专利名称：R-邻氯扁桃酸及其醇酯的制备方法
技术领域：
本发明属于生物工程技术领域，涉及ー种邻氯扁桃酸及其醇酯，特别是涉及ー种R-邻氯扁桃酸及其醇酯的制备方法。
背景技术：
邻氯扁桃酸或其醇酯是ー种重要的医药、化工中间体。单ー对映体R-邻氯扁桃酸及其醇酯的制备依赖于三类方法化学法、物理法和生物法。(I)化学法，主要是利用手性胺类化合物，通过形成非对映异构体盐，得到单ー对映体，也可以利用某种还原试剂以邻氯苯こ酮酸甲酯不对称合成单ー构型的扁桃酸甲酷。(2)物理法，用于邻氯扁桃酸或其醇酯的 对映体拆分，如色谱法、结晶法、膜法和超临界萃取等方法。无论化学法还是物理法邻氯扁桃酸或其醇酯对映体的拆分，都不可避免地带来环保及成本压力、重金属残留等弊端。近年来生物法发展较为迅速，生物法国内外的研究逐年增多，包括野生微生物转化、基因工程菌转化、酶法催化及反应介质的选择等诸多报道。其中，野生微生物转化主要是以外消旋型邻氯扁桃酸或其醇酯为底物，通过特定微生物降解某ー对映体，获得单一光学对映体邻氯扁桃酸或其醇酷，即便经过菌种改造提高转化速率，这种方法最大转化率的理论值仅为50%，转化率较低，造成资源浪费。国际上，通过定向进化技术获得的羟氰化酶已应用于R-邻氯扁桃酸的エ业生产。但由于反应中有剧毒物质HCN的參与，存在极大的安全隐患及环境压力。采用专一性羰基还原酶还原邻氯苯こ酮酸甲酷，进而通过分离纯化获得単一的R-邻氯扁桃酸甲酷，但这种方法需要添加特定的辅因子NADP+ (烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸)，使得反应向还原方向持续进行，成本较高，而且上述方法往往需要调节转化反应体系，比如常采用两相催化及离子液体等反应体系，以期获得更高的产率及光学純度，生产过程较复杂。
发明内容
本发明要解决的技术问题针对现有技术存在的缺陷，提供一种底物廉价易得、理论转化率高、环境友好、经济的R-邻氯扁桃酸及其醇酯的制备方法。本发明的技术方案
本发明提供ー种R-邻氯扁桃酸及其醇酯制备方法，构建ー种氧化还原偶联催化体系，该体系包括工程菌培养，诱导表达S-扁桃酸脱氢酶、邻氯苯こ酮酸羰基还原酶及葡萄糖脱氢酶，直接制备静息细胞-磷酸盐缓冲体系，以外消旋型邻氯扁桃酸(或其醇酷)及葡萄糖为 底物，进行顺序催化反应。R-邻氯扁桃酸的制备方法包括以下步骤
(I)酶的重组表达
设计引物对P1、P2 Pl :5’ -atacgcggatccatgtggaacaatgctccgc3’，P2 :5’ -gggccgctcgagttaacttctcgcttgttc3，，以荧光假单胞菌基因组的DNA为PCR模板，进行PCR第一次扩增，扩增产物为S-扁桃酸脱氢酶基因Pf量//ガ，经改造后得到序列为Seql的氨基酸，将序列Seql与表达载体pETDuet-Ι 连接；
设计引物对P3、P4
P3 D> -ccgccggaattcatgtatccggatttaaaag3J,P4 :5，-ataagaatgcggccgcttaaccgcggcctgcctgg3’，
以枯草芽孢杆菌基因组的DNA为PCR模板，进行PCR第二次扩增，扩增产物为枯草芽孢杆菌葡萄糖脱氢酶基因其氨基酸序列为Seq2N ；
设计引物对P5、P6
P5 :5’ -gggggaagatctatgtcagttttcgtttcag3 ,Pd :5’ -gggccgctcgagttatattctgccct
CSLSLSL^0，
以酿酒酵母基因组的DNA为PCR模板，进行PCR第三次扩增，扩增产物为酿酒酵母羰基还原酶基因6 ,经改造后得到序列为Seq3的氨基酸，将Seq2N、Seq3先后与表达载体pETDuet-Ι 连接；
