，重悬细胞，重复2次。用500 μ L蔗糖溶液重悬细胞，将感受态细胞在室温放置。用电转的方法将pSSR-lacS载体转化到冰岛硫化叶菌中，转化步骤如下将要电转的质粒(500ng)分到EP管中，加入50ul感受态细胞，混勻。将感受态细胞-DNA悬浮液转入电转杯(Bio-Rad公司)中。电击，电压1200伏，电阻600欧，电容25 微法；电击后，立即用SOOul提前在75度预热的培养基重悬到EP管中。电击后细胞75°C 孵育lh。孵育结束后，将细胞倒在固体平板(含有20 μ M的辛伐他汀，杭州德立公司)上于 75°C培养。3)转化子中β -半乳糖苷酶表达情况检测将25mg 5_溴_4_氯_3_吲哚-β -D-吡喃半乳糖苷(X-gal)溶解在Iml 二甲基甲酰胺(Dimethylformamide)中，配成Χ-gal母液。将X-gal母液加水稀释至5mg/ml，然后喷洒在含有转化子的平板上，平板放置75°C中，继续培养30分钟。经过X-gal显色的转化子颜色由白色变成蓝色，如图2所示，说明pSSR-lacS载体已成功转入冰岛硫化叶菌细胞中，且β —半乳糖苷酶得到了成功的表达。 实施例4、pSSR载体表达DNA解旋酶1) pSSR-herA 载体的构建设计引物herA上游和herA下游，引物herA上游中加入了 NdeI酶切位点，引物 herA下游中加入了 Mil酶切位点，引物herA上游和herA下游的序列如下herA 上游5' CGCCGCATATGATAATTGGTTATGTAATTGGTC3 ‘herA 下游5' CTAGTCGACATCACCAATTTCCGTTCCAAAG 3 ‘以Sulfolobus islandicus基因组DNA为模板，用引物herA上游和herA下游PCR 扩增herA基因片段。PCR反应体系10 XPCR buffer 5 μ L，上游、下游引物(10 μ Μ)各 1 μ L，模板 1 μ L，dNTPs (各 2. 5mM) 4 μ L，pfu 酶(2. 5U/ μ L) 1 μ L,最后补水至 50 μ L。反应条件94°C热变性5min ；94°C变性45s，55°C退火45s，72°C延伸aiiin，共30个循环；72°C延伸IOmin。PCR产物在0. 5 X TBE配制的琼脂糖凝胶中电泳，DNA回收试剂盒(omega公司)回收目的片段，方法参考其说明书，回收产物_20°C保存备用。用NdeI和Mil限制性内切酶双酶切herA基因的PCR产物和pSSR载体。双酶切体系如下IOXH buffer 5 μ L，herA 基因片段或 pSSR 载体 20 μ L，NdeI (Takara 公司)2 μ L， Sail (Takara公司)2 μ L，补充水至50 μ L，37°C酶切过夜。酶切产物在0. 5 X TBE配制的琼脂糖凝胶中电泳，DNA回收试剂盒(omega公司)回收目的片段。回收产物_20°C保存备用。酶切后的PCR产物和pSSR载体进行连接反应，反应体系如下IOXligation buffer 1 μ L，T4DNA 连接酶(NEB 公司)1 μ L，酶切后的 PCR 产物 3 μ L，酶切后的载体2 μ L，补充水至10 μ L，16°C反应2小时。连接液转化大肠杆菌DH5 α (invitrogen公司)，转化步骤如下100 μ L感受态细胞中加入10 μ L连接液，混勻，冰浴30分钟。42°C水浴热激90 秒，冰上放置3分钟，加入LB培养基500yL，置于37°C下，150rpm震荡培养1小时。收集菌体，用200 μ L LB培养基重悬，涂布在LB平板上(含有氨苄青霉素)，37°C培养14小时。 挑取平板上的单克隆提取质粒(omega公司试剂盒)，经测序验证其序列正确，该载体被命名为 pSSR-herA。2) pSSR-herA载体转化冰岛硫化叶菌冰岛硫化叶菌感受态细胞制备所用菌株为 S. islandicus Rey15A(Deng et al. ，2009， Extremophiles,13 735-746)。硫化叶菌培养基成分为=Brock培养基，蛋白胨(3g/L)，蔗糖Qg/L)。从-80°C取出Rey 15A菌种，常规方法接种到30ml液体培养基中活化，75°C高温摇床培养，当菌液的0D600在0. 8左右时，按体积比5%的接种量转接到新鲜培养基中培养。 重复转接4次后，转接到IOOml培养基中培养，当0D600在0. 2左右时停止培养，将培养物转移到2个IOOml的离心管中，6000rpm离心IOmin收集细胞，弃上清。