专利名称：一种酵母工程菌发酵方法和应用的制作方法
技术领域：
本发明属于生物工程技术领域，尤其涉及一种酵母工程菌发酵方法和应用。
背景技术：
近年来，抗生素滥用各种弊端逐渐显现，抗菌肽(特别是美洲商陆抗菌肽)和抗生素具有相似的功用，其杀菌机理独特，抗菌谱范围广泛，对抗生素耐药菌、肿瘤细胞及病毒等均有良好的杀伤作用，且其本身毒副作用极低。但是，目前以发酵方法生产抗菌肽的产量不高，如《Novel Expression Vector for Secretion of Cecropin AD in Bacillus subtilis with Enhanced Antimicrobial Activity》一文中获得的抗菌肽含量为 30. 6mg/ L，《复合抗菌肽PL在毕赤酵母中的分泌表达及其活性研究》一文中两种抗菌肽的含量分别为95. 04mg/L和91mg/L，造成发酵生产抗菌肽成本相对较高，因此目前国内外开发的发酵法生产抗菌肽的工艺多停留在实验室阶段，无法进行工业化生产，本发明正是针对这一问题，以美洲商陆酵母工程菌为生产菌株，通过对发酵培养基优化，对接种量、通气量、PH以及发酵过程其它参数进行修正改进，使得抗菌肽产量大幅度提升，为实现抗菌肽的大规模生产开辟可行的路径。
发明内容
有鉴于此，本发明实施例的目的在于提供一种产量高的酵母工程菌发酵方法。本发明是这样实现的，一种酵母工程菌发酵方法，包括如下步骤配制包括如下组分的液体培养基；将菌种种龄为2. 5-3. 5亿个/mL的美洲商陆酵母工程菌按接种量为2. 5-7.0% (ν/ν)接种于该液体培养基，在ρΗ为3. 5-4. 5、通气量为0. 4-1. Ovvm、温度为条件下，发酵培养22-26小时，该培养基组分如下葡萄糖40_60g/L黄豆粉10-16. 8g/L玉米浆6-10g/L硫酸铵9_15g/L棉籽粉4_7.2g/L无水碳酸钙0.1-0. 3g/L磷酸二氢钾0.5_0.94g/L硫酸锌0.08-0.2g/L无水硫酸镁 0. 5-lg/L。本发明实施例进一步提供上述酵母工程菌发酵方法所制备的抗菌肽在药品、消毒产品中的应用。
3
本发明实施例酵母工程菌发酵方法，通过采用上述发酵培养基成分及含量、发酵 PH值、通气量等参数，实现了发酵产物(美洲商陆抗菌肽Ι^-ΑΜΡ05)发酵产量显著提升。
图1是本发明实施例发酵方法发酵过程中抗菌肽浓度、葡萄糖浓度及酵母工程菌数量变化图。
具体实施例方式为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合附图及实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。本发明实施例提供一种酵母工程菌发酵方法，包括如下步骤SOl，配制包括如下组分的液体培养基；S02,将菌种种龄为2. 5-3. 5亿个/mL的美洲商陆酵母工程菌按接种量为 2. 5-7.0% (ν/ν)接种于该液体培养基，在ρΗ为3. 5-4. 5、通气量为0.4-1. Ovvm、温度为
条件下，发酵培养22-26小时，该培养基组分如下
葡萄糖40-60g/L
黄豆粉10-16. 8g/L
玉米浆6-10g/L
硫酸铵9-15g/L
棉籽粉4-7. 2g/L
无水碳5睃钙0. l-o. 3g/L
磷酸二氢钾0. 5-0. 94g/L
硫酸锌0. 08-0. 2g/L
无水硫5睃镁0. 5-lg/Lo
具体地，该美洲商陆酵母工程菌是指包含有美洲商陆抗菌肽基因序列Ι^-ΑΜΡ05
的酵母工程菌，具体是指申请号201010278464. O的专利中的酵母工程菌。该专利文件中， 关于酵母工程菌的表述为一种酵母工程菌，该酵母工程菌包含由酵母穿梭质粒和美洲商陆抗菌肽I^-AMP05 基因重组构成的重组质粒，美洲商陆抗菌肽 ^_ΑΜΡ05基因序列如SEQ ID NO=I所示。本发明实施例的酵母工程菌中，重组质粒由酵母穿梭质粒和美洲商陆抗菌肽 Pa-AMP05基因重组而成，该重组质粒在酵母细胞基因组之外，游离于酵母细胞质之中。酵母穿梭质粒是美洲商陆抗菌肽 ^_ΑΜΡ05基因的表达载体。