调控种子大小的基因及其编码的蛋白质和应用的制作方法

专利名称：调控种子大小的基因及其编码的蛋白质和应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及调控种子大小的基因及其编码的蛋白质和应用，具体地说，本发明涉及来源自大豆的种子大小调控基因GmBGSl基因以及其所编码的蛋白，该调控基因参与了植物的种子大小的调控过程。本发明还提供了利用这些GmBGSl基因增大大豆种子的方法。 属于生物技术和植物学领域。
背景技术：
在作物产量构成因素中，种子的大小和重量是构成产量的重要成分，由之决定的百粒重是一个具有较高遗传力的性状，是作物育种中重要的育种目标。种子的大小是多个因素共同作用的结果，譬如在大豆中，据SoyBase数据库公布的数据，已经定位了种子的大小基因位点高达90多个。由此可见，寻找出制约大豆种子的大小的主导因子，对培育优质高产品种具有重要意义。

发明内容
针对上述现有技术，本发明提供了一种从大豆中分离的控制种子大小的基因和蛋白，以及利用该蛋白提高大豆种子的大小的应用。本发明是通过以下技术方案实现的调控种子大小的基因，即种子大小调控基因GmBGSl，其序列为以下核苷酸序列之(I)SEQ ID NO. 1所示的核苷酸序列；(2) SEQ ID NO. 1所示的核苷酸序列添加、取代、缺失或插入一个或多个核苷酸的同源序列；(3) SEQ ID NO. 1所示的核苷酸序列的等位基因及(2)所述的同源序列的等位基因。调节种子大小的蛋白质，其序列为以下氨基酸序列之一(I)SEQ ID NO. 2所示的氨基酸序列；(2) SEQ ID NO. 2所示的氨基酸序列添加、取代、缺失或插入一个或多个氨基酸的同源序列。一种植物表达载体，其含有调控种子大小的基因的完整编码阅读框序列。一种遗传工程化的宿主细胞，其含有上述的植物表达载体。本发明所述的调控种子大小的基因具有增大种子和提高百粒重的效果，可以用于制备转基因植物。具体应用时，步骤如下步骤(1)将本发明编码种子大小调控蛋白的多核苷酸转入植物细胞；(b)将步骤(1)中的植物细胞再生成植株。本发明的基因经实验证明，可以参与调控植物的种子大小的决定，通过转基因的手段可以增加植物种子的大小和百粒重，从而提高植物的种子产量。


图1.显示了本发明大豆GmBGSl基因的基因组序列，其中粗体表示外显子序列，阴影粗斜体表示内含子序列，_表示启动子，_表示终止子。图2.显示了大豆GmBGSl基因的正义表达载体。图3.显示转入GmBGSl基因正义质粒后的T2代大豆的果荚增大。图4.显示转入GmBGSl基因正义质粒后的T2代大豆的豆粒增大。图5.显示转入GmBGSl基因正义质粒株系中百粒重的增加情况。
具体实施例方式本发明经过深入而广泛的研究，从大豆中分离了调控基因和其编码蛋白GmBGSl， 参与调控植物种子的大小，对其活性进行调节可以产生豆粒和百粒重增加的植株，在此基础上完成了本发明。在本发明中，术语“GmBGSl基因””或“种子大小调控基因GmBGSl”可互换使用都指具有种子大小调控蛋白GmBGSl核苷酸序列(SEQ ID NO :1)。术语“GmBGSl蛋白”、“GmBGSl 多肽”或“种子大小调控蛋白GmBGSl”可互换使用，都指具有种子大小调控蛋白GmBGSl氨基酸序列(SEQ ID NO 2)的蛋白或多肽。如本文所用，“分离的”是指物质从其原始环境中分离出来(如果是天然的物质，原始环境即是天然环境)。如活体细胞内的天然状态下的多聚核苷酸和多肽是没有分离纯化的，但同样的多聚核苷酸或多肽如从天然状态中同存在的其他物质中分开，则为分离纯化的。