专利名称：一种采用荧光rt-pcr技术检测牙鲆tlr1基因表达的方法
技术领域：
本发明涉及生物技术领域，涉及用于检测牙鲆TLRl基因表达的特异性引物，更具体的说是一种采用荧光RT-PCR技术检测牙鲆TLRl基因表达的方法。主要用于牙鲆TLRl 基因表达调控机理研究和免疫学功能研究。
背景技术：
随着世界范围水产养殖规模的扩大，国内外水产品贸易及水产苗种跨区域交流日益频繁，大大增加了水产养殖动物病原传播的机会。同时，由于现代水产养殖的集约化、高密度生产方式及渔业水域环境的恶化，又常会引发养殖动物的应激反应，导致机体的免疫系统受到抑制。正是这些因素相互影响，出现了全球性的水产养殖动物发病率趋于频繁、流行程度日益广泛、经济损失极为巨大的局面。运用现代生物技术作为水产养殖的技术支撑， 掌握病害的免疫防御技术是水产科技急需解决的首要问题，因此，近年来国际上鱼类免疫学的研究逐渐受到重视。
在人类免疫学研究的历史舞台上，细胞免疫和体液免疫一直是两个主角。相比之下，固有免疫的研究由于缺乏对其相应受体的系统认识，明显滞后于获得性免疫研究的进程。20世纪90年代，Janeway等有关“病原体相关分子模式”以及“模式识别受体”概念的提出，标志着固有免疫研究进入了一个崭新的阶段。鱼类虽是低等脊椎动物，但已具备免疫的基本特性，与哺乳动物一样，其体内也存在2种免疫应答类型固有免疫应答和获得性免疫应答。而相对于哺乳动物来说，鱼类的固有免疫研究才刚刚起步。
Toll样受体(Toll-like receptors, TLRs)家族是动物识别入侵病原体的主要 “模式识别受体”，可识别几乎所有病原生物的一些通用结构，是启动固有免疫应答的关键。 一般认为TLR 1、2、4、5和6主要参与细菌成分的识别，而TLR3、TLR7和TLR8主要特异地针对病毒成分，TLR9对这二者均能够识别。TLR14、21 23在某些鱼类中存在，在哺乳动物中还未发现。
牙鲆iParalichthys olivaceus)在我国俗称牙片、偏口、比目鱼，是我国北方海水工厂化养殖的主要名贵鱼类品种，同时也是重要的海水增养殖鱼类之一。牙鲆属于鲽形目， 鲆科，牙鲆属。牙鲆属的鱼类在南、北美洲东西岸较多，而亚洲沿岸只有牙鲆一种，主要分布于渤海、黄海、东海、南海以及朝鲜、日本、俄罗斯沿岸海区。近年来，腹水病、病毒性神经坏死症等各种病害的爆发和流行给生产企业造成了巨大的经济损失，严重阻碍了牙鲆养殖产业的发展。腹水病在牙鲆疾病中危害最为严重，该病从苗种到成鱼均有发生，死亡率可达 50%-80%。由于目前对牙鲆免疫机理和机制的了解较少，尚无有效的免疫防治技术和治疗方法。
TLRs是宿主免疫的必需分子之一，通过感知病原微生物体，识别病原相关分子模式，激活天然免疫系统，TLRl作为TLRs家族的成员，参与鱼类免疫调节。揭示牙鲆TLRl 的免疫学功能及作用机理，将为寻找鱼类病害防治的新策略提供理论依据，具有潜在的应用价值和社会效益。
实时荧光PCR技术是在常规PCR技术的基础上发展起来的核酸定量技术。实时荧光PCR不仅实现了常规PCR从定性到定量的飞跃，而且与常规PCR相比，实时荧光PCR技术由自动化仪器收集荧光信号，避免了肉眼判断的主观性，可进一步提高灵敏度；实时荧光 PCR技术全封闭反应，无须PCR后处理，避免污染，保证了结果的可靠性和重复性。目前，已广泛应用于分子生物学和医学研究等领域。随着实时荧光PCR试剂盒的进一步开发，近年来，实时荧光PCR技术在动物疫病诊断中也得到了广泛的应用。发明内容
本发明的目的是公开一种采用荧光RT-PCR技术检测牙鲆TLRl基因表达的方法。
为实现上述目的，本发明所采用的技术方案如下设计一种采用荧光RT-PCR技术检测牙鲆TLRl基因表达的特异性引物，其特征在于包括符合荧光PCR反应特点的特异上下游引物TLRl-q-F :5，_ TCCGCACTTCTCATCTTTAT -3'； TLRl-q-R 5'- ATTTCACCACAGCCCTTC -3'；以及作为内参基因的牙鲆β -actin特异上下游引物β -actin-F 5' -AGGTTCCGTTGTC CCG-3' ； β -actin-R 5'-TGGTTCCTCCAGATAGCAC-3’。