(2 )转化宿主制备BL21宿主感受态后，通过热激法或电击法获得能够表达S-扁桃酸脱氢酶的基因工程菌I及可表达GRE2与Bsmi的基因工程菌13,备用;
(3)接种培养将所述基因工程菌I和基因工程菌]]按菌体密度Γ5:1的比例混合，
共同培养于LB-Amp液体培养基中，于37°C摇床振荡培养6 10h，转速240转/分，当OD6tltl达到O. 4^0. 6时，接种于装有150mL LB-Amp液体培养基的三角瓶中，三角瓶用纱布封ロ，继续培养至OD6tltl O. Γ0. 6，将所有培养物接种于装有IOL LB-Amp液体培养基的种子罐中，培养8h，移种至150L发酵罐中，培养至0D_ O. 4 0. 5，于23°C 26°C、摇床振荡培养5 8h，转速220转/分，至DO值25% 38% ；
(4)外消旋型邻氯扁桃酸和葡萄糖的添加按照lmol/L的浓度添加外消旋型邻氯扁桃酸，葡萄糖添加量
为外消旋型扁桃酸的1-1. 5倍，以NADP为辅因子，经过6 10h催化，获得R-邻氯扁桃酸。所述的制备方法中第一次、第二次和第三次PCR扩增时PCR体系均为=IOXTaqbuffer 5 μ I ； 10 mmol/L
的 dNTP I. 5 μ I ；25 mmol/L MgCl2 3 μ I ;对应的上下游引物各 I μ I ；DNA 模板 I μ I ;5U/ μ I Taq DNA 聚合
SI 0. 25 μ I ；ddH20 37. 25 μ I。其中第一次PCR扩增时的步骤为(1) 95°C，预变性3min ;(2) 94°C，变性30s;
(3)50°C退火 30s ;(4)
72°C延伸75s ;步骤⑵ (4)重复30次；(5) 72°C继续延伸lOmin，冷却至4で。第二次PCR扩增时的步骤为(I) 94°C，预变性3min ;(2) 94°C，变性30s ; (3)54°C退火3Os; (4) 72
で延伸50s ;步骤⑵ ⑷重复30次；(5) 72°C继续延伸lOmin，冷却至4°C。第三次PCR扩增时的步骤为(I) 94°C，预变性3min ； (2) 94°C，变性30s ； (3)54°C退火30s ；(4) 72°C延伸66s ;步骤⑵ ⑷重复30次；(5) 72°C继续延伸lOmin，冷却至4°C。 本发明的积极有益效果
(I)本发明将廉价易得的外消旋型邻氯扁桃酸(或其醇酷)生物催化为有重要エ业价值的R-邻氯扁桃酸(或其醇酷)，这ー顺序偶联反应使得S-邻氯扁桃酸(或其醇酷)完全转化为其光学对映体，成本低，绿色环保，エ艺简化，适于エ业化生产。(2)本发明方法的理论转化率可达到100%，是ー种环境友好、经济的R-邻氯扁桃酸単一光学对映体制备方法，其中S-扁桃酸脱氢酶、羰基还原酶及葡萄糖脱氢酶基因是分离于生物体的天然序列，或经过改造后能够在相应宿主内获得活性表达，且S-扁桃酸脱氢酶具有底物S-邻氯扁桃酸(或其醇酷)专ー性，羰基还原酶具有底物邻氯苯こ酮酸(或其醇酷)专ー性，以NADP为辅因子，葡萄糖脱氢酶可以氧化葡萄糖且产生适量NADPH，維持催化 反应顺序进行。(3)本发明过程精简，反应时间短，耗能小，易于操作，得率高，产物R-邻氯扁桃酸(或其醇酷)的得率大于85%，R-邻氯扁桃酸(或其醇酷)ee值在95%以上。
图I表示S-扁桃酸脱氢酶基因与表达载体pETDuet-Ι的连接；
图2表示枯草芽孢杆菌葡萄糖脱氢酶基因和酿酒酵母羰基还原酶基因GRE2与表达载体pETDuet-Ι的连接。
具体实施例方式实施例I :R_邻氯扁桃酸的制备方法，包括以下步骤
(I)酶的重组表达