每管加入30ml20mM 蔗糖溶液，轻柔地吸吹，重悬细胞，重复2次。用500 μ L蔗糖溶液重悬细胞，将感受态细胞在室温放置。用电转的方法将PSSR-herA载体转化到冰岛硫化叶菌中，转化步骤如下将要电转的质粒(500ng)分到EP管中，加入50ul感受态细胞，混勻。将感受态细胞-DNA悬浮液转入电转杯(Bio-Rad公司)中。电击，电压1200伏，电阻600欧，电容25 微法；电击后，立即用SOOul提前在75度预热的培养基重悬到EP管中。电击后细胞75°C 孵育lh。孵育结束后，将细胞倒在固体平板(含有20 μ M的辛伐他汀)上于75°C培养。3) HerA DNA解旋酶在冰岛硫化叶菌中表达挑取平板上的单克隆到30ml液体培养基(含有20μΜ的辛伐他汀)中培养，当 0D600在0. 8时，1 %接种量转接到250ml培养基(不含蔗糖，含有20 μ M的辛伐他汀)中培养，当0D600在0. 2时，加入阿拉伯糖(终浓度0. 2mg/ml)诱导蛋白表达，当0D600在0. 5 时，6000rpm，IOmin收集菌体。收集的菌体经超声波破壁，IOOOOrpm离心，取上清，进行镍柱亲和层析(Novagen公司)，得到纯度较高的HerA解旋酶蛋白。将得到的蛋白样品进行十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶(SDS-PAGE)电泳，结果如图3所示，M是蛋白marker，1是菌体破壁后的全蛋白，2是经镍柱亲和层析后的蛋白。
权利要求
1.一种基于抗生素标记的超嗜热泉古菌表达载体，其特征在于所述表达载体包括一个原核复制起点、一个古菌复制起点、氨苄青霉素抗性基因、多克隆位点、阿拉伯糖启动子和抗生素选择标记基因SimR ；所述载体命名为PSSR ；载体的核苷酸序列为SEQ ID NO. 4所示序列。
2.根据权利要求1所述的载体，其特征在于所述选择标记基因SimR是一种辛伐他汀抗性基因，由sac7d基因的启动子和hmg基因组成；其核苷酸序列为SEQ ID NO. 3所示序列。
3.根据权利要求1所述载体的构建方法，步骤是1)设计合成如下引物sac7d 上游5' TAATTGAGCTCCCCTCACTATAACT 3' sac7d 下游5' TCTCTTGCATATTAGGTCAAGTTATCT 3' hmg 上游5' CTTGACCTAATATGCAAGAGATAATTG 3' hmg 下游5' TATATACCCGGGATGGTTAAGTTAATT 3'2)以Sulfolobusacidocaldarius基因组DNA为模板，用sac7d上游和sac7d下游引物进行PCR扩增，得到Sac7d基因的启动子片段；3)以Sulfolobustokodaii基因组DNA为模板，用hmg上游和hmg下游引物进行PCR 扩增，得到hmg基因片段；4)利用重叠延伸PCR将sac7d基因的启动子和hmg基因融合，得到simR基因；5)用Mel和XmaI限制性内切酶双酶切simR基因和pZC载体；6)用T4DNA连接酶对酶切后的simR基因和pZC载体进行连接；7)以步骤6)的含重组载体的连接液转化大肠杆菌感受态细胞，挑取单克隆，提取质粒，获得基于抗生素标记的超嗜热泉古菌表达载体，即PSSR载体。
4.权利要求1所述的表达载体在超嗜热泉古菌中表达超嗜热酶的应用。
5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于所述超嗜热酶是半乳糖苷酶或DNA解旋酶。
6.根据权利要求4所述的应用，其特征在于所述超嗜热泉古菌选择冰岛硫化叶菌。
全文摘要
本发明公开了一种基于抗生素标记的超嗜热泉古菌表达载体，包含一个原核复制起点、一个古菌复制起点、氨苄青霉素抗性基因、多克隆位点、阿拉伯糖启动子和抗生素选择标记基因simR；所述载体的核苷酸序列为SEQ ID NO.4所示序列。其中simR基因是一种辛伐他汀抗性基因，由sac7d基因的启动子和hmg基因组成。本发明还公开了所述表达载体在超嗜热泉古菌中表达超嗜热酶的应用。本发明的载体具有广泛的宿主范围，转化效率高，假阳性低，可以简便、快速、高效的表达带有组氨酸标签的超嗜热酶，预示本发明的载体具有很好的应用前景。
文档编号C12N9/40GK102174552SQ20111002092
公开日2011年9月7日 申请日期2011年1月19日 优先权日2011年1月19日
发明者佘群新, 倪金凤, 申玉龙, 郑涛 申请人:山东大学