Cdkn1b基因突变检测特异性引物和液相芯片的制作方法
【专利摘要】本发明公开了一种CDKN1B基因突变检测液相芯片和特异性引物，该液相芯片主要包括有：每种由5’端的tag序列和3’端针对目的基因突变位点的特异性引物序列组成的ASPE引物，所述特异性引物序列为：针对G-79A位点的SEQ?ID?NO.7及SEQ?ID?NO.8，针对G-838T位点的SEQ?ID?NO.9及SEQ?ID?NO.10，和/或针对T326G位点的SEQ?ID?NO.11及SEQ?ID?NO.12；有anti-tag序列包被的微球；扩增引物。本发明所提供的检测液相芯片的检测结果与测序法的吻合率高达100％，实现多个突变位点的野生型和突变型并行检测。
【专利说明】CDKN1B基因突变检测特异性引物和液相芯片
【技术领域】
[0001]本发明属于分子生物学领域，涉及医学和生物技术，具体的是涉及一种⑶KNlB基因突变检测特异性引物和液相芯片。
【背景技术】[0002]Q3KN1B基因全称周期蛋白依赖激酶抑制因子IB (cyclin dependentkinaseinhibitor IB, CDKN1B)，又称为 p27，Kipl，定位于 12 号染色体 12ρ13.1_ρ12 短臂上，是一种调控细胞周期并抑制细胞分裂的重要基因。CDKNlB基因编码的P27蛋白为细胞周期素(cyclin)依赖性蛋白激酶抑制因子，其编码的蛋白质含有198个氨基酸，相对分子质量约27X 103，由2个外显子和2个内含子组成。P27蛋白质N端没有结构锌指的结构域，C端有2个分开的核定位信号。p27主要与cyclin结合而发挥对cyclin2⑶K的抑制作用，具有多种生物学功能:(I)可直接抑制cyclin2CDK复合物的生物学活性，从而阻止细胞由Gl期向S期的转变，同时还可作为细胞外刺激信号的潜在媒介来调控细胞周期。(2)促进细胞分化，介导细胞间黏附及诱导细胞凋亡。Gardner等发现，缺氧可诱导p27的产生，抑制⑶K2的活性，从而阻滞细胞周期，如减少或清除P27将清除缺氧所致的Gl期阻滞，但也有p27抑制细胞凋亡的报道。P27诱导还可抑制细胞凋亡，可能与细胞类型、生长状态及其恶性化与否有关。(3)与细胞衰老有关。Tsukiyama等发现，⑶4与⑶8_的胸腺细胞和激活的成熟T细胞的P27表达下降，人为上调p27表达后，可引起胸腺细胞发育障碍和成熟T细胞增殖能力下降，推测P27表达下降对T细胞的发育、增殖及免疫反应是必需的。研究表明，pRb导致细胞衰老可因p27表达减弱而丧失,pRb可能通过转录后的调节上调p27表达,并特异性地抑制CDK2活性来延长细胞周期阻滞，从而实现其诱导衰老的作用。p27作为细胞周期的负性调节因子，被认为是一种抑癌基因。大量研究发现，P27基因多态性位点与甲状腺乳头状癌、心肌梗塞、子宫内膜癌、卵巢癌的发生呈现显著相关性。
[0003]目前，⑶KNlB基因突变检测方法主要有:PCR-RFLP技术、荧光定量PCR技术和Affymetrix芯片技术，PCR-RFLP法是基于基因突变造成的限制性内切酶识别位点的改变，如位点丢失或产生新位点，通过PCR扩增某一特定片段，再用限制性内切酶酶切扩增产物，电泳观察片段的大小，这种方法用于检测酶切位点改变的基因突变，可直接判断基因型，但该法不能用于没有产生新酶切位点的基因突变检测。荧光定量PCR技术具有灵敏度高、特异性强、自动化程度高的特点，但也存在样品易污染、假阳性率高的缺点，且每次只能检测一种突变类型。虽然高通量是Affymetrix芯片技术比较成熟，然而该芯片技术对于中低密度的临床诊断型芯片并不合适，很难在同一个反应体系中扩展检测众多生物学性状相关的SNP或标签SNP。另外，Affymetrix芯片主要在表达谱芯片上比较强，物种较多，在SNP芯片上相对较弱，而且检测价格昂贵，并不能满足实际需要。
【发明内容】
