专利名称：一种循环血dna提取方法和相关的循环血dna提取试剂盒的制作方法
技术领域：
本发明涉及DNA提取技术领域，特别涉及循环血DNA提取技术领域，具体是指一种循环血DNA提取方法和相关的循环血DNA提取试剂盒。
背景技术：
人血浆中存在游离基因组DNA，这些DNA分子是在细胞凋亡或死亡后释放到外周血中的，检测分析游离gDNA有很重要的临床意义许多疾病状态下，比如中风、心肌梗塞、 糖尿病及许多恶性肿瘤患者血浆游离gDNA会显著升高。因此血浆游离gDNA浓度可以作为疾病进展的一个临床指标，对于恶性肿瘤患者血浆中游离gDNA的检测分析更具有重要意义，因为这些gDNA分子直接来自肿瘤细胞，对其进行基因分析可以获得肿瘤恶性程度的全部信息，可以为肿瘤的诊断和治疗提供重要的依据。由于在孕妇外周血中存在胎儿的游离 gDNA,因此，血浆游离gDNA分析还可以作为产前诊断的重要方法。由于血浆游离gDNA片段小，含量低，在提取过程中容易丢失，其浓度在ng/mL水平，无法用紫外分光光度法检测。需要很高的提取效率和稳定的得率才能应用于定量和相关检测。传统的苯酚/氯仿抽提法操作者需要接触苯酚、氯仿这些有害物质，影响人体健康。也有专利采用硅柱吸附法，其原理是利用DNA分子一定盐浓度下能与收集硅柱可逆吸附来提取纯化DNA。但是该方法抽提效率较低，操作繁琐，需要专用的DNA吸附柱，无法反复利用，成本高。因此，需要一种循环血DNA提取方法，其抽提效率高、操作简便、成本低廉、安全环保。
发明内容
本发明的目的是为了克服上述现有技术中的缺点，提供一种循环血DNA提取方法和相关的循环血DNA提取试剂盒，该循环血DNA提取方法设计巧妙，抽提效率高、操作简便、 成本低廉、安全环保，适于大规模推广应用。为了实现上述目的，在本发明的第一方面，提供了一种循环血DNA提取方法，其特点是，采用酸化预处理的硅珠浊液提取循环血DNA，例如血浆中游离基因组DNA、病毒DNA等寸。所述硅珠浊液可以采用任何合适的方法制备，较佳地，所述硅珠浊液是将硅珠震荡分散在液体中然后经过所述酸化预处理形成。液体可以是任何合适的液体，比如水，或者常规的DNA提取缓冲液等等。所述酸化预处理可以采用任何合适的方式，较佳地，所述酸化预处理通过加入酸实现。酸通常是无机酸，例如盐酸、硝酸等等，也可以是有机酸，例如醋酸、甲酸等等。更佳地，所述酸是盐酸。所述硅珠浊液的PH值小于7即可，较佳地，所述硅珠浊液的pH值为2. 0。
为了避免蛋白污染，较佳地，在所述血浆中还加入蛋白酶K。为了将细胞中的DNA完全释放出来，较佳地，在所述血浆中还加入裂解缓冲液。所述裂解缓冲液可以是DNA提取所用的常见的裂解缓冲液，更佳地，所述是0.2M Tris-HCl,0. 5% SDS, pH 7. 0。采用酸化预处理的硅珠浊液提取循环血DNA之后，还可以进行常规DNA提取后续步骤进行纯化，例如采用洗涤缓冲液洗涤，乙醇重新沉淀等等，这些均是现有技术，这里不再赘述。在本发明的第二方面，提供了一种循环血DNA提取试剂盒，其特点是，包括用于配制上述的循环血DNA提取方法中使用的硅珠浊液的硅珠。在本发明的第三方面，提供了一种循环血DNA提取试剂盒，其特点是，包括用于上述的循环血DNA提取方法的硅珠浊液。本发明的有益效果具体如下本发明的循环血DNA提取方法采用酸化预处理的硅珠浊液提取循环血DNA，安全无毒，操作者不需接触苯酚，氯仿等有害物质，操作简便，主要仪器只需一架台式离心机，抽提效率高，对循环血中的短DNA抽提效率显著优于过柱法，纯化效率可达70 %以上，足以满足常规分子生物学需求，成本低廉，不需要专用的DNA吸附柱，因此，设计巧妙，抽提效率高、操作简便、成本低廉、安全环保，适于大规模推广应用。
