高价值化学产品的微生物生产，以及相关的组合物、方法和系统的制作方法

专利名称：高价值化学产品的微生物生产，以及相关的组合物、方法和系统的制作方法
技术领域：
本发明涉及代谢工程微生物，例如细菌菌株，其中存在增多的丙二酰辅酶A利用，用于生产化学产品，其可以包括聚酮化合物化学品。另外，可以对微生物中的生物合成途径进行遗传修饰，以提供一种或多种化学产品，例如聚酮化合物。
序列表本申请包含序列表，该序列表以ASCII格式通过EFS-Web提交，并且特此全文并入作为参考。在2011年I月27日创建的所述ASCII拷贝被命名为0PXX20111，大小是2，236，123 字节。
背景技术：
随着人们越来越认同石油烃供给正在下降且其成本最终增加，对发展和改善用于生产化学品和燃料的工业微生物系统的兴趣增大。此类工业微生物系统可以完全或部分地代替石油烃在生产某些化学品中的应用。众多化学品通过此类手段生产，范围从抗生素和抗疟疾药物产品到精细化学品再到燃料例如乙醇。微生物发酵的商业目标包括目标化学产品的滴度、生产速率和产率的提高。当发酵事件中的总体比生产率提高时，除了积极地影响生产速率和其他经济因素例如资本成本以外，还可以积极地影响产率。这种生产的一种候选化学品是3-羟基丙酸(“3-HP”，CAS号503_66_2)，它可以转化成用于在范围广泛的工业和消费产品中使用的聚合物的许多基本结构单元。遗憾的是，以前通过微生物合成3-HP以达到商业上可行的滴度的努力已揭示，使用的微生物被远低于确定的商业上可行的滴度的3-HP浓度所抑制。其他目的化学品包括在一个或多个酶转化步骤中以丙二酰辅酶A作为底物的各种化学品。尽管对通过提高某些化学产品的产率和/或生产率来改进微生物发酵经济学有强烈的兴趣，但仍然存在对提高净转化的需求，这可以根据使用商业上可行的发酵方法，由发酵性微生物细胞在发酵生产运行各时期内或整个发酵生产运行期内生产所需目标化学产品的产率进行量化。此外，仍待解决的相关问题有如何改善修饰的微生物的比生产率和容积生产率，例如改善到经济学上重要的水平，这样的微生物适合于生产在微生物生产化学产品的途径中以丙二酰辅酶A作为底物的化学产品，例如但不限于各种聚酮化合物化学
女口
广叩ο

发明内容
根据一个实施方案，本发明涉及一种生产化学产品例如聚酮化合物的方法，所述方法包括i)将碳源与微生物细胞培养物组合，以生产此类化学产品，其中a)所述细胞培养物包含脂肪酸合成酶抑制剂，或者所述微生物经过遗传修饰降低了生物的脂肪酸合成酶途径中的酶活性，从而提供减少的丙二酰辅酶A向脂肪酸的转化；且13)其中所述化学产品是 由所述微生物通过从丙二酰辅酶A到聚酮化合物化学产品的代谢途径所产生的聚酮化合物。这可以包括这样的实施方案，其中所述微生物经过遗传修饰提高了生物的化学产品生物合成途径中的酶活性，该途径包括作为中间体(即，在一个生物合成酶促转化步骤中作为底物)的丙二酰辅酶A。在另一个实施方案中，本发明涉及一种生产化学产品例如聚酮化合物的方法，所述方法包括i)将碳源与微生物细胞培养物组合，以生产此类化学产品，其中a)所述细胞培养物包含脂肪酸合成酶抑制剂，或者所述微生物经过遗传修饰降低了生物的脂肪酸合成酶途径中的酶活性，从而提供减少的丙二酰辅酶A向脂肪酸的转化；且幻其中所述化学产品是由所述微生物通过遗传修饰引入从丙二酰辅酶A到该化学产品的代谢途径而产生的。在一些这样的实施方案中，化学产品不是3-羟基丙酸或由其制备的基于丙烯酸的消费产品。在各方面，碳源具有约1.0X 10_14或更大的碳-14/碳-12比率。另外，对于任一上述实施方案，碳源主要是葡萄糖、蔗糖、果糖、右旋糖、乳糖、其组合，或其中所述碳源是小于50%的甘油。另外，在以上方法的各种实施方案中，微生物经过遗传修饰提高了从丙二酰辅酶A到化学产品的一个或多个酶转化步骤的酶活性，而在一些这样的实施方案中，将至少一种多核苷酸提供到微生物细胞中，该多核苷酸编码的多肽催化沿代谢途径的转化步骤。在一些上述实施方案中，细胞培养物包含脂肪酸合成酶抑制剂，或者所述微生物经过遗传修饰降低了生物的脂肪酸合成酶途径中的酶活性。在后者的一些实施方案中，脂肪酸合成酶抑制剂选自硫乳霉素、三氯生、浅蓝菌素、噻吩并重氮烃基硼(thienodiazaborine)、异烟肼及其类似物。在以上方法的各种实施方案中，化学产品选自四环素、红霉素、除虫菌素、大环内酯类、万古霉素组抗生素和II型聚酮化合物。另外，在其中所述化学产品是聚酮化合物的上述方法的各种实施方案中，此类化学产品选自表1B。在上述方法的各种实施方案中——其中所述化学产品是由所述微生物通过遗传修饰引入从丙二酰辅酶A到该化学产品的代谢途径而产生的，化学产品选自表1C。此外，根据任一以上实施方案制备的重组微生物是本发明的一个方面。另外,在各种实施方案中，提供一种用于根据任一以上实施方案生产选定的化学产品的系统，所述系统包含适合微生物细胞培养的发酵罐；用于将发酵罐的内容物排出到提取和/或分离容器中的管线；和适合从细胞培养废物中移取化学产品的提取和/或分离容器。该系统可以生产各种量的化学产品，包括但不限于在发酵罐中每个发酵事件至少
10、至少100或至少1，000千克化学产品。