[0004]本发明的目的之一是提供⑶KNlB基因突变检测液相芯片，该液相芯片可用于单独或并行检测CDKNlB基因三种常见基因型G-79A、G-838T和T326G的野生型和突变型。
[0005]实现上述目的的技术方案如下。
[0006]一种⑶KNlB基因突变检测液相芯片，包括有:
[0007](A).针对⑶KNlB基因不同突变位点分别设计的野生型和突变型的ASPE引物对:每条ASPE引物由5’端的tag序列和3’端针对目的基因突变位点的特异性引物序列组成，所述特异性引物序列为:针对G-79A位点的SEQ ID N0.7及SEQ ID N0.8，针对G-838T位点的 SEQ ID N0.9及SEQ ID N0.10，和 /或针对T326G位点的 SEQ ID N0.11 及SEQ ID N0.12 ；所述 tag 序列选自 SEQ ID N0.1 ~SEQ ID N0.6 ；
[0008](B).有不同ant1-tag序列包被的、具有不同颜色编码的微球,所述ant1-tag序列与微球连接中间还设有间隔臂序列；所述ant1-tag序列选自SEQ ID N0.13~SEQ IDN0.18,且所述ant1-tag序列能相应地与(A)中所选的tag序列互补配对；
[0009]( C).用于扩增出需要检测的、具有相应突变位点的目标序列的引物。
[0010]在其中一个实施例中，所述扩增引物为:针对G-79A位点的SEQ ID N0.19及SEQID N0.20，针对 G-838T 位点的 SEQ ID N0.21 及 SEQ ID N0.22，和 / 或针对 T326G 位点的SEQ ID N0.23 及 SEQID N0.24。
[0011]在其中一个实施例中，所述ASPE引物为:针对G-79A位点的由SEQ ID N0.1和SEQID N0.7组成的序列及由SEQ ID N0.2和SEQ ID N0.8组成的序列，针对G-838T位点的由SEQ ID N0.3和SEQ ID N0.9组成的序列及由SEQ ID N0.4和SEQ ID N0.10组成的序列，和/或针对T326G位点的由SEQ ID N0.5和SEQ ID N0.11组成的序列及由SEQ ID N0.6和SEQ ID N0.12组成的序`列。
[0012]本发明的另一目的是提供用于CDKNlB基因突变检测的特异性引物。
[0013]实现上述目的技术方案如下。
[0014]用于CDKNlB基因突变检测的特异性引物，所述特异性引物序列为:针对G-79A位点的 SEQ ID N0.7 及 SEQ ID N0.8，针对 G-838T 位点的 SEQ ID N0.9 及 SEQ ID N0.10，和/ 或针对 T326G 位点的 SEQ ID N0.11 及 SEQ ID N0.12。
[0015]本发明的主要优点在于:
[0016]1.本发明所提供的CDKNlB基因突变检测液相芯片的检测结果与测序法的吻合率高达100%。且检测所需要的时间远远低于常用的测序技术，特别符合实际应用需要。所制备的CDKNlB基因突变检测液相芯片具有非常好的信号-噪声比，并且所设计的探针以及ant1-tag序列之间基本上不存在交叉反应，tag标签序列、ant1-tag标签序列的选取以及tag标签序列与具体ASPE引物的结合，能够避免交叉反应，实现多个突变位点的并行检测。
[0017]2.本发明通过发明人长期积累的设计经验和大量的实验操作，从众多的特异性引物中选取了最优的组合。本发明设计的ASPE引物特异性引物能够灵敏特异地识别目标检测的突变位点，准确区分各种型别的基因型；在同一个反应体系中，不同的特异性引物之间、特异性引物与非目标检测的PCR扩增产物之间基本上不存在交叉反应，检测特异性好，交叉反应率低于3% ;除了能够检测单个位点突变情况，也能够同时并行检测多个突变位点的突变情况，检测效果一致。