如本文所用，“分离的GmBGSl蛋白或多肽”是指GmBGSl多肽基本上不含天然与其相关的其它蛋白、脂类、糖类或其它物质。本领域的技术人员能用标准的蛋白质纯化技术纯化GmBGSl蛋白。基本上纯的多肽在非还原聚丙烯酰胺凝胶上能产生单一的主带。本发明的多肽可以是重组多肽、天然多肽、合成多肽，优选重组多肽。本发明的多肽可以是天然纯化的产物，或是化学合成的产物，或使用重组技术从原核或真核宿主(例如，细菌、酵母、高等植物、昆虫和哺乳动物细胞)中产生。根据重组生产方案所用的宿主， 本发明的多肽可以是糖基化的，或可以是非糖基化的。本发明还包括GmBGSl蛋白的片段、衍生物和类似物。如本文所用，术语“片段”、 “衍生物”和“类似物”是指基本上保持本发明的天然GmBGSl蛋白相同的生物学功能或活性的多肽。本发明的多肽片段、衍生物或类似物可以是(i)有一个或多个保守或非保守性氨基酸残基(优选保守性氨基酸残基)被取代的多肽，而这样的取代的氨基酸残基可以是也可以不是由遗传密码编码的，或(ii)在一个或多个氨基酸残基中具有取代基团的多肽，或 (iii)成熟多肽与另一个化合物(例如聚乙二醇)融合所形成的多肽，或(iv)附加的氨基酸序列融合到此多肽序列而形成的多肽(如前导序列、分泌序列、或用来纯化此多肽的序列等)根据本文的指导，这些片段、衍生物和类似物属于本领域熟练技术人员公知的范围。发明还提供大豆GmBGSl蛋白或多肽的类似物。这些类似物与天然大豆GmBGSl蛋白或多肽的差别可以是氨基酸序列上的差异，也可以是不影响序列的修饰形式上的差异， 或者兼而有之。这些多肽包括天然或诱导的遗传变异体。诱导变异体可以通过各种技术得到，如通过辐射或暴露于诱变剂而产生随机诱变，还可通过定点诱变法或其他已知分子生
4物学的技术。类似物还包括具有不同于天然L-氨基酸的残基(如D-氨基酸)的类似物， 以及具有非天然存在的或合成的氨基酸(如β、Y-氨基酸)的类似物。应理解，本发明的多肽并不限于上述例举的代表性的多肽。修饰(通常不改变一级结构)形式包括体内或体外的多肽的化学衍生形式如乙酰化或羧基化。修饰还包括糖基化，如那些在多肽的合成和加工中或进一步加工步骤中进行糖基化修饰而产生的多肽。修饰形式还包括具有磷酸化氨基酸残基(如磷酸酪氨酸，磷酸丝氨酸，磷酸苏氨酸)的序列。本发明的多核苷酸可以是DNA形式或RNA形式。DNA形式包括cDNA、基因组DNA 或人工合成的DNA。DNA可以是单链或双链。DNA可以是编码链或非编码链。对GmBGSl而言，编码成熟多肽的编码区序列可以与SEQ ID NO :1所示的编码区序列相同或者是简并的变异体。如本文所用，“GmBGS的简并变异体”在本发明中是指编码具有SEQID NO :2的蛋白质，但与SEQ ID NO :1所示的编码区序列有差别的核酸序列。编码成熟多肽的多核苷酸包括只编码成熟多肽的编码序列；成熟多肽的编码序列和各种附加编码序列；成熟多肽的编码序列(和任选的附加编码序列)以及非编码序列。术语“编码多肽的多核苷酸”可以是包括编码此多肽的多核苷酸，也可以是还包括附加编码和/或非编码序列的多核苷酸。本发明还涉及上述多核苷酸的变异体，其编码与本发明有相同的氨基酸序列的多肽或多肽的片段、类似物和衍生物。此多核苷酸的变异体可以是天然发生的等位变异体或非天然发生的变异体。这些核苷酸变异体包括取代变异体、缺失变异体和插入变异体。如本领域所知的，等位变异体是一个多核苷酸的替换形式，它可能是一个或多个核苷酸的取代、 缺失或插入，但不会从实质上改变其编码的多肽的功能。本发明还涉及与上述的序列杂交且两个序列之间具有至少60%，较佳地至少 70%，更佳地至少80%相同性的多核苷酸，最佳地至少90%相同性的多核苷酸。本发明特别涉及在严格条件下与本发明所述多核苷酸可杂交的多核苷酸。在本发明中，“严格条件” 是指(1)在较低离子强度和较高温度下的杂交和洗脱，如0.2XSSC，0. SDS，60°C ；或
