专利名称：一种水中沙门氏菌活体的定量检测方法
技术领域：
本发明涉及地表水体、污水的检测方法，具体涉及一种水中沙门氏菌活体的定量检测方法，该方法将多管发酵技术、PCR技术和最大可能数(MPN)计数方法相结合，能够准确的定量检测水中沙门氏菌活体的含量。适合于地表水体、污水等多种水样中沙门氏菌活体的定量检测。
背景技术：
前对于沙门氏菌的检测，可以分为培养法、免疫学检测法和核酸检测法三类。培养法和免疫学检测法通常是根据沙门氏菌的生长特性，采用选择性的培养基使沙门氏菌成为优势菌群，然后基于沙门氏菌的生化特性和菌体表面抗原特性，利用生化反应和抗原-抗体反应的特异性进行沙门氏菌的检测。这些方法大都存在操作复杂、易受干扰、难以定量检测的问题。沙门氏菌属种类极多，其性状在水环境中时常会出现变异，常常出现实际生化反应结果与沙门氏菌鉴别表中的类型不相符的情况，造成检测失败。核酸检测法是利用PCR 技术对沙门氏菌保守的基因片段进行检测来实现准确检测的目的，然而其最大的弊端是无法区分活体和已死亡的菌体，单纯利用PCR技术无法深入研究水环境中沙门氏菌对人体健康的影响。因此，目前还没有一种适用于水中沙门氏菌活体的定量检测方法。
发明内容
本发明的目的在于，提供一种水中沙门氏菌活体的定量检测方法。为了实现上述任务，本发明采取如下的技术解决方案
一种水中沙门氏菌活体的定量检测方法，其特征在于，按下列步骤进行 步骤一，样品采集
用预先灭菌的采样瓶采集水样1L，水样采集后立即放入冰盒内保存，6h内进行检测； 步骤二，水样的浓缩
对于沙门氏菌浓度低的水样，真空抽滤IOOOmL水样通过微孔滤膜，过滤完毕后取出滤膜，置于已灭菌的烧杯中，加入IOmL磷酸盐缓冲液，该磷酸盐缓冲液的pH值为7. 4，用磁力搅拌洗脱滤膜30min ；弃滤膜，保存洗脱产物，取洗脱产物lmL，加入到9mL超纯水中，混勻后再取出lmL，加入到9mL超纯水中，依次梯度稀释，得到ΙΟΛΚΓ1和10_2三种稀释度的样品； 对于沙门氏菌浓度高的水样，取原水lmL，加入到9mL超纯水中，混勻后再取出lmL，加入到9mL超纯水中，依次梯度稀释，得到ΙΟΛΚΓ1和10_2稀释度的样品； 步骤三，水样前增菌
将1O-0、lO-1和10_2这三种稀释度的样品分别加入前增菌液混勻，每个稀释度做5份，放入37°C恒温培养箱中培养Mh ； 步骤四，选择性增菌
将各个稀释度样品的前增菌产物ImL转入到100 mL选择性增菌液中并混勻，在42°C下进行选择性增菌培养Mh ；步骤五，平板划线分离
挑取选择性 增菌产物，分别在XLD平板和BS平板上划线分离和培养，其中，XLD平板在 37°C下培养24h，BS平板在37°C下培养48h ； 步骤六，阳性菌落的鉴定
培养完毕，观察在XLD和BS平板上生长的菌落形态，分别挑取不同形态的菌落，置于 PCR反应管中，以沙门氏菌属通用引物进行扩增，扩增片段长度为284 bp ；并对PCR产物在 IOOV下电泳40min，观察在284 bp位置上是否有明亮的扩增条带出现，若有，则该菌落为沙门氏菌阳性；
所述的沙门氏菌属通用引物包括上游引物139和下游引物141，其中 上游引物 139 的序列为5，- GTGAAATTATCGCCACGTTCGGGCAA-3’ ； 下游引物 141 的序列为5，- TCATCGCACCGTCAAAGGAACC-3，；
步骤七，鉴定XLD和BS两种平板上的阳性菌落，并进行互补计数，对于每个稀释度的样品，对应的XLD平板和BS平板只要有其一是阳性平板，则该稀释度即为阳性；以阳性组合的方式记录平板上阳性菌落的结果，对照MPN表查找对应的MPN值，除以在步骤二中水样浓缩的倍数，得到100 mL水样的沙门氏菌活体含量(MPN/100mL)。所述的PCR扩增的条件是