在各种实施方案中，提供遗传修饰的微生物。这样的微生物包含至少一个提高聚酮化合物生产的遗传修饰，并且能够以选自大于O. 05g/gDCW-hr、0. 08g/gDCW_hr、大于 O. lg/gDCW-hr、大于 O. 13g/gDCW_hr、大于 O. 15g/gDCW_hr、大于 O. 175g/gDCW_hr、大于O. 2g/gDCW-hr、大于 O. 25g/gDCW_hr、大于 O. 3g/gDCW_hr、大于 O. 35g/gDCW_hr、大于 O. 4g/gDCW-hr、大于O. 45g/gDCff-hr或大于O. 5g/gDCff-hr的速率的比速率生产。此外，这样的微生物可以包含一个或多个遗传修饰，用以提高乙酰辅酶A羧化酶活性，并降低烯酰-ACP还原酶活性、乳酸脱氢酶活性和乙酰磷酸转移酶活性；提高乙酰辅酶A羧化酶活性，并降低烯酰-ACP还原酶活性、乳酸脱氢酶活性和乙酸激酶活性；提高乙酰辅酶A羧化酶活性，并降低烯酰-ACP还原酶活性、乳酸脱氢酶活性、乙酸激酶活性和乙酰磷酸转移酶活性；提高乙酰辅酶A羧化酶活性，并降低烯酰-ACP还原酶活性、乳酸脱氢酶活性和丙酮酸甲酸裂解酶活性；提高乙酰辅酶A羧化酶活性，并降低烯酰-ACP还原酶活性、乳酸脱氢酶活性和丙酮酸氧化酶活性；提高乙酰辅酶A羧化酶活性，并降低烯酰-ACP还原酶活性、乳酸脱氢酶活性和丙酮酸氧化酶活性；提高乙酰辅酶A羧化酶活性，并降低烯酰-ACP还原酶活性、乳酸脱氢酶活性和甲基乙二醛合成酶活性；提高乙酰辅酶A羧化酶活性、β-酮 脂酰-ACP合成酶活性、乳酸脱氢酶活性、甲基乙二醛合成酶活性中的一种或多种；和/或提高乙酰辅酶A羧化酶活性并降低烯酰-ACP还原酶活性、鸟苷3' - 二磷酸5'-三磷酸合成酶活性和鸟苷3' -二磷酸5' -二磷酸合成酶活性。此外，包含这些遗传修饰的任意微生物可以包含额外的提高NADH (烟酰胺腺嘌呤二核苷酸)/NADPH (烟酰胺腺嘌呤二核苷磷酸)转氢酶活性的遗传修饰，例如通过提供和/或提高可溶性转氢酶和/或膜结合的转氢酶的活性。任意此类微生物可以额外包含提高一种或多种以下活性的遗传修饰氰酸酶；碳酸酐酶；和丙酮酸脱氢酶。本发明也涉及遗传修饰的微生物，其包含3-ΗΡ致耐受性复合物(3HPTGC)复合物的一种或多种成分，其中所述3-羟基丙酸耐受性的提高是通过分别向3HPTGC的A组和B组提供至少一个遗传修饰而造成的。这样的微生物可以额外包含一个或多个3HPTGC阻遏基因的破坏，并且在一些这样的实施方案中，这些阻遏基因选自tyrR、trpR、metJ、purR、lysR、nrdR及其同系物。另外，在本发明的各种实施方案中，达到的容积生产率可以是O. 25g聚酮化合物(或其他化学产品)/升/小时(g (化学产品)/L-hr)，可以大于O. 25g聚酮化合物(或其他化学产品)/L_hr，可以大于O. 50g聚酮化合物(或其他化学产品)/L-hr，可以大于I. Og聚酮化合物(或其他化学产品)/L_hr，可以大于1.50g聚酮化合物(或其他化学产品)/L-hr，可以大于2. Og聚酮化合物(或其他化学产品)/L-hr，可以大于2. 50g聚酮化合物(或其他化学产品)/L-hr，可以大于3. Og聚酮化合物(或其他化学产品)/L-hr，可以大于3. 50g聚酮化合物(或其他化学产品)/L_hr，可以大于4. Og聚酮化合物(或其他化学产品)/L-hr，可以大于4. 50g聚酮化合物(或其他化学产品)/L-hr，可以大于5. Og聚酮化合物(或其他化学产品)/L-hr，可以大于5. 50g聚酮化合物(或其他化学产品)/L-hr，可以大于6. Og聚酮化合物(或其他化学产品)/L_hr，可以大于6. 50g聚酮化合物(或其他化学产品)/L-hr，可以大于7. Og聚酮化合物(或其他化学产品)/L-hr，可以大于7. 50g聚酮化合物(或其他化学产品)/L-hr，可以大于8. Og聚酮化合物(或其他化学产品)/L-hr,可以大于8. 50g聚酮化合物(或其他化学产品)/L_hr，可以大于9. Og聚酮化合物(或其他化学产品)/L-hr，可以大于9. 50g聚酮化合物(或其他化学产品)/L-hr，或可以大于10. Og聚酮化合物(或其他化学产品)/L-hr。本文提供的权利要求涉及包括图和表在内的说明书中描述的特定方面、特征和组合。但是，说明书也公开了与生产3-羟基丙酸(3-HP)、丙烯酸和由其制备的其他化学品以及基于丙烯酸的消费产品相关的各种教导。以下段落主要但不仅涉及后者。本发明的微生物可以通过引入编码具有单功能或双功能丙二酰辅酶A还原酶活性多肽的异源核酸序列而进行遗传修饰，以提高生物的丙二酰辅酶A还原酶(mcr)途径中的酶活性。在各种实施方案中，丙二酰辅酶A还原酶是不依赖NADPH的。在各种实施方案中，根据本发明生产3-羟基丙酸，比生产率大于O. 05克/克微生物细胞(基于干重)/小时，或容积生产率大于O. 05克/升/小时。本发明包括这样的实施方案，其中细胞培养物包含遗传修饰的微生物。遗传修饰的微生物可以针对某个性状而被修饰，该性状选自降低的生物脂肪酸合成酶途径中的酶活 性、提高的生物丙二酰辅酶A还原酶途径中的酶活性、提高的3-羟基丙酸耐受性、提高的生物NADPH依赖性转氢酶途径中的酶活性、提高的胞内碳酸氢盐水平、提高的生物乙酰辅酶A羧化酶途径中的酶活性，及其组合。例如，可以对遗传修饰的微生物进行修饰，以降低生物的脂肪酸合成酶途径中的酶活性。或者，降低的酶活性是选自β -酮脂酰-ACP还原酶、3-羟酰-辅酶A脱水酶、烯酰-ACP还原酶和硫酯酶的酶的酶活性的降低。