专利名称：从植物源材料中筛选产细菌素乳酸菌的方法
技术领域：
本发明涉及从植物源材料中筛选获得产细菌素乳酸菌菌株的方法。
背景技术：
细菌素是细菌通过核糖体合成的一类蛋白或多肽类物质，因其具有抑菌活性而受到广泛的关注。与化学类防腐剂和抗生素相比，细菌素作为一种蛋白类物质，抑菌活性强， 稳定性好，可被酶解而不会残留于人体内，不易引起抗药性，具有较高的安全性，可广泛应用于食品天然防腐剂及医药领域。很多乳酸菌是细菌素的产生菌，其中由乳酸乳球菌产生的细菌素Nisin，已被FAO批准用于食品生物保鲜中，但由于Nisin仅对部分革兰氏阳性菌有抑制作用，抑菌谱较窄，并且在中性条件下溶解性差，稳定性较低，因而极大地限制了 Msin在食品防腐保鲜中的应用。因此，为开发新的具有优良性能的细菌素，筛选出产细菌素的乳酸菌是应用研究的第一环节。目前，筛选产细菌素乳酸菌的方法主要包括以下几步先筛选出产酸菌株，再通过将发酵上清液的PH调至5. 5 6. 0做抑菌实验以排除发酵液中酸对指示菌的抑制作用，再通过过氧化氢酶处理的上清液做抑菌实验来排除过氧化氢对指示菌的抑制作用。进一步通过酶解实验，确认筛选出的菌株可以产生蛋白质性质的抑菌物质-细菌素。但由于乳酸菌在发酵过程中除了可以产生各种有机酸和过氧化氢等抑菌物质外，还会产生如双乙酰等小分子抑菌物质，因此传统的常规方法不能够完全排除小分子的影响，而且实验结果的准确度不高，往往有一些假阳性的结果。此外，相当一部分细菌素属于酸依赖型细菌素，若将发酵上清液的PH调至5. 5 6. 0，这些酸依赖型的细菌素就会失去活性，从而无法筛选出这些产细菌素的菌株。
发明内容
本发明的目的是提供一种从植物源材料中筛选产细菌素乳酸菌的方法。为实现上述目的，本发明采用了以下技术方案一种从植物源材料中筛选产细菌素乳酸菌的方法，其特征在于包括如下步骤(1)植物源材料的处理将植物源材料剪成小块后装入试管，或将植物源材料直接加入试管，向试管中加入适量无菌水，压实后密封，室温下富集10 15天，得到富集液；(2)乳酸菌的分离与纯化A、在无菌条件下，吸取0. ImL富集液，进行梯度稀释，得到10_4、10_5、10_6、10_7的梯度稀释液；B、取上述不同梯度的稀释液各0. 05 0. 2mL，分别加入到MRS固体平板上，并将菌悬液均勻涂布于平板表面；C、在25°C 35°C的无氧条件下，将上述平板静置培养1 5天；D、根据菌落形态的差异，用接种环挑取各种典型菌落，在另一 MRS固体平板上进行四区划线，置于25°C 35°C的无氧条件中培养1 5天；E、持续D步骤的操作至少2次，直至菌落完全纯化；(3)产抑菌物质的乳酸菌的筛选A、将步骤( 得到的完全纯化的菌株分别接入MRS液体培养基中，在25°C 35°C 无氧条件下静置培养M 48h，得到菌株的发酵液；B、在4°C条件下，分别将上述发酵液经7000 10000r/min离心10 25min，保留