设计引物对P1、P2
Pl :5’ -atacgcggatccatgtggaacaatgctccgc3’，P2 :5’ -gggccgctcgagttaacttctcgcttgttc3，,
以突光假单胞菌iPsGudomorms /Ywore1Scefl1S )的基因组的DNA为PCR模板,进行PCR扩增，PCR 体系为10 X Taq buffer 5μ I ；10 mmol/L dNTP I. 5μ I ；25 mmol/L MgCl2 3 μ I ;上下游引物各 I μ I ;DNA 模板 I μ I ；5U/ μ I Taq DNA polymerase O. 25 μ I ；ddH20 37. 25 μ I ；PCR 扩增步骤为(1) 95°C，预变性 3min ;(2) 94°C，变性 30s ; (3) 50°C 退火 30s ; (4) 72 °C延伸75s ;重复步骤(2) (4) 30次；(5) 72°C继续延伸lOmin，冷却至4で。PCR产物经琼脂糖凝胶电泳纯化，利用琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒回收1100-1200bp区间的目标条带，扩增产物为S-扁桃酸脱氢酶基因PfM//ガ，其核苷酸序列和对应的氨基酸序列分别为SeqlN、SeqlA，SeqlA经改造后得到序列为Seql的氨基酸，将Seql与表达载体pETDuet-Ι连接 '参见图I。设计引物对P 3、P4:
P3 :5，-ccgccggaattcatgtatccggatttaaaag3J,P4 :5，-ataagaatgcggccgcttaaccgcggcctgcctgg3’，
以枯草芽孢杆菌{Bacillus subtil is )基因组的DNA为PCR模板，进行PCR扩增，PCR体系为10XTaq buffer 5 μ I ；10 mmol/L 的 dNTP I. 5μ I ；25 mmol/L 的 MgCl2 3 μ I ;上下游引物各 I μ I ；DNA 模板 I μ I ；5U/ μ I Taq DNA polymerase O. 25 μ I ；ddH20 37. 25 μ I。PCR扩增步骤为(1) 94°C，预变性 3min ;(2) 94°C，变性 30s ; (3) 54°C退火 30s; (4) 72。。延伸50s ;步骤⑵ ⑷重复30次；(5) 72°C继续延伸lOmin，冷却至4°C。PCR产物经琼脂糖凝胶电泳纯化，利用琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒回收700-900bp区间的目标条带，扩增产物为枯草芽孢杆菌葡萄糖脱氢酶基因BsGDH，其核苷酸序列和对应的氨基酸序列分别为Seq2N、Seq2A，将 Seq2A 与表达载体 pETDuet-Ι 连接；
设计引物对P 5、P6
P5 :5’ -gggggaagatctatgtcagttttcgtttcag3 ,Pd :5’ -gggccgctcgagttatattctgccct
CSLSLSL^0，