将酵母工程菌扩大培养，其基因组得到表达，同时本发明实施例的酵母工程菌中的重组质粒也得到表达。本发明实施例中的酵母，包括各种酵母，例如毕赤酵母、酿酒酵母，优选的为酿酒酵母，其中酿酒酵母，包括但不限于酒精酵母、汉逊酵母、假丝酵母等，优选的为酿酒酵母 S78。酿酒酵母含有符合机体需求的优质蛋白、膳食纤维、复合维生素B和有机铬、锌、硒、 铁、钙等元素，其本身即是一种纯天然、无污染、生物态的健康营养源。酿酒酵母是食品级的表达系统，其表达产物安全无毒，使得本发明实施例的酵母工程菌的表达产物中不会掺杂有害物质。同时酵母遗传背景清楚，适用于工业化生产。本发明实施例对酵母穿梭质粒没有具体的限制，可以为各种酵母穿梭质粒，只要能够在酵母细胞中作为表达载体即可，包括含有诱导型启动子的酵母穿梭质粒，还包括含有非诱导型启动子的酵母穿梭质粒，这些酵母穿梭质粒都能够作为美洲商陆抗菌肽 Pa-AMP05基因的表达载体，使得美洲商陆抗菌肽Ι^-ΑΜΡ05基因在酿酒酵母中能够得到表达。诱导型启动子，在基因表达中，需要加入诱导剂才能启动基因的表达，非诱导型的启动子即在基因表达中不需要加入诱导剂，基因也能够得到表达。例如酵母穿梭质粒PYES2，以半乳糖为诱导剂；酵母穿梭质粒PYES6/CT，也以半乳糖为诱导剂以及酵母穿梭质粒ρ (212 等。非诱导型启动子优选的为酵母穿梭质粒pVT102U/ci。酵母穿梭质粒pVT102U/a含有非诱导型启动子，使得上述重组质粒在表达过程中，不需要加入任何的诱导剂，避免了表达产物中混入诱导剂杂质，例如甲醇，保证了表达产物的安全。本酵母穿梭质粒pVT102U/a 是分泌型表达载体，通过α因子的信号肽的作用，能够将表达产物分泌到酵母细胞外，也简化了表达产物分离提纯的过程，节约成本。另外，请参见图2，图2显示以酵母穿梭质粒pVT102U/ci作为美洲商陆抗菌肽 Pa-AMP05基因的表达载体时，重组质粒所具有的表达框 ADHl-α -MFL-抗菌肽 Pa-AMP05_TT其中ADHl为启动子，α -MFL为α因子信号肽的碱基序列，TT是终止子，抗菌肽 Ι^-ΑΜΡ05是指美洲商陆抗菌肽Ι^-ΑΜΡ05的碱基序列，具体见于SEQ ID Ν0:1。美洲商陆抗菌肽Ι^-ΑΜΡ05基因表达的抗菌肽蛋白Ι^-ΑΜΡ05的N端区域与α因子的信号肽融合，信号肽引导着整个融合蛋白分泌到酵母细胞外的培养基中；α因子的信号肽带有前体加工酶 Kex2的酶切位点，融合蛋白在酵母本身分泌的Kex2的作用下切掉信号肽而直接得到具有天然构象和生物活性的目标抗菌肽Ι^-ΑΜΡ05蛋白。SEQ ID NO 1gctggttgtattaaaaatggtggtagatgtgttgcttctggtggtccaccatattgttgttctaattat
tgttBtBgBCBBgttggttgggCtCBtBgBtattgtBBBBBtBgBtBB。具体地，步骤SOl中，该液体培养基的组分如下葡萄糖40_60g/L，黄豆饼粉 10-16. 8g/L，玉米浆6-10g/L，硫酸铵9_15g/L，棉籽饼粉4-7. 2g/L，无水碳酸钙0. 1-0. 3g/ L,磷酸二氢钾0. 5-0. 94g/L，硫酸锌0. 08-0. 2g/L，无水硫酸镁0. 5-lg/L ；该液体培养基的溶剂为纯净水。该液体培养基通过选择上述组分和含量，满足了菌体生长的需要，使得在发酵结束时酿酒酵母工程菌菌数达到较高的水平，实现了发酵产物浓度显著提高。配制该液体培养基的方法没有限制，得到液体培养基后，进行121°C灭菌30min再冷却至即可以使用。配制液体培养基的器具没有限制。具体地，步骤S02中，酵母工程菌的菌种种龄为2. 5-3. 5亿个/mL，其培养过程为从YPD斜面上挑取一环酵母工程菌，接入60mL的YPD液体培养基，在温度为32°C， 转速为200rpm条件下摇床培养16_18h ；再于25L培养器中置入14-16L YPD液体培养基， 121°C灭菌30min冷却至32°C后，接入前述培养好的酵母工程菌，培养16_1他，即可得到菌种种龄为2. 5-3. 5亿个/mL的酵母工程菌，培养过程中不控pH，通气量为0. 