本发明所述特异性引物快速检测牙鲆TLRl基因表达的方法，其特征在于按如下步骤进行(1)使用下述引物进行该基因的检测符合荧光PCR反应特点的该序列特异上下游引物 TLRl-q-F 5' - TCCGCACTTCTCATCTTTAT -3， TLRl-q-R 5' - ATTTCACCACAGCCCTTC -3' 以及作为内参基因的牙鲆β-actin特异上下游引物 β -actin-F 5'-AGGTTCCGTTGTCCCG-3’ β -actin-R 5'-TGGTTCCTCCAGATAGCAC-3，；(2)总RNA提取与纯化采用各种通用的RNA提取方法和纯化方法，从牙鲆头肾中提取得到纯化的牙鲆头肾总RNA ；(3)cDNA第一链合成以牙鲆头肾总RNA为模板合成cDNA第一链，反应体系为20μ L ；(4)实时荧光PCR:以上述合成的cDNA第一链为模板，上述(1)中TLRl-q-F和 TLRl-q-R、β -actin-F和β -actin-R为特异性引物，进行实时荧光PCR扩增反映，每个样品设3个平行管，扩增后所得3个平行管的Ct值取平均数。
(5)牙鲆的头肾组织中TLRl基因的相对表达量计算实时荧光PCR完成后，根据 Ct值计算牙鲆病原感染各时间段下的Δ Ct、2_u 值，计算方式如下Δ Ct = Ct — Ct 内对照(β -actin) ΔΔ Ct = Δ Ct —Δ Ct (0时健康牙鲆)以2_(ΔΔ")数值表示牙鲆头肾中TLRl基因相对于健康牙鲆TLRl基因的表达量。
本发明所述的检测方法，其中每条引物分别配制成浓度为25 ymol/L的贮存液， 工作浓度为0.5 ymol/L。
本发明更加详细的试验方法如下牙鲆TLRl基因的实时荧光RT-PCR检测方法可通过以下步骤实现 (1)引物设计根据TLRl的全长序列，使用ft~imer 5软件设计适用于实时荧光PCR检测的特异性引物，引物序列如下TLRl-q-F 5'- TCCGCACTTCTCATCTTTAT -3， TLRl-q-R 5'- ATTTCACCACAGCCCTTC -3'TLRl的PCR产物预计长度为201 bp，琼脂糖凝胶电泳结果显示扩增后的产物长度与预计产物长度一致，且为单一条带，说明所设计的引物具有很强的特异性，适合用于实时荧光 RT-PCR检测；琼脂糖凝胶电泳结果如图1所示。
同时，根据NCBI里提供的牙鲆β -actin的cds序列(EU090804)设计用于实时荧光PCR内对照的引物，引物序列如下β -actin-F 5'-AGGTTCCGTTGTCCCG-3’ β -actin-R 5'-TGGTTCCTCCAGATAGCAC-3，β-actin的PCR产物预计长度为150 bp。琼脂糖凝胶电泳结果显示扩增后的产物长度与预计产物长度一致，且为单一条带，说明所设计的引物具有很强的特异性，适合用于实时荧光RT-PCR检测时作为内对照扩增。琼脂糖凝胶电泳结果如图2所示。
(2)牙鲆感染实验近期未施用过疫苗的健康牙鲆(体长8-10 cm) 50尾，培养于水族箱内，每尾腹腔注射活菌0.1 mL (IO5个鳗弧菌)，或者每尾腹腔注射Poly (I: C)模拟 RNA病毒200 μ g，继续培养，于不同时间段处死牙鲆解剖分离头肾组织。
(3)总RNA提取与纯化采用各种通用的RNA提取方法和纯化方法，从牙鲆头肾中提取得到纯化的牙鲆头肾总RNA。
(4) cDNA第一链合成cDNA第一链的合成采用上海生工的 Protocol-BS249&BS250 MMLV First Strand cDNA Synthesis Kit试剂盒，反转录引物使用试剂盒所提供的随机六合引物或Oligo (dT) 18引物，以牙鲆头肾总RNA为模板合成cDNA第一链，反应体系为20 UL0
