专利名称：一株链霉菌及其在生产放线菌素中的应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及一株链霉菌及其在生产放线菌素中的应用。
背景技术：
癌症是一种非常古老的疾病，伴随着整个人类发展的历史，严重威胁着人类的健康与生命。放线菌素能够通过影响核酸合成、诱导细胞分化、诱导细胞凋亡、抑制一些蛋白酶活性及影响细胞周期等方式发挥其抗肿瘤活性。放线菌素还可通过与DNA结合抑制RNA 合成而发挥抗菌、抗病毒的作用。放线菌素D已经成为较为理想的抗肿瘤药物，广泛应用于恶性肿瘤的临床治疗、 结合手术治疗和放射治疗，对肾母细胞瘤、横纹肌肉瘤、神经母细胞瘤、霍奇金病、绒毛膜癌及睾丸肿瘤的治疗有效，尤其是对儿童肾母细胞瘤有很好的治疗效果，也常与其他药物联合用于肿瘤的治疗与研究。放线菌素)(2除了更好的抗肿瘤作用外，对病毒性心肌炎最常见的病原体柯萨奇病毒(CVB3)有显著地抑制作用。上世纪后期人们开始对放线菌素进行深入研究，主要集中于放线菌素的生物学功能和临床药理学研究，目前放线菌素已不仅是临床上重要的抗肿瘤药物，也越来越成为分子生物学和细胞生物学研究的工具。放线菌素的产生菌已见报道的有近30种，但基本上都是单一成分高产，且在这些产生菌中，放线菌素D的产量最高为野生菌株0. 21mg/ml、诱变菌株0. 85mg/ml，放线菌素\ 的最高产量为0. 15mg/ml。
发明内容
本发明的目的是提供一株链霉菌及其在生产放线菌素中的应用。本发明提供的链霉菌(Sti^ptomyces sp. )MS449，已于2011年11月09日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCCJia 北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮编100101)，保藏号为CGMCCNo. M52。本发明还保护所述链霉菌MS449在生产放线菌素中的应用。所述放线菌素可为放线菌素&、放线菌素D和放线菌素中的至少一种。本发明还保护一种种子培养基，是通过如下方法制备得到的培养基将20-30g可溶性淀粉、0. 2-0. 6g L-天冬酰胺、0. 5-1. Og KNO3>0. 2-0. 6g K2HPO4 · H20,0. 2-0. 6gNaCl 和 0.2-1. Og MgSO4 ·7Η20用水定容至1L。所述种子培养基的ρΗ可为7. 0-7. 5。所述种子培养基具体可通过如下方法制备得到将25g可溶性淀粉、0.4g L-天冬酰胺、0.8g KN03、0.4g K2HPO4 · H20,0. 4g NaCl 和 0. 6g MgSO4 · 7H20 用水定容至 IL0本发明还保护一种发酵培养基，是通过如下方法制备得到的培养基将5-15g葡萄糖、10-30g稷粉、10-30g棉籽蛋白粉和10-30g 3-(N-吗啉基)丙磺酸用水定容至1L。所述发酵培养基的PH可为7. 0-7. 5。所述发酵培养基培养基具体可通过如下方法制备得到将IOg葡萄糖、20g稷粉、20g棉籽蛋白粉和20g 3-(N-吗啉基)丙磺酸用水定容至1L。本发明还保护一种制备放线菌素的方法，是发酵所述链霉菌MS449，得到放线菌素。所述发酵的条件具体可为25-301、140-200印111、6-20天(如6-15天)。所述发酵的条件具体可为、180rpm、15天。所述方法具体可包括如下步骤将所述链霉菌MS449的种子液接种至所述发酵培养基中发酵并收获发酵液。所述方法中，可将5ml所述种子液接种至IOOml所述发酵培养基中。所述种子液具体可通过如下方法制备将所述链霉菌MS449接种于所述种子培养基中，25-30°C (如 280C )、140-200rpm(如180rpm)培养2-6天(如96小时)，得到种子液。所述方法还可包括如下步骤(1)将所述发酵液离心(离心参数具体可为4°C、8000转/min、15min)，分别收集