在各方面，通过引入异源核酸序列而发生生物的脂肪酸合成酶途径中的酶活性的降低，该异源核酸序列编码可操作地连接到编码脂肪酸合成酶途径中的酶或其同系物的序列上的诱导型启动子，或者该异源核酸序列编码具有降低的活性的脂肪酸合成酶途径中的酶或其同系物。在各方面，月旨肪酸合成酶途径中的酶或其同系物是具有温度敏感性β -酮脂酰-ACP还原酶或温度敏感性烯酰-ACP还原酶活性的多肽。在其它方面对遗传修饰的微生物进行修饰，以提高生物的丙二酰辅酶A还原酶途径中的酶活性。在某些实施方案中，通过引入异源核酸序列而发生丙二酰辅酶A还原酶(mcr)途径中酶活性的提高，该异源核酸序列编码具有双功能丙二酰辅酶A还原酶的酶活性或单功能丙二酰辅酶A还原酶活性的多肽。该异源核酸序列可以选自与选自SEQ ID NO. 783-791的序列具有至少70%同一性的序列。在各种实施方案中，对遗传修饰的微生物进行修饰，以提高对3-羟基丙酸的耐受性。3-羟基丙酸耐受性的提高可以在3-HP致耐受性复合物(3HPTGC)复合物的一种或多种成分中发生，或者其中所述3-羟基丙酸耐受性的提高是通过分别向3HPTGC的A组和B组提供至少一个遗传修饰而造成的。所述一种或多种成分可以选自CynS、CynT、AroG、SpeD、SpeE, SpeF, ThrA, Asd、CysM、IroK、IlvA及其同系物。在各种实施方案中，修饰是一个或多个3HPTGC阻遏基因的破坏。阻遏基因可以选自tyrR、trpR、metJ、purR、lysR、nrdR及其同系物。可以通过引入编码与选自SEQ ID NO. 780或782的序列具有至少70%同一性的多肽的异源核酸序列而发生生物的NADPH依赖性转氢酶途径中酶活性的提高。在各种实施方案中，通过引入编码具有氰酸酶和/或碳酸酐酶活性的多肽的异源核酸序列而发生胞内碳酸氢盐水平的提高。异源核酸序列可以选自与选自SEQ ID NO. 337的序列具有至少70%同一性的序列。
在各种实施方案中，通过引入编码与选自SEQ ID NO. 772、774、776和778的序列具有至少70%同一性的多肽的异源核酸序列而发生生物的乙酰辅酶A羧化酶途径中酶活性的提闻。遗传修饰的细菌可以进一步修饰，以降低乳酸脱氢酶、磷酸乙酰基转移酶、丙酮酸氧化酶或丙酮酸-甲酸裂解酶及其组合的活性。根据本发明的方法可以进一步包括通过在叔胺的存在下从所述培养物提取3-羟基丙酸而从所述细胞培养物中分离和/或纯化3-羟基丙酸。在其它方面，以大于O. 05克/克微生物细胞(基于干重)/小时的比生产率或大于O. 50克/升/小时的容积生产率生产3-羟基丙酸。本发明的方法可以包括诸如尿布、地毯、涂料、粘合剂和丙烯酸玻璃等消费产品的生产。本发明包括生物生产的3-羟基丙酸，其中3-羟基丙酸是根据本发明的方法生产的。这样的3-羟基丙酸可以基本不含化学催化剂，包括基于钥和/或钒的催化剂。根据本发明 的方法生产的3-羟基丙酸可以具有约1.0X 10_14或更大的碳-14/碳-12比率。在各方面，3-羟基丙酸包含小于约10%的源自石油的碳。另外，根据本发明的3-羟基丙酸可以包含与其生产方法相关的残留量的有机材料。在各种实施方案中，3-羟基丙酸包含残留量的有机材料，其量在3-轻基丙酸的Ippm(百万分之一)到IOOOppm之间。本发明的范围内包括遗传修饰的微生物，其中该微生物能够以选自大于O. 05g/gDCW-hr、O. 08g/gDCW-hr、大于 O. lg/gDCW-hr、大于 O. 13g/gDCW_hr、大于 O. 15g/gDCW_hr、大于 O. 175g/gDCW-hr、大于 O. 2g/gDCW_hr、大于 O. 25g/gDCW_hr、大于 O. 3g/gDCW_hr、大于O. 35g/gDCW-hr、大于 O. 4g/gDCW_hr、大于 O. 45g/gDCW_hr 或大于 O. 5g/gDCW_hr 的速率的比速率生产3-羟基丙酸酯。遗传修饰的微生物可以包含提高丙二酰辅酶A还原酶活性和乙酰辅酶A羧化酶活性的遗传修饰，以及降低烯酰-ACP还原酶活性、乳酸脱氢酶活性和乙酸激酶活性的遗传修饰。在其它方面，微生物包含提高丙二酰辅酶A还原酶活性和乙酰辅酶A羧化酶活性的遗传修饰，以及降低烯酰-ACP还原酶活性、乳酸脱氢酶活性和乙酰磷酸转移酶活性的遗传修饰。另外，微生物可以包含提高丙二酰辅酶A还原酶活性和乙酰辅酶A羧化酶活性的遗传修饰，以及降低烯酰-ACP还原酶活性、乳酸脱氢酶活性、乙酸激酶活性和乙酰磷酸转移酶活性的遗传修饰。在各方面，微生物包含提高丙二酰辅酶A还原酶活性和乙酰辅酶A羧化酶活性的遗传修饰，以及降低烯酰-ACP还原酶活性、乳酸脱氢酶活性和丙酮酸甲酸裂解酶活性的遗传修饰。在各种实施方案中，微生物包含提高丙二酰辅酶A还原酶活性和乙酰辅酶A羧化酶活性的遗传修饰，以及降低烯酰-ACP还原酶活性、乳酸脱氢酶活性和丙酮酸氧化酶活性的遗传修饰。也包括这样的微生物，它包含提高丙二酰辅酶A还原酶活性和乙酰辅酶A羧化酶活性的遗传修饰，以及降低烯酰-ACP还原酶活性、乳酸脱氢酶活性和甲基乙二醛合成酶活性的遗传修饰。