具体实施例方式为了能够更清楚地理解本发明的技术内容，特举以下实施例详细说明。应理解，实施例仅是用于说明本发明，而不是对本发明的限制。实施例11 试剂1.1 二氧化硅粉末SiR室温保存。1. 2 IN HCl室温保存。用12N浓盐酸配制。1. 3裂解缓冲液0. 2M Tris-HCl,0. 5% SDS, pH 7. 0。室温保存。1.4 蛋白酶 K-20°C 冻存，30U/mg。1. 5洗涤缓冲液50% 乙醇，70mM NaCl，IOmM Tris，2. 5mM EDTA。室温保存。1. 6 70% 乙醇室温保存。L 7 TE 缓冲液·室温保存。称取1. 21g Tris碱，0. 37g EDTA 二钠盐，加纯净水400毫升，剧烈搅拌，用NaOH调pH至8. 0，定容至500毫升，高温高压灭菌。1. 8纯净水2仪器与耗材
2. 1移液管、枪头1-200 μ L。2. 2 离心管1. 5_50mL。2. 3 计时器.2. 4磁力搅拌器2. 5涡旋振荡器2.6手持离心机2.7台式离心机2.8 量筒50mL2.9水浴锅2. 10空气培养箱2. 11 温度计2. 12离心管加热模块2. 13真空采血管2. 14 EDTA 抗凝管3实验步骤3. 1硅珠浊液制备3. 1. 1称取0. 6克SiO2，在50毫升纯水中震荡分散后静置M小时。3. 1. 2移去上清，补水到50毫升，震荡分散后静置M小时。3.1.3移去上清，向剩余浊液中加入IN盐酸至pH达到2。121°C湿热灭菌15分钟，室温避光保存。3. 2血浆制备3. 2. 1用真空采血管采集10毫升静脉血，可在EDTA抗凝管中保存4小时。3. 2. 2将血液转移到50毫升离心管中，1，500g离心10分钟。3. 2. 3将黄褐色的上清转移到15毫升离心管中，再次1，500g离心lOmin。3. 2. 4将约2. 5毫升上清转移到15毫升离心管中，_80°C冻存。3. 3抽提血浆循环DNA3. 3. 1向50毫升离心管中加入4毫升血浆，4毫升裂解缓冲液，100微升200微克 /微升蛋白酶K，10微升硅珠浊液。颠倒混勻5次，室温IOOrpm摇床振荡混合20分钟。3. 3. 2 9，OOOg离心3分钟，丢弃上清。3. 3. 3加入1毫升洗涤缓冲液重悬沉淀，转移到1. 5毫升离心管中，12，OOOg离心 1分钟，丢弃上清。3.3.4加入ImL 70%乙醇，充分重悬沉淀，12，OOOg离心lmin，丢弃上清，重复洗
涤1次。3. 3. 5吸走全部上清，在56°C离心管加热模块上烘烤3分钟。3. 3. 6加入50微升TE缓冲液，吹打重悬，震荡20秒后65°C水浴15分钟。3.3.7 14，OOOg离心3分钟，转移到新的1.5mL离心管中，4°C保存。
4.荧光定量PCR检测提取的DNA的质量采用Bioline公司PCR试剂盒产品进行QPCR检测抽提的Cir-DNA的品质，用CFFl 引物扩增一段长约150bp的gDNA片段。配制定量PCR体系2X SensiMix SYBR 10 μ L(Bioline 公司)5μΜ CFFl 弓丨物 5μ LCFFl-F 引物5’ -TAAGAGTAATAATGGATGGATGATG-3’ 酸序列)CFFl-R 引物5，-CCTCCCATCTCCCTTCC-3，(见 SEQddH20 4 μ Lcir-DNA 1 μ L共 20 μ L 体系·定量PCR循环条件95 "C IOmin.{95 "C 15sec58°C 60sec重复40个循环}{95 "C 15sec60 °C 15sec95°C I5Sec 2%升温速度}实施例2在硅珠浊液预处理酸化时加入硝酸调节pH实施例3在硅珠浊液预处理酸化时加入醋酸调节pH对比例1过柱法提取与实施例1相同来源的血浆中的游离基因组DNA，具体采用Epigentek 公司的FitAmp Plasma Serum DNA Isolation Kit进行。