上清液和沉淀；(2)将步骤(1)获得的沉淀用丙酮浸提(可室温静置10小时)，离心(离心参数具体可为4°C、8000转/min、15min)并收集上清液；(3)将步骤(1)的上清液和步骤( 的上清液合并，即为放线菌素粗提液(菌株粗提液)；(4)将所述放线菌素粗提液上样于HP-20大孔吸附树脂，依次用体积百分比为 40%、60%和80%的丙酮水溶液洗脱(各一升)，依次收集用60%和80%丙酮水溶液洗脱得到的过柱后洗脱液，依次命名为洗脱液乙和洗脱液丙；(5)将所述洗脱液乙蒸干并用丙酮重新溶解，过滤后进行反相HPLC ；反相HPLC参数采用Agilent ZORBAX XDB C-18 column(5 μ m，9· 4X250讓)；流动相为体积百分比为 60%的甲醇水溶液，流速为2. Oml/min ；收集保留时间为29. 2-29. 9min的洗脱液，蒸干后得到放线菌素；将所述洗脱液丙蒸干用丙酮重新溶解，过滤后进行反相HPLC ；反相HPLC参数采用 Agilent ZORBAX XDB C-18 column (5 μ m，9. 4X 250mm)；流动相为体积百分比为 70% 的甲醇水溶液，流速为2. Oml/min ；收集保留时间为38. 1-39. 6min的洗脱液，蒸干后得到放线菌素X2 ；收集保留时间为39. 9-40. 7min的洗脱液，蒸干后得到放线菌素D。本发明提供的链霉菌MS449在没有经过任何培养基及发酵条件优化的前提下，其放线菌素&，放线菌素D和放线菌素的产量分别可达1. 92、1. 77和0. 15mg/ml，均高于目前已见报道的放线菌素生产菌株的产量。本发明所提供的生产放线菌素的方法是发酵链霉菌MS449，发酵稳定、化合物分离工艺简便、产率高。本发明提供的菌株具有很好的工业化潜力和前景。
图1为链霉菌MS449在斜面培养基上培养28天的照片。图2为链霉菌MS449在扫描电镜(Quanta 200) 10000X下观察的照片。图3为放线菌素粗提液的HPLC分析图。图4为活性组份甲㈧、活性组份乙⑶和活性组份丙(C)的质谱图。图5为活性组份甲㈧、活性组份乙⑶和活性组份丙(C)的紫外光谱图。
图6为活性组份甲、活性组份乙和活性组份丙的碳信号归属。图7为每毫升发酵液中活性组份甲、活性组分乙和活性组分丙的产量。
具体实施例方式以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。可溶性淀粉购自北京化工厂，产品目录号为K0800034。葡萄糖购自北京现代东方精细化学品有限公司(HG)。稷粉购自农贸市场。棉籽蛋白粉(药媒)购自北京中棉紫光生物科技有限公司。MOPS即3-(N-吗啉基)丙磺酸，购自北京江晨生物。HP-20大孔吸附树脂 (三菱)购自北京慧德易科技有限公司。Agilent ZorbaxXDB C_8 column 购自北京慧德易科技有限公司。Agilent ZORBAX XDB C-18 column 购自北京慧德易科技有限公司。实施例1、链霉菌MS449的分离和鉴定一、链霉菌MS449的分离菌株分离培养基的组成如下(以下均为质量百分比)淀粉2%、L-天冬素 0. 05%,KNO3 0.1%,K2HPO4 · H2O 0. 05%,NaCl 0. 05%,MgSO4 · 7H20 0. 05%,CaCO3 0.1%, Agarl. 8%和 H2O ；pH 值为 7. 5。取1. Og 土样(采自中国南海海底泥的泥土样品)，放入装有9. Oml无菌水的50ml 离心管中，180rpm摇2h，于20KHz、100W功率超声^iiin ；取1. Oml悬浊液，放入装有9. Oml无菌水的50ml离心管中，混勻；取1. Oml悬浊液，放入装有9. Oml无菌水的50ml离心管中，混勻；系列稀释10_3和10_4 ；盖紧管盖，于100°C保温lh，取0. 2ml涂板。获得了一株菌，将其命名为菌株MS449。菌株MS449的保藏方法于25%甘油冻存管_80°C保藏。二、链霉菌MS449的鉴定菌株MS449在斜面培养基上培养观天的照片见图1。菌株MS449在扫描电镜 (Quanta 200) 10000X下观察的照片见图2。在斜面培养基上培养观天产生圆柱形孢子， 表面光滑，大小均勻(0. 5-0. 7 μ mX 1.5-2. Oym)。气生菌丝呈黄白色，表面带刺，基内菌丝
呈黄色，有黄色色素产生。根据菌落形态特征，将菌株MS449鉴定为链霉菌。链霉菌(Sti^ptomyces sp. )MS449已于2011年11月09日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCCJia 北京市朝阳区北辰西路1号院3号， 中国科学院微生物研究所，邮编100101)，保藏号为CGMCC No. M52。实施例2、应用链霉菌MS449生产放线菌素斜面培养基的制备方法如下(pH7. 0)将2 可溶性淀粉、0. 4g L-天冬酰胺、0. Sg ΚΝ03、0· 4g K2HPO4 · H20,0. 4g NaCl,0. 6g MgSO4 · 7H20 和 18g 琼脂用水溶解并用水定容至 1L。种子培养基的制备方法如下(pH7. 5)将2 可溶性淀粉、0. 4g L-天冬酰胺、0. Sg ΚΝ03、0· 4g K2HPO4 · H20,0. 4g NaCl 和 0. 6g MgSO4 · 7H20 用水溶解并用水定容至 IL0发酵培养基的制备方法如下(pH7. 0)将IOg葡萄糖、20g稷粉、20g棉籽蛋白粉和