(5)实时荧光PCR 实时荧光PCR采用上海生工的Hot Start Fluorescent PCR Core Reagent Kits (SYBR Green I)试剂盒进行。以上述合成的cDNA第一链为模板，上述(1)中TLRl-q-F和TLRl-q-R、β-actin-F和β-actin-R为特异性引物，进行实时荧光 PCR扩增反映，每个样品设3个平行管，扩增后所得3个平行管的Ct值(即每个反应管内的荧光信号到达设定的域值时所经历的反应循环数)取平均数。
实时荧光PCR扩增体系设置如下Components每管成分Volume 体积(μ L)HotstartFluc-PCRmix热启动荧光PCR混合物25Senseprimer 正向弓I物(25pmol/μ L)1Anti-senseprimer 反向弓丨物(25pmol/μ L)1cDNA 第一链(μ L)3(MH2O (μ L)20TotalVolume 总体积(μ L)50实时荧光PCR扩增参数设置如下940C 4 min ；940C 30 s ；600C 30 s ；72°C 30 s (40 个循环)； 720C 10 min ；12°C保温。
(6)感染牙鲆的头肾组织中TLRl基因的相对表达量计算实时荧光PCR完成后， 根据Ct值计算牙鲆病原感染各时间段下的Δ Ct、2_(“et)值，计算方式如下Δ Ct = Ct — Ct 内对照(β -actin) ΔΔ Ct = Δ Ct —Δ Ct (0时健康牙鲆)以2_(ΔΔ")数值表示牙鲆头肾中TLRl基因相对于健康牙鲆TLRl基因的表达量。
2_(δδ")数值代表了 TLRl基因相对于健康牙鲆TLRl基因的表达倍数。β -actin 基因是看家基因，在所有类型的细胞中都进行表达，看家基因的表达只受启动序列或启动子与RNA聚合酶相互作用的影响，而不受其他机制调节，受环境因素影响很小，表达水平较为恒定。因此，看家基因常被用做测定目标基因表达量时的参照基因。
图3为Poly(I = C)注射牙鲆后头肾组织TLRl基因的相对表达量，从图中看出 Poly (I C)模拟病毒不能显著改变牙鲆TLRl基因的表达，表明牙鲆TLRl与病毒成分的识别可能无关，这与哺乳动物中TLRl的功能一致。图4为鳗弧菌感染牙鲆后头肾组织中TLRl基因的相对表达量，从图中看出鳗弧菌感染后牙鲆头肾组织中TLRl基因表达量与健康牙鲆 (即0时间的表达量)相比变化也不明显，甚至有略微下降。有研究报道在哺乳动物中，TLRl 与TLR2形成异源二聚体，从而识别脂蛋白、脂肽。本实验中鳗弧菌不能上调TLRl基因的表达，分析原因可能由于牙鲆TLRl受体对弧菌一类细菌并不敏感，弧菌的识别可能主要由牙鲆TLRs家族中的其它成员⑶Π TLR21，我们的实验已经证实。在哺乳动物中还未发现TLR21 的存在)进行识别。
因此，牙鲆TLRl主要能够识别哪些细菌成分以及牙鲆TLRl基因的表达调控受哪些因素的影响还有待做进一步的研究来探明。本实例TLRl基因表达的荧光RT-PCR检测为研究牙鲆TLRl的免疫学功能提供了技术平台。
本发明提供的特异性引物快速检测牙鲆TLRl基因表达的方法与现有技术相比的有益效果是(1)本发明采用的实时荧光RT-PCR技术与常规PCR相比，实时荧光PCR技术由自动化仪器收集荧光信号，避免了肉眼判断的主观性，可进一步提高灵敏度；实时荧光PCR技术全封闭反应，无须PCR后处理，避免污染，保证了结果的可靠性和重复性。实时荧光RT-PCR技术也免除了常规PCR中的电泳、定量扫描等后续繁琐步骤，大大缩短了实验时间。
(2) TLRs是宿主免疫的必需分子之一，通过感知病原微生物体，识别病原相关分子模式，激活天然免疫系统。TLRl作为TLRs家族的成员，参与鱼类免疫调节，通过在不同因素影响下对牙鲆TLRl基因表达量变化的测定，可以了解牙鲆TLRl的免疫学功能及调控机理，为寻找鱼类病害防治的新策略提供理论依据，具有潜在的应用价值和社会效益。