(1 )PCR反应体系总体积25μ ，其中各成分终浓度为引物139和引物141各0. 4 μ mo 1/ L,0. 75U Taq 酶，0· 8 mmol/L dNTPs，2.5 mmol/L MgCl2 ；
(2) PCR扩增反应在PCR仪上进行，反应条件为95°C预变性5min ；95°C，30s，65°C， 30s，72°C，30s，进行30个循环；最后72°C延伸4min。本发明的水中沙门氏菌活体的定量检测方法，能够定量检测水中沙门氏菌活体含量，并提高检测的特异性，操作简便可行，适用于地表水、污水等多种水样的检测。
图1是沙门氏菌属通用引物的PCR产物电泳图，其中的泳道的标号分别为，M泳道表示DNA marker ；1泳道表示鼠伤寒沙门氏菌；2泳道表示伤寒沙门氏菌(CMCC 50071) ；3 泳道表示大肠埃希菌(ATCC25922) ;4泳道表示金黄色葡萄球菌(ATCC25923) ;5泳道表示金黄色葡萄球菌(ATCC29213) ；6泳道表示铜绿假单胞菌(ATCC27853) ；7泳道表示志贺氏菌； 8泳道表示枯草芽孢杆菌；N泳道表示阴性对照。以下结合附图和实施例对本发明作进一步的详细说明。
具体实施例方式1、设备和试剂
(1)PCR仪；
(2)核酸水平电泳仪；
(3)凝胶成像仪；
(4)恒温培养箱
(5)高压蒸汽灭菌器
(6)不锈钢真空抽滤器(7)微波炉
(8)0. 22 μ m混合纤维素酯微孔滤膜
(9)鼠伤寒沙门氏菌；
(10)木糖赖氨酸去氧胆酸盐琼脂培养基(XLD)
(11)亚硫酸铋琼脂培养基(BS)
(12)氯化镁孔雀绿增菌液
(13)蛋白胨
(14)琼脂糖
(15)Tris 干粉
(16)Na2EDTA · 2H20
(17)核酸染料
(18)DNA marker
(19)6XLoading buffer
(20)Taq酶
(21)dNTPs
(22)PCR buffer
(23)沙门氏菌属通用引物，包括上游引物139和下游引物141；上、下游引物由专业生物工程公司合成。上游引物139的核苷酸序列为5’_ GTGAAATTATCGCCACGTTCGGGCAA -3'；下游引物141的核苷酸序列为5'- TCATCGCACCGTCAAAGGAACC _3'，特异性扩增片段为 284bp。2、试剂配制
(1)前增菌液配制称取8g蛋白胨溶于400mL超纯水中，加热煮沸至完全溶解，定量分装，高压蒸汽灭菌备用。(2)选择性增菌液配制称取24g氯化镁孔雀绿固体干粉溶于SOOmL超纯水中，力口热煮沸至完全溶解，分装，高压蒸汽灭菌备用。(3)XLD平板的制备称取21. 57g XLD培养基溶于400mL超纯水中，加热煮沸至完全溶解，冷却至55°C左右，摇勻，倾注平板，室温冷却备用。(4)BS平板的制备称取19. 84g BS培养基溶于400mL超纯水中，加热煮沸至完全溶解，冷却至55°C左右，摇勻，倾注平板，室温冷却备用。(5)电泳缓冲液的制备称量242g Tris干粉和37. 2g Na2EDTA ·2Η20置于烧杯中， 加入约800 mL的超纯水，57. ImL醋酸，充分搅拌溶解。加超纯水定容至IL后，得到50ΧΤΑΕ Buffer。根据需要，以1 50的比例稀释，即得到IXTAE Buffer，作为电泳缓冲液。(6)琼脂糖凝胶的制备称量1.5g琼脂糖，置于250mL锥形瓶中，加入100 mL IXTAE Buffer，放入微波炉中加热至完全溶解，溶液清澈透明时取出。待稍冷，加入IOyL 核酸染料，混勻后倾倒入已插入梳子的核酸水平电泳槽中。待琼脂糖凝胶完全凝固后即可使用。3、测定程序