520g MOPS用水溶解并用水定容至1L。一、菌株发酵1、种子培养(1)将链霉菌MS449的孢子接种于斜面培养基，28°C培养8天(到气生菌丝丰满)， 即得到斜面菌种。(2)在500ml玻璃瓶中装入IOOml种子培养基。(3)从步骤(1)的斜面挖块接种至步骤O)的培养基，280C、ISOrpm培养96小时， 得到种子液。2、发酵培养(1)在500ml的三角瓶中加入IOOml发酵培养基。(2)在步骤(1)的培养基中接种5ml步骤1得到的种子液，、ISOrpm培养15 天，收获发酵液(发酵液为容器内的所有物质)。二、有效成分的分离纯化1、将1升步骤一得到的发酵液4°C条件下离心15min(8000转/min)，分别收集上清液和沉淀(菌体)。2、将步骤1获得的菌体用350mL丙酮室温条件下浸泡过夜(约10小时)，4°C条件下离心15min (8000转/min)，收集上清液。3、将步骤1的上清液和步骤2的上清液合并，即为放线菌素粗提液(菌株粗提液)。4、将50ml放线菌素粗提液上样于HP-20大孔吸附树脂柱，用100%丙酮洗脱，浓缩洗脱液，并进行HPLC分析。HPLC 参数Agilent Zorbax XDB C_8column(5 μ m，4. 6X 150mm)；体积百分比为 70%的甲醇水溶液为流动相，流速为1. Oml/min ；检测波长为2Mnm。HPLC图谱见图3。粗提液中存在三种成分，保留时间分别为8. 6min、14. 7min和 16.9min。5、将步骤3得到的菌株粗提液(约1300ml)上样于300ml HP-20大孔吸附树脂， 先用800ml水洗脱，然后依次用体积百分比为40%、60%和80%的丙酮水溶液(各1升) 洗脱，依次收集用60%和80%丙酮水溶液洗脱得到的过柱后洗脱液，依次命名为洗脱液乙 (约1升)和洗脱液丙(约1升)。6、将洗脱液乙通过旋转蒸发仪除去丙酮并蒸干，用3mL丙酮重新溶解，过滤后进行反相HPLC。反相HPLC参数Agilent ZORBAX XDB C-18 column (5 μ m，9. 4X 250mm)；体积百分比为60%的甲醇水溶液为流动相，流速为2. Oml/min ；检测波长为2Mnm。收集保留时间为四.2-29. 9min的洗脱液，用旋转蒸发仪蒸干，得到活性组分甲 (每毫升步骤一得到的发酵液中含有0. 15mg活性组分甲)。7、将洗脱液丙通过旋转蒸发仪除去丙酮并蒸干，用6mL丙酮重新溶解，过滤后进行反相HPLC。反相HPLC参数Agilent ZORBAX XDB C-18 column (5 μ m，9· 4X 250讓)；体积百分比为70%的甲醇水溶液为流动相，流速为2. Oml/min ；检测波长为2Mnm。
收集保留时间为38. 1-39. 6min的洗脱液，用旋转蒸发仪蒸干，得到活性组分乙 (每毫升步骤一得到的发酵液中含有1. 92mg活性组分乙)。收集保留时间为39.9_40.6min的洗脱液，用旋转蒸发仪蒸干，得到活性组分丙 (每毫升步骤一得到的发酵液中含有1. 77mg活性组分丙)。三、有效成分的鉴定1、外观活性组份甲、活性组分乙和活性组分丙均为无定形桔红色粉末。2、溶解性活性组份甲、活性组分乙和活性组分丙均易溶于甲醇、丙酮、氯仿，不溶于水。3、质谱活性组份甲的质谱图见图4A。ESI-MS质谱检测其[M+H]+为1271. 3，与文献报道放线菌素\0的分子离子峰一致。活性组分乙的质谱图见图4B。ESI-MS质谱检测其[M+H]+为U69. 1，[M+Na]+为 1291.1。与文献报道放线菌素X2的分子离子峰一致。活性组分丙的质谱图见图4C。ESI-MS质谱检测其[M+H]+为1255. 1，[M+Na]+为 1277.1。与文献报道放线菌素D的分子离子峰一致。4、紫外光谱紫外光谱测试仪器为Mariner System 5304instrument。活性组份甲的紫外光谱图见图5A，在238和444. Onm处有最大吸收峰。活性组份乙的紫外光谱图见图5B，在239和445. Onm处有最大吸收峰。活性组份丙的紫外光谱图见图5C，在240和444. Onm处有最大吸收峰。5、核磁信号归属核磁图谱测试仪器为Varian Inova 600MHz，所用溶剂为氘代丙酮(aCet0ne-d6)。 活性组份甲、活性组份乙和活性组份丙的碳信号归属如表1和图6所示。与文献报道一致。表1活性组份甲、活性组份乙和活性组份丙的碳信号归属