图1为牙鲆TLRl基因实时荧光RT-PCR产物电泳结果；TLRl产物长度201 bp, Marker 条带从下而上依次为100、250、500、750、1000、2000bp ；图2为牙鲆内对照基因β -actin实时荧光RT-PCR产物电泳结果；β -actin产物长度 150 bp, Marker 条带从下而上依次为100、250、500、750、1000、2000bp ；图3为Poly(I = C)注射后牙鲆TLRl基因的相对表达量。
图4为鳗弧菌感染后牙鲆TLRl基因的相对表达量。
具体实施例方式下面结合实施例说明本发明，这里所述实施例的方案，不限制本发明，本领域的专业人员按照本发明的精神可以对其进行改进和变化，所述的这些改进和变化都应视为在本发明的范围内，本发明的范围和实质由权利要求来限定；其中所用试剂均有市售。
实施例1 牙鲆感染实验鳗弧菌(由天津市水产病害防治中心提供)接种于pH值7.5、补加了 2% NaCl的 Luriai-Bertani液体培养基中，于恒温振荡(150 r/min)培养24 h。在550 nm下测定OD值，计算菌体浓度及细胞总数。离心收集菌体，并用PBS离心洗涤菌体三次，配制成IO6 个/mL浓度的鳗弧菌菌液。
近期未施用过疫苗的健康牙鲆(体长8-10 cm)50尾，培养于水族箱内，每尾腹腔注射活菌0.1 mL(105个鳗弧菌)，或者每尾腹腔注射Poly (I: C)模拟RNA病毒200 yg，继续培养，于不同时间段处死牙鲆解剖分离头肾组织。
实施例2 总RNA的提取和纯化(1)取头肾组织100 mg用剪刀剪碎加入1 mL的Trizol试剂(美国invitrogen公司) 和10 μ L肝素于勻浆器里彻底研磨勻浆，然后转移至1.5 mL无RNase的离心管中震荡混勻，室温放置5 min，使其充分裂解。
(2) 4°C、12000 rpm离心5min，将上清液转入新的无RNase的离心管中。
(3)向每管加入0. 1 mL 5 mol/L的NaCl混合均勻，再向每管加入0. 3 mL氯仿，剧烈振荡15 s后，室温放置3 min, 4°C>12000 r/min离心15 min，在尽可能不吸入中间层的情况下，吸出上清液转入另一干净的1. 5 mL离心管中。
(4)向每管加入与所得上清液相等体积的异丙醇，轻轻混勻后，室温放置10 min, 4°C、12000 r/min离心10 min，小心倒掉管中液体，保留沉淀，加入1 mL 75%乙醇洗涤沉淀。
(5) 40C >7500 r/min离心5 min，小心倒掉管中液体，保留沉淀，再加入1 mL 75% 乙醇洗涤沉淀，4°C、7500 r/min离心5 min,，所得沉淀即为牙鲆头肾总RNA，-70°C保存。
(6)提取的总RNA可用DNase I酶(Invitrogen公司)进一步纯化，以去除RNA中残存的DNA，具体如下往0. 2 mL离心管中加入1 yg提取的总RNA、1 μ L IOXDNase I 反应缓冲液、1 μ L DNase I (IU/ μ L)、DEPC水补至总体积到10 μ L，室温或37°C放置15 min，加入 1 μ L 25 mM EDTA，65°C 10 min。既得纯化的总 RNA。
实施例3 TLRl基因的实时荧光RT-PCR检测 (1)引物设计根据SEQ ID NO为1所述TLRl的全长序列，使用I^rimer 5软件设计适用于实时荧光 PCR检测的特异性引物，引物序列如下TLRl-q-F 5' - TCCGCACTTCTCATCTTTAT -3'TLRl-q-R 5'- ATTTCACCACAGCCCTTC -3'TLRl的PCR产物预计长度为201 bp，琼脂糖凝胶电泳结果显示扩增后的产物长度与预计产物长度一致，且为单一条带，说明所设计的引物具有很强的特异性，适合用于实时荧光 RT-PCR检测；琼脂糖凝胶电泳结果如图1所示。