6vvm(每分钟内，通入气体的体积和发酵罐中发酵液体积比)，搅拌转速为150rpm，罐压0. 05Mpa，温度为32 °C。具体地，步骤S02为按接种量为2. 5-7. 0% (v/v)(种子液体积和发酵罐中液体培养基体积比)将上述菌种种龄的酵母工程菌接种于上述液体培养基，进行发酵2216小时， 具体发酵的参数为ρΗ为3. 5-4. 5、通气量为0. 4-1. Ovvm、温度为^_34°C。本步骤中，使用碱性剂调节发酵过程中的PH值，该碱性剂没有限制，例如，氢氧化钠、氨水等。具体地，步骤S02中，使用的发酵设备没有限制，优选为500L以上的发酵罐，该发酵罐的装料系数为0. 5-0. 75，可以将步骤SOl中配制的液体培养基加入至该发酵罐中，再接种上述菌种种龄的酵母工程菌进行发酵，也可以在步骤SOl中直接使用该发酵罐，再接种上述菌种种龄的酵母工程菌进行发酵。本发明实施例发酵方法，通过选择上述菌种种龄和接种量，使得酵母工程菌生长和发酵产物生成速率显著提高，延迟期缩短，在发酵得到美洲商陆抗菌肽 ^_ΑΜΡ05的前提下，有效缩短了发酵周期；通过对发酵培养基的优化和发酵过程中PH值控制为3. 5-4. 5，使得发酵产物(美洲商陆抗菌肽 ^-ΑΜΡΟΟ的浓度显著增加，大大提升了发酵产物的产量；酵母工程菌发酵过程中，通气量控制在0. 4-1. Ovvm,进一步，酵母工程菌发酵过程中，搅拌转速为100-250rpm，罐压0. 03-0. OSMpa,通过控制上述发酵参数，使得发酵过程中液体培养基内的溶氧量既能够满足酵母工程菌生长需要，又有利于发酵产物产量的显著提升，大大降低了能耗。通过上述改进，本发明实施例酵母工程菌发酵方法发酵生产抗菌肽的效率大大提高，发酵后混合液中抗菌肽的浓度达到42;3mg/L，而普通的发酵方法所得到的浓度大概为41mg/L ；葡萄糖利用率显著提升，发酵结束时发酵液中残余葡萄糖为1. 5 2. 5g/L，衡算葡萄糖利用率达到95%以上。请参阅图1，图1是本发明实施例发酵方法发酵过程中抗菌肽浓度、葡萄糖浓度及酵母工程菌数量(连续10批平均值)变化图。根据图1可知，发酵结束后，菌体浓度较高， 抗菌肽浓度在410mg/L以上，发酵产量比普通的发酵方法大大提高，葡萄糖利用率显著提升。本发明实施例进一步提供上述酵母工程菌发酵方法所制备的抗菌肽在药品、消毒产品中的应用。以下结合具体实施例对上述发酵方法进行详细阐述。实施例一本发明实施例酵母工程菌发酵方法，包括如下步骤1、从YPD斜面上挑取一环酵母工程菌，接入60mL的YPD液体培养基，于温度为 32°C，转速为200rpm条件下，摇床培养16h ；2、于25L发酵罐中置入14L YPD液体培养基，121°C灭菌30min冷却至后，接入步骤1中培养好的酵母菌培养16h，培养过程中，通气量为0. 6vvm，搅拌转速为150rpm，罐压0. 05Mpa,培养过程温度为32°C ；3、于500L发酵罐中配制360L成分如下的发酵培养基葡萄糖40g/L，黄豆饼粉 10g/L,玉米浆6g/L，硫酸铵9g/L，棉籽饼粉4g/L，无水碳酸钙0. lg/L，磷酸二氢钾0. 5g/ L，硫酸锌0. 08g/L，无水硫酸镁0. 5g/L，经过121°C灭菌30min冷却至32°C后，按接种量为 2.5% (ν/ν)接入步骤2中培养好的酵母菌，发酵22h。发酵过程中通气量为0.4vvm，搅拌转速为lOOrpm，罐压0. 03Mpa，温度为^°C，以4mol/L的NaOH溶液和50%的磷酸溶液调节本步骤发酵过程中发酵液的PH为3. 5。发酵结束时，发酵液中美洲商陆抗菌肽浓度达到 320mg/L。实施例二1、从YPD斜面上挑取一环酵母菌，接入60mL的YPD液体培养基，于温度为32°C，转速为200rpm条件下，摇床培养17h ；2、于25L发酵罐中置入15L YPD液体培养基，121°C灭菌30min冷却至32°C后，接入步骤1中培养好的酵母菌，培养17h，此过程中通气量为0. 6vvm,搅拌转速为150rpm，罐压 0. 05Mpa，温度为 320C ；3、于500L发酵罐中配制360L成分如下的发酵培养基葡萄糖60g/L，黄豆饼粉12. 8g/L，玉米浆8g/L，硫酸铵12g/L，棉籽饼粉6g/L，无水碳酸钙0. 