(1)样品采集用预先灭菌的采样瓶采集水样1L，水样采集后立即放入冰盒内保存，6h 内进行检测。
(2)水样的浓缩将不锈钢真空抽滤器高压蒸汽灭菌，把已灭菌的微孔滤膜用超纯水润湿，平贴于真空抽滤器的承托片上，过滤IOOOmL水样。结束后，取出滤膜，置于无菌的烧杯中，其中盛有IOmL磷酸盐缓冲液(pH7. 4)，磁力搅拌洗脱滤膜30min。取洗脱产物lmL， 加入到9mL超纯水中，混勻后再取出lmL，加入到9mL超纯水中，依次梯度稀释，得到10_°、 ΙΟ"1和10_2三种稀释度的样品。(3)水样前增菌取ΙΟΛ Ο—1和10_2三种稀释度的样品各lmL，分别加入9 mL前增菌液，在具棉塞的锥形瓶中混勻，每种稀释度各做5管，放入37°C恒温培养箱中培养24h。(4)选择性增菌分别将各个稀释度样品的前增菌产物ImL转入到100 mL选择性增菌液中，在具棉塞的锥形瓶中混勻后置于42°C恒温培养箱中培养24h。(5)平板划线分离对于每一个进行选择性增菌的锥形瓶，都用接种环挑取其中的选择性增菌产物，分别在一个XLD平板和一个BS平板上划线分离单菌落，然后在37°C培养。 XLD平板培养24h，BS平板培养48h。(6)阳性菌落鉴定培养完毕，观察XLD和BS平板上菌落生长形态。用接种针分别挑取各平板上不同形态的单菌落，置于PCR反应管中，加入沙门氏菌属通用引物139 (lOymol/L)禾口 141 (10ymol/L)# lyL,0. 15yL 5U/ul Taq 酶，2 μ L 10 mmol/L dNTPs, 2. 5μ L 25mmol/L MgCl2, 2. 5μ L 10XPCR buffer，15. 85 μ L 超纯水，总反应体积 25 PL。PCR 反应条件为95°C预变性5min ；然后95°C，30s，65°C，30s，72°C 30s，共进行30个循环；最后 72°C 延伸 4min。反应结束后，取PCR产物 μ ，加入5μ 6 X Loading buffer混勻，取5μ 置于琼脂糖凝胶的点样孔中，以100V的电压电泳约40 Hiin0完毕后，取出凝胶，置于凝胶成像仪上， 以DNA marker作为参照，观察样品扩增条带的位置。如果样品在284 bp的位置上有明亮的扩增条带，则证明该菌落为沙门氏菌属阳性。一个平板上只要出现一个阳性菌落，该平板即为阳性。(7) MPN定量分析对于每个稀释度的样品，其XLD平板和BS平板的阳性菌落鉴定结果互补计数。XLD平板和BS平板只要有其一是阳性平板，则该稀释度样品即为阳性。 以阳性组合的方式记录每个稀释度样品的检测结果，查找最大可能数(MPN)表(附表1)，得到对应的MPN值。例如10_°样品5管中有3管呈阳性，ΙΟ"1稀释度样品5管中有1管呈阳性，10_2稀释度样品5管全部为阴性，则记录为“3-1-0”，查找最大可能数(MPN)表得到 llOMPN/lOOmL。由于在步骤(2)中进行了 100倍的浓缩，因此水样的沙门氏菌活体含量为 110
—=l_IMPN/100m￡。 100表1 最大可能数 (MPN)表
权利要求