同时，根据NCBI里提供的牙鲆β -actin的cds序列(EU090804)设计用于实时荧光PCR内对照的引物，引物序列如下β -actin-F 5'-AGGTTCCGTTGTCCCG-3’ β -actin-R 5'-TGGTTCCTCCAGATAGCAC-3，β-actin的PCR产物预计长度为150 bp。琼脂糖凝胶电泳结果显示扩增后的产物长度与预计产物长度一致，且为单一条带，说明所设计的引物具有很强的特异性，适合用于实时荧光RT-PCR检测时作为内对照扩增。琼脂糖凝胶电泳结果也如图2所示。
(2) cDNA 第一链合成以实施例2所述纯化的牙鲆头肾总RNA作为模板，使用上海生工的 Protocol-BS249&BS250 MMLV First Strand cDNA Synthesis Kit试剂盒，用试剂盒所提供的随机六合引物或Oligo (dT) 18引物，按照试剂盒推荐方法反转录合成cDNA第一链。反应体系总体积为20 μ L。
(3)实时荧光 PCR:实时荧光PCR采用上海生工的Hot Start Fluorescent PCR Core Reagent Kits (SYBR Green I)试剂盒进行。以上述(2)中合成的cDNA第一链为模板，上述(1)中TLRl-q-F和 TLRl-q-R、β -actin-F和β -actin-R为特异性引物，进行实时荧光PCR扩增反映，每个样品设3个平行管，扩增后所得3个平行管的Ct值(即每个反应管内的荧光信号到达设定的域值时所经历的循环数)取平均数。
实时荧光PCR扩增体系设置如下
权利要求
1.一种采用荧光RT-PCR技术检测牙鲆TLRl基因表达的特异性引物，其特征在于包括符合荧光PCR反应特点的特异性上下游引物TLRl-q-F :5，_ TCCGCACTTCTCATCTTTAT -3'； TLRl-q-R 5'- ATTTCACCACAGCCCTTC -3'；以及作为内参基因的牙鲆β -actin基因特异性上下游引物β -actin-F 5' -AGGTTCC GTTGTCCCG-3' ； β -actin-R 5'-TGGTTCCTCCAGATAGCAC-3’。
2.一种采用权利要求1所述的特异性引物快速检测牙鲆TLRl基因的方法，其特征在于按如下步骤(1)使用下述引物进行该基因的检测符合荧光PCR反应特点的该序列特异性上下游引物 TLRl-q-F 5' - TCCGCACTTCTCATCTTTAT -3' TLRl-q-R 5' - ATTTCACCACAGCCCTTC -3' 以及作为内参基因的牙鲆β-actin特异性上下游引物 β -actin-F 5'-AGGTTCCGTTGTCCCG-3’ β -actin-R 5'-TGGTTCCTCCAGATAGCAC-3，；(2)总RNA提取与纯化采用各种通用的RNA提取方法和纯化方法，从牙鲆头肾中提取得到纯化的牙鲆头肾总RNA ；(3)cDNA第一链合成以牙鲆头肾总RNA为模板合成cDNA第一链，反应体系为20μ L ；(4)实时荧光PCR:以上述合成的cDNA第一链为模板，上述(1)中TLRl-q-F和 TLRl-q-R、β -actin-F和β -actin-R为特异性引物，进行实时荧光PCR扩增反映，每个样品设3个平行管，扩增后所得3个平行管的Ct值取平均数；实时荧光PCR扩增体系设置如下
3.如权利要求2所述的检测方法，其中每条引物分别配制成浓度为25 ymol/L的贮存液，工作浓度为0.5 ymol/L。
全文摘要
本发明公开了一种采用荧光RT-PCR技术检测牙鲆TLR1基因相对表达量的方法。TLR1参与鱼类免疫调节，通过感知病原微生物体，识别病原相关分子模式，激活天然免疫系统，本发明中牙鲆TLR1基因实时荧光RT-PCR检测方法的建立，为研究牙鲆TLR1基因表达调控机理及免疫学功能奠定基础，并为在mRNA水平对TLR1的相对定量分析提供了技术平台。
文档编号C12N15/11GK102533999SQ201210003929
公开日2012年7月4日 申请日期2012年1月9日 优先权日2012年1月9日
发明者吴恋, 孙金生, 潘宝平, 耿绪云, 高虹 申请人:天津师范大学