上清液；C、通过牛沣杯双层平板扩散法筛选出产抑菌物质的菌株；(4)产细菌素乳酸菌的筛选将上述产抑菌物质的菌株的上清液用截留分子量为500 IOOODa的透析袋透析 6 12h，将透析液冷冻干燥制成冻干粉；将冻干粉溶解在二级水中，浓度为20 200mg/ mL，通过牛沣杯扩散法检测冻干粉制备的样品是否产生抑菌圈，并保存产细菌素的菌株；(5)产细菌素乳酸菌的验证将(4)中得到的产细菌素菌株的发酵上清液通过硫酸铵沉淀法进一步验证抑菌物质为细菌素。本发明中，所述的植物源材料为植物的茎、叶、根、果实或种子。进一步的，所述的植物源材料为新鲜的马齿苋、蓬蓬菜、花椰菜、西红柿、大白菜或小米。本发明还可以通过以下技术措施得以进一步实现所述( 产抑菌物质的乳酸菌的筛选，C步骤通过牛沣杯双层平板扩散法筛选出产抑菌物质的菌株的具体操作方法如下将指示菌接种于LB液体培养基中，37°C培养5 10h, OD600为0. 2 0. 4 ；取指示菌菌液0. 1 0. 3mL,与5 8mL经融化后保持在45°C左右的LB半固体培养基混勻，立即倒在素琼脂平板上；待所述混勻物凝固，放上牛沣杯，每个平板放置1 6个，并分别向牛沣杯中加入B步骤制备好的上清液0. 1 0. 2mL ；将平板放于 4°C冰箱中静置4 10h，然后在观 37°C培养6 12h，观察牛沣杯周围是否有抑菌圈形成，以得到产抑菌物质的菌株。所述(4)产细菌素乳酸菌的验证，硫酸铵沉淀法具体操作如下将(3)A步骤得到的产抑菌物质菌株的发酵上清液，以饱和度为80 100%硫酸铵沉淀，在4°C冰箱中静置过夜，在4°C下，7000 lOOOOr/min离心40min得到沉淀；将所得沉淀溶解在二级水中，用截留分子量为500 IOOODa的透析袋透析6 12h，将透析液冷冻干燥制成冻干粉；将所得冻干粉溶解在二级水中，浓度为20 200mg/mL，通过牛沣杯双层平板扩散法检测是否有抑菌圈形成，以进一步通过酶解实验验证得到的抑菌物质为细菌素。通过对制得的产细菌素乳酸菌发酵上清液的硫酸铵沉淀样品的酶解实验验证菌株所产抑菌物质蛋白质类物质，具体操作步骤如下A、取上述经硫酸铵沉淀后制成的冻干粉，溶于二级水中，浓度为20 100mg/mL， 调PH值至各种蛋白酶的最适pH ；B、向上述溶液中分别加入各种对应的蛋白酶，终浓度为1. 0 2. 5mg/mL，对照组不加蛋白酶，37°C水浴1 池；C、然后将B步骤所得溶液的pH值调至4. 0 5. 0，通过牛沣杯扩散法测定有无抑菌圈；经各种蛋白酶的作用后，所获样品在牛沣杯周围无抑菌圈，表明菌株所产抑菌物质是蛋白质，即为细菌素。所述MRS培养基的组成葡萄糖20. Og,酵母粉5. Og,蛋白胨10. 0g，牛肉膏10. Og, 硫酸镁0. 56g，磷酸氢二钾2g，柠檬酸二铵5. Og,乙酸钠5. Og,硫酸锰0. 25g，吐温805. OmL, 用三级水定容至1L，pH值为7. 0。所述的指示菌为各种革兰氏阳性菌或阴性菌。优选的，所述的指示菌为绿脓杆菌、鸡白痢沙门氏菌、李斯特菌、大肠杆菌、变形杆菌。所述的蛋白酶为蛋白酶E、蛋白酶K、木瓜蛋白酶、糜蛋白酶、胃蛋白酶或胰蛋白酶中的任意一种。本发明对产细菌素乳酸菌的分离纯化方法进行了改进，通过用截留分子量较小 (500 IOOODa)的透析袋透析处理发酵上清液，即可排除发酵上清液中的小分子抑菌物质对指示菌的抑制作用，同时又保证了细菌素的活力。本方法既减少了实验步骤，又提高了筛选效率。