另外，根据本发明的微生物可以包含提高丙二酰辅酶A还原酶活性和乙酰辅酶A羧化酶活性的遗传修饰，以及提高β -酮脂酰-ACP合成酶活性并降低乳酸脱氢酶活性和甲基乙二醛合成酶活性的遗传修饰，和/或该微生物可以包含提高丙二酰辅酶A还原酶活性和乙酰辅酶A羧化酶活性的遗传修饰，以及降低烯酰-ACP还原酶活性、鸟苷3' - 二磷酸5'-三磷酸合成酶活性和鸟苷3' - 二磷酸5' -二磷酸合成酶活性的遗传修饰。另外，在一些微生物中，作为降低烯酰-ACP还原酶活性的替代或补充，降低烯酰辅酶A还原酶活性。在各种实施方案中，已经进行了提高NADH/NADPH转氢酶活性的进一步的遗传修饰。例如，转氢酶活性可以是可溶的，可以是膜结合的，可以具有已进行的提高氰酸酶活性的进一步的遗传修饰，可以包括提高碳酸酐酶活性的进一步的遗传修饰，和/或可以包括提高丙酮酸脱氢酶活性的进一步的遗传修饰。在各种实施方案中，已经进行了降低鸟苷3' - 二磷酸5'-三磷酸合成酶活性和鸟苷3' - 二磷酸5' -二磷酸合成酶活性的进一步的遗传修饰。也包括已经进行的在通气环境中提高NADH/NAD+比率的遗传修饰。此外，可以进行降低β _酮脂酰-ACP合成酶活性、降低3-羟基丙酸还原酶活性、降低NAD+依赖的3-羟基丙酸脱氢酶活性、降低NAD+依赖的 3-羟基丙酸脱氢酶活性、提高对3-羟基丙酸的耐受性、提高3-ΗΡ致耐受性复合物中的任意酶的活性、提高丙酮酸脱氢酶活性、提高氰酸酶活性、提高碳酸酐酶活性、提高天冬氨酸激酶活性、提高苏氨酸脱水酶活性、提高2-脱氢-3-脱氧磷酸庚糖酸醛缩酶活性、提高半胱氨酸合成酶活性、提高核糖-磷酸二磷酸激酶活性、提高核糖核苷-二磷酸还原酶活性、提高L-半胱氨酸脱巯基酶活性、提高赖氨酸脱羧酶活性、提高高半胱氨酸转甲基酶活性、提高二氢叶酸还原酶活性、提高N-乙酰基谷氨酰磷酸还原酶活性、提高乙酰谷氨酸激酶活性、提高精氨基琥珀酸裂解酶活性、提高乙酰鸟氨酸脱酰酶活性、提高分支酸变位酶活性、提高预苯酸脱水酶活性、提高预苯酸脱氢酶活性、提高2-脱氢-3-脱氧磷酸庚糖酸醛缩酶活性和/或提高D-3-磷酸甘油酸脱氢酶活性的遗传修饰。在各种实施方案中，本发明包括一种培养系统，其包含水性培养基中的碳源和根据任一权利要求或上述实施方案所述的遗传修饰的微生物，其中所述遗传修饰的生物以选自大于 O. 05gDCW/L、0. lgDCW/L、大于 lgDCW/L、大于 5gDCW/L、大于 10gDCW/L、大于 15gDCW/L或大于20gDCW/L的量存在，例如当水性培养基的体积选自大于5mL、大于IOOmU大于O. 5L、大于1L、大于2L、大于10L、大于250L、大于1000L、大于10，000L、大于50，000L、大于100，000L或大于200，000L时，以及例如当水性培养基的体积大于250L且包含在钢制容器内时。在其它方面，此类培养系统的碳源选自右旋糖、蔗糖、戊糖、多元醇、己糖、己糖+戊糖，及其组合，水性培养基的PH小于7. 5，例如以选自i)大于5mm0l/L-hr的氧气且小于200mmol/L-hr的氧气；ii)大于5mmol/L_hr的氧气且小于100mmol/L_hr的氧气；iii)大于5mmol/L_hr的氧气且小于80mmol/L_hr的氧气；和iv)大于5mmol/L_hr的氧气且小于50mmol/L-hr的氧气的氧输送率,对该培养系统通气。在各种实施方案中，本发明是从根据各种所述实施方案的培养系统获得的水性培养液，其中所述水性培养液包含i) 3-羟基丙酸酯，其浓度选自大于5g/L、大于10g/L、大于15g/L、大于 20g/L、大于 25g/L、大于 30g/L、大于 35g/L、大于 40g/L、大于 50g/L、大于 60g/L、大于70g/L、大于80g/L、大于90g/L或大于100g/L的3-羟基丙酸酯；和ii) 1，3-丙二醇，其浓度选自小于30g/L、小于20g/L、小于10g/L、小于5g/L、小于lg/L或小于0. 5g/L。在一些方面，水性培养液包含一定量的生物质(biomass)，其量选自小于20gDCW/L的生物质、小于15gDCW/L的生物质、小于10gDCW/L的生物质、小于5gDCW/L的生物质或小于lgDCW/L的生物质。或者，根据本发明的水性培养液是这样的，使得3-HP/琥珀酸酯比率(g 3-HP/g琥拍酸酯)大于3、大于10、大于30、大于60、大于100、大于150或大于200。在各方面，3-HP/富马酸酯比率(g 3-HP/g富马酸酯)大于3、大于10、大于30、大于60、大于100、大于150或大于200，或3-HP/甘油比率(g 3-HP/g甘油)大于3、大于10、大于30、大于60、大于100、大于150或大于200，或3-HP/乙酸酯比率(g 3-HP/g乙酸酯)大于I. 5、大于3、大于10、大于30、大于60、大于100、大于150或大于200，或3-HP/丙氨酸比率(g 3-HP/g丙氨酸)大于3、大于10、大于30、大于60、大于100、大于150或大于200,或3_ΗΡ/ β -丙氨酸比率(g 3-HP/g β -丙氨酸)大于I. 5、大于3、大于10、大于30、大于60、大于100、大于150或大于200，或3-ΗΡ/谷氨酸比率(g 3-HP/g谷氨酸)大于3、大于10、大于30、大于60、大于100、大于150或大于200，或3-HP/谷氨酰胺比率(g 3-HP/g谷氨酰胺)大于3、大于10、大于30、大于60、大于100、大于150或大于200，或3-HP/3-羟基丙醛比率(g 3-HP/g 3-轻基丙醒)大于I. 5、大于3、大于10、大于30、大于60、大于100、大于150或大于200,或3-ΗΡ/1，3-丙二醇比率(g 3-HP/g 1，3-丙二醇)大于I. 5、大于3、大于10、大于30、大于60、大于100、大于150或大于200，和/或3-HP/乳酸酯比率(g 3-HP/g乳酸酯)大于