以酿酒酵母i^scchaxomycGS cerevisiae )基因组的DNA为PCR模板，进行PCR扩增，PCR 体系为10XTaq buffer 5μ I ；10 mmol/L 的 dNTP I. 5μ I ；25 mmol/L 的 MgCl23μ I ;上下游引物各 1μ I ;DNA 模板 1μ I ;5υ/μ I Taq DNA polymerase 0. 25 μ I ；ddH2037. 25 μ I。PCR 扩增步骤为(1) 94°C，预变性 3min ; (2) 94°C，变性 30s ; (3) 54°C退火30s ； (4) 72°C延伸66s ;步骤(2) (4)重复30次；(5) 72°C继续延伸lOmin，冷却至4°C。PCR产物经琼脂糖凝胶电泳纯化，利用琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒回收1000-1 IOObp区间的目标条带，扩增产物为酿酒酵母羰基还原酶基因6 ，其核苷酸序列和对应的氨基酸序列分别为Seq3N、Seq3A, Seq3A经改造后得到Seq3氨基酸序列,将Seq3与表达载体pETDuet_l连接；參见图2。(2)转化宿主
制备BL21 (DE3)宿主感受态后，通过常规热激法或电击法获得能够表达S-扁桃酸脱氢
酶的基因工程菌I及可表达GRE2与鳩H的基因工程菌II，备用；
(3)接种培养
将所述的基因工程菌I和基因工程菌 31按菌体密度Γ5:1的比例混合，共同培养于
LB-Amp液体培养基(含50mg/L氨苄青霉素的LB培养基)中，于37°C、摇床振荡培养6 10h，转速240转/分钟，当OD6tltl达到0. 4^0. 6时，接种于5个装有150mL LB-Amp液体培养基的三角瓶中，其中三角瓶用八层纱布封ロ，继续培养至OD6J). 4^0. 6，将所有培养物接种于10L LB-Amp液体培养基的15L种子罐中，培养8小吋，移种至150L发酵罐中，培养至0D_0. 4 0. 5，加入终浓度为 0. 1-0. 6mmol/L (优选 0. 5mmol /L)的 IPTG,于 23°C 26°C、摇床振荡培养5 8小时，转速220转/分，至DO值25% 38% ；
(4)外消旋型邻氯扁桃酸及葡萄糖的添加按照lmol/L的浓度添加外消旋型邻氯扁桃酸，葡萄糖添加量为外消旋型扁桃酸的1-1. 5倍，以NADP为辅因子，经过6 10小时催化，获得R-邻氯扁桃酸。实施例2 R-邻氯扁桃酸甲酯的制备方法，和实施例I基本相同，包括以下步骤 将消旋型邻氯扁桃酸在浓硫酸作用下与甲醇酯化，产生消旋型邻氯扁桃酸甲酷。以下
步骤与实施例I中的步骤(1)、(2)、(3)、(4)相同，最后获得R-邻氯扁桃酸甲酷。其他醇酯的制备只需将酯化的醇变换为相应的醇即可。
权利要求
1.ー种R-邻氯扁桃酸的制备方法，其特征在于该方法包括以下步骤 (I)酶的重组表达 设计引物对P1、P2 Pl :5’ -atacgcggatccatgtggaacaatgctccgc3’，P2 :5’ -gggccgctcgagttaacttctcgcttgttc3，, 以荧光假单胞菌基因组的DNA为PCR模板，进行PCR第一次扩增，扩增产物为S-扁桃酸脱氢酶基因Pf量//ガ，经改造后得到序列为Seql的氨基酸，将序列Seql与表达载体pETDuet-Ι 连接； 设计引物对P3、P4 P3 D> -ccgccggaattcatgtatccggatttaaaag3J,P4 :5，-ataagaatgcggccgcttaaccgcggcctgcctgg3’， 以枯草芽孢杆菌基因组的DNA为PCR模板，进行PCR第二次扩增，扩增产物为枯草芽孢杆菌葡萄糖脱氢酶基因其氨基酸序列为Seq2N ； 设计引物对P5、P6 P5 :5’ -gggggaagatctatgtcagttttcgtttcag3 ,Pd :5’ -gggccgctcgagttatattctgccctCSLSLSL^0， 以酿酒酵母基因组的DNA为PCR模板，进行PCR第三次扩增，扩增产物为酿酒酵母羰基还原酶基因6 ,经改造后得到序列为Seq3的氨基酸，将Seq2N、Seq3先后与表达载体pETDuet-Ι 连接； (2 )转化宿主制备BL21宿主感受态后，通过热激法或电击法获得能够表达S-扁桃酸脱氢酶的基因工程菌I及可表达6 与的基因工程菌 Ii，备用； (3)接种培养将所述基因工程菌I和基因工程菌Il按菌体密度1~5:1的比例混合，共同培养于LB-Amp液体培养基中，于37°C摇床振荡培养6 10h，转速240转/分，当0D_达到O. 4^0. 