具体实施例方式下述实施例中的实验方法，如无特别说明，均为常规方法。下述实施例中的百分含量，如无特别说明，均为质量百分含量。实施例1 (1)植物源材料的处理将马齿苋的叶和茎剪成小块，装入试管，加入少量无菌水，压实，用塑料袋与牛皮纸密封，25°C中富集15天，得到富集液；(2)乳酸菌的分离与纯化A、在无菌条件下，用取样器从试管底部吸取0. ImL富集液，进行梯度稀释，得到 10-4、10-5、10_6、10-7 的梯度稀释液;B、取上述不同梯度的稀释液0. lmL，分别加入到MRS固体平板上，用三角刮铲将菌悬液均勻涂布于平板表面；C、在的无氧条件下，将上述平板培养48h ；D、根据菌落形态的差异，用接种环挑取各种典型菌落，在另一 MRS固体平板上进行四区划线，置于的无氧条件下培养48h;Ε、持续D步骤的操作至少2次，直至菌落完全纯化，得到40株以上纯的乳酸菌菌株；(3)产抑菌物质乳酸菌的筛选Α、将上述菌株分别接入MRS液体培养基中，在无氧条件下静置培养48h，得到菌株的发酵液；B、在4°C下，分别将上述发酵液经9000r/min离心15min，保留上清液；C、通过牛沣杯双层平板扩散法筛选出产抑菌物质的菌株将指示菌接种于LB液体培养基中，37°C培养6h，OD600为0. 2。取菌液0. 2mL,与6mL经融化后保持在45°C左右的LB半固体培养基混勻，立即倒在素琼脂平板上。待其凝固，放上牛沣杯，每板可放6个，分别向牛沣杯中加入上述制备好的上清液0. 2mL。将平板放于4°C冰箱中静置5h，然后在37°C 培养他，观察牛沣杯周围是否有抑菌圈形成；上述C步骤中的指示菌，可为各种革兰氏阳性细菌和阴性细菌如鸡白痢沙门氏菌或绿脓杆菌或李斯特菌或变形杆菌或大肠杆菌。(4)产细菌素乳酸菌的筛选排除有机酸、过氧化氢、双乙酰等小分子的抑菌作用将上述菌株的上清液用截留分子量为500Da的透析袋透析12h，将透析液冷冻干燥制成冻干粉。将冻干粉溶解在二级水中，浓度为50mg/mL，通过牛沣杯双层平板扩散法检测是否产生抑菌圈。若有抑菌圈形成，可排除小分子的抑菌作用。(5)用酶解实验验证菌株所产抑菌物质为细菌素A、硫酸铵沉淀法将上述菌株的发酵上清液，按饱和浓度为80%进行硫酸铵沉淀，在4°C冰箱中静置过夜。然后在4°C下，9000r/min离心40min。将沉淀溶解在二级水中，用截留分子量为500Da的透析袋透析12h，冷冻干燥制成冻干粉。将冻干粉溶解在二级水中，浓度为50mg/mL，通过牛沣杯双层平板扩散法检测是否有抑菌圈形成，从而筛选出产细菌素的菌株；B、取上述经硫酸铵沉淀后制成的冻干粉，溶于二级水中，浓度为100mg/mL，调pH 值至各种酶的最适PH ；C、分别加入酶，终浓度为2. 5mg/mL,对照组不加酶，37°C水浴2h ；D、将溶液的pH值调至4. 2，通过牛沣杯双层平板扩散法测定抑菌圈有无；以上C步骤中的酶，可为蛋白酶E或蛋白酶K或木瓜蛋白酶或糜蛋白酶或胃蛋白酶或胰蛋白酶或任何一种蛋白酶。经各种蛋白酶作用后，所获样品在牛沣杯周围不产生抑菌圈，说明该菌株所产抑菌物质是细菌素。