3、大于10、大于30、大于60、大于100、大于150或大于200。


本发明的新特征在权利要求书中具体阐述。通过参考阐述了利用本发明原理的说明性实施方案的以下详述及附图，将获得对本发明的特征和优点的更佳理解，在附图中图I描述了与本发明的方面相关、更具体地与3-HP的生产相关的微生物的代谢途径，在某些酶促步骤显示了大肠杆菌(E.coli)的基因名称，后者作为举例而并不意味着限制。图2A描述了与本发明的方面相关的微生物的代谢途径，在某些酶促步骤显示了大肠杆菌的基因名称，后者作为举例而并不意味着限制。图2B提供了脂肪酸合成酶系统的典型酶转化和示例性大肠杆菌基因的更详细描述，该系统在图2A中更概要地描述。图3提供了示例性的多序列比对，对比了碳酸酐酶多肽(碳酸酐酶多肽的CLUSTAL
2.O. 12多序列比对)。图4A提供了示例性的序列比对fablts (JPl 111 (SEQ ID NO :769))和野生型(BW25113(SEQ ID NO :827))大肠杆菌fabl基因DNA突变C722T的DNA序列的对比。图4B提供了示例性的序列比对fabIts (JP1111 (SEQ ID NO :770)和野生型(BW25113(SEQ ID NO :828))大肠杆菌fabl基因氨基酸-S241F的蛋白质序列的对比。图5、6和7提供来自实施例11的数据和结果。图8描述了具有多个与本发明的方面相关、更具体地与3-HP生产相关的遗传修饰的微生物的代谢途径，在某些酶促步骤显示大肠杆菌的基因名称，后者作为举例而并不意味着限制。对于生产3-HP以外的化学产品的实施方案，可以提供和使用这些遗传修饰的各种组合。图9A第1-7幅是代谢途径的部分的多图描述，显示了在大肠杆菌中共同构成3-HP致耐受性复合物(3HPTGC)的途径产物和酶。第I幅提供了余下各幅的排列的总体示意描述。图9B第1-7幅提供了枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)的3HPTGC的多图描述。第I幅提供了余下各幅的排列的总体示意描述。图9C 第 1-7 幅提供了酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)的 3HPTGC 的多图描述。第I幅提供了余下各幅的排列的总体示意描述。图9D第1-7幅提供了钩虫贪铜菌(Cupriavidus necator)(以前称为真氧产碱杆菌(Ralstonia eutropha))的3HPTGC的多图描述。第I幅提供了余下各幅的排列的总体示意描述。图10提供了甘氨酸裂解途径的图示。图11提供了从葡萄糖到丙酮酸再到乙酰辅酶A再到丙二酰辅酶A再到3-HP的已知3-HP生产途径的概述，来自现有技术参考文献。图12提供了从葡萄糖到磷酸烯醇丙酮酸(PEP)再到草酰乙酸(直接或通过丙酮酸)再到天冬氨酸再到丙氨酸再到丙二酸半醛再到3-HP的已知3-HP生产途径的概述， 来自现有技术参考文献。图13提供了来自现有技术参考文献的已知3-ΗΡ生产途径的概述。图14Α和14Β提供了大肠杆菌中的天然混合发酵途径的示意图。图15Α至150提供了对照微生物对3-ΗΡ的反应的图形数据，而图15Ρ提供了与3HPTGC的一个遗传修饰的对比。图16Α描述了由来自结核分枝杆菌(M. tuberculosis)的kgd基因编码的α-酮戊二酸催化的已知化学反应，而图16Β描述了新的酶功能，即草酰乙酸脱羧为丙二酸半醛，这是通过kgd基因的修饰而实现的。图17概述了提出的选择方法的生化基础。图18显示了对kgd突变体提出的选择方法。图19A至19C显示了与图18中描述的所提出的选择方法相关的筛选方案。图20提供了关于IroK肽序列的对比。图21提供了用HPLC进行的3-HP的校正曲线。图22提供了为GC/MS进行的3-HP的校正曲线。图23提供了用于3-HP的酶分析的典型的标准曲线。图24A、B和C以及图25A和B显示了将生物质转化成成品例如尿布的整个过程的
示意图。表格也在本文中提供，并且是说明书的一部分。
具体实施例方式本发明涉及可用于发酵生产多种化学产品的多种生产方法和/或遗传修饰的微生物，在容器中利用这些微生物群体制备此类化学产品的方法，以及使用这些微生物和方法进行化学生产的系统。本发明的益处包括提高此类微生物在发酵事件或循环期间生产化学产品的比生产率。本发明提供了生产技术和/或遗传修饰的微生物，用以利用一种或多种调节从丙二酰辅酶A到脂肪酰分子(此后其可以转化成脂肪酸，例如脂肪酰-ACP分子)的转化的手段生产所需化学产品，例如聚酮化合物，其中该生产途径包含使用丙二酰辅酶A作为底物的酶促转化步骤。调节丙二酰辅酶A向脂肪酰分子例如脂肪酰-ACP分子的转化的手段有效地平衡了向微生物生物质的碳流动和向化学产品的碳流动，并且令人吃惊地提高了比生产率。如共同发明人在另一个专利申请中所述的，一种化学产品可以是3-羟基丙酸(CAS No. 503-66-2，“3-HP”)。3-HP的生产可以在本文中用来证明本发明的特征，这些特征可以应用于其他化学产品。至于特定的聚酮化合物化学产品，它们包括但不限于四环素；红霉素；除虫菌素；万古霉素相关的抗生素；以及通常为II型的聚酮化合物。可以通过本发明制备的另一组化学产品是大环内酯类。其他特定的聚酮化合物化学产品包括1，3，6，8-四羟基萘(THN)或其衍生物淡黄霉素(CAS No. 479-05-0)。其他聚酮化合物及其他化学产品包括表IB和IC中的那些。