(2)杂交时加有变性剂，如50%(ν/ν)甲酰胺，0. 小牛血清/0. Ficoll，42°C等；或
(3)仅在两条序列之间的相同性至少在90%以上，更好是95%以上时才发生杂交。并且，可杂交的多核苷酸编码的多肽与SEQ ID NO :2所示的成熟多肽有相同的生物学功能和活性。本发明还涉及与上述的序列杂交的核酸片段。如本文所用，“核酸片段”的长度至少含15个核苷酸，较好是至少30个核苷酸，更好是至少50个核苷酸，最好是至少100个核苷酸以上。核酸片段可用于核酸的扩增技术(如PCR)以确定和/或分离编码GmBGSl的多聚核苷酸。本发明的大豆GmBGSl核苷酸全长序列或其片段通常可以用PCR扩增法、重组法或人工合成的方法获得。对于PCR扩增法，可根据本发明所公开的有关核苷酸序列，尤其是开放阅读框序列来设计引物，并用常规方法提取的DNA、或市售的cDNA库或按本领域技术人员已知的常规方法所制备的cDNA作为模板，扩增而得有关序列。当序列较长时，常常需要进行两次或多次PCR扩增，然后再将各次扩增出的片段按正确次序拼接在一起。一旦获得了有关的序列，就可以用重组法来大批量地获得有关序列。这通常是将其克隆入载体，再转入细胞，然后通过常规方法从增殖后的宿主细胞中分离得到有关序列。
此外，还可用人工合成的方法来合成有关序列，尤其是片段长度较短时。通常，通过先合成多个小片段，然后再进行连接可获得序列很长的片段。目前，已经可以完全通过化学合成来得到编码本发明蛋白(或其片段，或其衍生物)的DNA序列。然后可将该DNA序列引入本领域中已知的各种现有的载体和细胞中。此外，还可通过化学合成将突变弓I入本发明蛋白序列中。本发明也涉及包含本发明的多核苷酸的载体，以及用本发明的载体或GmBGSl蛋白编码序列经基因工程产生的宿主细胞，以及经重组技术产生本发明所述多肽的方法。通过常规的重组DNA技术(Science，1984 ；224 1431)，利用本发明的多聚核苷酸序列可用来表达或生产重组的GmBGSl多肽。一般来说有以下步骤(1).用本发明的编码大豆GmBGSl肽的多核苷酸(或变异体)，或用含有该多核苷酸的重组表达载体转化或转导合适的宿主细胞；(2).在合适的培养基中培养的宿主细胞；(3).从培养基或细胞中分离、纯化蛋白质。本发明中，大豆GmBGSl完整多核苷酸序列或部分多核苷酸序列可正向或方向插入到重组表达载体中。术语“重组表达载体”指本领域熟知的细菌质粒、噬菌体、酵母质粒、 植物细胞病毒、哺乳动物细胞病毒如腺病毒、逆转录病毒或其他载体。在本发明中适用的载体包括但不限于在细菌中表达的基于T7的表达载体，在植物细胞中表达的pCAMBIA表达载体等。总之，只要能在宿主体内复制和稳定，任何质粒和载体都可以用。表达载体的一个重要特征是通常含有复制起点、启动子、标记基因和翻译控制元件。本领域的技术人员熟知的方法能用于构建含大豆GmBGSl编码DNA序列和合适的转录/翻译控制信号的表达载体。这些方法包括体外重组DNA技术、DNA合成技术、体内 Μ Ε ^^ (Sambroook, et al. Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory. New York，1989)。所述的DNA序列可有效连接到表达载体中的适当启动子上，以指导mRNA合成。这些启动子的代表性例子有真核启动子包括泛素启动子肌动蛋白启动子，RuBP羧化酶启动子，热击蛋白启动子等；植物病毒的CaMV 35S启动子，CaMV基因VI启动子；反转录病毒的LTRs和其他一些已知的可控制基因在原核或真核细胞或其病毒中表达的启动子。表达载体还包括翻译起始用的核糖体结合位点和转录终止子。此外，表达载体优选地包含一个或多个选择性标记基因，以提供用于选择转化的宿主细胞的表型性状，如真核细胞培养用的葡萄糖酸酶基因(Gus基因)，氯霉素乙酰转移酶基因(Cat基因)，二氢叶酸还原酶(DHFR基因)、新霉素磷酸转移酶基因(Npt-II基因，潮霉素磷酸转移酶基因(HPT基因)，PPT乙酰转移酶基因(bar基因)以及绿色荧光蛋白(GFP)，或用于大肠杆菌的四环素或氨苄青霉素抗性。包含上述的适当DNA序列以及适当启动子或者控制序列的载体，可以用于转化适当的宿主细胞，以使其能够表达蛋白质或抑制宿主细胞中对应蛋白的正常表达。宿主细胞可以是原核细胞，如细菌细胞；或是低等真核细胞，如酵母细胞；或是高等真核细胞，如植物细胞。代表性例子有细菌细胞如大肠杆菌；真菌细胞如酵母；植物细胞等。优选的是植物细胞，尤其是植物的细胞，其中包括作物，如大豆、花生、碗豆、水稻、小麦、玉米、蚕豆、绿豆、扁豆等；牧草和绿肥作物，如苜蓿、紫云英、百脉根，三叶草等；药用植物，如决明、黄芪、苦参等；观赏植物，如金雀花、紫藤、香豌豆属、龙牙豆属等；绿化树种，如黄檀、凤凰木、格木、铁刀木、台湾相思等。本发明的多核苷酸在高等真核细胞中表达时，如果在载体中插入增强子序列时将会使转录得到增强。增强子是DNA的顺式作用因子，通常大约有10到300个碱基对，作用于启动子以增强基因的转录。可举的例子包括在复制起始点晚期一侧的100到270个碱基对的SV40增强子、在复制起始点晚期一侧的多瘤增强子以及腺病毒增强子等。本领域一般技术人员都清楚如何选择适当的载体、启动子、增强子和宿主细胞。用重组DNA转化宿主细胞可用本领域技术人员熟知的常规技术进行。当宿主为原核生物如大肠杆菌时，能吸收DNA的感受态细胞可在指数生长期后收获，用CaCl2法处理所用的步骤在本领域众所周知。如果需要，转化也可用电穿孔的方法进行。当宿主是真核生物，可选用如下的DNA转化和转染方法根癌农杆菌Ti质粒介导的基因转化，发根农杆菌 Ri质粒介导的基因转化，植物病毒载体介导的基因转化，磷酸钙共沉淀法，和DNA直接导入基因的转化方法如基因枪法，显微注射，电穿孔，超声波介导，激光微束介导脂质体包装，物理诱导，化学诱导等。获得的转化子可以用常规方法培养，表达本发明的基因所编码的多肽。根据所用的宿主细胞，培养中所用的培养基可选自各种常规培养基。在适于宿主细胞生长的条件下进行培养。当宿主细胞生长到适当的细胞密度后，用合适的方法(如温度转换或化学诱导) 诱导选择的启动子，将细胞再培养一段时间。通过常规的植物组织培养技术，可以将将转化的植物细胞再生成完全的植株。在所获转基因植株中，大豆GmBGSl基因得以异位过量表达或抑制其正常表达，从而使植物的种子大小发生变化，产生具有新表型的植株。本发明还包括用本发明方法获得的转基因植物及其子代，包括转基因植物与普通植物的杂交后代。在上面的方法中的重组多肽可在细胞内、或在细胞膜上表达、或分泌到细胞外。如果需要，可利用其物理的、化学的和其它特性通过各种分离方法分离和纯化重组的蛋白这些方法是本领域技术人员所熟知的。这些方法的例子包括但并不限于常规的复性处理、用蛋白沉淀剂处理(盐析方法)、离心、渗透破菌、超处理、超离心、分子筛层析(凝胶过滤)、 吸附层析、离子交换层析、高效液相层析(HPLC)和其它各种液相层析技术及这些方法的结