(6)通过菌种的形态学特征、生理生化特征以及16S rDNA序列分析，依据《伯杰氏细菌分类手册》和《乳酸细菌分类鉴定及实验方法》，对所获菌株进行鉴定。鉴定结果表明从马齿苋叶和茎中分离筛选出2株产细菌素的植物乳杆菌菌株。实施例2 (1)植物源材料的处理将大白菜叶剪成小块，装入试管，加入少量无菌水，压实，用塑料袋与牛皮纸密封， 25°C中富集15天，得到富集液；(2)乳酸菌的分离与纯化A、在无菌条件下，用取样器从试管底部吸取0. ImL富集液，进行梯度稀释，得到 10-4、10-5、10_6、10-7 的梯度稀释液;B、取上述不同梯度的稀释液0. lmL，分别加入到MRS固体平板上，用三角刮铲将菌悬液均勻涂布于平板表面；C、在的无氧条件下，将上述平板培养48h ；D、根据菌落形态的差异，用接种环挑取各种典型菌落，在另一 MRS固体平板上进行四区划线，置于的无氧条件中培养48h;
E、持续D步骤的操作至少2次，直至菌落完全纯化，得到40株以上纯的乳酸菌菌株；(3)产抑菌物质乳酸菌的筛选A、将上述菌株分别接入MRS液体培养基中，在无氧条件下静置培养48h，得到菌株的发酵液；B、在4°C下，分别将上述发酵液经9000r/min离心15min，保留上清液；C、通过牛沣杯双层平板扩散法筛选出产抑菌物质的菌株将指示菌接种于LB液体培养基中，37°C培养6h，OD600O. 2。取菌液0. 2mL,与6mL经融化后保持在45°C左右的LB 半固体培养基混勻，立即倒在素琼脂平板上。待其凝固，放上牛沣杯，每板可放6个，分别向牛沣杯中加入上述制备好的上清液0. 2mL。将平板放于4°C冰箱中静置证，然后在37°C培养他，观察牛沣杯周围是否有抑菌圈形成；上述C步骤中的指示菌，可为各种革兰氏阳性细菌和阴性细菌如鸡白痢沙门氏菌或绿脓杆菌或李斯特菌或变形杆菌或大肠杆菌。(4)产细菌素乳酸菌的筛选排除有机酸、过氧化氢、双乙酰等小分子的抑菌作用将上述菌株的上清液用截留分子量为500D的透析袋透析12h，冷冻干燥制成冻干粉。将冻干粉溶解在二级水中，浓度为 50mg/mL，通过牛沣杯双层平板扩散法检测是否产生抑菌圈。若有抑菌圈形成，可排除小分子的抑菌作用；(5)用酶解实验验证菌株所产抑菌物质为细菌素A、硫酸铵沉淀法将上述菌株的发酵上清液，按饱和浓度为80%进行硫酸铵沉淀，在4°C冰箱中静置过夜。然后在4°C下，9000r/min离心40min。将沉淀溶解在二级水中， 用截留分子量为500D的透析袋透析12h，冷冻干燥制成冻干粉。将冻干粉溶解在二级水中， 浓度为50mg/mL，通过牛沣杯双层平板扩散法检测是否有抑菌圈形成，从而筛选出产细菌素的菌株；B、取上述经硫酸铵沉淀后制成的冻干粉，溶于二级水中，浓度为100mg/mL，调pH 值至各种酶的最适PH ；C、分别加入酶，终浓度为2. 5mg/mL,对照组不加酶，37°C水浴2h ；D、将溶液的pH值调至4. 2，通过牛沣杯双层平板扩散法测定抑菌圈的大小；以上C步骤中的酶，可为蛋白酶E或蛋白酶K或木瓜蛋白酶或糜蛋白酶或胃蛋白酶或胰蛋白酶或任何一种蛋白酶。经各种蛋白酶作用后，所获样品在牛沣杯周围不产生抑菌圈，说明该菌株所产抑菌物质是细菌素。(6)通过菌种的形态学特征、生理生化特征以及16S rDNA序列分析，依据《伯杰氏细菌分类手册》和《乳酸细菌分类鉴定及实验方法》，对所获菌株进行鉴定。鉴定结果表明从大白菜叶中分离筛选出1株产细菌素的亚利桑纳乳杆菌菌株。实施例3 (1)植物源材料的处理将小米装入试管，加入少量无菌水，压实，用塑料袋与牛皮纸密封，250C中富集15 天，得到富集液；