它们中的任一种可以在本文中描述为选定的化学产品或目的化学产品。另外，以上列表的任意分组，包括任意亚组，可以被认为是“选定的化学产品”、“目的化学产品”等所指的。对于这些化学产品中的任一种，微生物可能固有地包含此类化学产品的生物合成途 径，和/或可能需要添加一个或多个异源核酸序列，以提供或完成这样的生物合成途径，从而达到该化学产品的期望的生产。如本文所述，本发明的各方面涉及包含从丙二酰辅酶A到目的化学产品的代谢途径的微生物细胞，例如上面描述的那些，并且也提供了调节丙二酰辅酶A向脂肪酰分子(此后其可以转化成脂肪酸)转化的手段。然后，当调节手段进行调节以降低这样的转化时，按比例更大数量的丙二酰辅酶A分子I)被产生和/或2)通过从丙二酰辅酶A到化学产品的代谢途径被转化。在各种实施方案中，可以进行额外的遗传修饰，以例如I)提高胞内碳酸氢盐水平，例如通过增加碳酸酐酶，2)提高乙酰辅酶A羧化酶和NADPH依赖的转氢酶的酶活性。遗传修饰的微生物群体的比生产率的出乎意料地提高可以通过以下方法和系统实现，其中微生物具有从丙二酰辅酶A到选定的化学产品的微生物生产途径，以及微生物脂肪酸合成酶系统的选定酶(更加具体地，其脂肪酸延伸酶)酶活性的降低。在各种实施方案中，也可以对包含这种微生物群体的生物反应器容器提供特定补充物，以进一步改善该方法和系统。在本文中对各种实施方案公开了其他另外的遗传修饰。另外如本文所述，本发明的各方面涉及包含从丙二酰辅酶A到3-HP的代谢途径的微生物细胞，并且也提供了调节丙二酰辅酶A向脂肪酰分子(此后其可以转化成脂肪酸)转化的手段。然后，当调节手段进行调节以降低这种转化时，按比例更大数量的丙二酰辅酶A分子I)被产生和/或2)通过从丙二酰辅酶A到3-HP的代谢途径被转化。在各种实施方案中，可以进行额外的遗传修饰，以例如I)提高胞内碳酸氢盐水平，例如通过增加碳酸酐酶，2)提高乙酰辅酶A羧化酶和NADPH依赖的转氢酶的酶活性。此外，对于一种化学产品3-羟基丙酸(3-HP)，提供了对生产途径的遗传修饰，并且描述了致耐受性复合物，可以对该致耐受性复合物进行遗传修饰和/或培养系统改进，以提高微生物对3-HP的耐受性。此外，用以提高碳酸酐酶和/或氰酸酶的表达和/或酶活性的遗传修饰可以提供有利地改善3-HP生产和3-HP耐受性的双重功能。定义除非上下文另外明确指出，在说明书和权利要求书中使用的单数形式“一个”、“一种”和“该”包括复数的指示物。因此，例如，提到“表达载体”时包括一个表达载体和多个表达载体，不管是相同的(例如相同操纵子)还是不同的；提到“微生物”时包括一种微生物和多种微生物；等等。本文使用的大肠杆菌菌株的细胞干重(DCW)是基于基线DCW与0D_测量值的比率，按照测量的OD6tltl值的O. 33倍计算的。本文使用的“降低的酶活性”、“降低酶活性”等旨在表明微生物细胞的酶或分离的酶展示的活性水平低于在相同种的可比较细胞中测量的水平或其天然酶的水平。即，在该酶的已知标准条件下，从指示的底物到指示的产物的酶促转化比在标准指定条件下由天然(未修饰的)酶的相同生化转化的酶活性低了至少10%、至少20%、至少30%、至少40%、至少50%、至少60%、至少70%、至少80%或至少90%。该术语也可以包括该酶活性的消除。具有降低的某种酶的酶活性的细胞可以使用任意本领域已知的方法鉴别。例如，可以使用酶活性试验来鉴别具有降低的酶活性的细胞。参见，例如Enzyme Nomenclature,Academic Press， Inc. ，New York 2007。
本文使用的术语“异源DNA”、“异源核酸序列”等是指其中下面至少一项为真的核酸序列(a)核酸序列对于给定宿主微生物来说是外来的(即，不天然存在于其中)；(b)该序列可天然存在于给定宿主微生物中，但其数量反常(例如大于预期)；或(c)核酸序列包含两个或多个子序列，在自然界中未发现这些子序列彼此有相同联系。例如，关于情况(c)，重组产生的异源核酸序列将具有来自为了制备新功能核酸而排列的无关基因的两个或多个序列。术语“异源”包括术语“外源”，后一个术语是本领域普遍使用的。对于异源核酸序列引入前的宿主微生物基因组，编码该酶的核酸序列是异源的(无论异源核酸序列是否引入到该基因组中)。本文使用的术语“基因破坏”或其语法等同物(并且包括“破坏酶功能”、“酶功能的破坏”等)是指对微生物的遗传修饰，该遗传修饰致使编码的基因产物具有与未这样修饰的微生物细胞中的多肽活性或从中得到的多肽活性相比降低的多肽活性。遗传修饰可以是例如整个基因的缺失、转录或翻译所需的调节序列的缺失或其他修饰、得到截短的基因产物(例如酶)的基因部分的缺失，或通过降低所编码的基因产物的活性(包括达到不可检测的活性水平)的各种突变策略中的任一种。