2g/L，磷酸二氢钾 0. 75g/L，硫酸锌0. 15g/L，无水硫酸镁0. 7g/L，经过121°C灭菌30min冷却至32°C后，接入步骤2中培养好的酵母菌，发酵Mh。发酵过程中通气量为0. 6vvm，搅拌转速为150rpm，罐压0. 05Mpa温度为32°C，以4mol/L的NaOH和50%的磷酸溶液控制发酵液的pH为4. 0。发酵结束时，发酵液中美洲商陆抗菌肽浓度达到42;3mg/L。实施例三1、从YPD斜面上挑取一环酵母菌，接入60mL的YPD液体培养基，在温度为32°C，转速为200rpm，摇床培养18h。2、于25L发酵罐中置入16L YPD液体培养基，121°C灭菌30min冷却至32°C后，接入步骤1中培养好的酵母菌，培养18h，培养过程中，通气量为0. 6vvm，搅拌转速为150rpm， 罐压0. 05Mpa，温度为320C ο3、于500L发酵罐中配制360L成分如下的发酵培养基葡萄糖50g/L，黄豆饼粉 16. 8g/L，玉米浆10g/L，硫酸铵15g/L，棉籽饼粉7. 2g/L，无水碳酸钙0. 3g/L，磷酸二氢钾 0. 94g/L，硫酸锌0. 2g/L，无水硫酸镁lg/L，经过121°C灭菌30min冷却至32°C后，接入步骤2中培养好的酵母菌，发酵^h，发酵过程中通气量为1. Ovvm,搅拌转速为250rpm，罐压 0. 08Mpa，温度为34°C，以4mol/L的NaOH和50%的磷酸溶液控制发酵液的pH为4. 5。发酵结束时，发酵液中美洲商陆抗菌肽浓度达到360mg/L。以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
权利要求
1.一种酵母工程菌发酵方法，包括如下步骤 配制包括如下组分的液体培养基；将菌种种龄为2. 5-3. 5亿个/mL的美洲商陆酵母工程菌按接种量为2. 5-7. 0% (ν/ν) 接种于所述液体培养基，在PH为3. 5-4. 5、通气量为0. 4-1. Ovvm、温度为条件下，发酵培养22-26小时，所述培养基组分如下 葡萄糖40-60g/L黄豆粉10-16.8g/L玉米浆6-10g/L硫酸铵9-15g/L棉籽粉4-7. 2g/L无水碳酸钙 0. 1-0. 3g/L 磷酸二氢钾 0. 5-0. 94g/L 硫酸锌0. 08-0. 2g/L无水硫酸镁 0. 5-lg/L。
2.如权利要求1所述的酵母工程菌发酵方法，其特征在于，所述液体培养基的组分如下葡萄糖60g/L黄豆饼粉 12. 8g/L 玉米浆8g/L硫酸铵12g/L棉籽饼粉 6g/L 无水碳酸钙 0. 2g/L 磷酸二氢钾 0. 75g/L 硫酸锌0. 15g/L无水硫酸镁 0. 7g/0
3.如权利要求1所述的酵母工程菌发酵方法，其特征在于，所述发酵培养步骤中使用发酵罐作为容器，所述发酵罐的装料系数为0. 5-0. 75。
4.如权利要求1所述的酵母工程菌发酵方法，其特征在于，所述发酵培养在搅拌转速为100-250rpm条件下进行。
5.如权利要求1所述的酵母工程菌发酵方法，其特征在于，所述发酵培养在压强为 0. 03-0. 08Mpa条件下进行。
6.如权利要求1-5任一项所述发酵方法所制备的抗菌肽在药品、消毒产品中的应用。
全文摘要
本发明适用于生物工程技术领域，提供了一种酵母工程菌发酵方法，包括如下步骤配制液体培养基；将菌种种龄为2.5-3.5亿个/mL的美洲商陆酵母工程菌按接种量为2.5-7.0％(v/v)接种于所述液体培养基，在pH为3.5-4.5、通气量为0.4-1.0vvm、温度为28-34℃条件下，发酵培养22-26小时。本发明酵母工程菌发酵方法，通过对发酵培养基优化，对接种量、通气量、pH以及发酵过程其它参数进行修正改进，实现了发酵产物(美洲商陆抗菌肽Pa-AMP05)发酵产量显著提升。
文档编号C12R1/865GK102174623SQ20111002063
公开日2011年9月7日 申请日期2011年1月18日 优先权日2011年1月18日
发明者张捷, 彭永鹤, 董清风, 郑文官 申请人:深圳市圣西马生物技术有限公司