(2)乳酸菌的分离与纯化A、在无菌条件下，用取样器从试管底部吸取0. ImL菌悬液，进行梯度稀释，得到 10-4、10-5、10_6、10-7 的梯度稀释液;B、取上述不同梯度的稀释液0. lmL，分别加入到MRS固体平板上，用三角刮铲将菌悬液均勻涂布于平板表面；C、在的无氧条件下，将上述制备好的平板置于培养48h ；D、根据菌落形态的差异，用接种环挑取各种典型菌落，在另一 MRS固体平板上进行四区划线，置于的无氧条件中培养48h;Ε、持续D步骤的操作至少2次，直至菌落完全纯化，得到40株以上纯的乳酸菌菌株；(3)产抑菌物质的乳酸菌的筛选Α、将上述菌株分别接入MRS液体培养基中，在无氧条件下静置培养48h，得到菌株的发酵液；B、在4°C下，分别将上述发酵液经9000r/min离心15min，保留上清液；C、通过牛沣杯双层平板扩散法筛选出产抑菌物质的菌株将指示菌接种于LB液体培养基中，37°C培养6h，OD600为0. 2。取菌液0. 2mL,与6mL经融化后保持在45°C左右的 LB半固体培养基混勻，立即倒在素琼脂平板上。待其凝固，放上牛沣杯，每板可放6个，分别向牛沣杯中加入上述制备好的上清液0. 2mL。将平板放于4°C冰箱中静置5h，然37°C培养他，观察牛沣杯周围是否有抑菌圈形成；上述C步骤中的指示菌，可为各种革兰氏阳性细菌和阴性细菌如鸡白痢沙门氏菌或绿脓杆菌或李斯特菌或变形杆菌或大肠杆菌。(4)产细菌素乳酸菌的筛选将上述菌株的上清液用截留分子量为500Da的透析袋透析12h，将透析液冷冻干燥制成冻干粉。将冻干粉溶解在二级水中，浓度为50mg/mL，通过牛沣杯双层平板扩散法检测是否产生抑菌圈。若有抑菌圈形成，可排除小分子如有机酸、过氧化氢、双乙酰的抑菌作用。(5)用酶解实验验证菌株所产抑菌物质为细菌素A、硫酸铵沉淀法将上述菌株的发酵上清液，按饱和浓度为80%进行硫酸铵沉淀，在4°C冰箱中静置过夜。然后在4°C下，9000r/min离心40min。将沉淀溶解在二级水中， 用截留分子量为500D的透析袋透析12h，冷冻干燥制成冻干粉。将冻干粉溶解在二级水中， 浓度为50mg/mL，通过牛沣杯双层平板扩散法检测是否有抑菌圈形成，从而筛选出产细菌素的菌株；B、取上述经硫酸铵沉淀后制成的冻干粉，溶于二级水中，浓度为100mg/mL，调pH 值至各种酶的最适PH ；C、分别加入酶，终浓度为2. 5mg/mL,对照组不加酶，37°C水浴2h ；D、将溶液的pH值调至4. 2，通过牛沣杯双层平板扩散法测定抑菌圈的大小；以上C步骤中的酶，可为蛋白酶E或蛋白酶K或木瓜蛋白酶或糜蛋白酶或胃蛋白酶或胰蛋白酶或任何一种蛋白酶。经各种蛋白酶作用后，所获样品在牛沣杯周围不产生抑菌圈，说明该菌株所产抑菌物质是细菌素。 (6)通过菌种的形态学特征、生理生化特征以及16S rDNA序列分析，依据《伯杰氏细菌分类手册》和《乳酸细菌分类鉴定及实验方法》，对所获菌株进行鉴定。鉴定结果表明从小米中分离筛选出1株产细菌素的植物乳杆菌菌株。