[0018]3.本发明的检测方法步骤简单，3种突变位点检测可通过一步PCR即可完成3条含有突变位点的目标序列的扩增，避免了反复多次PCR等复杂操作过程中存在的诸多不确定因素，因而可大大提高检测准确率，体现了精确的同时定性、定量分析特征。
[0019]4.本发明不仅克服了传统固相芯片敏感性不高，检测结果的可重复性差的缺陷，同时对现有的液相芯片技术进行改进，使得所制备微球能适用于不同的检测项目，具有很强的拓展性。检测的荧光信号值大大提高，从而使得检测的灵敏度进一步得到提高，信噪比增强，检测结果更加准确可靠。
【具体实施方式】
[0020]实施例1⑶KNlB基因突变检测液相芯片，主要包括有:
[0021]一、ASPE 引物
[0022]针对CDKNlB基因三种常见基因型G-79A、G-838T和T326G的野生型和突变型，分别设计特异性引物序列。ASPE引物由“tag序列+特异性引物序列”组成。ASPE引物序列如下表所示:
[0023]表1⑶KNlB基因的ASPE引物序列(tag序列+特异性引物序列)
[0024]
【权利要求】
1.一种⑶KNlB基因突变检测液相芯片，其特征是，包括有: (A).针对CDKNlB基因不同突变位点分别设计的野生型和突变型的ASPE引物对:每条ASPE引物由5’端的tag序列和3’端针对目的基因突变位点的特异性引物序列组成，所述特异性引物序列为:针对G-79A位点的SEQ ID N0.7及SEQ ID N0.8，针对G-838T位点的SEQ ID N0.9 及 SEQ ID N0.10，和 / 或针对 T326G 位点的 SEQ ID N0.11 及 SEQ ID N0.12 ；所述 tag 序列选自 SEQ ID N0.1 ~SEQ ID N0.6 ； (B).有不同ant1-tag序列包被的、具有不同颜色编码的微球,所述ant1-tag序列与微球连接中间还设有间隔臂序列；所述ant1-tag序列选自SEQ ID N0.13~SEQ ID N0.18，且所述ant1-tag序列能相应地与(A)中所选的tag序列互补配对； (C).用于扩增出需要检测的、具有相应突变位点的目标序列的引物。
2.根据权利要求1所述的CDKNlB基因突变检测液相芯片，其特征是，所述扩增引物为:针对 G-79A 位点的 SEQ ID N0.19 及 SEQ ID N0.20，针对 G-838T 位点的 SEQ ID N0.21 及SEQ IDN0.22，和 / 或针对 T326G 位点的 SEQ ID N0.23 及 SEQ ID N0.24。
3.根据权利要求1或2所述的CDKNlB基因突变检测液相芯片，其特征是，所述ASPE引物为:针对G-79A位点的由SEQ ID N0.1和SEQ ID N0.7组成的序列及由SEQ ID N0.2和SEQ ID N0.8组成的序列，针对G-838T位点的由SEQ ID N0.3和SEQ ID N0.9组成的序列及由SEQ ID N0.4和SEQ ID N0.10组成的序列，和/或针对T326G位点的由SEQ ID N0.5和SEQ ID N0.11组成的序列及由SEQ ID N0.6和SEQ ID N0.12组成的序列。
4.根据权利要求1或2所述的CDKNlB基因突变检测液相芯片，其特征是，所述间隔臂为5 — 10个T。
5.用于CDKNlB基因突变检测的特异性引物，其特征是，所述特异性引物为:针对G-79A位点的 SEQ ID N0.7 及 SEQ ID N0.8`，针对 G-838T 位点的 SEQ ID N0.9 及 SEQ ID N0.10，和 / 或针对 T326G 位点的 SEQ ID N0.11 及 SEQ ID N0.12。
【文档编号】C12Q1/68GK103865990SQ201210545906
【公开日】2014年6月18日 申请日期:2012年12月14日 优先权日:2012年12月14日
【发明者】刘丽, 许昌有 申请人:益善生物技术股份有限公司