破坏可以广泛包括编码酶的核酸序列的全部或部分的缺失，并且还包括但不限于其他类型的遗传修饰，例如引入终止密码子、移码突变、引入或移除基因的一部分以及引入降解信号，这些遗传修饰影响mRNA转录水平和/或稳定性，并且改变编码酶的基因上游的启动子或阻遏物。在各种语境中，基因破坏的意思是任何导致多肽活性降低的对DNA、由DNA编码的mRNA和对应的氨基酸序列的遗传修饰。可以使用许多不同的方法来制备具有降低的多肽活性的细胞。例如，使用常见的诱变或敲除技术，可以将细胞工程化为具有破坏的调节序列或多妝编码序列。参见，例如 Methods in Yeast Genetics (1997 版)，Adams 等，Cold SpringHarbor PreSS(1998)。一种特别有用的基因破坏方法是完整基因删除，因为这减少或消除了本发明的遗传修饰微生物中遗传回复的发生。因此，对产物是酶的基因的破坏由此破坏了酶功能。或者，反义技术可以用来降低特定多肽的活性。例如，细胞可以被工程化为包含编码阻止多肽翻译的反义分子的cDNA。此外，基因沉默可以用来降低特定多肽的活性。
本文使用的术语“反义分子”包括任何含有与内源多肽的编码链相对应的序列的核酸分子或核酸类似物(例如肽核酸)。反义分子也可以具有侧翼序列(例如调节序列)。因此，反义分子可以是核酶或反义寡核苷酸。本文使用的核酶可以具有任意普通结构，包括但不限于发夹、锤头或斧头结构，只要该分子能切割RNA。在此类用语中使用时，术语“降低”或“以降低”及其语法等同物包括此类转化的
完全消除。本文使用的生物生产可以是需氧、微需氧或厌氧的。
本文使用的措辞“足够同源”是指这样的蛋白质或其部分，当与在本申请中提供的氨基酸序列(包括SEQ ID No./序列表)中的氨基酸序列相比时，它们具有的氨基酸序列包括最小数目的相同或等同的氨基酸残基，使得该蛋白质或其部分能够实现各自的酶反应和/或其他功能。为了确定特定蛋白质或其部分是否足够同源，可以通过酶活性试验进行确定，例如本领域公知的那些。对序列同一性和同源性的描述和方法是示例性的，并且认识到这些概念是本领域中充分了解的。此外应当理解，核酸序列可以变化，但仍然编码展示所需功能性的酶或其他多肽，并且此类变化也在本发明的范围内。另外，短语“其等同物”旨在表示所提及的基因、酶等的功能等同物。这样的等同物可以是相同物种或另一物种的，例如另一微生物种的。进一步地，对于核酸序列，“杂交”是指其中两条单链多核苷酸非共价地结合形成稳定的双链多核苷酸的过程。术语“杂交”也可以指三链杂交。得到的(通常为)双链多核苷酸是“杂合体”或“双链体”。“杂交条件”一般包括小于约1M，更通常小于约500mM和小于约200mM的盐浓度。杂交温度可以低到5°C，但是一般大于22°C，更典型地大于约30°C，并且常常超过约37°C。杂交通常在严格条件，即探针将与其靶标子序列杂交的条件下进行。严格条件是依赖于序列的，并且在不同情况下不同。对于具体的杂交，较长的片段可能需要较高的杂交温度。由于包括碱基组成和互补链的长度、有机溶剂的存在和碱基错配的程度在内的其他因素可能影响杂交的严格性，参数组合比任一个单独的绝对测量更重要。通常，严格条件选择为比具体序列在限定离子强度和PH下的Tm低约5°C。示例性的严格条件包括至少O. OlM到不超过IM Na离子浓度(或其他盐)的盐浓度，pH 7. O到
8.3，和至少 25°C 的温度。例如，5XSSPE(750mM NaCl，50mM 磷酸钠，5mM EDTA, pH 7.4)和温度25-30°C的条件适合等位基因特异性探针杂交。关于严格条件，参见例如Sambrook和Russell 和Anderson“Nucleic Acid Hybridization”第 I 版,BIOS Scientific PublishersLimited (1999)，其特此并入以参考杂交方案。“特异性地与...杂交”或“与...特异性杂交”等表述是指当一个或多个特定核苷酸序列存在于复杂混合物(例如总细胞的)DNA或RNA中时，分子在严格条件下基本与或仅与该序列的结合、双链体形成或杂交。术语“鉴别的酶功能变异体”是指经确定具有目的酶的酶活性和特异性，但具有与该目的酶不同的氨基酸序列的多肽。可以构建相应的“变异核酸序列”，经确定其编码这种鉴别的酶的功能变异体。为了特定目的，例如通过增加微生物中3HPTGC的一个或多个酶转化步骤的酶转化的遗传修饰来提高对3-HP的耐受性，可以进行一个或多个遗传修饰，以提供编码一个或多个鉴别的3HPTGC酶功能变异体的一个或多个异源核酸序列。S卩，各个这样的核酸序列编码一种多肽，该多肽不完全是3HPTGC的酶的已知多肽，但证明其展示该酶的酶活性。这样的核酸序列，及其编码的多肽，可以不落在指定的同源性或同一性限制内，但是它在细胞中的存在提供了所需的酶活性和特异性。获得这样的变异核酸序列和鉴别的酶功能变异体的能力得到了生物信息学以及蛋白质工程和设计领域的技术水平最新进展的支持，包括计算、预测和高通量方法学的进展。功能性变异体更一般地包括酶功能变异体，和编码它们的核酸序列，以及非酶多肽的变异体，其中该变异体展示出原始(目标)序列的功能。短语“目的片段”的使用包括目的基因和任何其他核酸序列片段。用来获得目的片段的方法的一个实例是获得微生物的培养物，其中该微生物的基因组包含目的基因或核酸序列片段。当在本文中，包括在权利要求书中，提及基因产物(即酶)的遗传修饰时，可以理解，该遗传修饰是通常编码所述基因产物(即酶)的核酸序列(例如或包括基因)的遗传修饰。