位置13C NMR 位移(ppm)a—ringb-ring活性组份甲活性组份乙活性组份丙活性组份甲活性组份乙活性组份丙
权利要求
1.链霉菌(Sti^ptomycessp. )MS449，它的保藏编号为 CGMCC No. 5452。
2.权利要求1所述链霉菌MS449在生产放线菌素中的应用。
3.如权利要求2所述的应用，其特征在于所述放线菌素为放线菌素&、放线菌素D和放线菌素\0中的至少一种。
4.用于培养权利要求1所述链霉菌MS449的培养基，是通过如下方法制备得到的培养基将 20-30g 可溶性淀粉、0. 2-0. 6g L-天冬酰胺、0. 5-1. Og ΚΝ03、0· 2-0. 6gK2HP04 · H2O, 0. 2-0. 6g NaCl 和 0. 2-1. Og MgSO4 · 7H20 用水定容至 1L。
5.用于培养权利要求1所述链霉菌MS449的培养基，是通过如下方法制备得到的培养基将5-15g葡萄糖、10-30g稷粉、10-30g棉籽蛋白粉和10-30g 3_(N_吗啉基)丙磺酸用水定容至1L。
6.一种制备放线菌素的方法，是发酵权利要求1所述链霉菌MS449，得到放线菌素。
7.如权利要求6所述的方法，其特征在于所述发酵的条件为25-30°C、140-200rpm、 6-20 天。
8.如权利要求6或7所述的方法，其特征在于所述方法包括如下步骤将权利要求1 所述链霉菌MS449的种子液接种至权利要求5所述培养基中发酵并收获发酵液。
9.如权利要求8所述的方法，其特征在于所述种子液的制备方法如下将权利要求1 所述链霉菌MS449接种于权利要求4所述培养基中，25-300C、140-200rpm培养2_6天，得到种子液。
10.如权利要求8或9所述的方法，其特征在于所述方法还包括如下步骤(1)将所述发酵液离心，分别收集上清液和沉淀；(2)将步骤(1)获得的沉淀用丙酮浸提，离心并收集上清液；(3)将步骤(1)的上清液和步骤O)的上清液合并，即为放线菌素粗提液；(4)将所述放线菌素粗提液上样于HP-20大孔吸附树脂，依次用体积百分比为40%、 60%和80%的丙酮水溶液洗脱，依次收集用60%和80%丙酮水溶液洗脱得到的过柱后洗脱液，依次命名为洗脱液乙和洗脱液丙；(5)将所述洗脱液乙蒸干并用丙酮重新溶解，过滤后进行反相HPLC；反相HPLC参数 采用Agilent ZORBAX XDB C-18 column ；流动相为体积百分比为60%的甲醇水溶液，流速为2. Oml/min ；收集保留时间为29. 2-29. 9min的过柱后洗脱液，得到放线菌素Xoe ；将所述洗脱液丙蒸干用丙酮重新溶解，过滤后进行反相HPLC ；反相HPLC参数采用 Agilent ZORBAX XDB C-18 column ；流动相为体积百分比为70 %的甲醇水溶液，流速为 2. Oml/min ；收集保留时间为38. 1-39. 6min的过柱后洗脱液，得到放线菌素X2 ；收集保留时间为39. 9-40. 7min的过柱后洗脱液，得到放线菌素D。
全文摘要
本发明公开了一株链霉菌及其在生产放线菌素中的应用。本发明提供的菌株为链霉菌MS449，它的保藏编号为CGMCC No.5452。本发明提供的链霉菌MS449在没有经过任何培养基及发酵条件优化的前提下，其放线菌素X2，放线菌素D和放线菌素X0β的产量分别可达1.92、1.77和0.15mg/ml，均高于目前已见报道的放线菌素生产菌株的产量。本发明所提供的生产放线菌素的方法是发酵链霉菌MS449，发酵稳定、化合物分离工艺简便、产率高。本发明提供的菌株具有很好的工业化潜力和前景。
文档编号C12P21/02GK102391967SQ20111036603
公开日2012年3月28日 申请日期2011年11月17日 优先权日2011年11月17日
发明者代焕琴, 余珂, 傅成章, 刘雪婷, 宋福行, 张立新, 杨娜, 王倩, 谢峰, 郭徽, 陈彩霞 申请人:中国科学院微生物研究所