荧光定量PCR中模板采用过柱法提取的血浆中游离基因组DNA。初始血量10mL，从中提取到约5mL的血浆，从中取4mL血浆硅珠法，从中取0. 4mL 血浆过柱法，结果表明实施例1-3的硅珠法和对比例1的过柱法均提取到了 DNA。实施例1-3提取的Cir-DNA的Ct值在21. 7附近，Cir-DNA的融链曲线为双峰，峰值Tm分别为73. 4°C、79. 0°C，三重复结果相似。对比例1提取的Cir-DNA的Ct值在29. 6附近，Cir-DNA的融链曲线为三峰，峰值 Tm 分别为 74. 0°C, 79. 4 °C, 83. 2 "C。因此，从Ct值看来，硅珠法获得的Cir-DNA的扩增结果约比过柱法低8个Ct值， 按1个Ct值为2倍计算，另外考虑到实施例的结果是从10倍的血浆量中(硅珠法初始血浆量4mL vs过柱法初始血浆量0. 4mL)获得了约200倍(Δ Ct = 8,2"8 = 256)，所以推测同样血浆量的话，硅珠法较过柱法能够获得高10倍、1个数量级的游离DNA产量。从融链曲线来看，过柱法比硅珠法多一个峰，因此，整体上过柱法提到的DNA片段
(见SEQ ID NO :1所示的核苷 ID NO 2所示的核苷酸序列)
至2.0，其余同实施例1。 至2.0，其余同实施例1。可能比硅珠法提到的要更长。综上，本发明的循环血DNA提取方法设计巧妙，抽提效率高、操作简便、成本低廉、 安全环保，适于大规模推广应用。在此说明书中，本发明已参照其特定的实施例作了描述。但是，很显然仍可以作出各种修改和变换而不背离本发明的精神和范围。因此，说明书和附图
应被认为是说明性的而非限制性的。
权利要求
1.一种循环血DNA提取方法，其特征在于，采用酸化预处理的硅珠浊液提取循环血DNA。
2.根据权利要求1所述的循环血DNA提取方法，其特征在于，所述硅珠浊液是将硅珠震荡分散在液体中然后经过所述酸化预处理形成。
3.根据权利要求1所述的循环血DNA提取方法，其特征在于，所述酸化预处理通过加入酸实现。
4.根据权利要求3所述的循环血DNA提取方法，其特征在于，所述酸是盐酸。
5.根据权利要求1所述的循环血DNA提取方法，其特征在于，所述硅珠浊液的pH值为2. 0。
6.根据权利要求1所述的循环血DNA提取方法，其特征在于，在所述血浆中还加入蛋白酶K。
7.根据权利要求1所述的循环血DNA提取方法，其特征在于，在所述血浆中还加入裂解缓冲液。
8.根据权利要求7所述的循环血DNA提取方法，其特征在于，所述裂解缓冲液是0.2M Tris-HCl,0. 5% SDS, pH 7. 0。
9.一种循环血DNA提取试剂盒，其特征在于，包括用于配制根据权利要求1所述的循环血DNA提取方法中使用的硅珠浊液的硅珠。
10.一种循环血DNA提取试剂盒，其特征在于，包括用于根据权利要求1所述的循环血 DNA提取方法的硅珠浊液。
全文摘要
本发明提供了一种循环血DNA提取方法，其采用酸化预处理的硅珠浊液提取循环血DNA。较佳地，硅珠浊液是将硅珠震荡分散在液体中然后经过酸化预处理形成，酸化预处理通过加入酸实现，硅珠浊液的pH值为2.0，在血浆中还加入蛋白酶K，在血浆中还加入裂解缓冲液。还提供了相关的循环血DNA提取试剂盒。本发明的循环血DNA提取方法设计巧妙，抽提效率高、操作简便、成本低廉、安全环保，适于大规模推广应用。
文档编号C12N15/10GK102559665SQ20121005281
公开日2012年7月11日 申请日期2012年3月2日 优先权日2011年8月30日
发明者赵翊均 申请人:赵翊均