I=I O重组的大豆GmBGSl蛋白或多肽有多方面的用途。这些用途包括(但不限于) 用于改变植物种子大小，用于筛选促进或对抗大豆GmBGSl蛋白功能的抗体、多肽或其它配体。利用本发明蛋白，通过各种常规筛选方法，可筛选出与大豆GmBGSl蛋白发生相互作用的物质，如受体、抑制剂、激动剂或拮抗剂等。当本发明蛋白激动剂或抑制剂等在农业上进行施用时，可提供不同的效果。下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如 Sambrook 等人，分子克隆实验室手册(New York Co Id Spring Harbor Laboratory Press, 1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。实施例1.大豆中GmBGSl基因的分离和结构分析(1)基因的分离首先从大豆吉林35 (购自山东师范大学)幼嫩花序中，分离mRNA ；以此mRNA为模板，B^为引物(如表1所示)合成cDNA第一条链。接着以该cDNA第一条链为模板，0L3^/ 0L329(如表1所示)为引物进行扩增，获得了 1个GmBGSl基因的长为1636bp的cDNA片段，分别克隆到PMD18-T载体(TaKaRa公司)中并命名为pFLBlOOl。pFLB 1001 中所包含 GmBGSl CDS 序列如 SEQ ID NO. 1 所示，共 1380bp，它编码一个460个氨基酸的蛋白(SEQ ID NO. 2)。(2)基因的结构分析以大豆吉林35幼嫩叶片为材料，提取其中的DNA，接着以该基因组DNA为模板， 0L328/0L329为引物进行扩增获得了 1个GmBGSl基因组的片段，分别克隆到pMD18_T载体 (TaKaRa公司)中并命名为pFLB1002。pFLB1002中所包含GmBGSl的DNA序列如SEQ ID NO. 3所示，共1945bp,它含有1 个内含子和2个外显子(如图1)。表 1
引物名称序列(5'至3')SEQ ID NO B26GACTCGAGTCGACATCGA(T)1740L328TGCATCCTTCTCTTMCCTTCCTCC50L329GCTACMCCTCCAAACCCTACCATT6 实施例2. GmBGSl正义表达载体的构建将GmBGSl⑶S正向连到中间载体pRTlOl载体(山东师范大学生命研究中心)上， 然后将含有35S的强启动子加上正向GmBGSl⑶S再接上polyA的片段克隆到植物表达载体 pCAMBIA1301(CAMBIA研究中心)中，得到GmBGSl正义的表达载体，该载体全长为14Kbp (如图2)，在大肠杆菌中的抗性为卡那霉素抗性，在植物体中的抗性为潮霉素抗性，该载体在 T-DNA区域还带有⑶S报告基因。实施例3基因枪法转化豆科植物在本实施例中，通过基因枪法转化大豆胚尖的方法，得到含有GmBGSl调控基因的正义表达载体的“荷豆12号”的外植体。(A)大豆外植体的获得选取表面光滑、无破损、无病斑、无裂痕的“荷豆12号”成熟大豆种子，以氯气方法灭菌14h。将灭菌后的种子浸泡在无菌水中，黑暗处理16h。在超净台上去掉大豆种皮、子叶和原叶，将下胚轴连同刚萌动的胚尖作为基因枪转化的受体材料。