专利名称：一种紫堇达明分离工艺的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种紫堇达明分离工艺，特别涉及发酵液的预处理、大孔树脂富集和溶剂萃取，和紫堇达明的硅胶层析精制几方面。
背景技术：
从发酵液中提取有效成分同传统的植物中提取化合物不同，由于存在大量的水相，而发酵产品相对含量较低，所以对于这种类型的发酵，有必要结合传统的植化知识和发酵工程的一些方法，综合降低成本，提高产率。发酵工程下游技术一般涉及发酵液的预处理、固液分离、产品粗提取和精致几个方面。生物碱的传统提取分离方法一般综合考虑生物碱的溶解性和极性采用溶剂萃取，树脂吸附，柱层析等手段。
发明内容
本发明公开了一种紫堇达明分离工艺。本发明中，发酵液的培养基组成按20升计含玉米粉100-400g ；豆粕20_160g ； 酵母粉l_10g ；无水硫酸镁0. 5-4g ；磷酸氢二钾10-200g ；七水硫酸亚铁0. 5_4g ；氯化钠10-200g，碳酸钙l-20g。培养时间为24-144小时。在本发明中从发酵液中制备紫堇达明首先需要获得便于固液分离的发酵液，另外需要解决发酵液的浓缩问题，以及产物和底物的分离难点。为解决上述问题，本实验提供以下技术方案，具体工艺如下将保发酵液调节pH3. 5-4. 5、加热至 75_90°C、100-300rpm 搅拌 30_60min ；加入氯化钙至浓度150-350mg/L，40_60°C静置0. 5-1. 5小时，过滤，滤液采用AB-8大孔树脂动态吸附，上样流速3-6ml/min ；洗脱流速3-8ml/min。洗脱过程蒸馏水4-8BV除杂；35%的乙醇洗脱收取，收集6BV洗脱液；洗脱液浓缩干燥后与硅胶混合拌样，浓缩后固体与硅胶的比率1 1.5-1 4;采用硅胶柱层析，分离硅胶质量与拌样硅胶质量比1 8-1 12，采用石油醚-丙酮-三乙胺系统等度洗脱。洗脱过程洗脱须控制温度0-7°C，收集6-10BV洗脱液，减压浓缩，乙醇重结晶。
具体实施例方式本发明通过酸处理和絮凝技术结合的方法考察发酵液的前处理。综合考察了大孔树脂对处理后的发酵液的吸附解吸附行为。考察了硅胶柱层析精制紫堇达明的详细工艺参数。通过以下结合实施例和实验例进一步详述本发明的工艺特点。实施例1 将制备好的发酵液的进行预处理。实施例2:
将实施例1制备所得的发酵液通过大孔树脂富集。实施例3: 将实施例1制备的发酵液通过有机溶剂萃取进行富集。实施例4:将实施例2制备的提取物通过硅胶柱层析，得到紫堇达明纯品。实验例实验例采用的实验材料、和器材如下药品与试剂左旋四氢巴马汀(I-THP)，紫堇达明(1-⑶L)，氯化钠；磷酸氢二钾； 酵母粉；豆粕；玉米粉；硫酸亚铁；碳酸钙；无水硫酸镁；甲苯；二甲苯；二氯甲烷；乙醚；乙酸乙酯；醋酸异丙酯；盐酸；丙酮；乙醇；甲醇；大孔树脂D-101 ；大孔树脂AB-8 ；大孔树脂 ADS-5 ；大孔树脂ADS-17 ；大孔树脂HPD-100 ；大孔树脂HPD-820 ；大孔树脂DA201 ； 100-200 目柱层析硅胶；200-300目柱层析硅胶。实验仪器岛津液相色谱仪LC-2010C HPLC ；色谱柱汉邦C18，(250mmX4. 6mm, 5ym) ；AL204型电子精密天平(梅特勒一托利多仪器有限公司)；蒸汽发生器上海佳田制造有限公司DZFZ-9-5 ；发酵罐上海傲中生物工程设备有限公司BMR-A30U ；空压机宁波展翅无油空压机有限公司VW-0. 11/7-Χ单相，100L储气罐。实验例1 发酵液的预处理(1)酸处理发酵液选择搅拌速度、ρΗ值、温度和加热时间四个因素入手优化发酵液的过滤品质。用正交表L9 (34)来安排试验，实验结果见表1。表1发酵液酸处理正交试验结果
权利要求
1.一种紫堇达明分离工艺，其特征是包括以下步骤第一步将保藏号为ATCC 13273的灰色链霉菌生物转化发酵液调节pH3. 5-4. 5、加热至 75-90°C、100-300rpm 搅拌 30_60min ；第二步加入氯化钙至浓度150-350mg/L，40-60°C静置0. 5-1. 5小时，过滤，第三步滤液采用AB-8大孔树脂动态吸附，上样流速3-6ml/min ；洗脱流速3_8ml/ min0洗脱过程蒸馏水4-8BV除杂；35%的乙醇洗脱收取，收集6BV洗脱液；第四步洗脱液浓缩干燥后与硅胶混合拌样，浓缩后固体与硅胶的比率 1 1.5-1 4;采用硅胶柱层析，分离硅胶质量与拌样硅胶质量比1 8-1 12，采用石油醚-丙酮-三乙胺系统等度洗脱。洗脱过程洗脱须控制温度0-7°C，收集6-10BV洗脱液，减压浓缩，乙醇重结晶。
2.根据权利要求1所述保藏号为ATCC13273的灰色链霉菌生物转化发酵液为使用 ATCC13273的灰色链霉菌在液体培养基中培养M小时后，加入底物左旋四氢巴马汀后继续共培养M-144小时的发酵液。
3.根据权利要求1所述石油醚-丙酮-三乙胺系统其特征是体积比 (75-95) (5-25) (0. 1-5)。
4.根据权利要求2所述灰色链霉菌ATCC13273的液体培养基组成按20升计含玉米粉:100-400g ；豆粕:20-160g ；酵母粉=I-IOg ；无水硫酸镁0. 5_4g ；磷酸氢二钾:10_200g ； 七水硫酸亚铁0. 5-4g ；氯化钠10-200g，碳酸钙l-20g。
5.根据权利要求2所述，底物左旋四氢巴马汀与灰色链霉菌ATCC13273发酵液的质量 (W，单位克)体积(V，单位升)比范围为0. 1-2.0。
全文摘要
本发明公开了一种从保藏号为ATCC 13273的灰色链霉菌生物转化左旋四氢巴马汀的发酵液中提取转化产物紫堇达明的新型组合工艺。发酵液是复杂的多相系统，转化产物在培养液中浓度较低，下游处理成本高，回收率低，因此在合理的发酵条件基础上进行分离纯化研究是降低工业化生产成本的关键。通过本发明公开的工艺可以获得纯度98％以上的紫堇达明纯品。
文档编号C12P17/18GK102250086SQ20111012532
公开日2011年11月23日 申请日期2011年5月16日 优先权日2011年5月16日
发明者余伯阳, 刘吉华, 孙乐明, 张剑, 徐田, 朱羽尧 申请人:中国药科大学