1.一种水中沙门氏菌活体的定量检测方法，其特征在于，按下列步骤进行步骤一，样品采集用预先灭菌的采样瓶采集水样1L，水样采集后立即放入冰盒内保存，6h内进行检测； 步骤二，水样的浓缩对于沙门氏菌浓度低的水样，真空抽滤IOOOmL水样通过微孔滤膜，过滤完毕后取出滤膜，置于已灭菌的烧杯中，加入IOmL磷酸盐缓冲液，该磷酸盐缓冲液的pH值为7. 4，用磁力搅拌洗脱滤膜30min ；弃滤膜，保存洗脱产物，取洗脱产物lmL，加入到9mL超纯水中，混勻后再取出lmL，加入到9mL超纯水中，依次梯度稀释，得到ΙΟΛΚΓ1和10_2三种稀释度的样品； 对于沙门氏菌浓度高的水样，取原水lmL，加入到9mL超纯水中，混勻后再取出lmL，加入到9mL超纯水中，依次梯度稀释，得到ΙΟΛΚΓ1和10_2稀释度的样品； 步骤三，水样前增菌将IO-flUO-1和10_2这三种稀释度的样品分别加入前增菌液混勻，每个稀释度做5份，放入37°C恒温培养箱中培养Mh ； 步骤四，选择性增菌将各个稀释度样品的前增菌产物ImL转入到100 mL选择性增菌液中并混勻，在42°C下进行选择性增菌培养Mh ； 步骤五，平板划线分离挑取选择性增菌产物，分别在XLD平板和BS平板上划线分离和培养，其中，XLD平板在 37°C下培养Mh，BS平板在37°C下培养48h ； 步骤六，阳性菌落的鉴定培养完毕，观察在XLD和BS平板上生长的菌落形态，分别挑取不同形态的菌落，置于 PCR反应管中，以沙门氏菌属通用引物进行扩增，扩增片段长度为观4 bp ；并对PCR产物在 IOOV下电泳40 min，观察在观4 bp位置上是否有明亮的扩增条带出现，若有，则该菌落为沙门氏菌阳性；所述的沙门氏菌属通用引物包括上游引物139和下游引物141，其中 上游引物 139 的序列为5，- GTGAAATTATCGCCACGTTCGGGCAA-3’ ； 下游引物 141 的序列为5，- TCATCGCACCGTCAAAGGAACC-3，；步骤七，鉴定XLD和BS两种平板上的阳性菌落，并进行互补计数，对于每个稀释度的样品，对应的XLD平板和BS平板只要有其一是阳性平板，则该稀释度即为阳性；以阳性组合的方式记录平板上阳性菌落的结果，对照MPN表查找对应的MPN值，除以在步骤二中水样浓缩的倍数，得到100 mL水样的沙门氏菌活体含量。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的PCR扩增的条件是(1)PCR反应体系总体积25μ ，其中各成分终浓度为引物139和引物141各0.4 μ mol/ L,0. 75U Taq 酶，0· 8 mmol/L dNTPs，2.5 mmol/L MgCl2 ；(2)PCR扩增反应在PCR仪上进行，反应条件为95°C预变性5min ；95°C，30s，65°C， 30s，72°C，30s，进行30个循环；最后72°C延伸4min。
3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的前增菌液配制方法是称取8g蛋白胨溶于400 mL超纯水中，加热煮沸至完全溶解，定量分装，高压蒸汽灭菌备用。
4.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的选择性增菌液配制方法是称取24g氯化镁孔雀绿固体干粉溶于SOOmL超纯水中，加热煮沸至完全溶解，分装，高压蒸汽灭菌备用。全文摘要
本发明公开了一种水中沙门氏菌属活体的定量检测方法，该方法根据沙门氏菌的生长特性和invA基因的保守性，采用多管发酵法从水样中初步筛选出以沙门氏菌为主的活体细菌。利用沙门氏菌属通用引物139和141，通过PCR扩增来鉴别沙门氏菌阳性菌落。通过MPN计数方法，定量检测水中的沙门氏菌活体。该方法能够准确检测水中沙门氏菌活体的含量，特异性高，操作简便可行，适用于地表水、污水等多种水样的检测。
文档编号C12Q1/06GK102154472SQ20111002050
公开日2011年8月17日 申请日期2011年1月18日 优先权日2011年1月18日
发明者张崇淼, 王晓昌, 船水尚行 申请人:西安建筑科技大学