在一些实施方案中，截短的各多肽具有由编码各天然酶的核酸序列所编码的多肽 全长的至少约90%，并且更加具体地具有由编码各天然酶的核酸序列所编码的多肽全长的至少95%。多肽具有与多肽的参考氨基酸序列至少例如95% “相同”的氨基酸序列是指，除了请求保护的多肽序列在多肽的参考氨基酸的每100个氨基酸中可以包含多达五个氨基酸改变以外，请求保护的多肽的氨基酸序列与该参考序列相同。换句话说，为获得具有与参考氨基酸序列至少95%相同的氨基酸序列的多肽，参考序列中可达5%的氨基酸残基可以缺失或被另一种氨基酸取代，或参考序列中的许多氨基酸，可达总氨基酸残基的5%，可以插入到参考序列中。参考序列的这些改变可以发生在参考氨基酸序列的氨基或羧基末端位置或这些末端位置之间的任何地方，或者独立散布在参考序列的残基之间，或者散布在参考序列内的一个或多个叠连群中。在其他实施方案中，如本文别处所述，截短的程度可能更大。物种和其他系统发生鉴别根据微生物学领域技术人员已知的分类进行。当本文描述的方法和步骤指出某些事件以某种次序发生时，本领域普通技术人员将认识到，某些步骤的排序可以修改，并且这样的修改是根据本发明的变化方案进行的。此夕卜，在可能时，某些步骤可以在平行过程中同时进行，以及相继进行。本文提供的预言性实例是广泛示例性的，而绝非限制。这适用于关于3-HP的分离和纯化以及3-HP向下游化合物的转化的实例，因为这些步骤和转化有众多可能的方法，包括在本文引用和并入的参考文献中公开的那些方法。缩写的含义如下从其使用可以清楚地看出，“C”是指摄氏或摄氏度，DCW是指细胞干重，“s”是指秒，“min”是指分钟，“h”、“hr”或“hrs”是指小时，“psi”是指磅/平方英寸，“nm”是指纳米，“d”是指天，“ μ L”或“uL”或“ul ”是指微升，“mL”是指毫升，“L”是指升，“mm”是指毫米，“nm”是指纳米，“mM”是指毫摩尔浓度，“ μ Μ”或“uM”是指微摩尔浓度，“M”是指摩尔浓度，“mmol”是指毫摩尔，“ μπιο ”或“uMol”是指微摩尔，“g”是指克，“ μ g”或“ug”是指微克，而“ng”是指纳克，“PCRn”是指聚合酶链反应，“0D”是指光密度，“0D_”是指在600nm的光子波长处测量的光密度，“kDa”是指千道尔顿，“g”是指重力常数，“bp”是指碱基对，“kbp”是指千碱基对，“ % w/v”是指重量/体积百分比，“ % v/v”是指体积/体积百分比，“IPTG”是指异丙基-D-硫代吡喃半乳糖苷，“RBS”是指核糖体结合位点，“rpm”是指每分钟的转数，“HPLC”是指高效液相色谱法，而“GC”是指气相色谱法。如本文公开的“3-HP”是指3-羟基丙酸，而“3HPTGC”是指3-HP致耐受性复合物。另外，10~5等用
来指IO5等。I.碳源本发明中，与具有3-HP生物合成途径的重组微生物一起使用的生物生产培养基必须包含适合预期代谢途径的碳源或底物。合适的底物可以包括但不限于单糖例如葡萄糖和果糖，寡糖例如乳糖或蔗糖，多糖例如淀粉或纤维素或其混合物，以及来自可再生原料的未纯化混合物例如干酪乳清渗透物、玉米浆、甜菜糖蜜和大麦芽。另外，碳底物也可以是单碳底物例如二氧化碳、一氧化碳或甲醇，已证明了它们向关键的生化中间体的代谢转化。除了单碳和双碳底物以外，还已知甲基营养型生物利用许多其他含碳化合物例如甲胺、葡糖胺和多种氨基酸进行代谢活动。尽管预期所有上面提及的碳底物及其混合物在本发明中适合作为碳源，但常见的 用作碳源的碳底物是葡萄糖、果糖和蔗糖，以及任意这些糖的混合物。其他合适的底物包括木糖、阿拉伯糖、其他基于纤维素的C-5糖、高果糖的玉米糖浆以及各种其他糖和糖混合物，如市售的那些。蔗糖可以由例如甘蔗、甜菜、木薯、香蕉或其他水果以及甜高粱等原料获得。葡萄糖和右旋糖可以通过包括诸如玉米、小麦、黑麦、大麦和燕麦等谷物在内的基于淀粉的原料的糖化而获得。另外，在一些实施方案中，碳源的全部或一部分可以是甘油。或者，可以不包括甘油作为添加的碳源。在一个实施方案中，碳源选自葡萄糖、果糖、蔗糖、右旋糖、乳糖、甘油及其混合物。在其它方面，碳源中这些组分的量可以是碳源的大于约50%、大于约60%、大于约70%、大于约80%、大于约90%或更多、可达100%或基本为100%。另外，已知甲基营养型生物利用许多其他含碳化合物例如甲胺、葡糖胺和多种氨基酸进行代谢活动。例如，已知甲基营养型酵母利用来自甲胺的碳形成海藻糖或甘油(Bellion 等，Microb. Growth Cl Compd. (Int. Symp.), 7th (1993), 415-32。编者MurrelI,J. Collin ；Kelly, Don P。出版商Intercept, Andover, UK)。类似地，念珠菌属(Candida)的各个种代谢丙氨酸或油酸(Suiter等，Arch. Microbiol. 153 :485-489 (1990))。因此预期，在本发明实施方案中利用的碳源可以包含多种多样的含碳底物。另外，可以通过预处理和糖化的工艺，由纤维素和木质纤维素生物质获得可发酵的糖，如在例如美国专利
发明者迈克尔·D·林奇, R·T·吉尔, 坦尼娅·瓦尼克-利普斯科布 申请人:Opx生物工艺学公司, 科罗拉多州立大学董事会(法人团体)