权利要求
1.一种从植物源材料中筛选产细菌素乳酸菌的方法，其特征在于包括如下步骤(1)植物源材料的处理将植物源材料剪成小块后装入试管，或将植物源材料直接加入试管，向试管中加入适量无菌水，压实后密封，室温下富集10 15天，得到富集液；(2)乳酸菌的分离与纯化A、在无菌条件下，吸取0.ImL富集液，进行梯度稀释，得到10_4、10_5、10_6、10_7的梯度稀释液；B、取上述不同梯度的稀释液各0.05 0. 2mL,分别加入到MRS固体平板上，并将菌悬液均勻涂布于平板表面；C、在25°C 35°C的无氧条件下，将上述平板静置培养1 5天；D、根据菌落形态的差异，用接种环挑取各种典型菌落，在另一MRS固体平板上进行四区划线，置于25°C 35°C的无氧条件中培养1 5天；E、持续D步骤的操作至少2次，直至菌落完全纯化；(3)产抑菌物质的乳酸菌的筛选A、将步骤( 得到的完全纯化的菌株分别接入MRS液体培养基中，在25°C 35°C无氧条件下静置培养M 48h，得到菌株的发酵液；B、在4°C条件下，分别将上述发酵液经7000 10000r/min离心10 25min，保留上清液；C、通过牛沣杯双层平板扩散法筛选出产抑菌物质的菌株；(4)产细菌素乳酸菌的筛选将上述产抑菌物质的菌株的上清液用截留分子量为500 IOOODa的透析袋透析6 12h，将透析液冷冻干燥制成冻干粉；将冻干粉溶解在二级水中，浓度为20 200mg/mL，通过牛沣杯扩散法检测冻干粉制备的样品是否产生抑菌圈，并保存产细菌素的菌株；(5)产细菌素乳酸菌的验证将中得到的产细菌素菌株的发酵上清液通过硫酸铵沉淀法进一步验证抑菌物质为细菌素。
2.根据权利要求1所述的从植物源材料中筛选产细菌素乳酸菌的方法，其特征在于 所述的植物源材料为植物的根、茎、叶、果实、种子。
3.根据权利要求2所述的从植物源材料中筛选产细菌素乳酸菌的方法，其特征在于 所述的植物源材料为新鲜的马齿苋、蓬蓬菜、花椰菜、西红柿、大白菜或小米。
4.根据权利要求1 3任一项所述的从植物源材料中筛选产细菌素乳酸菌的方法，其特征在于所述C3)产抑菌物质的乳酸菌的筛选，C步骤通过牛沣杯双层平板扩散法筛选出产抑菌物质的菌株的具体操作方法如下将指示菌接种于LB液体培养基中，37°C培养5 10h, OD600为0. 2 0. 4 ；取指示菌菌液0. 1 0. 3mL,与5 8mL经融化后保持在45°C左右的LB半固体培养基混勻，立即倒在素琼脂平板上；待所述混勻物凝固，放上牛沣杯，每个平板放置1 6个，并分别向牛沣杯中加入B步骤制备好的上清液0. 1 0. 2mL ；将平板放于 4°C冰箱中静置4 10h，然后在观 37°C培养6 12h，观察牛沣杯周围是否有抑菌圈形成，以得到产抑菌物质的菌株。