6时，接种于装有150mL LB-Amp液体培养基的三角瓶中，三角瓶用纱布封ロ，继续培养至OD6tltl O. Γ0. 6，将所有培养物接种于装有IOL LB-Amp液体培养基的种子罐中，培养8h，移种至150L发酵罐中，培养至OD6tltl O. 4 O. 5，于23°C 26°C、摇床振荡培养5 8h，转速220转/分，至DO值25% 38% ； (4)外消旋型邻氯扁桃酸和葡萄糖的添加按照lmol/L的浓度添加外消旋型邻氯扁桃酸，葡萄糖添加量 为外消旋型扁桃酸的1-1. 5倍，以NADP为辅因子，经过6 10h催化，获得R-邻氯扁桃酸。
2.如权利要求I所述的制备方法，其特征在于其中第一次、第二次和第三次PCR扩增时PCR体系均为10XTaq buffer 5μ I ；10 mmol/L 的 dNTP I. 5μ I ；25 mmol/L MgCl2 3 μ I ；对应的上下游引物各I μ I ；DNA模板I μ I ；5U/ μ I Taq DNA聚合酶O. 25 μ I ；ddH2037. 25 μ I ο
3.如权利要求I所述的制备方法，其特征在于其中第一次PCR扩增时的步骤为(I)95°C，预变性 3min ;(2) 94°C，变性 30s ; (3) 50°C退火 30s ; (4) 72°C延伸 75s;步骤⑵ ⑷重复30 次；(5) 72°C继续延伸lOmin，冷却至4で。
4.如权利要求I所述的制备方法，其特征在于其中第二次PCR扩增时的步骤为(I)94°C，预变性 3min ；⑵94°C，变性30s ； (3) 54°C退火30s ； (4) 72°C延伸50s ;步骤⑵ ⑷重复30次；(5) 72°C继续延伸lOmin，冷却至4°C。
5.如权利要求I所述的制备方法，其特征在于其中第三次PCR扩增时的步骤为(I)94°C，预变性 3min ； (2) 94°C，变性 30s ； (3) 54°C退火 30s ； (4) 72°C延伸 66s ;步骤(2) (4)重复30次；(5) 72°C继续延伸lOmin，冷却至4°C。
全文摘要
本发明公开一种R-邻氯扁桃酸及其醇酯制备方法。本方法通过诱导表达重组S-扁桃酸脱氢酶、羰基还原酶及葡萄糖脱氢酶，以外消旋型邻氯扁桃酸或其醇酯及葡萄糖为底物，进行顺序催化反应，获得R-邻氯扁桃酸或其醇酯。采用的基因工程菌为大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、假单胞菌及酿酒酵母。该方法是一种环境友好、经济的R-邻氯扁桃酸单一光学对映体制备方法，反应时间短，耗能小，易于操作，得率高，产物R-邻氯扁桃酸(或其醇酯)的得率大于85%，R-邻氯扁桃酸(或其醇酯)的ee值在95%以上。本发明将廉价易得的外消旋型邻氯扁桃酸生物催化为具有重要工业价值的R-邻氯扁桃酸，成本低，绿色环保，工艺简化，适于工业化生产。
文档编号C12N15/70GK102660625SQ20121011957
公开日2012年9月12日 申请日期2012年4月23日 优先权日2012年4月23日
发明者吴阔, 王海勇 申请人:郑州市拓信生物研究所