(B)大豆转化基因枪方法采用PDS 1000/He型基因枪(Bio-RAD公司)，300ug/枪金粉含量，金粉尺寸为0. 6 μ m，轰击时氦压力值为llOOpsi，真空压力数为27inHg，轰击距离为9cm。转化了 345个胚尖外植体。5mg/L 6-BA黑暗诱导16h后，置于5mg ·厂1的潮霉素筛选培养基上筛选7d，之后移至IOmg · Γ1的潮霉素筛选培养基上筛选7d，然后移到15mg · Γ1的潮霉素筛选培养基上继续筛选14d，最终筛选得到了 9个抗性植株，GUS检测这9株植物均为阳
8性。在温室中培养5个月后果荚开始成熟，6个月后收种完毕。(C)可以遗传的转基因植株将收获的Tl代种子在温室中每个株系种植4株，可以观察到过量表达GmBGSl基因的植株豆荚明显大于转基因受体-野生型“荷豆12号”的豆荚(图幻。成熟后单株收种，对豆粒分别进行拍照(图4)，称重，其中有9个株系中有14株过量表达GmBGSl基因的转基因植株的百粒重比野生型“荷豆12号”高出10%以上(见图5)，其中有4个株系5株过量表达GmBGSl基因的转基因植株高出20%以上；特别是株系9中的有4个单株的百粒重分别是野生型“荷豆12号”的127%、121%、117%和109%;同时在株系2和9中各有两个单株的百粒重超过野生型“荷豆12号”的10%以上。综上所述，大豆GmBGSl基因可以参与调控植物的种子大小的决定，通过转基因的手段可以增加植物种子的大小和百粒重，从而提高植物的种子产量。
权利要求
1.一种调控种子大小的基因，其特征在于其序列为以下核苷酸序列之一(1)SEQID NO. 1所示的核苷酸序列；(2)SEQ ID NO. 1所示的核苷酸序列添加、取代、缺失或插入一个或多个核苷酸的同源序列；(3)SEQ ID NO. 1所示的核苷酸序列的等位基因及(2)所述的同源序列的等位基因。
2.一种调控种子大小的蛋白质，其特征在于其序列为以下氨基酸序列之一(1)SEQID NO. 2所示的氨基酸序列；(2)SEQ ID NO. 2所示的氨基酸序列添加、取代、缺失或插入一个或多个氨基酸的同源序列。
3.一种植物表达载体，其特征在于所述植物表达载体含有权利要求1所述的调控种子大小的基因的完整编码阅读框序列。
4.一种遗传工程化的宿主细胞，其特征在于所述宿主细胞含有权利要求3所述的植物表达载体。
5.一种调控种子大小的蛋白质的制备方法，其特征在于，该方法包含(a)在适合表达调控种子大小的基因的条件下，培养权利要求4所述的宿主细胞；(b)从培养物中分离出调控种子大小的蛋白质。
6.权利要求1所述的调控种子大小的基因在制备转基因植物中的应用。
7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于应用步骤如下(1)将本发明调控种子大小的基因转入植物细胞；(b)将步骤(1)中的植物细胞再生成植株，即得可提高种子产量的转 基因植物。
全文摘要
本发明公开了一种新的源自大豆调控种子大小的蛋白GmBGS1，编码GmBGS1蛋白的多核苷酸，GmBGS1编码基因参与了植物种子大小的决定。本发明还提供了利用转基因技术异位表达GmBGS1改变植物种子大小、增加植物种子的大小和百粒重，从而提高植物的种子产量的方法。
文档编号C12N15/29GK102174523SQ201110020709
公开日2011年9月7日 申请日期2011年1月18日 优先权日2011年1月18日
发明者冯献忠, 叶美, 张慧, 杨素欣, 赵彦修 申请人:山东师范大学