5.根据权利要求1 3任一项所述的从植物源材料中筛选产细菌素乳酸菌的方法，其特征在于所述(4)产细菌素乳酸菌的验证，硫酸铵沉淀法具体操作如下将(3)A步骤得到的产抑菌物质菌株的发酵上清液，以饱和度为80 100%硫酸铵沉淀，在4°C冰箱中静置过夜，在4°C下，7000 lOOOOr/min离心40min得到沉淀；将所得沉淀溶解在二级水中，用截留分子量为500 IOOODa的透析袋透析6 12h，将透析液冷冻干燥制成冻干粉；将所得冻干粉溶解在二级水中，浓度为20 200mg/mL，通过牛沣杯双层平板扩散法检测是否有抑菌圈形成，以进一步通过酶解实验验证得到的抑菌物质为细菌素。
6.根据权利要求1 3任一项所述的从植物源材料中筛选产细菌素乳酸菌的方法，其特征在于通过对制得的产细菌素乳酸菌发酵上清液的硫酸铵沉淀样品的酶解实验验证菌株所产抑菌物质蛋白质类物质，具体操作步骤如下A、取上述经硫酸铵沉淀后制成的冻干粉，溶于二级水中，浓度为20 100mg/mL，调pH 值至各种蛋白酶的最适PH ；B、向上述溶液中分别加入各种对应的蛋白酶，终浓度为1.0 2. 5mg/mL，对照组不加蛋白酶，37°C水浴1 汕；C、然后将B步骤所得溶液的pH值调至4.0 5. 0，通过牛沣杯扩散法测定有无抑菌圈；经各种蛋白酶的作用后，所获样品在牛沣杯周围无抑菌圈，表明菌株所产抑菌物质是蛋白质，即为细菌素。
7.根据权利要求1 3任一项所述的从植物源材料中筛选产细菌素乳酸菌的方法， 其特征在于所述MRS培养基的组成葡萄糖20. Og,酵母粉5. 0g，蛋白胨10. 0g，牛肉膏 10. Og,硫酸镁0. 56g，磷酸氢二钾2g，柠檬酸二铵5. Og,乙酸钠5. Og,硫酸锰0. 25g，吐温 805. OmL，用三级水定容至1L，pH值为7. 0。
8.根据权利要求4所述的从植物源材料中筛选产细菌素乳酸菌的方法，其特征在于 所述的指示菌为各种革兰氏阳性菌或阴性菌。
9.根据权利要求6所述的从植物源材料中筛选产细菌素乳酸菌的方法，其特征在于 所述的蛋白酶为蛋白酶E、蛋白酶K、木瓜蛋白酶、糜蛋白酶、胃蛋白酶或胰蛋白酶中的任意一种。
10.根据权利要求8所述的从植物源材料中筛选产细菌素乳酸菌的方法，其特征在于 所述的指示菌为绿脓杆菌、鸡白痢沙门氏菌、李斯特菌、大肠杆菌、变形杆菌。
全文摘要
本发明涉及从植物源材料中筛选产细菌素乳酸菌的方法。本方法包括下述步骤植物源材料的处理；乳酸菌的分离筛选；用菌株发酵上清液做抑菌试验的方法筛选产抑菌物质的乳酸菌菌株；通过用上清液的透析液做抑菌试验来排除小分子的干扰，筛选产细菌素的乳酸菌菌株，以及用硫酸铵沉淀后的蛋白粗提物做抑菌试验的方法和各种蛋白酶对粗提物的酶解实验的方法证明了利用该方法可以有效地筛选到产细菌素的乳酸菌菌株。本发明对产细菌素乳酸菌的分离纯化方法进行了改进，通过用截留分子量较小的透析袋透析处理发酵上清液，即可排除发酵上清液中的小分子抑菌物质对指示菌的抑制作用，同时又保证了细菌素的活力。本方法既减少了实验步骤，又提高了筛选效率。
文档编号C12R1/25GK102250806SQ20111018413
公开日2011年11月23日 申请日期2011年7月1日 优先权日2011年7月1日
发明者张明, 祁克宗, 蔡庆霞, 陈一然, 陈晓琳 申请人:安徽农业大学